Farba a priehľadnosť hotového média. Uránová reťazová reakcia a senzačná reťazová reakcia

119. Pandey a Nonne - Apelt reakcie

Ako činidlo na uskutočnenie Pandeyovej reakcie sa použije číra kvapalina nad usadeninou, ktorá sa získa intenzívnym pretrepaním 100 g kvapalnej kyseliny karbolovej s 1000 ml destilovanej vody. Pre sediment a číra tekutina(činidlo), táto zmes sa najskôr umiestni do termostatu na 3-4 hodiny a potom sa udržiava pri izbovej teplote počas 2-3 dní.

Položte hodinky alebo sklíčko na tmavý papier a naneste naň 2-3 kvapky činidla, potom 1 kvapku cerebrospinálnej tekutiny. Keď sa kvapka zakalí alebo sa na jej okraji objaví vláknitý zákal, reakcia sa považuje za pozitívnu.

Na uskutočnenie Nonne-Apeltovej reakcie sú potrebné čisté skúmavky, nasýtený roztok síranu amónneho, destilovaná voda a tmavý papier. Pripraví sa nasýtený roztok síranu amónneho nasledujúcim spôsobom: 0,5 g chemicky čistého neutrálneho síranu amónneho sa vloží do 1000 ml banky, potom sa naleje 100 ml destilovanej vody zohriatej na 95 °C, pretrepáva sa, kým sa soľ úplne nerozpustí, a nechá sa niekoľko dní pri izbovej teplote. Po 2-3 dňoch sa roztok prefiltruje a stanoví sa pH. Reakcia musí byť neutrálna.

0,5-1 ml výsledného roztoku sa naleje do skúmavky a pozdĺž steny skúmavky sa opatrne pridá rovnaké množstvo cerebrospinálnej tekutiny. Po 3 minútach vyhodnoťte výsledok. Vzhľad belavého krúžku naznačuje pozitívnu reakciu. Potom sa obsah skúmavky pretrepe, stupeň zákalu sa stanoví porovnaním so skúmavkou obsahujúcou destilovanú vodu. Výsledky reakcie sa vyhodnocujú na pozadí čierneho papiera.

120. Bordet-Janguova reakcia

Cenný diagnostický test pri identifikácii chronická kvapavka medzi ľuďmi s chronickými zápalové ochorenia genitourinárny systém. Podľa literatúry s správne použitie Táto metóda odhaľuje až 80% prípadov kvapavky, ktorá nie je zistená bakterioskopickou alebo bakteriologickou metódou.

Reakciu Bordet-Jangu možno vysledovať v dôsledku predchádzajúcej choroby alebo použitia gonovakcíny na diagnostické (imunobiologická metóda provokácie), ako aj na terapeutické (liečba chronických zápalových procesov genitourinárneho systému u žien podľa Baksheeva) . Preto je pred jej vykonaním potrebné starostlivo zhromaždiť anamnézu,

Reakcia môže byť aj falošne pozitívna so zavedením mlieka, použitie v liečebné účely pyrogénne.

Preto pozitívna Bordet-Janguova reakcia neslúži ako nesporný dôkaz prítomnosti gonokoková infekcia, rovnako ako negatívne nemôže byť dôkazom neprítomnosti kvapavky. Avšak pozitívne výsledky dlhodobo by mal byť nariadený lekárom, aby hľadal ohnisko gonokokovej infekcie v tele.

Ako antigén sa používa usmrtená gonokoková kultúra obsahujúca 3-4 miliardy mikrobiálnych teliesok na 1 ml. Gonokokový antigén sa zakonzervuje roztokom formaldehydu a naleje do 1-5 ml ampuliek. Neotvorené ampulky sú vhodné na 6 mesiacov, otvorené je možné skladovať 2-3 dni v sterilnej skúmavke v chladničke pri teplote 3-5°C,

Borde-Zhangova reakcia viazania komplementu sa uskutočňuje podobne ako Wassermanova reakcia (pozri č. 121). Gonokokový antigén sa zriedi izotonickým roztokom chloridu sodného podľa titra uvedeného na štítku ampulky. Reakcia sa najčastejšie uskutočňuje v objeme 2,5 ml, preto do 0,5 ml zriedeného testovacieho séra 1:5 sa do každej skúmavky pridá 0,5 ml zriedeného antigénu. Zvyšných 1,5 ml je 1 ml hemolytického systému a 0,5 ml komplementu.

Reakcia sa považuje za pozitívnu v prítomnosti rôzneho stupňa hemolýza oneskoruje v testovanom sére. Pod kontrolou (krvné sérum zdravých ľudí) pozoruje sa úplná hemolýza.

121. Wassermanova reakcia

V krvnom sére pacientov so syfilisom sú reaginy a protilátky. Reaginy majú schopnosť vstupovať do zlúčenín s kardiolipínovým antigénom. Špecifické protilátky proti Treponema pallidum sa spájajú so špecifickými antigénmi. Výsledné komplexy antigén-protilátka sú sorbované komplementom pridaným do reakcie. Indikácia sa uskutočňuje zavedením hemolytického systému (ovčie erytrocyty + hemolytické sérum).

Aby reakcia prebehla:

a) izotonický roztok chloridu sodného;

b) ultrasonifikovaný treponémový (skladovaný v chladničke pri +4 °C) a kardiolipínový (skladovaný pri izbovej teplote) antigény;

c) komplement, čo je krvné sérum získané punkciou srdca 5-10 zdravých morčiat. Možno skladovať v chladničke až 2 mesiace za predpokladu
konzervačný 4% roztok kyselina boritá a 5 % roztok síranu sodného;

d) hemolyzín - hemolytické králičie krvné sérum imunizované ovčími erytrocytmi s rôznymi titrami (skladované v chladničke pri teplote 4 °C);

e) ovčie erytrocyty získané punkciou krčná žila. Krv sa zhromaždí v sterilnej nádobe so sklenenými guľôčkami (na miešanie) a pretrepáva sa 15 minút. Fibrínové zrazeniny sa oddelia filtráciou cez sterilnú gázu. Defibrinovaná krv sa môže uchovávať v chladničke až 5 dní.

Niekedy je potrebné dlhšie skladovanie ovčej krvi, a preto sa konzervuje špeciálnym konzervačným prostriedkom (6 g glukózy, 4,5 g kyseliny boritej, 100 ml izotonického roztoku chloridu sodného), ktorý sa varí vo vodnom kúpeli 20 minút denne počas 3 dní Na 100 ml defibrinovanej ovčej krvi je potrebných 15 ml konzervačnej látky. Takto konzervovaná defibrinovaná krv sa uchováva v chladničke.

Hlavnému experimentu predchádza niekoľko etáp.

U pacienta z kubitálna žila odoberte 5-10 ml krvi a spracujte sérum. U detí je možné odobrať krv zo spánkovej žily alebo z rezu na päte. Punkcia sa vykonáva pomocou sterilných nástrojov, injekčnej striekačky a ihly
vopred premytý izotonickým roztokom chloridu sodného.

Krv na výskum sa odoberá na prázdny žalúdok; 3-4 dni pred štúdiom je pacientovi zakázané používať drogy, digitalisové prípravky, vezmite si alkohol.

Štúdia sa nemá vykonávať u pacientov s zvýšená teplota tela, po úraze, operácii, narkóze, nedávnych infekčných ochoreniach, u žien počas menštruácie, u tehotných žien (v posledných 10 dňoch tehotenstva), rodiacich žien (v prvých 10 dňoch po pôrode), ako aj u novorodencov (v prvých 10 dní života).

Získaná krv v sterilnej skúmavke sa umiestni na 15-30 minút do termostatu pri teplote 37 °C. Výsledná zrazenina sa oddelí od stien skúmavky sterilnou sklenenou tyčinkou a umiestni sa na jeden deň do chladničky. Oddelené priehľadné sérum (nad zrazeninou) sa odsaje Pasteurovou pipetou pomocou gumovej hrušky alebo sa opatrne preleje do inej sterilnej skúmavky a inaktivuje sa vo vodnom kúpeli 30 minút pri teplote 56 °C. Takto pripravené sérum na experiment je možné uchovávať v chladničke až 5-6 dní.

Antigény sa riedia podľa metódy a titra uvedeného na štítku.

Pripravte hemolytický systém. Za týmto účelom sa defibrinovaná krv alebo ovčie erytrocyty v množstve potrebnom na reakciu odstredia, plazma sa opatrne oddelí a zrazenina sa premyje 5 až 6 objemami izotonického roztoku chloridu sodného, ​​kým sa supernatant úplne neodfarbí. Zo sedimentu sa pripraví 3 % suspenzia erytrocytov v izotonickom roztoku chloridu sodného podľa trojitého titra.

Roztok hemolytického séra a suspenzia ovčích erytrocytov sa rýchlo premiešajú a umiestnia sa na 30 minút do termostatu.

Suchý komplement sa zriedi izotonickým roztokom chloridu sodného v pomere 1:10, normálne inaktivované ľudské sérum - 1:5.

Komplement sa titruje v 30 skúmavkách umiestnených v stojane s 10 skúmavkami v 3 radoch. V dvoch radoch sa titruje v prítomnosti dvoch antigénov, v treťom - izotonickým roztokom chloridu sodného. Päť skúmaviek je kontrolných: dve pre zodpovedajúce dva antigény a jedna pre kontrolu komplementu, hemolytického séra a izotonického roztoku chloridu sodného na hemotoxicitu; vyplňte ich takto:

Rúry sa umiestnia do termostatu na 45 minút, potom sa skontrolujú. Hemolýza by nemala byť v žiadnej skúmavke.

Doplnok v riedení 1:10 sa naleje do 10 skúmaviek 1. radu stojana v dávkach: 0,1, 0,16, 0,2, 0,24, 0,3, 0,36, 0,4, 0,44, 0,5 a 0,55 ml. K obsahu každej skúmavky pridajte izotonický roztok chloridu sodného do 1 ml a dôkladne premiešajte. 0,25 ml zmesi z každej skúmavky sa prenesie do zodpovedajúcich skúmaviek 2. a 3. radu. Stojan so skúmavkami sa pretrepe, do 3. radu skúmaviek sa pridá 0,5 ml hemolytického systému, opäť sa pretrepe a umiestni sa na 45 minút do termostatu pri teplote 37 °C. Do všetkých 30 skúmaviek sa naleje normálne ľudské krvné sérum zriedené izotonickým roztokom chloridu sodného v pomere 1:5, 0,25 ml.

Antigén I (treponémový ultrazvuk), zriedený v titri izotonickým roztokom chloridu sodného, ​​0,25 ml sa pridá do 10 skúmaviek 1. radu; antigén II (kardiolipín v rovnakom riedení a v rovnakom množstve) - v 10 skúmavkách 2. radu. 0,25 ml izotonického roztoku chloridu sodného sa naleje do 10 skúmaviek 3. radu, zvyšných 0,25 ml sa naleje. Po inkubácii v termostate sa do 20 skúmaviek (1. a 2. rad) pridá 0,5 ml hemolytického systému, pretrepe sa a opäť sa umiestni na 45 minút do termostatu.

Po 45 minútach sa stanoví pracovná dávka komplementu, to znamená jeho titer s prídavkom v rozmedzí 15-20%.

Za titer komplementu sa považuje minimálne množstvo, čo spôsobuje úplnú hemolýzu baraních erytrocytov v prítomnosti antigénu a normálneho ľudského krvného séra.

Hlavnou skúsenosťou je, že každé testované inaktivované sérum zriedené v pomere 1:5 izotonickým roztokom chloridu sodného sa naleje do 0,25 ml v troch skúmavkách. Do prvej skúmavky pridajte 0,25 ml antigénu I, do druhej 0,25 ml antigénu II a do tretej (kontrola) 0,25 ml izotonického roztoku chloridu sodného. Do všetkých skúmaviek pridajte 0,25 ml komplementu zriedeného na pracovnú dávku. Všetky skúmavky sa umiestnia na 45 minút do termostatu, potom sa k nim pridá 0,5 ml hemolytického systému, pretrepú sa a umiestnia sa na 45-50 minút do termostatu. Výsledok experimentu sa zaznamenáva po začiatku úplnej hemolýzy v kontrolných skúmavkách.

Výsledky reakcie sú hodnotené plusmi: úplné oneskorenie hemolýzy (silne pozitívna reakcia) ++++, významná (pozitívna reakcia) +++, čiastočná (slabo pozitívna reakcia) ++, nevýznamná (pochybná reakcia) - ±, žiadne oneskorenie hemolýzy (negatívna reakcia) - .

O kvantitatívna metóda pri Wassermannovej reakcii je skúsenosť nastavená na klesajúce objemy séra zriedeného izotonickým roztokom chloridu sodného.

Schéma na vykonanie hlavnej skúsenosti Wassermanovej reakcie

Klinický význam Wassermanovej reakcie je ťažké preceňovať. Vykonáva sa u všetkých pacientov pred začiatkom liečby, ale zvláštny význam ona má pri latentný syfilis, porážka vnútorné orgány a nervový systém.

Výsledky Wassermanovej reakcie charakterizujú kvalitu liečby, ktorá dáva dôvod na odhlásenie liečených pacientov v určitom časovom období.

Pri primárnom syfilise je Wassermanova reakcia zvyčajne pozitívna na konci 6. týždňa od okamihu infekcie; so sekundárnym čerstvým syfilisom je pozitívny v takmer 100% prípadov, so sekundárnym recidivujúcim - v 98-100%; terciárne aktívne - v 85 %; terciárne skryté - v 60% prípadov.

Wassermanova reakcia sa vykonáva dvakrát u všetkých tehotných žien, pacientov so somatickými, nervovými, duševnými a kožné ochorenia, ako aj nariadené kontingenty obyvateľstva. Zároveň by sa s pozitívnymi a slabo pozitívnymi výsledkami reakcie malo zaobchádzať kriticky, pretože môžu byť na konci tehotenstva a po pôrode s hypertyreózou, maláriou, leprou, rozpadom zhubný nádor, infekčné choroby, kolagenózy a pod.. Preto v prítomnosti klinické prejavy choroby, treba ich brať do úvahy spolu s údajmi z bakterioskopie v prvom rade.

Zároveň existujú faktory, ktoré môžu skresliť skutočnú povahu výsledkov Wassermanovej reakcie: zle umyté laboratórne sklo (stopy kyselín a zásad v skúmavkách), dlhodobé skladovanie krvi odobratej na výskum, konzumácia tukov a alkohol pacientom pred vyšetrením, menštruačným obdobím a pod.

Vo všetkých prípadoch je žiaduce vykonať komplexné vyšetrenie pacienta, zahŕňajúce okrem Wassermannovej reakcie aj RIBT (pozri 122, 123, 124) atď.

122. Reakcia Sachs - Vitebsky (cytocholik)

Používa sa na detekciu syfilisu. Je založená na tvorbe zrazeniny, keď sa krvné sérum pacienta zmieša s antigénom.

Na prípravu antigénu sa svaly niekoľkých hovädzích sŕdc očistia od šliach, fascií, tuku, pomelú sa v mlynčeku na mäso a extrahujú sa 5-násobným objemom 96 % etanolu počas 15 dní s denným 20-minútovým trepaním. Získaný extrakt sa odparí na vodnom kúpeli v porcelánovej nádobe vo vákuu. K zvyšku (svetložltá hmota lipoidov) sa pridá horúci 96% etylalkohol v množstve 1/3 objemu svalov odobratých na extrakciu.

Extrakt sa nechá 3 dni pri teplote miestnosti, prefiltruje sa (v studená voda) a pridajte 0,3-0,6% roztok kryštalického cholesterolu v závislosti od výsledkov titrácie pozitívnymi a negatívnymi sérami. Cytocholický antigén uchovávajte pri izbovej teplote v uzavretých ampulkách alebo uzavretých skúmavkách.

Metodológia. Do 2 ml izotonického roztoku chloridu sodného sa rýchlo naleje 1 ml cytocholového antigénu a nechá sa 15 minút pri teplote miestnosti, kým sa neobjavia vločky. Pridajte 0,1 ml antigénnej emulzie k 0,2 ml inaktivovaného séra, pretrepte 3 minúty a nechajte pôsobiť 30 minút, potom pridajte 1 ml izotonického roztoku chloridu sodného.

Do kontrolnej skúmavky s antigénom sa pridá 1,2 ml izotonického roztoku chloridu sodného a 0,1 ml antigénnej emulzie. V kontrole by nemali byť žiadne vločky. Výsledky reakcie sa zohľadňujú vizuálne alebo pomocou lupy a sú označené v závislosti od množstva vločiek, ktoré vypadli s plusmi (++++, +++, ++). Pri negatívnej reakcii nie sú žiadne vločky, ale obsah skúmavky môže byť mierne opaleskujúci.

V roku 1931 P. Sachs a E. Witebsky navrhli modifikáciu tejto techniky, ktorá spočíva v riedení antigénu v dvoch fázach: k 1 dielu antigénu sa pridajú 2 diely izotonického roztoku chloridu sodného a udržiava sa pri izbovej teplote 5 minút. a ďalších 9 dielov izotonického roztoku sa pridá chlorid sodný. Odporúča sa tiež riedenie antigénu 2% roztokom chloridu sodného, ​​čo podľa autorov zvyšuje citlivosť reakcie. Je možná aj kvantitatívna modifikácia reakcie riedením séra (1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64 atď.).

Reakcia je pomerne citlivá, trvá krátko (asi 1 hodinu) a jej výsledky sa odčítajú okamžite.

123. Imobilizačná reakcia bledého treponému (RIBT)

Pomocou reakcie v krvnom sére pacientov so syfilisom sa zisťujú protilátky a komplement, ktoré imobilizujú bledý treponém.

S primárnym syfilisom je RIBT prevažne negatívny, so sekundárnym pozitívnym v 92-96% prípadov, s terciárnym - v 92-100%, so syfilisom nervového systému a vrodeným - v 86-89% prípadov.

Pozitívne výsledky RIBT boli zaznamenané pri sarkoidoch, erytematóze, cukrovke, malígnych nádoroch, vírusová hepatitída, cirhóza pečene, malária, lepra, infekčná mononukleóza, niektoré choroby horúcich krajín (pinta, yaws atď.).

Antigén je suspenzia svetlého treponému odobratá zo semenníkov králika infikovaného syfilisom zavedením 0,75-1 ml suspenzie svetlého treponému v izotonickom roztoku chloridu sodného do semenníka (50 jedincov na zorné pole).

Testikulárny materiál by sa mal odobrať 6-8 dní po infekcii zvieraťa. Pred odberom antigénu je králik zabitý vykrvácaním (punkcia srdca resp krčnej tepny). Testikulárne tkanivo sa rozdrví a naplní sa zdravým králičím krvným sérom zriedeným izotonickým roztokom chloridu sodného, ​​pretrepáva sa -30 minút a potom sa 10 minút odstreďuje (1000 otáčok za minútu). Supernatant sa mikroskopicky skúma. V každom zornom poli by malo byť aspoň 10-15 bledých treponém.

Doplnok sa pripravuje obvyklým spôsobom z krvi morčiat.

Na RIBT potrebujete: 1,2 ml 0,2 % roztoku želatíny, 2,8 ml 5 % roztoku albumínu, 1,6 ml suspenzie bledého treponému; stredné pH - 7,2. K tejto zmesi sa pridá 0,15 ml komplementu (koktail). Paralelne sa vložia dve vzorky: s aktívnym (experiment) a reaktívnym (kontrola) doplnkom.

Študované sérum sa zbiera do melanžúr po značku „1“ a potom sa kokteil zbiera po značku „2“ a uzatvoria sa sterilným gumeným krúžkom.

Súčasne sa podobná reakcia uskutočňuje so zjavne pozitívnymi a zjavne negatívnymi sérami.

Melangery sa očíslujú a umiestnia sa do termostatu pri teplote 35 °C na 18-20 hodín, potom sa po pároch (experiment - kontrola) vyberú z termostatu a obsah sa naleje do príslušných skúmaviek. Na podložné sklíčko sa aplikujú 2 kvapky: vľavo - skúsenosť, vpravo - kontrola, prekryté krycím sklíčkom a mikroskopované v tmavom zornom poli.

Najprv sa študujú výsledky kontroly: určuje sa percento mobilných a imobilných bledých treponémov. Vzorec počítania: X = (A - B) / A * 100, kde A je počet mobilných bledých treponém v kontrole; B - počet mobilných bledých treponém v experimente.

Príklad: (24 - 19) / 24 * 100 = 21 %.

Odhady výsledkov RIBT: pod 20 % - negatívne. 21-30% - pochybné, 31-50% - slabo pozitívne, nad 50% - pozitívne.

Antigén, komplement a pomocný, indikátorový alebo hemolytický systém – hemolytické sérum a ovčie erytrocyty.

Ak sa v prvom systéme vytvorí špecifický komplex antigén + protilátka, potom sa komplement adsorbuje (spája sa s týmto komplexom) a v druhom systéme nedochádza k hemolýze.

Reakcia vyžaduje:

1. Testovacie sérum, ktoré sa získava z krvi odobratej punkciou loketnej žily pacienta. Po zrážaní krvi sa sérum odsaje do samostatnej skúmavky a inaktivuje sa 30 minút pri 56 °C vo vodnom kúpeli.

2. Antigén – suspenzia usmrtených gonokokov.

3. Ovčie erytrocyty sa získavajú zo sterilnej defibrinovanej krvi. Premyjú sa 3-krát odstredením s novými dávkami fyziologického roztoku. V reakcii sa používa 3% suspenzia erytrocytov.

4. Hemolytické sérum sa pripraví vopred imunizáciou králikov baraními erytrocytmi. Sérum sa pred použitím titruje.

5. Doplnok - čerstvé morčacie sérum. Krv sa zo srdca morčaťa odsaje injekčnou striekačkou, po zrážaní sa sérum oddelí. Pred experimentom sa titruje pracovná dávka komplementu. Na tento účel vezmite hlavné riedenie doplnku 1:10 a nalejte ho do skúmaviek od 0,1 do 0,5, potom sa objem v každej skúmavke upraví fyziologickým roztokom na 1,5 ml.

Zároveň sa pripravuje hemolytický systém - zriedený v trojitom titri, hemolytické sérum + 3% suspenzia ovčích erytrocytov. Obe zložky sú v rôznych objemoch a udržiavajú sa v termostate počas 30 minút (senzibilizácia zmesi), potom sa zmes pridá v 1 ml do skúmaviek a umiestni sa do termostatu na 30 minút. 2 skúmavky slúžia ako kontrola:

1. 1 ml hemolytického systému + 1,5 ml fyziologického roztoku;

2. 0,5 ml komplementu 1:10 + 0,5 ml suspenzie erytrocytov + 1,5 ml fyziologického roztoku.

Titer komplementu je minimálne množstvo, pri ktorom ešte dochádza k hemolýze. Na nastavenie reakcie sa odoberie pracovná dávka komplementu, zvýšená oproti titru o 20-25 %, t.j. zvyčajne množstvo komplementu, ktoré je v predposlednej skúmavke s hemolýzou. Zvýšenie dávky komplementu je nevyhnutné, pretože v reakcii môže byť aktivita komplementu do istej miery potlačená inými zložkami reakcie (antigén, sérum).
43) RSK Wasserman

Používa sa na diagnostiku syfilisu za účelom detekcie protilátok, ako aj na stanovenie účinnosti špecifická terapia. Je založená na princípe Borde-Gangou reakcie fixácie komplementu. Významným rozdielom vo Wassermanovej reakcii je nešpecifickosť antigénu: lipoidné extrakty z normálne orgány zvierat

Na nastavenie Wassermanovej reakcie je potrebné mať sérum pacienta, diagnostiku, skrížene reagujúce antigény č.1, č.2, komplement, hemolytické sérum, baranie erytrocyty, fyziologický roztok.

Diagnosticum č.1 - špecifické, treponém.

Diagnosticum č. 2 - nešpecifické, kardiolipínový antigén, čo sú vysoko purifikované výťažky z hovädzieho srdca, ktoré majú konštantné chemické zloženie lipoidov. Lipoidy, podľa chemické zloženie sú blízke lipoidom treponema pallidum, preto aj keď nie sú špecifické, fixujú protilátky proti spirochétám.

Tieto antigény sa vyrábajú centrálne a používajú sa v reakcii zriedené podľa titra uvedeného na štítku.

Súčasne s hlavným experimentom sa umiestnia 2 kontroly: so zjavne negatívnym a so zjavne pozitívnym sérom.

Nastavenie hlavného zážitku

Najprv sa inaktivované a zriedené testovacie sérum v pomere 1:5 naleje do 4 skúmaviek. Potom sa do 2 skúmaviek nalejú antigény (č. 1, č. 2), do 3. skúmavky sa naleje fyziologický roztok. Potom sa do všetkých skúmaviek pridá pracovná dávka komplementu. Po zmiešaní zložiek sa stojan so skúmavkami umiestni na 30 minút do termostatu pri 37 °C. Po uchovávaní v termostate sa do všetkých skúmaviek pridá hemolytický systém. Skúmavky sa opäť umiestnia do termostatu na 2 hodiny a potom sa nechajú pri teplote miestnosti. Nasledujúci deň sa zaznamená výsledok. Stupeň intenzity reakcie sa odhadne, štyri plusy (++++), tri (+++), dva (++) a jeden (+) - v závislosti od intenzity farby kvapaliny a veľkosti sedimentu erytrocytov na dne. Úplná hemolýza je označená (-) mínusom. S ostrým rozdielom medzi výsledkami s rôznymi antigénmi sa experiment opakuje s novou časťou krvi.
44) RIT-r. Imobilizácia bledého treponému.

Táto reakcia sa používa v diagnostické účely a za uznanie falošne pozitívne výsledkyštandardné sérologické reakcie, najmä s latentným syfilisom.

RIBT spočíva v tom, že v prítomnosti imobilizínov v sére pacientov so syfilisom a aktívnym komplementom strácajú svetlé treponémy svoju pohyblivosť.

RIBT je umiestnený v sterilných boxoch. Na reakcii sa zúčastňuje testované sérum, komplement a antigén.

Pri RIBT je antigén suspenziou svetlého treponému z králičích semenníkov v skoré termíny(7-8 dní po infekcii) syfilitická orchitída. Špeciálne suspenzné médium zachováva životaschopnosť bledého treponému aspoň jeden deň. Doplnok sa používa v RIBT morčatá. RIBT prebieha v anaeróbnych podmienkach. Skúmavky s prísadami sa umiestnia do mikroaerostatu, z ktorého atmosférický vzduch a vstrekne sa zmes plynov (95 dielov dusíka a 5 dielov oxid uhličitý). Mikroanaerostat so skúmavkami sa umiestni do termostatu (35 °C) na 18-20 hodín.

Súbežne s formuláciou reakcie, kontrolné štúdie s pozitívnym a negatívnym krvným sérom získaným z predchádzajúcich skúseností.

Výsledky RIBT sa vyhodnocujú po vybratí skúmaviek z termostatu (t.j. po 18-20 hodinách skúseností). Pasteurovou pipetou sa kvapka obsahu skúmavky nanesie na podložné sklíčko, ktoré sa prekryje krycím sklíčkom a skúma sa v tmavom poli mikroskopu (objektív 40, okulár 10). Pri imobilizácii až 20% bledých treponémov sa reakcia považuje za negatívnu, od 21 do 30% - pochybná, od 31 do 50% slabo pozitívna, od 51 do 100% - pozitívna. Percento imobilizácie bledého treponému sa určuje podľa špeciálnej tabuľky.

45) Opson-fagocytárna reakcia

Mechanizmus: zvýšená fagocytóza mikrobiálnych buniek pod vplyvom priateľských účinkov protilátok, imunitného séra a komplementu.

Zložky reakcie:

1) antigén - denná mikrobiálna kultúra;

3) doplnok - čerstvé sérum z morčiat;

4) fagocyty - suspenzia leukocytov.

Opsoníny sú protilátky nachádzajúce sa v normálnych a imunitných sérach a pripravujú mikróby na fagocytózu.

Reakcia sa umiestni do špeciálnych skúmaviek pri t=37° minút. Potom sa z každej skúmavky pripravia nátery, spočíta sa 100 fagocytov a stanoví sa počet fagocytovaných mikrokontrol.

Opsonický index = fagocytárny index. sérový/fagocytový index normálneho séra

Čím vyšší je opsonický index (mal by byť >1) skúmaného séra, a teda tým vyšší! brucelóza).

Používa sa na stanovenie opsonínov – protilátok stimulujúcich fagocytárnu aktivitu leukocytov, t.j. sérodiagnostika infekcií, ako je brucelóza.

Zosilnenie fagocytózy nastáva v dôsledku pripojenia opsonínov s aktívnymi centrami (Pav-fragment) na bakteriálne determinanty a potom pomocou Pc-fragmentov na Pc-receptory fagocytov. Normálne sérum obsahuje malé množstvá opsonínov, ktoré pôsobia v prítomnosti komplementu. V imunitnom sére je viac opsonínov a ich aktivita je menej závislá od komplementu.

Komponenty:

Študované sérum

normálne sérum

Denná mikrobiálna kultúra (napríklad stafylokoková)

Fagocyty - suspenzia neutrofilov

Inkubácia pri 37 °C počas 30 minút. Z každej skúmavky sa pripravia nátery zafarbené podľa Romanovského-Giemsa a pod mikroskopom sa spočíta počet mikróbov v 100 a viacerých neugrofiloch, t.j. určiť fagocytárny index.

Fagocytárny index - počet mikróbov absorbovaných jedným neutrofilom.

Opsonický index fagocytárny index imunitného (testovaného) séra / fagocytový index normálneho séra.

Čím vyšší je opsonický index (mal by byť > 1), tým vyššia je imunita.

Opsono-fagocytárny index je digitálny indikátor = počet fagocytov x skóre fagocytózy (v závislosti od počtu požitých mikróbov). Maximálne skóre je -75.

46) RN na myšiach, aby sa stanovil exotoxín

Táto reakcia je založená na schopnosti špecifického antitoxického séra neutralizovať exotoxín.

Protilátky imunitného séra sú schopné neutralizovať škodlivý účinok mikróbov alebo ich toxínov na citlivé bunky a tkanivá, čo je spojené s blokádou mikrobiálnych antigénov protilátkami, t.j. ich neutralizáciou.

Neutralizačná reakcia (RN) sa uskutočňuje zavedením zmesi antigén-protilátka do zvierat alebo do citlivých testovacích objektov (bunková kultúra, embryá). Pri absencii škodlivého účinku mikroorganizmov alebo ich antigénov, toxínov u zvierat a testovaných predmetov hovoria o neutralizačnom účinku imunitného séra, a teda o špecifickosti interakcie komplexu antigén-protilátka.

Na uskutočnenie reakcie sa zmieša s testovaným materiálom, v ktorom sa očakáva prítomnosť exotoxínu antitoxické sérum uchovávané v termostate a podávané zvieratám (morčatám, myšiam). Kontrolným zvieratám sa injikuje filtrát testovaného materiálu, ktorým sa nelieči sérum. V prípade, že dôjde k neutralizácii exotoxínu antitoxickým sérom, zvieratá experimentálnej skupiny zostanú nažive. Kontrolné zvieratá uhynú v dôsledku pôsobenia exotoxínu.

Neutralizačná reakcia exotoxínu nastáva, keď interaguje s antitoxickým sérom (protilátky-antitoxíny). V dôsledku tvorby komplexu antigén-protilátka stráca toxín svoje toxické vlastnosti.

Neutralizačná reakcia sa uskutočňuje za účelom detekcie a titrácie toxínov, toxoidu alebo antitoxínov.

Toxíny sa získavajú filtráciou kvapaliny rastové médium alebo testovaný materiál, kde sa množili toxigénne baktérie. Pri spracovaní s formalínom počas 30-45 dní pri teplote 37°C sa toxín zmení na anatoxín, ktorý sa používa na imunizáciu zvierat za účelom získania antitoxického séra.

Neutralizačná reakcia in vivo. Na určenie typu toxínu sa zmieša s diagnostickým antitoxickým sérom a táto zmes sa podáva bielym myšiam. Keď je toxín neutralizovaný antitoxickým sérom, myši nezomrú.

Neutralizačná reakcia sa používa na stanovenie antitoxickej imunity u detí s diftériou (Schickov test) a šarlach (Dickov test). Na tento účel sa do oblasti predlaktia intradermálne vstrekne určité množstvo zodpovedajúceho toxínu (1/40 DLM). Ak sú v tele antitoxíny, toxín bude neutralizovaný a reakcia bude negatívna. Pri nedostatku antitoxínov v tele, zápalová odpoveď v mieste vpichu.
47) RN (neutralizačná reakcia) na myšiach na identifikáciu vírusu kliešťová encefalitída

Vírus TBE je patogénny pre množstvo laboratórnych a voľne žijúcich zvierat. Najcitlivejšie sú novorodenci a mladé biele myši. Po infekcii v mozgu, intraperitoneálne, intramuskulárne, sa u týchto zvierat rozvinie encefalitída, ktorá končí smrťou zvierat. Z hospodárskych zvierat sú na vírus TBE najcitlivejšie kozy, menej vnímavé sú ovce a kravy a slabo vnímavé sú kone. Vírus TBE má cytopatogénny účinok (CPE), spôsobuje cytopatické zmeny v primárnych a transplantovaných kultúrach buniek embryonálnych obličiek ošípaných (SPEV a RPE) av mnohých ďalších sa množí bez výrazného CPE. bunkových kultúr. V mozgu infikovaných myší a kultúrnej tekutine infikovaných kultúr sa hromadí vírus TBE a špecifické vírusové antigény: fixácia komplementu, hemaglutinácia, precipitácia atď.

vírus TBE dlho konzervované pri nízkych teplotách ( optimálny režim-60 stupňov C a menej), dobre znáša lyofilizáciu, v sušenom stave zostáva dlhé roky, ale pri izbovej teplote sa rýchlo inaktivuje. Var ju zabije po 2 minútach a v horúcom mlieku pri 60 stupňoch. C zomrie po 20 minútach.

Inaktivačne pôsobí aj formalín, fenol, alkohol a iné dezinfekčné prostriedky, ultrafialové žiarenie.

Neutralizačná reakcia je založená na schopnosti špecifických imunitných sér uhasiť infekčný účinok vírusov. Aplikuje sa v dvoch smeroch:

1) na typizáciu izolovaných vírusov;

2) na titráciu protilátok v sére zotavených pacientov.

Nastavenie reakcie:

1. Na laboratórnych zvieratách. Kritériá na prítomnosť vírusu

je smrť laboratórnych zvierat. Vypočíta sa LD50

Maximálne riedenie vírusovej suspenzie, ktoré

spôsobila smrť 50 % infikovaných zvierat. Pre

vykonáva sa identifikácia vírusu kliešťovej encefalitídy

intracerebrálna infekcia bielych myší.

2. V tkanivových kultúrach. Prebieha účtovanie výsledkov

Cytopatickým účinkom (CPE)

Metódou testu farby založenou na zmene farby

Hemadsorpciou.

3. V kuracom embryu. Účtovanie výsledkov sa vykonáva podľa

objavenie sa pockmarkov pozdĺž chorioalantoickej membrány.

48) RTGA

Táto reakcia sa používa vo virologickej praxi:

Na určenie typu vírusu (na skle);

Na detekciu v sére pacientov (nasadené).

Pri nastavení približnej hemaglutinačnej inhibičnej reakcie sa na sklo aplikuje 1 kvapka typovo špecifického imunitného séra, potom sa pridá 1 kvapka testovaného materiálu a 1 kvapka 5 % suspenzie erytrocytov.

Zohľadnenie výsledkov: typ vírusu je určený sérom, s ktorým sa reakcia nevyskytla, pretože imunitné sérum špecifické pre izolovaný vírus potláča jeho hemaglutinačný účinok a erytrocyty neaglutinujú.
49) RIF

Ako etiketa sa používajú svietivé fluorochrómové farbivá (fluorisceín izotiokyanát atď.).

Existujú rôzne modifikácie RIF. Na expresnú diagnostiku infekčných chorôb - na detekciu mikróbov alebo ich antigénov v testovanom materiáli sa používa RIF podľa Koonsa.

Existujú dve metódy RIF podľa Koonsa: priame a nepriame.

Priame komponenty RIF:

1) skúmaný materiál (črevný pohyb oddelený nosohltanom atď.);

2) označené špecifické imunitné sérum obsahujúce AT-la na požadovaný antigén;

3) izotonický roztok chloridu sodného.

Rozter z testovaného materiálu sa ošetrí značeným antisérom.

Dochádza k AG-AT reakcii. Luminiscenčné mikroskopické vyšetrenie v oblasti lokalizácie AG-AT komplexov odhalí fluorescenciu – luminiscenciu.

Nepriame komponenty RIF:

1) študovaný materiál;

2) špecifické antisérum;

3) antiglobulínové sérum (AT-la proti imunoglobulínu) označené fluorochrómom;

4) Izotonický roztok chloridu sodného.

Náter z testovaného materiálu sa najskôr ošetrí imunitným sérom na požadovaný antigén a potom značeným antiglobulínovým sérom.

Svetelné komplexy AG-AT - značené AT sa detegujú pomocou fluorescenčného mikroskopu.

Výhodou nepriamej metódy je, že nie je potrebné pripravovať široké spektrum fluorescenčných špecifických sér a používa sa iba jedno fluorescenčné antiglobulínové sérum.

Izoluje sa aj 4-zložková odroda nepriameho RIF, keď sa dodatočne zavedie komplement (sérum z morčiat). Pri pozitívnej reakcii vzniká AG-AT komplex - označený - AT-komplement.

Reakcia sa týka sérologické reakcie zahŕňajúce značené antigény alebo protilátky.

Vykonáva sa priamymi a nepriamymi metódami.

O priama metóda detekovať antigén v materiáli od pacienta. Používa sa diagnostické fluorescenčné sérum, ktoré obsahuje imunoglobulíny izolované z imunitných sér a značené fluorochrómmi.

Špecifický antigén sa nachádza vo forme jasne zelených luminiscenčných konglomerátov a pozadie prípravku sa zmení na oranžovo-červené.

Zložky priamej imunofluorescenčnej reakcie:

1) študovaný materiál;

2) špecifické luminiscenčné sérum;

3) luminiscenčný mikroskop.

Pri diagnostike chrípky sa diferenciácia uskutočňuje od patogénov parainfluenzy a adenovírusová infekcia. Výter z nazofaryngu sa ošetrí fluorescenčným chrípkovým sérom alebo chrípkovým imunoglobulínom.

"+" výsledok vo forme zelenej žiary sa získa po 3 hodinách.

Pri nepriamej metóde sa zisťujú a titrujú špecifické protilátky. Sérový titer je jeho maximálne riedenie, pri ktorom je fluorescencia zaznamenaná na "+ +".

Zložky nepriamej imunofluorescenčnej reakcie

Ak chcete vyhľadať antigén v expresnej diagnostike:

1) testovaný materiál (antigén);

2) špecifické sérum;

3) antiglobulínové luminiscenčné sérum

4) luminiscenčný mikroskop.

/ špecifické pre fázu

Sérové ​​protilátky sa adsorbujú na antigén.

// nešpecifická fáza

Používa sa antiglobulínové sérum značené fluorochrómom. Vzniká komplex antigén + protilátka (I) + antiglobulínové sérum (II), ktoré žiari.