Mikroskopski pregled stolice. Intravitalna dijagnoza helmintijaze

Izravne metode: otkrivanje samih helminta, njihovih fragmenata, jaja, ličinki u izmetu, urinu, duodenalnom sekretu, sputumu, nosnoj i vaginalnoj sluzi, sadržaju subungualnih prostora, biopsiranim komadićima tkiva.

Prilikom dijagnosticiranja nemoguće je identificirati jaja ili ličinke svih vrsta helminta koji žive u probavni sustav osoba. Stoga, kada se koristi metoda flotacije, jajašca trematoda i, u nekim slučajevima, neoplođena jajašca valjkastih crva ne plutaju u površinskom filmu (zbog njihove visoke specifične težine). Vrlo je rijetko pronaći jaja pinworma i onkosfere taeniida u izmetu, koji se otkrivaju posebnim metodama istraživanja: struganje iz perianalnih nabora za pinworme i taeniide, metode sedimentacije za trematode (jaja opistorhida, itd.). Stoga, za ciljani pregled pacijenta za infekcije helmintima, liječnik u uputnici mora naznačiti na koje se helminte treba usredotočiti (dijagnoza), što će laboratorijskom pomoćniku omogućiti odabir odgovarajuće tehnike za identifikaciju ove vrste helminta. Izmet uzet iz razna mjesta stolicu u količini od najmanje 50 grama (žličica) u čistoj staklenoj posudi potrebno je poslati u laboratorij najkasnije 24 sata nakon defekacije i pregledati na dan primitka.

Ako je potrebno sačuvati stolicu do sljedeći dan stavlja se na hladno mjesto (0-4°C) ili puni nekim od konzervansa.

Prije pregleda, izmet se miješa štapom tako da su jaja helminta ravnomjerno raspoređena u ukupnoj masi.

Ako se u pripravku pronađu jaja bilo kojeg helminta, gledanje se ne zaustavlja, jer može postojati dvostruka ili trostruka invazija.

Praćenje učinkovitosti liječenja infekcija helmintima provodi se ispitivanjem izmeta na jaja helminta 2-3 tjedna ili 2-3 mjeseca nakon liječenja, ovisno o otkrivenom helmintu.

Makroskopske metode koriste se za otkrivanje cijelih zrelih helminta ili njihovih fragmenata u izmetu golim okom ili korištenjem ručnog povećala.

Često se na površini izmeta nakon defekacije mogu vidjeti aktivno gmižući pinwormi; okrugli crvi se izlučuju izmetom; Ponekad ljudi sami primjećuju prolaz helminta. U bolesnika s difilobotrijazom mogu se oslobađati fragmenti strobila trakavice (u obliku "rezanaca"), a kod zaraženih taeniidama (svinjska ili goveđa trakavica) segmenti helminta često se odvajaju s izmetom (u obliku "bijelih" isječci”) ili aktivno ispuzaju iz anus.

Makroskopska metoda je glavna za diferencijalnu dijagnozu taeniaze i taeniarinhoze (u kombinaciji s pregledom).

Od specijalnih makroskopskih metoda koristi se metoda sekvencijalnog ispiranja fecesa.

Izmet se miješa u vodi kako bi se dobila jednolika suspenzija, nakon čega dobro osvjetljenje pažljivo se ispituju u zasebnim malim obrocima u crnim fotografskim kivetama ili na tamna pozadina u Petrijevim zdjelicama. Pincetom ili iglom za seciranje uklonite sve sumnjive bijele čestice, velike tvorevine sumnjive na fragmente helminta i pregledajte ih pod povećalom između dva stakalca. Mali helminti ili glave cestoda ispituju se pod povećalom u kapi glicerina ili pod mikroskopom.

Kod ove metode za dijagnosticiranje segmenata svinjske, goveđe i široke trakavice isprani segmenti se stave između dvije čaše i promatranjem pod povećalom ili malim povećanjem mikroskopa vrsta se određuje prema građi. maternice (kod zrelog segmenta svinjske trakavice 8-12 bočnih ogranaka i goveđa trakavica 18-32, češće 28-32, kod široke trakavice segmenti su širi, a maternica u sredini je u obliku "rozete"). Ako je maternica teško vidljiva, tada se može prvo zadržati neko vrijeme u 50% otopini glicerina, nakon čega se mogu jasno vidjeti i prazna debla maternice.

Pri identifikaciji ovih cestoda prema građi odvojenih glava, pažljivo se stave s vratom u kap glicerina između stakalca (ili prekriju pokrovnim stakalcem) i, bez stiskanja, pregledaju pod mikroskopom pri malom povećanju.

Mikroskopske metode dijele se na proste, složene i posebne.

U jednostavne spadaju metode nativnog brisa, nativnog brisa s Lugolovom otopinom, metode debelog brisa pod celofanom po Katu, uvrtanja (po Shulmanu) i perianalnog struganja.

Složene metode su učinkovitiji i temelje se na koncentraciji jaja u pripravcima. Oni uključuju prethodnu obradu izmeta tekućim reagensima, zbog čega se jaja helminta talože ili plutaju na površini tekućine.

Složene metode uključuju metode obogaćivanja:

a) flotacija (kada specifična gravitacija jaja imaju manju specifičnu težinu slana otopina a jaja plutaju na površini filma);

b) sedimentacija (kada je specifična težina jaja veća od specifične težine slanih otopina i jaja se talože u sediment).

Posebne metode za otkrivanje jaja i ličinki helminta, cista i vegetativnih oblika protozoa su metode struganja, flotacije, sedimentacije, larvoskopije, protozooskopije, ispitivanja žuči te metode bojenja razmaza fecesa, sputuma i dr.

Jednostavne metode fekalne pretrage

Nativni bris. Drvenim štapićem s raznih dijelova isporučene porcije uzme se sitna čestica izmeta, dobro utrlja na predmetno staklo u kap 50% otopine glicerola i napravi tanak razmaz na 2-3 stakalca. Najmanje 3 preparata se ispituju pod mikroskopom. Nedostatak metode: pregledava se mala količina materijala, stoga se ne koristi kao samostalna metoda.

Metoda uvijanja(Šulman). 2,0-3,0 g izmeta stavi se u čašu, temeljito promiješa staklenim štapićem s 5-strukim volumenom fiziološke otopine ili destilirane vode, radeći brze pokrete 2-3 minute, i brzo izvadi štapić iz smjese. Kap smjese na kraju štapića prenese se na predmetno staklo i pregleda pod mikroskopom. Princip centrifugalne sile uzrokuje nakupljanje jaja i ličinki na štapiću.

Metoda kato debelog razmaza celofanom. Kemijski reagensi: 100% glicerin, 6% otopina fenola (100 ml vode + 6 g fenola), 3% otopina malahitnog zelenog (2,5 ml destilirane vode + 75 ml malahitnog zelenog).

Priprema radne otopine: 100 ml 6% otopine fenola + 100 ml čistog glicerina + 1,2 ml 3% otopine malahitnog zelenila.

Priprema celofanskih traka: Izrežite celofanske trake veličine koja odgovara predmetnom staklu. Celofan mora biti hidrofilan (prikladan je celofan koji gori; ako se topi, nepogodan je). U radnoj otopini može se obraditi do 5 tisuća traka. Razdoblje izlaganja celofanskih traka do njihove upotrebe u radnoj otopini je najmanje 24 sata.

Napredak studije. 50 mg fecesa (veličine velikog zrna graška) nanese se na predmetno stakalce, utrlja pojedinačnim štapićem (staklenim, drvenim), pokrije celofanskom trakom i utrlja na vrhu gumenim čepom dok se ne dobije jednoličan gust razmaz. dobiveno. Preparat se suši na sobnoj temperaturi 1 sat ili u termostatu na 40°C 20-30 minuta i pregleda mikroskopski (vrijeme ekspozicije može se povećati na sobnoj temperaturi na 5-6 sati ili više).

U pogledu učinkovitosti, ova metoda je bliska metodi flotacije, ali otkriva invaziju intenzivnog i srednjeg intenziteta.

Koristi se kao samostalna dijagnostička metoda i preporučuje se za masovni probir stanovništva.

U kliničkim dijagnostičkim laboratorijima koristi se kao jedinstvena metoda za dijagnosticiranje helminta u nedostatku specifičnih dijagnoza u liječničkim uputama.

Metode perianalnog struganja i nativnog brisa s Lugolovom otopinom opisane su u poglavlju Posebne metode.

Sofisticirane metode obogaćivanja izmeta

Metode obogaćivanja temelje se na razlici u specifičnoj težini jajašaca helminta i korištene slane otopine.

Pri korištenju metode flotacije mogu se koristiti sljedeće otopine soli:

1. Otopina olovnog nitrata PbNO3 (olovni nitrat) gustoće 1,5. Pripremljeno brzinom od 650 g tvari na 1 litru vode. Sol se otopi u dijelovima u vrućoj vodi u emajliranoj posudi, zagrije na štednjaku i neprestano miješa dok se potpuno ne otopi. Otopinu nije potrebno filtrirati. Otopina se priprema na dan studije, budući da tijekom vremena daje talog, a njegova gustoća počinje padati nakon 24 sata.Ako se otopina priprema u velikim količinama, tada se sljedećih dana prije studije zagrijava, miješajući talog. Otopina se priprema u dimnoj komori, jer je olovni nitrat sol teškog metala.

2. Otopina amonijevog nitrata NH4NO3 (granulirani ili obični amonijev nitrat) gustoće 1,3 priprema se na isti način kao i prethodni, ali brzinom od 1500 g tvari po 1 litri. Vruća voda.

3. Otopina natrijevog nitrata NaNO3 ili natrijevog nitrata s gustoćom od 1,38-1,4 priprema se brzinom od 1000 g tvari na 1 litru vruće vode.

4. Otopina natrijeva tiosulfata Na2S2O3×5H2O (natrijev hiposulfit) gustoće 1,4 priprema se brzinom od 1750 g tvari na 1 litru vruće vode.

5. Otopina natrijevog sulfata Na2SO4 (Epsom sol) s gustoćom od 1,26-1,28 priprema se brzinom od 920 g tvari na 1 litru vruće vode.

6. Otopina cinkovog klorida ZnCl2 (cinkovog klorida) gustoće 1,82 priprema se brzinom od 2000 g tvari na 1 litru vruće vode. Ohlađena otopina ne kristalizira.

7. Zasićena otopina klorida natrij NaCl(kuhinjska sol) gustoće 1,18-1,2. na! l vode, dodajte 400-420 g soli u dijelovima u kantu cakline kipuće vode, neprestano miješajući dok se potpuno ne otopi. Kako se otopina hladi, kristali natrijevog klorida precipitiraju.

Specifična težina flotacijskih otopina mjeri se aerometrom tek nakon što se otopina potpuno ohladi na sobnoj temperaturi.

Metode flotacije su najučinkovitije za otkrivanje jajašca patuljaste trakavice, bičaša, ankilostoma, valjkaste gliste i trakavice.

Površinski film može se ukloniti pomoću žičane omče ili predmetnog stakla.

U zasićenoj otopini stolna sol film se može ispitati nakon 30-40 minuta, u otopini amonijevog nitrata - nakon 10-20-30 minuta nakon taloženja.

Prilikom skidanja filma žičanom omčom ispituje se najmanje 8 kapi.

Predmetna stakla uklanjaju više jajašaca s filma nego žičane petlje. Staklo mora biti u kontaktu s tekućinom flotacijske otopine koja se pipetom dodaje u čašu. Nakon taloženja, staklo se izvadi i postavi navlaženom površinom prema gore na staklo. veća veličina i ispitati pod mikroskopom. Stakalca se prije upotrebe moraju odmastiti.

Za provođenje istraživanja potrebno je imati: stakalce, čaše, žičane omče, kivete, Petrijeve zdjelice, pipete, žarulje, staklene ili drvene šipke.

Napredak studije. 5 g izmeta prelije se s 10-strukom količinom flotacijske otopine (po mogućnosti specifične težine 1,38-1,40), temeljito promiješa, ukloni velike netopljive čestice odozgo i ostavi suspenziju 10-15 minuta. Film se zatim ukloni petljom na stakalcu ili stakalcem. Za razrjeđivanje izmeta bolje je uzeti čaše kapaciteta 30-50 ml, uliti otopinu u ravnini s rubovima (ili ispod 2-3 mm) i prekriti smjesu predmetnim staklom, a zatim dodati otopinu za flotaciju s pipetom dok ne dođe u dodir s predmetnim staklom. Nakon 10-20 minuta brzo uklonite staklo i mikroskopirajte preostali film na njemu bez pokrovnog stakla.

Metode sedimentacije

Metode sedimentacije koriste se za otkrivanje jajašca geohelminta, biohelminta u izmetu i kao posebne metode za testiranje na opisthorchiasis.

Metoda Gorjačev-Zolotuhin(pojednostavljena Gorjačevljeva metoda). Oko 1,5 g fecesa razmuti se u čaši u 3-4 ml vode. Rezultirajuća suspenzija se filtrira kroz dva sloja gaze u epruvetu za centrifugiranje, pažljivo se stavljajući na vrh 4-5 ml zasićene otopine natrijevog klorida prisutne u njoj. Epruvete se stave u postolje 15-20 sati.Za to vrijeme se talože teška jaja trematoda. Dobivaju se dva jasno razgraničena sloja. Sediment se mikroskopski pregleda.

Eter-formalinska metoda. Koristi se za dijagnostiku svih intestinalnih invazija i kao posebna metoda za jaja protozoa i opistorhida.

Oprema: centrifuga na 3000 o/min; centrifugalne graduirane cijevi, lijevci; metalno cjedilo (cijedilo za čaj) ili dvoslojni zavoj; stakalca i pokrovna stakalca; drvene (ili staklene) štapiće; vata, zavoj.

Kemijski reagensi: 10% otopina formalina (1 dio otopine farmaceutskog formalina i 4 dijela destilirane vode); etil eter (medicinski).

U epruvete za centrifugiranje ulije se 7 ml 10% otopine formalina i stavi 1 g fecesa (tolika količina fecesa da otopina u epruveti poraste na 8 ml). Izmet se miješa s formaldehidom dok ne nastane homogena smjesa, a zatim se prelije kroz metalno cjedilo (ili dvoslojnu gazu, zavoj) u drugu epruvetu centrifuge (ako izmet ostane na cjedilu, cjedilo je potrebno isprati formaldehidom). Dodajte 2 ml etera u tu epruvetu za centrifugiranje, zatvorite i snažno protresite 30 sekundi.

Smjesa se centrifugira na 3000 okretaja u minuti jednu minutu (ili dvije minute na 1500 okretaja u minuti). Zbog reakcije eter-formalin, proteini koaguliraju u obliku čepa na vrhu epruvete, a jajašca helminta se talože. Koagulacijski sloj se ukloni, tekućina iz supernatanta se iscijedi, sediment se nanese na predmetno stakalce izravno iz epruvete ili Pasteurove pipete, pokrije pokrovnim stakalcem i pogleda pod mikroskopom.

Eter-octena metoda taloženja. Princip eter-octene sedimentacije jaja helminta sastoji se od sekvencijalne obrade fekalnih uzoraka s 10% vodenom otopinom. octena kiselina i eter. Octena kiselina je bolja od ostalih kemijski spojevi emulgira fekalne uzorke. Prodire u neprobavljene čestice koje se uglavnom sastoje od vlakana, koje kada odličan sadržaj ometati istraživanje taloženjem nakon centrifugiranja. Naknadno dodavanje etera u epruvetu i miješanje dovodi do ekstrakcije octene kiseline iz sadržaja epruvete zajedno s fekalnim česticama natopljenim njime. Budući da je specifična težina mješavine etera i octene kiseline manja od specifične težine vode, uzorci stolice tretirani ovim tvarima plutaju, a jaja helminta, koja imaju visoku specifičnu težinu, talože se.

Količina taloga dobivena nakon taloženja eter-octenom kiselinom je 3-4 puta manja nego nakon taloženja eter-formalinom. To uvelike olakšava otkrivanje jaja helminta u njemu i omogućuje vam ispitivanje cijelog sedimenta s izvaganom količinom od 0,5-1 g. Toksičnost eter-octene metode je 5 puta manja.

Napredak studije. U graduiranu epruvetu centrifuge ulije se 7 ml 10% otopine octene kiseline i doda se uzorak fecesa od 1 g (tj. količina fecesa pri kojoj otopina octene kiseline poraste na 8 ml). Dobro promiješajte staklenim ili drvenim štapićem. Procijedite kroz lijevak s dva sloja gaze u drugu epruvetu centrifuge. U emulzat dodajte 2 ml etil eter(tj. do 10 ml). Epruvete se zatvore gumenim čepom (od bočice za penicilin) ​​i mućkaju 15 sekundi. Nakon uklanjanja čepa, epruvete se centrifugiraju jednu minutu na 3000 okretaja u minuti tijekom 2 minute. Tekućina supernatanta iz epruvete se ispušta. U nekim slučajevima fekalni čep koji nastaje ometa drenažu supernatanta. U tom slučaju staklenom ili drvenom šipkom odvojite čep od stijenki epruvete. Cijeli sediment pipetira se na predmetno stakalce i pregleda mikroskopski pod pokrovnim stakalcem pri malom povećanju. Sediment je obično sitan i bezbojan. Jaja helminta, osobito malih trematoda, lako se otkrivaju.

Metoda kemijske sedimentacije. Princip istraživanja temelji se na taloženju jajašaca iz fekalnog uzorka u fiziološkoj otopini specifične težine 1,15. Suština metode je izravno centrifugiranje epruvete u kojoj se čep izmeta emulgiran u 1% otopini octene kiseline slojevito nanosi na otopinu natrijevog nitrata (specifične težine 1,16). Visoka specifična težina fiziološke otopine i mjehurići koji se oslobađaju uslijed kemijske reakcije koji prodiru u sloj homogeniziranog izmeta sprječavaju njegovo taloženje. Jaja helminta se talože s malom količinom vlakana. Sediment se može očistiti od zaostalog detritusa tretiranjem s 10% otopinom octene kiseline i etera. U ovom slučaju ostaju samo jedna jaja helminta, što uvelike olakšava njihovu identifikaciju.

Napredak studije. U graduiranu epruvetu centrifuge ulije se 6 ml otopine natrijeva nitrata specifične težine 1,15. U drugu epruvetu ulije se 7 ml 1% otopine octene kiseline. Dodajte fekalni uzorak (do oznake od 7,5 ml za uzorak od 0,5 g i do 8 ml za uzorak od 1,0 g). Uzorak temeljito promiješajte staklenim štapićem. Procijedite kroz lijevak s jednim slojem gaze, stavljajući ga na otopinu natrijevog nitrata. Epruveta sa slojevitim filtratom se centrifugira na 1500-2000 okretaja u minuti 5 minuta. Tekućina supernatanta se odvodi brzim okretanjem epruvete. U epruvetu s talogom dodajte 3-4 ml 10% otopine octene kiseline i 0,5 ml etera, zatvorite gumenim čepom i protresite. Ponovljeno centrifugiranje provodi se 1 minutu. Bacite tekućinu supernatanta. Sediment se prenese na predmetno stakalce, pokrije pokrovnim stakalcem i pregleda pod mikroskopom.

HELMINTOLOŠKE ISPITIVANJA ŽUČI, DUODENALNOG SADRŽAJA, Sputuma, KRVI, URINA I MIŠIĆA

Otkrivanje jaja i ličinki helminta u duodenalnom sadržaju i žuči. Ispitivanje žuči i duodenalnog sadržaja provodi se ako se sumnja na helmintiju jetre i žučnog mjehura (opistorhijaza, klonorhijaza, dikrocelioza) i duodenum(strongiloidijaza).

Napredak studije. Duodenalni sadržaj i žuč (porcije A, B, C) uzimaju se na uobičajeni način intubacijom. Za dio B preporuča se postići refleks žučnog mjehura davanjem 33% otopine kroz sondu. magnezijev sulfat. Iz ispitne tekućine odaberu se pahuljice koje plutaju u njoj i pregledaju pod mikroskopom, a zatim se pomiješaju s jednakom količinom sumpornog etera. Smjesa se temeljito protrese i centrifugira. Supernatant se baci, a cijeli sediment pregleda pod mikroskopom.

U nedostatku gnoja i sluzi, žuč i duodenalni sadržaj se centrifugiraju bez miješanja s eterom.

Ispitivanje sputuma. U helmintološkoj praksi ispitivanje sputuma provodi se u svrhu laboratorijske dijagnoze paragonimiaze. Ponekad se otkrivaju jajašca šistosoma, ličinke okruglih crva i elementi ehinokoknog mjehura.

Iz sputuma se priprema nativni razmaz na predmetnom staklu koji se pregledava pod mikroskopom.

Ako je u ispljuvku veća količina gnoja, pomiješa se s 0,5% otopinom natrijevog hidroksida ili kalijevog hidroksida, mućka se 5 minuta i centrifugira. Sediment se mikroskopski pregleda.

Krvni test. Krv se ispituje ako se kod bolesnika sumnja na filarijazu.

Zbog činjenice da su kod nekih vrsta filarijaze (lojaza, wuchererioza uzrokovana subperiodičnom sojom) ličinke (mikrofilarije) prisutne u perifernoj krvi samo tijekom dana, a kod nekih (brugioza, wuchererioza uzrokovana periodičnom sojom) - samo noću, odnosno u to vrijeme krv se uzima za analizu.

Tehnika uzimanja krvi, pripremanja preparata (tanki razmaz i debela kap), bojenja istih (prema Romanovskom) i testiranja slični su onima za laboratorijsku dijagnostiku malarije.

Mikrofilarije različitih vrsta razlikuju se po duljini, širini, zakrivljenosti tijela, prisutnosti ili odsutnosti kapice, obliku kraja repa, položaju nuklearne tvari u tijelu i kaudalnom području ličinki.

Napredak studije. Zatim se urin pusti da odstoji najmanje 30 minuta gornji sloj ocijediti, ostavljajući 10-15 ml taloga, koji se ulije u epruvete za centrifugiranje i centrifugira 1-2 minute. Nakon ispuštanja supernatanta, sediment se prenese na predmetno staklo i pregleda pod mikroskopom.

STUDIJA MIŠIĆNIH BIOPTA

Metoda trihineloskopije. Potreba za pregledom mišićne biopsije bolesnika javlja se kada se sumnja na trihinelozu.

Biopsija se izvodi prema općim pravilima. Obično se radi biopsija deltoidnog mišića. Prilikom patološkog pregleda može se učiniti biopsija mišića dijafragme, jednjaka, jezika, žvačnih i međurebarnih mišića, fleksora udova, mišića očna jabučica, budući da su najintenzivnije pogođene ličinkama trihinele.

U laboratoriju se biopsirani komadić mišića reže na vrlo male komadiće (mikrotomom), koji se stavljaju između dva stakla, drobeći mišićna vlakna, i pregledavaju pod mikroskopom. Trenutno se u tu svrhu naširoko koriste posebni mikroskopi - trihineloskopi.

U slučaju trihineloze, trihineloskopijom se otkrivaju oštro istaknuti znakovi duž mišićnih vlakana. ovalnog oblika(poput limuna) trihineloze kapsule. Prosječna vrijednost kapsule kod ljudi je 0,4 x 0,26 mm. Kapsula, u pravilu, sadrži jednu trihinelu spiralno smotanu u 2,5 zavoja. Uz veliki intenzitet invazije, u jednoj kapsuli mogu biti 2 ili 3 ličinke. Mišićna vlakna uz kapsulu gube svoje poprečne pruge i poprimaju homogen izgled.

Na isti se način ispituje meso ili mesne prerađevine koje su uzrokovale infekciju.

Metoda probave mišića. Metoda je učinkovitija.

Napredak studije. Mišići koji se proučavaju su fino mljeveni i ispunjeni umjetnim želučana kiselina u omjeru 1:15-20. Dobivena smjesa se stavlja u termostat na 37°C 12-16 sati, nakon čega se mikroskopski pregleda sediment u kojem se među masom ostataka probavljenih mišićnih vlakana nalaze ličinke trihinele u slobodnom stanju.

Umjetni želučani sok može se kupiti u ljekarni ili pripremiti u laboratoriju. Da biste to učinili, dodajte 10 ml koncentrirane klorovodične kiseline u 1 litru destilirane vode; Prije upotrebe dodajte 30 g pepsina u 1 litru razrijeđene kiseline.

KVANTITATIVNE METODE ISTRAŽIVANJA

Kvantitativne metode Istraživanja se koriste za određivanje intenziteta invazije, procjenu učinkovitosti različitih antihelmintika, određivanje kvalitete dehelmintizacije, praćenje tijeka masovnog liječenja i preventivnih mjera itd.

Kvantitativno određivanje jajašaca helminta provodi se dvijema metodama: metodom Stoll i metodom Krasilnikova i Volkova (1974).

Stollova metoda. Za provođenje studije morate imati mikroskop, staklenu tikvicu s oznakom od 56 i 60 ml, graduirani cilindar, staklene kuglice, gumeni čep za tikvicu, graduirane pipete, stakalce i 0,4% otopinu natrijevog hidroksida.

Napredak studije. Decinormalna otopina natrijevog hidroksida (približno 0,4% koncentracije) se ulije u tikvicu pomoću graduiranog cilindra do oznake od 56 ml i dodaje se izmet dok razina tekućine ne dosegne 60 ml (tj. 4 ml izmeta). Smjesa se temeljito protrese staklenim kuglicama 1 minutu, zatvarajući posudu gumenim čepom (možete miješati i štapićem). Odmah nakon mućkanja graduiranom pipetom uzeti 0,075 ml smjese (sadrži 0,005 ml fecesa), prenijeti na predmetno staklo i pod mikroskopom izbrojiti broj jajašaca u preparatu. Za određivanje broja jaja u 1 g izmeta, otkriveni broj se množi s 200.

Usporedba broja jajašaca u pripravku pronađenih u pacijenta prije i nakon tretmana omogućuje procjenu učinkovitosti dehelmintizacije.

Stollova metoda je jednostavna, daje usporedive rezultate za sve helmintijaze, čiji uzročnici sustavno otpuštaju jajašca u crijeva bolesnika. Međutim, nedostatak metode je što je relativno niska osjetljivost, osobito s niskim intenzitetom invazije.

Krasilnikov-Volkova metoda. Prilikom proučavanja ovom metodom, najmanje 1 g izmeta pomiješa se u staklenoj tikvici ili velikoj epruveti s 1% otopinom Lotusa (ili 1,5% otopinom Extra) u omjeru 1:10. Suspenzija se temeljito protrese dok ne nastane homogena suspenzija, zatim se 0,1 ml suspenzije (što odgovara 0,01 g fecesa) brzo uzme graduiranom pipetom i prenese na predmetno staklo. Preparat se pokrije pokrovnim staklom ili celofanskom pločom (20 x 30 mm), drži najmanje jedan dan na 50% Vodena otopina glicerin.

Izbrojite broj jaja u cijeloj pripremi. Da bi se izračunao broj jaja u 1 g izmeta, dobiveni broj mora se pomnožiti sa 100.

Ova metoda ima niz prednosti u odnosu na Stoll metodu. Prvo, osjetljiviji je i omogućuje vam otkrivanje helminta kada slab stupanj infestacije. Drugo, vrlo je pogodno za masovna ispitivanja, jer otopine deterdženata, kao konzervansi za jaja helminta, omogućuju provođenje istraživanja na ne sasvim svježem materijalu. Međutim preduvjet To uključuje skupljanje izmeta izravno u otopinu deterdženta.

Za kvantitativno istraživanje Možete koristiti bilo koju od opisanih unificiranih kvalitativnih metoda temeljenih na principu plutajućih jaja. Ali u ovom slučaju za analizu se mora uzeti ista količina izmeta i isti volumen otopine za flotaciju. Stupanj invazije može se izračunati poznavanjem broja jaja u 1 g izmeta, prema donjoj tablici.

Intenzitet invazije ovisi o broju jaja helminta

u 1 g izmeta

SEROLOŠKE DIJAGNOSTIČKE METODE

Ove metode, temeljene na detekciji specifičnih protutijela u krvnom serumu, koriste se u dijagnostičke i probirne svrhe.

Serološke metode uključuju:

Prstenasta precipitacijska reakcija (RCR) (trihineloza, cisticerkoza);

Prstenasta reakcija taloženja u epruvetama na hladnom (trihineloza, cisticerkoza);

Reakcija mikroprecipitacije na živim ličinkama (trihineloza, ascariasis);

Reakcija neizravne hemaglutinacije (IRHA) (trihineloza, ehinokokoza, alveokokoza, cisticerkoza, itd.);

Reakcija lateks aglutinacije (LAR) (ehinokokoza, alveokokoza, trihineloza, teniarinhijaza, itd.);

Reakcija vezanja komplementa (FFR) (trihineloza, ehinokokoza, cisticerkoza);

Reakcija antitijela obilježena enzimima (ERA) (ehinokokoza, onhocerkoza, šistosomijaza, trihineloza, toksokarijaza);

Vezani imunosorbentni test(ELISA) (trihineloza, opisthorchiasis, toxocariasis, toxoplasmosis, itd.).

Za izvođenje seroloških reakcija proizvode se standardni antigeni ili se pripremaju samostalno (na primjer, iz ehinokoknih mjehura ovaca), a proizvode se posebni testni sustavi za ELISA.

Posebne metode studije za enterobiasis, teniarinhoz, taeniasis

Struganje s perianalnih nabora. Da biste dobili struganje s perianalnih nabora, možete koristiti drvenu lopaticu, celofansku traku, celulozni papir ili traku, štapiće za oči s posebnim ljepljivim slojem:

a) struganje drvenom lopaticom (lopatica je spljoštena šibica ili štapić), navlaženom 1% otopinom glicerina (ili 0,5% otopinom soda bikarbona), izvodi se laganim struganjem s površine perianalnih nabora duž cijelog opsega anusa. Dobiveni struganje se rubom pokrovnog stakla s kraja lopatice prenese na predmetno staklo u kap 50%-tne otopine glicerola, pokrije se istim pokrovnim staklom i mikroskopira. Nedostatak ove metode je nedovoljna detekcija jaja i nadražujuće djelovanje;

b) prema Torgushinovoj metodi, ispiranje se vrši pamučnim štapićem na drvenoj ili drugoj lopatici navlaženoj 50% otopinom glicerina, a razmaz se priprema na stakalcu u kapi glicerina;

c) prema metodi Kevorkove, oko 5 ml se ulije u epruvetu centrifuge kuhana voda, u njega stavite lopaticu (štapić) s vatom. Prije uzimanja materijala tampon se lagano pritisne na unutarnju stijenku epruvete, njime se prebrišu perianalni nabori i špatula s tamponom uvuče u epruvetu. Obrisak se dobro protrese u epruveti, ispiranje centrifugira 3 minute i dobiveni sediment pregleda pod mikroskopom;

d) struganje ljepljivom trakom po Grahamu. Komad ljepljive trake (prozirna polietilenska traka s ljepljivim slojem za dječje kreativnosti, ali bolje je koristiti kirurški film LPO-1, LPO-2) duljine 8-10 cm, zalijepiti ga ljepljivim slojem na perianalne nabore kože, držeći ga za krajeve, a zatim ga prebaciti u staklo skliznuti s ljepljivim slojem prema dolje (odsjeku se krajevi trake koji izlaze izvan rubova stakla), naočale se numeriraju, a podaci o pacijentu i broj čaše upisuju se u dnevnik. U laboratoriju se ljepljiva traka na jednom kraju odlijepi na veliku udaljenost i ispod nje se nakapaju 1-2 kapi. vazelinsko ulje ili glicerin (za uklanjanje optičkih nedostataka) i mikroskop;

e) struganje pomoću staklenih štapića za oči, čija je površina obložena posebnim ljepljivim sastavom. Štapići za oči ugrađeni su u poseban tronožac. Materijal se uzima dodirom plosnatog dijela spatule na kožu perianalnog otvora. Štapić se zatim ponovno pričvrsti na tronožac radi transporta. Mikroskopiranje se izvodi izravno na lopatici obostrano (bez stakalca i pokrovnih stakala) uz prethodno postavljanje u kasete pri malom povećanju (okular x 10, objektiv x 8). Na kraju rada štapovi se dezinficiraju kuhanjem u otopini sapuna, a stativ i kasete tretiraju se alkoholom i operu otopinom sapuna i sode. Sastav ljepila: cleol – 10 g, ricinusovo ulje– 2,5 g, etil eter – 5 g, etanol 96% - 2,5 g.

Lopatice se umoče u otopinu ljepila, zatim se osuše na zraku na sobnoj temperaturi. Ljepljivi film koji se formira na površini traje nekoliko dana.

Metoda je prikladna za masovni pregled djece na enterobiazu i odraslih na tenijazu.

Uz metodu struganja za teniarhinkozu i taeniazu, također se koriste gore opisana metoda istraživanja i makroskopska metoda (pri identificiranju segmenata).

Posebne metode istraživanja za strongiloidijazu

Eter-octena metoda koristi se za otkrivanje jaja (vidi gore), a Bermanova metoda za otkrivanje ličinki u izmetu.

Bermanova metoda. Pregledajte svježu stolicu, po mogućnosti nakon uzimanja laksativa. Uzorak fekalija od 5 g stavlja se na metalno sito (mreža iznutra je obložena s dva sloja gaze) u stakleni lijevak montiran na postolje. Na donji kraj lijevka stavi se gumena cijev sa stezaljkom (Bermanov aparat).

Mreža s izmetom se podigne i u lijevak se ulije voda zagrijana na 40-50°C tako da Donji dio mesh je bio uronjen u vodu i izmet je bio potpuno prekriven vodom. Nakon 2-4 sata stezaljka na gumenoj cijevi se brzo otvori i tekućina se ispusti u epruvetu centrifuge. Nakon centrifugiranja (1-2 minute) gornji dio tekućine brzo se ocijedi, a sediment u količini od 1 ml nanese se u tankom sloju na predmetno stakalce i mikroskopira pod malim povećanjem mikroskopa.

IMP i TM metoda. Dio izmeta veličine oraha stavi se u čašu, prelije toplom otopinom soli od 40°C tako da izmet bude prekriven otopinom i ostavi 20 minuta. Nakon 20 minuta, tekućina se izlije u Petrijevu zdjelicu i pregleda pod MBS binokularnim mikroskopom.

Za dijagnosticiranje strongiloidijaze, posebno za praćenje učinkovitosti liječenja, preporuča se kombinirati Bermanovu metodu s proučavanjem duodenalnog sadržaja.

Posebne metode istraživanja nematoda

Nematoze

Ascariasis

Povijest skreće pozornost na odnos prema vrtlarstvu i hortikulturi. Konzumiranje sirovog povrća i salata od tog povrća.

Kliničke manifestacije ranoj fazi Ascariasis je uzrokovan alergijskim promjenama u tijelu. Rani ili migratorni larvalni stadij ascariasis često se javlja u prisutnosti groznice s tjelesnom temperaturom do 38 ° i više, s kompleksom simptoma oštećenja pluća i prisutnosti izražene eozinofilije u krvi. U većini slučajeva, kod djece, prvi znaci bolesti su malaksalost, slabost, povremene glavobolje, znojenje, a ponekad i bolovi u mišićima i zglobovima. Često se pojavljuje obilan osip poput urtikarije s jakim ili umjerenim svrbežom. Dijagnoza rane faze potvrđuje se rendgenskim studijama na prisutnost hlapljivih tvari u plućima. eozinofilni infiltrati Leffler. Razmazi svježe izlučenog sputuma često sadrže eozinofilne stanice, crvene krvne stanice, Charcot-Leydenove kristale i ličinke valjkastih crva.

U intestinalnom imaginalnom stadiju ascariasis, kombinacija gastrointestinalnog i astenični sindromi, enterokolitička simptomi boli. Djeca često gube težinu, ponekad prilično značajno. Mučnina, pojačano lučenje sline, razdražljivost, odgođeni psihomotorni razvoj, smanjena inteligencija.

Za laboratorijsku dijagnostiku crijevnih sv.

Protozoe se dijele u 4 klase:

Kada se encistira, mikroorganizam stječe zaobljeni oblik i prekriven zaštitnim omotačem. U obliku ciste, protozoe postaju manje osjetljive na nepovoljni faktori okoliš.

Sljedeće može biti predmet istraživanja:

Bilješka:Postoje mnoge vrste dijagnostike, a mi ćemo razmotriti one vrste koje su najčešće u kliničkoj laboratorijskoj praksi.

Privatne vrste dijagnostike

U svakom konkretnom slučaju laboratorijski pomoćnik ima zadatak pronaći određeni patogen, ponekad se uz glavni otkrivaju i drugi.

Postoji 6 vrsta ovog mikroorganizma koji može živjeti u ljudskom crijevu. Klinički je značajna samo dizenterična ameba, koja se javlja u vegetativnom obliku iu obliku cista.

Dodatno se koriste imunološke metode:

• neizravna imunofluorescencija;
• neizravna aglutinacija (INA);
• radijalna imunodifuzija.

Bilješka: serološke metode su neinformativni i koriste se samo kao dodatak glavnim u sumnjivim slučajevima.

Dijagnostika trepljastih (ciliata)

Patogeni oblik mikroorganizama ovog roda je balantidij. To je mikrob koji uzrokuje balantidijazu, bolest praćenu ulceroznim procesom debelog crijeva. Uzročnik se otkriva u nativnom razmazu u obliku vegetativne forme i ciste. Materijal za bris (izmet i sluz) uzima se sigmoidoskopskim pregledom i sije na posebne podloge.

Dijagnostika flagelata (Leishmania, Giardia, Trypanosomes, Trichomonas)

Leishmania, tripanosomi, lamblia i trichomonas opasni su za ljude.

Lišmanija– mikrobi, izazivajući lišmaniozu, ispituju se u razmazima krvi, materijalima koštana srž, strugotine iz kožnih infiltrata. U nekim slučajevima, kada se dijagnosticira leishmania, koristi se kultura na hranjivim medijima.

Tripanosomi– uzročnici bolesti bolest spavanja(američka/afrička tripanosomijaza ili Chagasova bolest).

Afrička varijanta definirana je u početno razdoblje u proučavanju periferne krvi. Kako bolest napreduje, patološki mikrobi nalaze se u materijalu punkcija limfnih čvorova, au uznapredovalim stadijima - u cerebrospinalnoj tekućini.

Za dijagnosticiranje tripanosoma ako se sumnja na Chagasovu bolest, materijal koji se ispituje ispituje se pod mikroskopom pri malom povećanju. U ovom slučaju, mrlje i debela kap su prethodno obojeni.

Trichomonas(crijevne, oralne,) otkrivaju se mikroskopijom materijala uzetih sa zahvaćene sluznice.

Identifikacija sporozoa (malarični plazmodij, uzročnik kokcidoze i dr.)

Najčešća i najopasnija vrsta za ljude je malarijski plazmodij, koji ima 4 glavne vrste patogena: tercijanska malarija, četverodnevna malarija, tropska malarija a malarija ovalna.

Spolni razvoj plazmodija (sporogonija) odvija se kod komaraca Anopheles. Aseksualna (tkivna i eritrocitna shizogonija) – u tkivu i eritrocitima ljudske jetre. Ove značajke životnog ciklusa moraju se uzeti u obzir prilikom dijagnosticiranja malaričnog plazmodija.

Tako se u krvi tek oboljelog pacijenta mogu detektirati zametne stanice ciklusa sporogonije. Ali na vrhuncu napada malarije, shizonti se pojavljuju u velikom broju u krvi.

Štoviše, u različite faze malarična groznica pojaviti se raznih oblika plazmodij:

• tijekom razdoblja hladnoće krv se puni merozoitima, vrstom shizonta;
• pri povišenim temperaturama u eritrocitima se nakupljaju prstenasti trofozoiti;
• smanjenje temperature karakterizira prevlast trofozoita sličnih amebi;
• tijekom razdoblja normalnog stanja, krv sadrži odrasle oblike šizonata.

Proučavanje uzročnika malarije (malarijski plazmodij) provodi se u razmazu i debeloj kapi.

Bilješka:Dijagnoza malarije pregledom razmaza i debelih kapi krvi ponekad je pogrešna. Krvne pločice u nekim slučajevima mogu se pogrešno pripisati uzročniku malarije. Također ponekad fragmenti leukocita i drugih stanica simuliraju plazmodij.

Osnovne metode proučavanja protozoa

Pogledajmo ukratko najčešće metode istraživanja prisutnosti protozoa.

Dijagnostika protozoa pomoću nativnog brisa i brisa obojenog Lugolovom otopinom (u stolici)

Lijek se priprema iz emulzije izmeta u izotoničnoj otopini. Dvije kapi natrijeva klora i Lugolovu otopinu nanesu na predmetno staklo. Ispitni materijal se dodaje u obje kompozicije pomoću drvenog štapića i nakon prekrivanja staklom se promatra u različitim rezolucijama mikroskopa.

Pronađene protozoe bilježe se na temelju određenih karakteristika. Za točnost pripremite 2-3 preparata od istog materijala. U sumnjivim slučajevima, analiza se ponavlja nekoliko puta tijekom 2-3 tjedna.

Metoda može otkriti vegetativne i cistične oblike:

• lamblia;
• balantidij;
• dizenterična ameba.

Uz patogene oblike identificiraju se i nepatogene protozoe. Također u zdravih nositelja postoje luminalni i cistični oblici.

Važno:istraživanje treba provoditi više puta kako bi se izbjegle netočnosti i pogreške.

Nalaz dijagnostike protozoa metodom nativnog i obojenog razmaza treba sadržavati opis oblika uzročnika (luminum, cista, tkivo).

Zahtjevi istraživanja:

• materijal uzet za analizu (tekući izmet) ispituje se najkasnije 30 minuta nakon defekacije;
• formalizirana stolica mora se dijagnosticirati unutar 2 sata nakon defekacije;
• materijal ne smije sadržavati nečistoće ( dezinfekcijska sredstva, voda, urin);
• za rad s materijalom koristite samo drvene štapiće, staklene nisu prikladne zbog klizanja sluzi;
• Štapići se moraju spaliti odmah nakon upotrebe.

Metoda konzerviranja (pregled stolice) za dijagnosticiranje protozoa

Studija se provodi fiksiranjem protozoa s konzervansom. Razlika između ove metode i prethodne je u tome što vam konzervansi omogućuju dugotrajno očuvanje lijeka.

Konzervansi koji se koriste:

• Barrow. Sadrži sastojke konzervansa: 0,7 ml natrijevog klorida, 5 ml formalina, 12,5 ml 96% alkohola, 2 g fenola i 100 ml destilirane vode. Sastav za bojanje: 0,01% otopina tionina (azura).
• Safarlijevo rješenje. Sastojci: 1,65 g cink sulfata, 10 ml formalina, 2,5 g kristalnog fenola, 5 ml octene kiseline, 0,2 g metilen modrila, 100 ml vode. Ovaj konzervans se koristi u slučajevima kada se materijal mora čuvati više od mjesec dana.

Prazne boce se pune konzervansom, u njih se pretače materijal u omjeru 3:1, te se po potrebi dodaje boja. Rezultati se procjenjuju proučavanjem 2-3 lijeka.

Metoda obogaćivanja formalin-eterom (analiza na prisutnost protozoa u fecesu)

Ova dijagnostička metoda omogućuje vam odvajanje i koncentriranje cista protozoa. Za analizu su potrebni sljedeći sastojci: formalin (10 ml), 0,85 g izotonične otopine, destilirana voda, sumporni eter, Lugolova otopina.

Smjesa biomaterijala s navedenim tekućinama se miješa i centrifugira. Dobiveni sediment na dnu epruvete boji se Lugolovom otopinom i ispituje se na prisutnost cista i vegetativnih oblika.

Metoda otkrivanja leishmanije (bris koštane srži)

Za dijagnosticiranje lišmanijaze koriste se sljedeći reagensi: Nikiforova smjesa (sumporni eter i etilni alkohol), fosfatni pufer, Azur-eozin prema Romanovskom.

Supstanca koštane srži se nakon posebne pripreme vrlo pažljivo stavlja na predmetno staklo. Koristi se mikroskop s imerzijskim sustavom.

U akutno razdoblje bolesti, u punktatu se nalazi veliki broj lišmanija.

Bilješka:Ponekad krvne stanice može nalikovati prerađenoj lišmaniji, stoga je vrlo važno da laboratorijski tehničar bude oprezan i ima dovoljno iskustva za samostalno istraživanje.

Metoda otkrivanja lišmanije u razmazu kožnog infiltrata

Potrebni reagensi slični su prethodnim analizama.

Ispitni materijal se uzima iz postojećeg tuberkuloznog ili ulceroznog sadržaja. Ako se sumnja na lišmaniozu, struganje se radi vrlo pažljivo skalpelom, bez krvi. Zatim se preparat priprema na staklu. Kako bi se osigurala točnost dobivenih rezultata, istovremeno se ispituje nekoliko preparata.

U prisutnosti bolesti, lišmanija se otkriva i među makrofagima, fibroblastima i limfoidnim stanicama prisutnim u ispitivanom materijalu.

Metoda izolacije čiste kulture lišmanije dobivene struganjem patoloških tkiva

Ovom metodom dijagnosticiranja protozoa, strugotine tkiva stavljaju se u poseban hranjivi medij u kojem se Leishmania aktivno razmnožava.

Prije uzimanja struganja, koža se temeljito tretira alkoholom, zatim se napravi rez u tuberkulozu, s čijeg se dna uklanja sadržaj i stavlja u epruvetu s medijem. Materijal se uzima nekoliko puta, nakon čega se stavlja u različite epruvete. Zatim se uzgaja u termostatu na temperaturi od 22-24 stupnja. Rezultati se procjenjuju pod mikroskopom. Ova metoda se koristi kada su druge, jeftinije i brže metode dijagnosticiranja protozoa neučinkovite.

Kako se u praksi dešifriraju testovi na prisutnost protozoa pomoću kapi krvi možete vidjeti gledajući video pregled:

Lotin Alexander, medicinski kolumnist

Stolice se ispituju na dvije metode:

1. Makroskopski – otkriti helminte, njihove glave, segmente, fragmente strobila. Male porcije fecesa pomiješaju se s vodom u ravnoj posudi ili Petrijevoj zdjelici i gledaju se pri dobrom osvjetljenju na tamnoj pozadini, koristeći povećalo ako je potrebno. Sve sumnjive tvorevine se pincetom prenose u drugu čašicu s vodom ili na predmetno staklo u kapi razrijeđenog glicerola.

Uz metodu braneći se Dio fecesa koji se ispituje pomiješa se s vodom u staklenom cilindru, a nakon taloženja gornji sloj vode se iscijedi. To se ponavlja nekoliko puta. Kada tekućina postane prozirna, ocijedi se i ispituje sediment u Petrijevoj zdjelici.

2. Mikroskopski – za otkrivanje jaja i ličinki helminta. Postoje mnoge metode istraživanja.

1). Nativni bris – najčešća i tehnički pristupačna metoda istraživanja. Mogu se otkriti jaja i ličinke svih helminta. Međutim, s malim brojem jajašaca nije ih uvijek moguće pronaći. Stoga se koristi metoda obogaćivanja.

1). Fülleborg metoda – ovo je metoda obogaćivanja koja se temelji na plutanju jajašaca helmintijaze u zasićenoj otopini NaCl (1,2 – gustoća; 400 g NaCl na 1 litru vode; 40% otopina NaCl). Metoda je učinkovitija od nativnog brisa. 2-5 g izmeta stavi se u staklene posude i napuni otopinom NaCl, promiješa i nakon 45 minuta metalnom omčom odstrani nastali film, kap glicerina stavi na predmetno staklo. Pregledajte pod mikroskopom. Nedostatak metode je sporo pojavljivanje jaja raznih helminta, patuljaste trakavice - nakon 15-20 minuta, valjkastih glista - 1,5 sati, bičaša - 2-3 sata.

2) Kalantaryan metoda – također metoda obogaćivanja, ali se koristi zasićena otopina NaNO 3 (gustoće 1,38). Većina jaja pluta; ispitivanje sedimenta nije potrebno. Nedostatak je što držanje jaja u otopini dulje vrijeme dovodi do činjenice da neka jaja počnu bubriti i taložiti se na dno, nestajući s površinskog filma.

3. Metoda Goryacheva – na principu odlaganja jaja, otkrivanje malih jaja trematoda. Zasićena otopina NaCl koristi se kao otopina i pažljivo se nanosi 3-4 ml otopine fecesa na vrh. Nakon 15-20 sati jaja trematoda talože se na dno. Tekućina se iscijedi, a sediment se stavi na predmetno staklo i pod mikroskop.

4. Shulmanova metoda uvijanja – za otkrivanje ličinki helminta u izmetu. Pregledava se samo svježe izlučeni izmet. 2-3 g se stavi u staklenu posudu i doda 5-struka količina vode, brzo promiješa štapićem ne dodirujući stijenke posude - 20-30 minuta, zatim se štapić brzo izvadi i kap tekućina se na kraju prenese na stakalce i mikroskopira.

5. Bermanova metoda – temelji se na sposobnosti ličinki helminta da migriraju prema toplini i služi za njihovu identifikaciju u izmetu.

6. Harada i Mori metoda (metoda uzgoja ličinki) i preporučuje se za testiranje na infekcije ankilostomama. Metoda se temelji na činjenici da se na toplini i na vlažnom filtriranom papiru jajašca ankilostomatozoida razviju u filariformne ličinke koje se lako otkrivaju. Na sredinu trake filtriranog papira nanese se 15 g fecesa, papir s fecesom se stavi u staklenku tako da se donji kraj uroni u vodu, a gornji učvrsti čepom. Staklenka se drži u termostatu na 28 0 C 5-6 dana. Za to vrijeme razvijaju se filariformne ličinke i spuštaju se u vodu. Tekućina se ispituje pod povećalom. Ako ju je teško otkriti, tekućina se centrifugira, prethodno ubivši ličinke zagrijavanjem na 60 0. Laborant mora nositi rukavice.

7. Metode za enterobiasis – identifikacija jajašaca pinworma i goveđe trakavice.

a) struganje s perianalnih nabora – pamučnim štapićem čvrsto namotanim na drveni štapić i navlaženim 50% otopinom glicerina. U laboratoriju se bris ispere s 1-2 kapi 50% vodene otopine glicerina.

b) metoda ljepljivih grinja (Graham metoda)

Ljepljiva traka se nalijepi na perianalne nabore, zatim se ljepljivi sloj nanese na predmetno staklo i pregleda pod mikroskopom.

C) struganje pomoću očnih štapića (metoda Rabinovich). Za perianalno struganje koriste se staklene očne šipke čiji je široki dio prekriven posebnim ljepilom koje omogućuje zadržavanje jajašca pinworma.

Pregled krvi, žuči, sputuma i mišića

Mikroskopija krvi otkriva ličinke filarije.

Pregled sputuma - jajašca paraganima, larve valjkastih crva, nekator, strongiloid, elementi ehinokoknog mjehura.

Pregled mišića - ako se sumnja na trihinelozu, pregledavaju se mišići bolesnika ili leša, kao i meso od kojeg se pretpostavlja da se osoba zarazila. Za potrebe trihineloskopije mišić se reže na sitne komadiće i stavlja u kompresorij, to su dva široka debela stakla koja gnječe mišiće i nalaze se larve trihinele u obliku kapsula - metoda kompresije.

Metoda probave – mišići se pune umjetnim želučanim sokom (otopina klorovodične kiseline i pepsin). Mišići se probavljaju, a ličinke se lako identificiraju. Određivanje intenziteta invazije: broj ličinki do 200 u 1 g mišićno tkivo– umjeren intenzitet invazije; do 500 – intenzivno; preko 500 – superintenzivna invazija.

Serološke metode

poglavlje III. Dijagnostika helmintijaze i metode helmintološkog istraživanja

Potrebno je pregledati sve pacijente koji traže liječničku pomoć na helmintiju, a posebno pacijente koji se obraćaju pedijatru, terapeutu i neurologu s pritužbama na pojave iz gastrointestinalnog trakta, živčani sustav i kod anemije. Ako liječnik nije uvijek u mogućnosti koristiti laboratorijske metode istraživanja, tada je svaki medicinski radnik koji pruža njegu u poliklinici ili bolnici dužan ispitati pacijenta o izolaciji helminta.

Ako je dostupno, navedeno u relevantnim poglavljima kliničke indikacije Dijagnozu treba razjasniti pomoću laboratorijskih metoda za ispitivanje helmintijaze.

Zbog prevlasti crijevne helmintijaze najveći praktični značaj ima pregled stolice.

Metode ispitivanja stolice na helmintioze

Stolica se dostavlja u laboratorij u čistoj staklenoj posudi (oko četvrtine šalice stolice uzete s različitih mjesta u jednom dijelu); Tijekom rutinskog pregleda dopušteno je dostaviti stolicu u laboratorij u kutijama za šibice ili udlagama.

Za kontrolu dehelmintizacije isporučuje se cjelokupni dio izmeta prikupljen nakon primjene (prema preporuci liječnika). antihelmintik i laksativ (u velikim zatvorenim staklenim posudama, kantama).

Mikroskopski pregled stolice je osnovni u dijagnostici crijevnih helmintijaza; uvijek mu treba prethoditi opći makroskopski pregled izmeta kako bi se otkrili segmenti velikih cestoda, pinworma, valjkastih crva itd.

Stolica treba biti svježa ili konzervirana (u 5% otopini formaldehida), budući da sušenje dramatično mijenja strukturu jaja. Osim toga, kada izmet stoji, brz razvoj jajašca nekih helminta (na primjer, ankilostoma), što otežava dijagnozu.

Prema uputama Ministarstva zdravstva SSSR-a potrebno je istodobno pregledati stolicu metodom po Fullebornu i nativnim razmazom.

Nativni bris

Nativni bris: komadić fecesa (veličine zrna graška) uzet šibicom, staklom ili drvenim štapićem s različitih mjesta u isporučenoj porciji temeljito se smrvi na stakalcu u kapi 50% otopine glicerola ili u slanoj otopini ili u vodi. Pokrijte pokrovnim stakalcem i lagano ga pritisnite (iglom za disekciju). Razmaz mora biti tanak, proziran i ujednačen. Koristi se samo kao dodatak drugim metodama koje osiguravaju obogaćivanje lijeka. Moraju se pregledati najmanje dva lijeka.

Za otkrivanje ličinki helminta (kao i njihovih jaja) radi se nativni bris na sljedeći način(prema Shulmanu): 2-3 g fecesa dobro se izmiješa "uvrtanjem" staklenog štapića u emulziju s peterostrukom količinom čiste vode ili fiziološke otopine. Tijekom miješanja dolazi do nakupljanja ličinki u blizini staklenog štapića, pa se odmah nakon završetka miješanja kap emulzije staklenim štapićem brzo prenese na predmetno stakalce, pokrije pokrovnim stakalcem i pregleda. S. D. Lyubchenko (1936) dokazao je da je metoda uvijanja učinkovitija od metode razmaza, posebno u pogledu jajašaca glista. Na temelju rada S. D. Lyubchenka, smatramo da je preporučljivo zamijeniti metodu razmaza metodom uvijanja.

Fullebornova metoda

Fulleborn metoda: 5-10 g izmeta uzetog s različitih mjesta stavi se u staklenku zapremine 50-100 ml i temeljito utrlja staklenim ili drvenim štapićem u zasićenu otopinu kuhinjske soli (400 g te soli se otopi). u 1 litru vode, zagrijati do vrenja i filtrirati kroz sloj vate ili gaze; otopina se koristi hladna: specifična težina 1,2). Otopina se dodaje postupno dok se ne dobije jednolična suspenzija, a ukupna količina dodane otopine trebala bi biti približno 20 puta veća od količine fecesa. Za miješanje izmeta Fulleborn je preporučio korištenje čaša za čaj, ali je prikladnije pripremiti suspenziju u posudama za mast kapaciteta 50-100 ml, koristeći dvije posude za svaku analizu (ili u čašama kapaciteta 100 ml).

Odmah nakon pripreme suspenzije, krupnije čestice koje su isplivale na površinu uklanjaju se s površine špatulom, metalnom lopaticom ili komadom čistog papira ( biljne formacije, neprobavljeni ostaci hrane i sl.), nakon čega se smjesa ostavi stajati 1-1,5 sat. Nakon tog vremena, cijeli film se uklanja s površine smjese dodirivanjem žice ili platinaste petlje (ravne) promjera ne većeg od 1 cm, savijene pod pravim kutom; Film se istrese na predmetno stakalce i pokrije pokrovnim stakalcem. Stavite 3-4 kapi ispod svakog pokrovnog stakalca (18x18 mm). Ukupno treba pripremiti najmanje 4 pripravka (za svaki pripravak jedno pokrovno staklo). Petlja se zagrijava na vatri i nakon svake analize ispere vodom.

Fullebornovom metodom brzo se i lako otkrivaju jajašca svih nematoda (osim neoplođenih jajašaca valjkastih glista) i jajašca patuljaste trakavice.

Bermanova metoda se koristi za ispitivanje fecesa na ličinke helminta (za strongiloidijazu). Ova metoda je sljedeća: 5 g izmeta na metalnoj mrežici (za ovu svrhu je prikladno cjedilo za mlijeko) stavi se na stakleni lijevak pričvršćen na tronožac. Na donji kraj lijevka postavljena je gumena cijev sa stezaljkom.

Mrežica s izmetom se podigne i u lijevak se ulije voda zagrijana na otprilike 50° tako da donji dio mrežice s izmetom bude uronjen u vodu. Larve se aktivno kreću u vodu i nakupljaju u donjem dijelu gumene cijevi. Nakon 2-4 sata stezaljka se otvori i tekućina se ispusti u jednu ili dvije centrifugalne epruvete.

Nakon centrifugiranja od 1-2 minute, gornji dio tekućine se brzo ocijedi, a sediment se u kapima nanosi na stakalce i ispituje pod pokrovnim stakalcima ili raspoređuje u tankom sloju na 2-3 velike čaše i zatim ispituje bez poklopca poskliznuća.

Bermanova metoda također se koristi za ispitivanje tla na prisutnost ličinki ankilostoma.

Stollova metoda

Za određivanje intenziteta invazije koristi se Stollova metoda. Decinormalna otopina kaustične sode ulijeva se u posebnu staklenu tikvicu do oznake od 56 cm 3, a zatim se dodaju izmet dok razina tekućine ne dosegne 60 cm 3, odnosno 4 cm 3. Nakon mućkanja sa staklenim kuglicama uzima se 0,075 ml smjese za ispitivanje i ispituje pod jednim ili dva obična pokrovna stakalca. Dobiveni iznos se množi s 200 kako bi se dobio broj jajašaca sadržanih u 1 cm 3 izmeta.

Studija duodenalnog sadržaja

Duodenalni sok i žuč iz mokraćnog mjehura, dobiveni na uobičajeni način sondiranjem (i žuč iz mokraćnog mjehura nakon refleksa iz žučnog mjehura), temeljito se pomiješaju s jednakim volumenom etilnog etera; smjesa se centrifugira, nakon čega se sediment pregleda pod mikroskopom. Osim sedimenta, mikroskopski pregled pahuljice koje plutaju u tekućini, koje mogu sadržavati jaja helminta, nužno su izložene. Prilikom testiranja želučanog soka i povraćanja na jaja helminta, možete koristiti istu tehniku.

Ako postoji sumnja na, potrebno je napraviti pretragu duodenalnog soka i želučanog sadržaja helmintičke bolesti jetre, žučnog mjehura (opisthorhijaza, fasciolioza, dikrocelioza) i dvanaesnika (strongiloidijaza).

Ispitivanje sputuma

Ispljuvak se samelje na staklenoj ploči, čvrsto prekrije drugom staklenom pločom i pregleda golim okom na svijetloj i crnoj pozadini, kao i pod povećalom u propuštenom svjetlu. Pojedinačni komadići sputuma (“hrđave” nakupine, ostaci tkiva itd.) nanose se u tankom sloju na predmetno stakalce, čvrsto pokrivaju pokrovnim stakalcem i pregledavaju pod mikroskopom s malim i velikim povećanjem.

a) Za dijagnosticiranje cisticerkoze kože, potkožnog tkiva ili mišića prvo se golim okom pregleda aseptički izrezani komad odgovarajućeg tkiva. Dijelovi tkiva se razmiču iglama za disekciju kako bi se otkrila vezikula vidljiva golim okom - cisticerk (slika A); duljina mu je 6-20 mm, širina 5-10 mm. Kad se otkrije vezikula sumnjiva na cisticerk, zgnječi se između dva stakalca i pregleda pod mikroskopom. Cisticerkus (Cistycercus cellulosae) određen je prisutnošću skoleksa s četiri odoka i vjenčićem kukica (slika B).

Fotografija. A - cisticeri sa skoleksom okrenutim prema van; B - Glava svinjske trakavice.

b) Za dijagnosticiranje trihineloze aseptički izrezani komad mišića (biceps ili gastrocnemius) pažljivo se usitnjava u 50% otopini glicerina iglama za disekciju u najfinija vlakna. Zgnječeni mišići se stisnu između dva stakalca i pregledaju pod mikroskopom male snage u zamračenom vidnom polju. Preporuča se testiranje mišića na trihinelozu najranije 8. dana bolesti. Ličinke trihinele nalaze se u mišićima u smotanom položaju: zatvorene su u kapsulama u obliku limuna.

Fotografija. A - Ličinke trihinele u mišićima; B — Kalcificirane kapsule trihinele.

X-zraka

Najčešće se fluoroskopijom dijagnosticira ehinokokoza i rjeđe cisticerkoza. Cisticerci se otkrivaju fluoroskopijom tek nakon kalcifikacije (u slučajevima dugotrajna bolest). Posljednjih godina, fluoroskopija se također koristi za dijagnosticiranje ascariasis u ranom stadiju ličinke i djelomično u intestinalnom stadiju.

Tijekom razdoblja migracije ličinki okruglih crva (i ankilostoma), u plućima se otkrivaju nestabilni, ponekad višestruki upalni žarići; istovremeno se u krvi javlja značajna eozinofilija.

Spolno zrele valjkaste gliste jasno su vidljive na fluoroskopiji crijeva oboljelih jedinki. Ova metoda, unatoč svojoj složenosti i nezgrapnosti, treba se koristiti kao dodatna metoda za dijagnosticiranje ascariasis u slučajevima s negativnom skatološkom analizom. Prema E. S. Geselevichu, od 180 bolesnika s ascariasisom identificiranim fluoroskopijom, 54 nisu imala jaja ascarisa u stolici (vidi).

7.7. Metode za određivanje održivosti jaja i ličinki helminta

Preživljavanje jajašaca helminta određuje se njihovim izgledom, bojenjem vitalnim bojama, uzgojem u optimalni uvjeti i postavljanje biološkog uzorka.

7.7.1. Određivanje održivosti jaja ili ličinki helminta po izgledu

Jaja helminta se mikroskopiraju prvo pri malom, a zatim pri velikom povećanju. U deformiranim i mrtvim jajima helminta, ljuska je poderana ili savijena prema unutra, plazma je mutna i olabavljena. U segmentiranim jajima, kuglice za drobljenje (blastomere) su nejednake veličine, nepravilnog oblika i često pomaknute na jedan pol. Ponekad postoje abnormalna jaja koja se, unatoč vanjskim deformacijama, normalno razvijaju. U živim ličinkama valjkastih crva fina zrnatost prisutna je samo u srednjem dijelu tijela; dok umiru, širi se cijelim tijelom, pojavljuju se velike sjajne hijaline vakuole, takozvane "niske bisera".

Da biste odredili održivost zrelih jajašaca valjkastih crva, bičaša i pinworma, trebate nazvati aktivni pokreti ličinke laganim zagrijavanjem pripravka (na temperaturu ne veću od 37 °C). Pogodnije je promatrati vitalnost ličinki valjkastih glista i bičaša nakon što su izolirane iz ljuske jajeta pritiskom na pokrovno staklo preparata iglom za seciranje ili pincetom.

Kod ličinki invazivnih valjkastih glista često se vidi ljuštenje ovojnice na kraju glave, a kod ličinki bičaša koje su završile razvoj u jajetu, stilet se nalazi na tom mjestu pri velikom povećanju. U mrtvim ličinkama helminta, bez obzira na njihovu lokaciju (u jajetu ili izvan njega), primjećuje se propadanje tijela. pri čemu unutarnja struktura Larva postaje grudasta ili zrnasta, a tijelo mutno i neprozirno. Vakuole se nalaze u tijelu, a prijelomi se nalaze na kutikuli.

Sposobnost preživljavanja onkosfera taeniida (goveđa, svinjska trakavica, itd.) određena je kretanjem embrija kada su izloženi probavnim enzimima. Jaja se stavljaju na satno staklo psećim želučanim sokom ili umjetnim duodenalnim sokom. Sastav potonjeg: pankreatin - 0,5 g, natrijev bikarbonat - 0,09 g, destilirana voda - 5 ml. Satna stakla s jajima stavljaju se u termostat na 36 - 38 °C 4 sata. U ovom slučaju, živi embriji se oslobađaju svojih membrana. Ljuske živih onkosfera također se otapaju u zakiseljenom pepsinu i u alkalna otopina tripsina nakon 6 - 8 sati u termostatu na 38°C.

Ako jaja teniida stavite u 1% otopinu natrijevog sulfida ili 20% otopinu natrijevog hipoklorida ili u 1% otopinu klorirane vode na 36 - 38°C, zreli i živi embriji se oslobađaju membrana i ne promjena tijekom 1 dana. Nezrele i mrtve onkosfere se smanjuju ili nabubre i naglo se povećavaju, a zatim se "otapaju" unutar 10 minuta do 2 sata. Živi embriji taeniida također se aktivno kreću u mješavini 1% otopine natrijevog klorida, 0,5% otopine natrijevog bikarbonata i žuči na 36 - 38 °C.

Preživljavanje Adolescaria fascioli sakupljenih na biljkama i drugim objektima vodenih tijela provjerava se ispitivanjem na predmetnom stakalcu u fiziološkoj otopini pod mikroskopom s postoljem za zagrijavanje. Kada se ličinke trematoda zagriju, počinju se kretati.

Da bi se odredila održivost jaja patuljaste trakavice, najjednostavnija je metoda N.S. Ionine: u živim jajima, srednji par embrionalnih kukica je ili paralelan s bočnima, ili potonji tvore kut s medijanom na bazi manji od 45°. U mrtvim jajima, bočni parovi tvore kut s srednjim parom na bazi veći od 45°, ili su kuke nasumično razbacane (njihov raspored parova je izgubljen); Ponekad se embrij smanji i formiraju se granule. Točnija metoda temelji se na pojavi kretanja onkosfere tijekom oštre promjene temperature: od 5 - 10 ° do 38 - 40 ° C.

Određivanje održivosti nezrelih jaja nematoda treba proučavati u vlažnoj komori (Petrijeve zdjelice), stavljajući jajašca glista u 3% otopinu formaldehida pripremljenu u izotoničnoj otopini natrijevog klorida na temperaturi od 24 - 30 °C, jajašca glista u 3% otopina klorovodične kiseline na temperaturi od 30 - 35 ° C; jajašaca pinworma u izotoničnoj otopini natrijeva klorida na temperaturi od 37 °C. Petrijeve zdjelice treba otvoriti 1 - 2 puta tjedno radi boljeg prozračivanja, a filter papir treba ponovno navlažiti čista voda.

Promatranja razvoja jaja helminta provode se najmanje 2 puta tjedno. Odsutnost znakova razvoja unutar 2 - 3 mjeseca ukazuje na njihovu nesposobnost za život. Znakovi razvoja jaja helminta su prve faze drobljenja, dijeljenje sadržaja jaja u zasebne blastomere. Tijekom prvih dana razvija se do 16 blastomera koji prelaze u drugi stadij - morula itd.

Jaja ankilostoma se uzgajaju u staklenom cilindru (50 cm visine i 7 cm u promjeru) zatvorenom čepom. Mješavina jednakih volumena sterilni pijesak, ugljen i izmet s jajima glista, razrijeđeni s vodom do polutekuće konzistencije, pažljivo se izlijevaju na dno cilindra pomoću staklene cijevi. Tijekom 1 - 2 dana taloženja u mraku na temperaturi od 25 - 30 °C iz jaja se izlegu rabditiformne ličinke, koje nakon 5 - 7 dana postaju filariformne: ličinke pužu uz stijenke cilindra, gdje se nalaze vidljiv čak i golim okom.

Jaja trematoda koje se prirodno razvijaju u vodi, primjerice opisthorchis, diphyllobothriidae, fasciolae i druge, stave se na satno staklo, Petrijevu zdjelicu ili drugu posudu, te se prelije malim slojem obične vode. Kod uzgoja jaja Fasciola treba voditi računa da se ona brže razvijaju u mraku, dok se u živim jajima na temperaturi od 22 - 24 °C miracidij stvara za 9 - 12 dana. Pri mikroskopiranju jajašaca trematoda u razvoju jasno su vidljivi pokreti miracidija. Miracidium fasciola izlazi iz ljuske jajeta samo na svjetlu.

Fullebornova metoda. Ličinke ankilostoma i strongilida uzgajaju se na agaru u Petrijevoj zdjelici sa životinjskim ugljenom. Nakon držanja u termostatu na temperaturi od 25 - 30 °C tijekom 5 - 6 sati, ličinke pužu po agaru, ostavljajući iza sebe stazu bakterija.

Harada i Mori metoda. Dodajte 7 ml destilirane vode u epruvete postavljene u stalak. Drvenim štapićem uzeti 0,5 g izmeta i napraviti razmaz na filtar papiru (15 x 150 mm) 5 cm od lijevog ruba (ovo se radi na listu papira radi zaštite površine laboratorijskog stola). Zatim se traka s razmazom umetne u epruvetu tako da lijevi kraj bez razmaza dospije do dna epruvete. Gornji kraj prekrijte komadom celofana i čvrsto omotajte elastičnom trakom. Na epruvetu se upisuje broj i prezime osobe koja se ispituje. U tom stanju epruvete se čuvaju 8 - 10 dana na temperaturi od 28 °C. Za proučavanje ličinki uklonite celofanski omotač i pincetom uklonite traku filter papira. Pri tome treba biti oprezan jer se mali broj infektivnih ličinki može pomaknuti na gornji kraj filter papira ili na stranu cijevi i prodrijeti ispod površine celofana.

Epruvete se stave u kupelj s vrućom vodom na 50 °C 15 minuta, nakon čega se sadržaj protrese i brzo izlije u epruvetu od 15 ml da se ličinke talože. Nakon centrifugiranja, supernatant se ukloni, a sediment prenese na predmetno stakalce, prekrije pokrovnim stakalcem i ispita mikroskopski pod malim povećanjem.

Za diferencijalnu dijagnozu filariformnih ličinki potrebno je koristiti podatke u tablici 3.

Tablica 3

DIFERENCIJALNA DIJAGNOSTIKA FILARIOIDNIH LARVI A. DUODENALE, N. AMERICANUS, S. STERCORALIS, TRICHOStrONGYLUS SP.

Larve	Dimenzije	Karakteristični znakovi
A. duodenale	Duljina tijela oko 660 µm, duljina omotača - 720 nm	Ispruganost klobuka je manje izražena, oralna izbočina je manje uočljiva, prednji kraj tijela (ali ne i klobuka) je tup, promjer crijevne cijevi je manji od bulbusa jednjaka, kaudalni kraj je tup
N. americanus	Duljina tijela oko 590 mikrona, duljina omotača - 660 nm	Klobuk je primjetno izbrazan, osobito u kaudalnom dijelu tijela, oralna izbočina djeluje tamno, prednji kraj tijela (ali ne i klobuk) je zaobljen poput uskog kraja kokošje jaje, prednji dio crijevne cijevi ima isti promjer kao i ezofagealni bulbus, kaudalni kraj je oštro zašiljen
S. stercoralis	Duljina tijela oko 500 mikrona	Ličinka je bez ovoja, jednjak je oko polovine dužine tijela, rep je tup ili razgranat
Trichostrongylus sp.	Duljina tijela oko 750 µm	Intestinalni lumen nije ravan, već cik-cak, rep je zaobljen i ima oblik gumba

7.7.2. Metode bojenja jaja i ličinki helminta

Mrtva tkiva u većini slučajeva percipiraju boje brže od živih. Ove se značajke koriste u helmintologiji za određivanje održivosti jaja i ličinki helminta. Međutim, u nekim slučajevima, neke boje bolje percipiraju živa tkiva nego mrtva.

Za razlikovanje živih i mrtvih jaja i ličinki koriste se sljedeće boje i metode.

Leukobaza metilensko modrilo često se koristi za bojenje živih i mrtvih tkiva. Živa stanica ili tkivo reducira metilensko modrilo u bezbojnu leukobazu, mrtvo tkivo nema tu sposobnost pa dobiva boju.

Kriterij za stanje jajeta je bojanje embrija, ali ne i ljuske. Ta je sposobnost povezana s uvjetima pod kojima jajašce umire. U slučajevima kada vlaknasta membrana u mrtvom jajetu ne izgubi svoja polupropusna svojstva, ona neće dopustiti prolaz bojila, pa stoga mrtvi embrij neće biti obojen. Obojeni embrij uvijek ukazuje na smrt jajeta.

Za bojanje jaja okruglih crva možete koristiti metilensko plavo u otopini mliječne kiseline s kaustičnim alkalijama (0,05 g metilenskog plavog, 0,5 g natrijevog hidroksida, 15 ml mliječne kiseline). Živa jaja ne percipiraju boju; obojeni su Plava boja embriji mrtvih jajašaca. Bojanje ličinki glista baznom otopinom briljantkrezil plave boje u koncentraciji 1:10000 provodi se na sljedeći način: kap tekućine s jajima glista i kap bazne otopine boje nanese se na predmetno staklo. Preparat se prekrije pokrovnim stakalcem koje se uz lagano lupkanje disekcijskom iglom čvrsto pritisne na predmetno stakalce. Broj ličinki u nastajanju i stupanj njihove obojenosti promatraju se pod mikroskopom; nakon čega se nakon 2 - 3 sata ponovo ispituje isti lijek. Živima se smatraju samo nedeformirane ličinke koje nisu obojane 2 sata. Mrtve ličinke ili ne izlaze iz jaja, ili postaju obojene kada se ljuska pukne (djelomično ili potpuno).

Pri određivanju održivosti jajašaca ptičjih glista moguće je preparate obojiti s 5% otopina alkohola Yoda. Kada se nanese na pripravak, klice mrtvih jaja Ascaridia javljaju se unutar 1 - 3 sekunde. obojeni su narančastom bojom.

Mrtva jajašca opistorhisa i onkosfere goveđe trakavice boje se otopinom toluidin modrila (1:1000), a mrtve onkosfere goveđe trakavice otopinom briljantnog krezil modrila (1:10000). U isto vrijeme zameci i ljuske i mrtvih i živih jaja dobivaju boju. Stoga se nakon bojenja ispiru jaja i onkosfere čista voda te ih dodatno obojati safraninom (razrijeđen 1:10000 u alkoholu 10 °C). Alkohol skida boju s ljuske, a šafranin ju pocrveni. Zbog toga živa jaja postaju crvena; jaja s mrtvim embrijima postaju plava, ali ljuska ostaje crvena. Uginuli embriji onkosfera goveđe trakavice brzo se, u roku od nekoliko minuta, boje safraninom u jarko crveno ili ružičasto ili plavo s briljantnim krezil plavim u razrjeđenju 1:4000 ili indigo karminom u razrjeđenju 1:1000 - 1:2000. . Živi embriji ne mijenjaju se pod utjecajem ovih boja ni nakon 2 - 7 sati.

Za određivanje održivosti jaja patuljaste trakavice preporučuje se korištenje sljedećih boja:

1. Brilliantcreasyl blue (1:8000) - nakon 1 sata, onkosfera mrtvih jajašaca postaje posebno svijetle boje, koja se oštro ističe na blijedoj ili bezbojnoj pozadini ostatka jaja.

2. Safranin (1:8000 pri izlaganju 2 sata i 1:5000 3 - 5 sati).

3. 50% otopina pirogalne kiseline u razrjeđenju 1: 2 - kada je izložena 1 sat na temperaturi od 29 - 30 ° C (što je niža temperatura, to je duži proces bojenja).

7.7.3. Luminescentna metoda za proučavanje jaja i ličinki helminta

Fluorescentna mikroskopija omogućuje razlikovanje živih od mrtvih tijela bez oštećenja jajašca. Ne koristi se za fluorescenciju ultraljubičaste zrake, i plavo-ljubičasti dio vidljive svjetlosti, s konvencionalnim mikroskopom i stakalcima; Iluminatoru OI-18 dodan je poseban set filtara u boji.

Živa i mrtva jajašca valjkastih glista, pinworma, patuljaste trakavice, goveđe trakavice, široke trakavice i drugih helminta različito fluoresciraju. Ovaj fenomen se opaža i tijekom primarne luminescencije bez upotrebe boja i kada se boje fluorokromima (akridin narančasta, korifosfin, primulin, aurolin, berlerin sulfat, tripaflavin, rivanol, akrin itd.).

Nebojana, živa, nesegmentirana jaja valjkastih crva svijetle svijetlo zeleno sa žućkastom nijansom; u mrtvim jajima ljuska zrači zeleno svjetlo mnogo svjetlije od tamnozelenog embrionalnog dijela; U jajima valjkastih glista s ličinkom pojavljuje se samo ljuska, a u mrtvim jajima i ljuska i ličinka svijetlo su žute boje.

Nepigmentirana i nesegmentirana živa jaja pinworma i patuljaste trakavice emitiraju zelenkasto-žuto svjetlo; ljuska mrtvih jaja intenzivno svijetli na pozadini tamnozelene embrionalne mase.

Uz sekundarnu luminescenciju (kada se boji akridin narančastom u razrjeđenju 1:10 000 i 1:50 000 od 30 minuta do 2 sata), ljuska živih i mrtvih nematoda, trematoda i cestoda različito svijetli.

Ljuske živih i mrtvih jaja valjkastih crva, toksokara, pinworma, patuljaste trakavice, štakorske trakavice, bikove trakavice i trakavice obojene su narančasto-crvenom bojom. Embriji živih jajašaca valjkastih crva, toxascarisa, štakorske trakavice, široke trakavice i onkosfere goveđe trakavice fluoresciraju mutno tamnozelenom ili sivozelene boje. Mrtva embrionalna jaja ovih helminta emitiraju "goruću" narančasto-crvenu boju. Žive ličinke pinworma i toxocara (oslobođene ljuske jajeta) emitiraju mutno sivo-zeleno svjetlo; kada uginu, boja se mijenja od vrha glave do "goruće" svijetlozelene, zatim žute, narančaste i konačno svijetlonarančaste.

Kada se boje fluorokromima - korifosfilom, primulinom, mrtva jaja valjkastih glista i glista pokazuju sjaj od lila-žute do bakreno-crvene. Jaja sposobna za život ne svijetle, već su obojena u tamnozelenu boju.

Živa jaja trematoda (paragonimus i clonorchis) ne svijetle kada se boje akridin narančastom, ali mrtva jaja daju žućkasto-zelenu boju.

Metoda luminiscencije također se može koristiti za određivanje održivosti ličinki helminta. Dakle, ličinke strongylata i rhabditatusa fluorokromirane otopinom akridin narančaste (1: 2000) svijetle: žive - zelene (s nijansom), mrtve - jarko narančastom svjetlošću.

Žive miracidije koje izlaze iz ljuske emitiraju prigušeno plavičasto svjetlo s jedva primjetnim svijetložutim vjenčićem cilija, ali 10 - 15 minuta nakon smrti pojavljuju se sa jarkim "gorućim" svjetlozelenim, a zatim narančasto-crvenim svjetlom.

7.7.4. Metoda bioloških uzoraka

Na primjer, za određivanje održivosti jaja askarida (svinjske gliste, ljudske gliste, Toxocara, Toxascaris itd.) po životinji (zamorci, miševi) potrebno je najmanje 100 - 300 jaja s razvijenim ličinkama. Jajašca ascarisa u izotoničnoj otopini natrijevog klorida pipetiraju se kroz usta miša ili zamorca. Nakon 6-7 dana životinja se zakolje, otvore joj se jetra i pluća i zasebno pregledaju na prisutnost ličinki askaridata. Da biste to učinili, jetra i pluća se škarama isjeckaju na male komadiće i ispituju metodom Berman ili Supryaga (odjeljak 6.1.2).

Ako su životinje bile zaražene živim invazivnim jajima, tada se nakon autopsije migrirajuće ličinke askarida nalaze u jetri i plućima.

U slučaju infekcije, jajašca Fasciole u izmetu laboratorijskih životinja mogu se otkriti kod kunića nakon 2 mjeseca, u zamorci- nakon 50 dana, kod miševa - nakon 35 - 40 dana.

Radi bržeg dobivanja odgovora, laboratorijske životinje se nakon 20 - 30 dana otvore i pregleda jetra na prisutnost mladih fasciola.

Da bi se utvrdila održivost jaja patuljaste trakavice, preporuča se također dati njima prethodno neinficiranim bijelim miševima, nakon čega se životinje nakon 92-96 sati otvore i identificiraju cisticerkoidi u crijevnim resicama ili cestode u crijevnom lumenu.

Za određivanje održivosti jajašaca opisthorchisa preporučuje se metoda (njemački S.M., Baer S.A., 1984.), koja se temelji na fizikalno-kemijskoj aktivaciji miracidijeve žlijezde za izleganje i stimulaciji motorna aktivnost ličinke, što dovodi do otvaranja poklopca jajeta i aktivnog oslobađanja miracidija u eksperimentalnim uvjetima.

Suspenzija jaja opisthorchisa u vodi prethodno se ohladi na 10 - 12 °C (sve naredne radnje izvode se na sobnoj temperaturi 19 - 20 °C). 1 kap suspenzije koja sadrži 100 - 150 jaja dodaje se u epruvetu centrifuge. Epruveta se stavlja u stalak 5 - 10 minuta. Za to vrijeme sva jaja uspiju potonuti na dno. Zatim se višak vode pažljivo odsisa trakom filter papira i u epruvetu se dodaju 2 kapi posebnog medija. Medij je pripremljen u 0,005 M Tris-HCl puferu; u pufer se dodaje 12 - 13% otopina etanola i boja (fuksin, safranin, eozin, metilensko modrilo itd.). Epruveta se protrese, njen sadržaj se pipetira na predmetno staklo i ostavi 10 minuta uz lagano mućkanje. Zatim dodajte 2 kapi navedenog medija. Preparat je spreman za mikroskopiranje pod konvencionalnim svjetlosnim mikroskopom pri 20x povećanju.

Tijekom tog vremena otvara se poklopac održivih ličinki, a miracidij aktivno izlazi u navedeno okruženje. Zahvaljujući prisutnosti etanola u njemu, imobiliziraju se nakon 2 - 5 minuta i zatim se boje bojom. Mogu se lako detektirati i prebrojati mikroskopom.