Sérologické reakcie. Zrážacia reakcia

Tento článok sa zameria na fenomén precipitačnej reakcie. Tu sa pozrieme na črty tohto fenoménu, fenomén difúzie, všeobecné charakteristiky, úlohu v ľudskom živote a oveľa viac.

Úvod do fenoménu

Precipitácia je fenomén sérologického typu, počas ktorého interagujú rozpustné antigény s protilátkami a v dôsledku toho vzniká zrazenina.
Všeobecnou charakteristikou precipitačnej reakcie je forma spoločného vplyvu antigénu a protilátky. Tieto typy interakcií umožňujú určiť prítomnosť neznámych antigénov v testovanej látke pridaním známych protilátok a antigénov. Proces zrážania bez prítomnosti solí bude prebiehať horšie a najlepšie optimum leží v rozmedzí 7,0-7,4 pH.

Zložky reakcie

Medzi zložkami zrážacej reakcie sa rozlišujú tri hlavné prvky:

1. Antigén, ktorý má molekulárnu povahu. Je v jemne rozomletom stave, inými slovami, je rozpustný. A tiež sa takýto antigén nazýva precipitogén, čo je lyzát alebo extrakt tkaniva atď. Precipitogén má charakteristický rozdiel od aglutinogénu, ktorý spočíva vo veľkosti častíc, z ktorých pozostáva. Aglutinogén má vlastnú veľkosť bunky, zatiaľ čo precipitogény sú úmerné veľkosti molekuly. Roztok antigénu sa vyznačuje priehľadnosťou.
2. Protilátka nachádzajúca sa v ľudskom krvnom sére, ako aj v imunitnom diagnostickom sére, ktoré obsahuje študované protilátky.
3. Elektrolyty sú roztok chloridu sodného, ​​ktorý sa vyznačuje izotonickým stavom.

Získanie precipitogénu

Precipitačná reakcia nie je možná bez precipitogénu, ktorý sa získa mletím materiálov a extrakciou proteínových antigénov z nich. Extrakcia prebieha varením alebo inými metódami.
Pozoruhodným príkladom precipitogénov sú lyzáty, ako aj tkanivové a orgánové extrakty, krvné sérum, rôzne typy filtrátov na báze bujónových kultúr mikróbov, ako aj soľné extrakty mikroorganizmov a autolyzátové látky.

Staging v zrážkach

Teraz sa pozrime na spôsob nastavenia zrážacej reakcie.
Uskutoční sa kruhová precipitačná reakcia, ktorá sa vyskytuje v špeciálne pripravených skúmavkách. Sérum sa zavedie do dutiny misky a naleje sa pozdĺž steny pomocou nosa pipety. Potom sa na vrch opatrne navrství príslušné množstvo precipitogénu a potom sa skúmavka z vodorovnej polohy uvedie do zvislej polohy. Nastavenie a zohľadnenie precipitačnej reakcie je veľmi dôsledná operácia. Výsledok sa berie do úvahy po objavení sa bieleho krúžku na hranici medzi antigénom a protilátkou. Ak si reagujúce prvky reakcie navzájom zodpovedajú, komunikujú, ale to sa prejaví po dlhom čase ich interakcie.
Precipitačná reakcia sa tiež uskutočňuje v Petriho miske alebo na podložnom sklíčku, kde sa prenesie agarový gél a nanesie sa v malej vrstve. Po vytvrdnutí sa v géli vyreže malý počet jamiek, do ktorých sa umiestnia antigény a protilátky. Existujú dva spôsoby vykonania tejto akcie: metóda radiálnej imunodifúzie a dvojitej imunodifúzie.

Všeobecné informácie

Mechanika zrážania je podobná aglutinačnému zariadeniu. Pri vystavení vplyvu séra imunitného typu ho už zreagovaný antigén znižuje Dôležitou podmienkou je transparentnosť séra aj antigénu.
Registrácia reakcie sa môže zlepšiť vrstvením antigénov na protilátky. V dôsledku toho je možné pozorovať vzhľad prstencových precipitátov. Tento jav sa nazýva prstencové zrážanie a uskutočňuje sa v špeciálnych rúrkach s priemerom 2,5 až 3,5 mm. Jedným z najrozšírenejších príkladov precipitačnej reakcie je diagnóza antraxu.
Precipitácia umožňuje určiť úroveň toxigenity difterickej kultúry v agare.
Počas uvažovanej reakcie dochádza k precipitácii antigénnych komplexov a protilátok. Precipitácia je imunologický jav, ktorý umožňuje určiť množstvo obsahu protilátok v krvnom sére chorých alebo očkovaných ľudí a zvierat.

Dôsledok titrácie

Je dôležité vedieť, že údaje získané titráciou vyššie uvedenej metódy nie sú kvantitatívne. Na vytvorenie a analýzu kvantitatívneho odhadu obsiahnutého počtu protilátok vyvinuli M. Heidelberger a E. Kabat špeciálnu reakčnú techniku, ktorá je založená na hľadaní a identifikácii zóny ekvivalencie. Zmiešanie vekovo špecifického počtu antigénov s konštantným objemom antiséra vedie k zvýšeniu pôvodne vytvoreného precipitátu a následne k jeho opätovnému zníženiu v dôsledku zvýšenia schopnosti rozpúšťať komplexy antigénov. Stanovením množstva protilátok v supernatantoch obsiahnutých v každej skúmavke môžete zistiť, že v určitom počte misiek s protilátkami nebude žiadna tekutina. Tu sa v porovnaní s inými skúmavkami vytvorí najväčšia zrazenina. Vďaka tomu a odčítaniu precipitátu antigénneho proteínu od celkovej hodnoty proteínov je možné získať presnú hodnotu protilátok obsiahnutých v objeme špecificky študovaného séra. Ďalej sa množstvo proteínových molekúl v precipitáte stanoví množstvom dusíka alebo použitím kolorimetrických metód.

Odhad hodnôt

Hodnotenie hodnôt precipitácie v diagnostickej metodike musí brať do úvahy pravdepodobnosť prítomnosti protilátky, ktorá nemá vlastnosť precipitínu, v imunitnom sére, čo znamená, že samotná zrazenina sa po reakcii s antigénmi nemusí tvoriť. Zoznam takýchto molekúl zahŕňa parciálne protilátky a niektoré druhy zo skupiny gama A-globulínov.

Precipitačná reakcia v laboratórnych podmienkach nachádza uplatnenie v rôznych typoch modifikácií. Napríklad termoprecipitačná reakcia sa používa na detekciu bakteriálnych antigénov botulizmu, antraxu atď., ktoré nepodliehajú tepelnej denaturácii. Na rozdiel od kruhového zrážania tento typ reakcie využíva filtráty príslušného materiálu vo varenom stave.
Zrážanie v komplexnej zmesi neumožňuje charakterizovať vlastnosti jednotlivých prvkov zmesi. V takýchto prípadoch sa človek uchýli k metóde zrážania v agare a používa aj imunoelektroferézu.

Difúzne zrážky

V tejto oblasti výskumu existuje koncept difúznej precipitačnej reakcie (DPR). Je založená na schopnosti protilátok a rozpustných antigénov difundovať v géli. Difúzia je schopnosť molekuly určitej látky prenikať do molekúl inej, čo je spôsobené tepelným pohybom.
Gél je systém dispergovaného typu, v ktorom je kvapalná fáza distribuovaná rovnomerne v pevnej fáze. Najčastejšie sa na túto reakciu používa agarový gél.
Po zadaní parametrov, pri ktorých môžu molekuly navzájom difundovať, bude ich stretnutie sprevádzané tvorbou komplexu antigén + protilátka. Takýto novotvar môže v samotnom géli difundovať a vyzrážať sa vo forme prúžku, ktorý sa dá zistiť voľným okom. Ak sú antigén a protilátka homológne, pás sa nevytvorí.
Vytvorenie podmienok, za ktorých bude difúzia prebiehať v agarovej vrstve, zahŕňa naliatie zložiek, ale celkový počet jamiek a ich relatívna poloha je určená typom problému, ktorý je potrebné vyriešiť. RPD dáva osobe schopnosť detekovať a identifikovať neznáme izolované vírusy testovaním pomocou známeho protilátkového séra.

Aplikácia

Zrážky majú široké využitie nielen v diagnostike chorôb, ale svoje uplatnenie nachádzajú aj v súdnom lekárstve. Je ťažké si predstaviť analýzu, v ktorej je možné určiť druh krvi, časť orgánu alebo tkaniva nájdené na zločineckej zbrani, ktorá nevyužíva zrážaciu reakciu. Pri tomto procese sa používajú zrážacie séra, ktoré sa získavajú imunizáciou rôznych zvierat a vtákov. Je dôležité, aby hladina titra v sére bola aspoň 1:10 000 a musí mať aj dostatočnú špecifickosť. Z zistenej krvnej škvrny alebo jej kôry sa urobí extrakt na fyzikálne vyšetrenie. roztoku, ktorý bude následne vystavený vyzrážaniu séra. Pomocou tejto reakcie je možné určiť typy tkanivových a orgánových proteínov ľudí aj zvierat. Získanie zakalených extraktov núti človeka uchýliť sa k vyzrážaniu na agare.

závery

Analýzou informácií, ktoré sme si prečítali, môžeme dospieť k záveru, že precipitačné reakcie sú pre človeka mimoriadne dôležité, pretože umožňujú diagnostikovať rôzne antigény pomocou protilátok; tento jav je tiež široko používaný v súdnom lekárstve a umožňuje identifikovať typ krvi, tkaniva alebo orgán vo vzťahu ku konkrétnemu predmetu. Existuje niekoľko typov a metód zrážok, ktoré sa používajú v súlade s vznikajúcimi potrebami riešeného problému.

Precipitačná reakcia (RP) je tvorba a precipitácia komplexu rozpustného molekulárneho antigénu s protilátkami vo forme oblaku nazývaného precipitát. Vzniká zmiešaním antigénov a protilátok v ekvivalentných množstvách; nadbytok jedného z nich znižuje úroveň tvorby imunitných komplexov.

RP sa umiestňuje do skúmaviek (krúžková precipitačná reakcia), do gélov, živných médií atď. Rozšírené sú odrody RP v polotekutom agare alebo agarózovom géli: dvojitá imunodifúzia podľa Ouchterlonyho, radiálna imunodifúzia, imunoelektroforéza atď.

Mechanizmus. Vykonáva sa s transparentnými koloidnými rozpustnými antigénmi extrahovanými z patologického materiálu, predmetov prostredia alebo čistých bakteriálnych kultúr. Reakcia využíva číre diagnostické precipitačné séra s vysokými titrami protilátok. Za titer precipitujúceho séra sa považuje najvyššie riedenie antigénu, ktoré pri interakcii s imunitným sérom spôsobuje tvorbu viditeľnej zrazeniny – zákal.

Kruhová precipitačná reakcia sa uskutočňuje v úzkych skúmavkách (priemer 0,5 cm), do ktorých sa pridá 0,2 až 0,3 ml precipitačného séra. Potom sa pomocou Pasteurovej pipety pomaly navrství 0,1 až 0,2 ml roztoku antigénu. Skúmavky sa opatrne prenesú do zvislej polohy Reakcia sa zaznamená po 1-2 minútach V prípade pozitívnej reakcie sa na hranici medzi sérom a testovaným antigénom objaví zrazenina vo forme bieleho krúžku. kontrolných skúmaviek sa nevytvorí žiadna zrazenina.

15. Reakcia zahŕňajúca komplement: hemolytická reakcia, reakcia fixácie komplementu. Mechanizmus, komponenty, aplikácia.

Reakcia fixácie komplementu (CFR) spočíva v tom, že keď si antigény a protilátky navzájom zodpovedajú, vytvoria imunitný komplex, ku ktorému je prostredníctvom Fc fragmentu protilátok pripojený komplement (C), t.j. komplement je naviazaný komplexom antigén-protilátka. Ak sa nevytvorí komplex antigén-protilátka, komplement zostáva voľný.

Špecifická interakcia AG a AT je sprevádzaná adsorpciou (väzbou) komplementu. Keďže proces fixácie komplementu nie je vizuálne zrejmý, J. Bordet a O. Zhang navrhli použiť hemolytický systém (ovčie červené krvinky + hemolytické sérum) ako indikátor, ktorý ukazuje, či je komplement fixovaný

AG-AT komplex. Ak si AG a AT navzájom zodpovedajú, teda vznikol imunitný komplex, potom je komplement viazaný týmto komplexom a nedochádza k hemolýze. Ak AT nezodpovedá AG, potom sa komplex nevytvorí a komplement, ktorý zostane voľný, sa spojí s druhým systémom a spôsobí hemolýzu.

Komponenty. Reakcia fixácie komplementu (CFR) je komplexná sérologická reakcia. Na jeho uskutočnenie je potrebných 5 zložiek, a to: AG, AT a komplement (prvý systém), ovčie erytrocyty a hemolytické sérum (druhý systém).

Antigénom pre CSC môžu byť kultúry rôznych usmrtených mikroorganizmov, ich lyzáty, zložky baktérií, patologicky zmenené a normálne orgány, tkanivové lipidy, vírusy a materiály obsahujúce vírusy.

Ako doplnok sa používa čerstvé alebo sušené morčacie sérum.

Mechanizmus. RSK sa uskutočňuje v dvoch fázach: 1. fáza - inkubácia zmesi obsahujúcej tri zložky antigén + protilátka + komplement; 2. fáza (indikátor) - detekcia voľného komplementu v zmesi pridaním hemolytického systému pozostávajúceho z ovčích erytrocytov a hemolytického séra obsahujúceho protilátky proti nim. V 1. fáze reakcie, keď sa tvorí komplex antigén-protilátka, sa viaže komplement a následne v 2. fáze nedôjde k hemolýze erytrocytov senzibilizovaných protilátkami; reakcia je pozitívna. Ak sa antigén a protilátka nezhodujú (v testovanej vzorke nie je antigén alebo protilátka), komplement zostáva voľný a v 2. fáze sa spojí s komplexom erytrocyt - antierytrocytová protilátka, čo spôsobí hemolýzu; negatívna reakcia.Aplikácia. RSC sa používa na diagnostiku mnohých infekčných chorôb, najmä syfilisu (Wassermannova reakcia)

Imunodiagnostické reakcie. Reakcie antigén-protilátka a reakcie s označenými zložkami. Použitie na identifikáciu mikroorganizmov a diagnostiku infekčných chorôb.

Imunitné reakcie sa využívajú v diagnostických a imunologických štúdiách u chorých a zdravých ľudí. Na tento účel používajú sérologické metódy(z lat. sérum - srvátka a logá - náuka), t. j. metódy na štúdium protilátok a antigénov pomocou reakcií antigén-protilátka stanovených v krvnom sére a iných tekutinách, ako aj v telesných tkanivách.

Detekcia protilátok proti patogénnym antigénom v krvnom sére pacienta umožňuje stanoviť diagnózu ochorenia. Sérologické štúdie sa používajú aj na identifikáciu mikrobiálnych antigénov, rôznych biologicky aktívnych látok, krvných skupín, tkanivových a nádorových antigénov, imunitných komplexov, bunkových receptorov atď.

Pri izolácii mikróbu od pacienta sa patogén identifikuje štúdiom jeho antigénnych vlastností pomocou imunodiagnostických sér, teda krvných sér hyperimunizovaných zvierat obsahujúcich špecifické protilátky. Ide o tzv sérologická identifikácia mikroorganizmy.

V mikrobiológii a imunológii sú široko používané aglutinačné, precipitačné, neutralizačné reakcie, reakcie zahŕňajúce komplement, s použitím značených protilátok a antigénov (rádioimunologické, enzýmové imunostanovenie, imunofluorescenčné metódy). Uvedené reakcie sa líšia zaznamenaným účinkom a technikou výroby, všetky sú však základné. sú založené na reakcii interakcie antigénu s protilátkou a používajú sa na detekciu protilátok aj antigénov. Imunitné reakcie sa vyznačujú vysokou citlivosťou a špecifickosťou.

Nižšie sú uvedené princípy a schémy hlavných imunodiagnostických reakcií. Podrobná technika nastavenia reakcií je uvedená v. praktické pokyny pre imunodiagnostiku.

Aglutinačná reakcia - RA(z lat. agluti- národa- adhézia) je jednoduchá reakcia, pri ktorej protilátky viažu korpuskulárne antigény (baktérie, erytrocyty alebo iné bunky, nerozpustné častice s adsorbovanými antigénmi, ako aj makromolekulové agregáty). Vyskytuje sa v prítomnosti elektrolytov, napríklad keď sa pridá izotonický roztok chloridu sodného.

Používajú sa rôzne možnosti aglutinačnej reakcie: extenzívna, indikatívna, nepriama atď. Aglutinačná reakcia sa prejavuje tvorbou vločiek alebo sedimentu

RA sa používa na:

stanovenie protilátok v krvnom sére pacientov, napríklad s brucelózou (Wright, Heddelsonova reakcia), týfusom a paratýfusom (Vidalova reakcia) a inými infekčnými chorobami;

stanovenie patogénu izolovaného od pacienta;

stanovenie krvných skupín pomocou monoklonálnych protilátok proti aloantigénom erytrocytov.

Na stanovenie protilátok u pacienta daťpodrobná aglutinačná reakcia: pridať do riedenia pacientovho krvného séra diagnosticum(suspenzia usmrtených mikróbov) a po niekoľkých hodinách inkubácie pri 37 °C sa zaznamená najvyššie riedenie séra (sérový titer), pri ktorom došlo k aglutinácii, t.j. vytvoreniu zrazeniny.

Povaha a rýchlosť aglutinácie závisí od typu antigénu a protilátok. Príkladom sú zvláštnosti interakcie diagnostika (O- a R-antigénov) so špecifickými protilátkami. Aglutinačná reakcia s O-diagnostika(baktérie usmrtené teplom, udržiavanie tepelne stabilné O-antigén) vyskytuje sa vo forme jemnozrnnej aglutinácie. Aglutinačná reakcia s H-diagnosticum (baktérie usmrtené formaldehydom, zadržiavajúce termolabilný bičíkový H-antigén) je hrubá a prebieha rýchlejšie.

Ak je potrebné určiť patogén izolovaný od pacienta, dajte indikatívna aglutinačná reakcia, pomocou diagnostických protilátok (aglutinačné sérum), t.j. vykonáva sa sérotypizácia patogénu. Indikatívna reakcia sa uskutočňuje na podložnom sklíčku. Čistá kultúra patogénu izolovaná od pacienta sa pridá do kvapky diagnostického aglutinačného séra v riedení 1:10 alebo 1:20. V blízkosti je umiestnená kontrola: namiesto séra sa aplikuje kvapka roztoku chloridu sodného. Keď sa v kvapke obsahujúcej sérum a mikróby objaví vločkovitý sediment, a rozsiahla aglutinačná reakcia v skúmavkách so zvyšujúcim sa riedením aglutinačného séra, do ktorého sa pridajú 2-3 kvapky suspenzie patogénu. Aglutinácia sa berie do úvahy podľa množstva sedimentu a stupňa čírosti kvapaliny. Reakcia sa považuje za pozitívnu, ak sa aglutinácia pozoruje v zriedení blízkom titru diagnostického séra. Súčasne sa berú do úvahy kontroly: sérum zriedené izotonickým roztokom chloridu sodného by malo byť priehľadné, suspenzia mikróbov v tom istom roztoku by mala byť rovnomerne zakalená, bez sedimentu.

Rôzne príbuzné baktérie môžu byť aglutinované rovnakým diagnostickým aglutinačným sérom, čo sťažuje ich identifikáciu. Preto používajú adsorbované aglutinačné séra, z ktorých boli skrížene reagujúce protilátky odstránené adsorpciou na príbuzné baktérie. Takéto séra si zachovávajú protilátky, ktoré sú špecifické len pre danú baktériu. Produkciu špeciálnych monoreceptorových diagnostických aglutinačných sér navrhol A. Castellani (1902).

Nepriama (pasívna) hemaglutinačná reakcia (RNGA, RPGA) je založený na použití erytrocytov s antigénmi alebo protilátkami adsorbovanými na ich povrchu, ktorých interakcia s príslušnými protilátkami alebo antigénmi krvného séra spôsobuje zlepenie erytrocytov a ich vypadávanie na dno testu. trubica alebo bunka V vo forme vrúbkovaného sedimentu (obr. 13.2). V prípade negatívnej reakcie sa červené krvinky ■ usadia vo forme „gombíka“. Typicky sa protilátky detegujú v RNGA pomocou antigénneho diagnostického erytrocytu, ktorým sú erytrocyty s adsorbovanými na s antigénmi. Niekedy sa používa protilátková diagnostika erytrocytov, na ktorých sa adsorbujú protilátky. Napríklad botulotoxín sa dá zistiť tak, že sa k nemu pridá protilátka erytrocytov botulotoxín (táto reakcia sa nazýva tzv. reverzná nepriama hemaglutinačná reakcia- RONG). RNGA sa používa na diagnostiku infekčných ochorení a stanovenie gonadotropného hormónu V moču pri určovaní tehotenstva, na zistenie precitlivenosti na lieky, hormóny av niektorých ďalších prípadoch.

Koaglutinačná reakcia . Bunky patogénu sa určujú pomocou stafylokokov vopred ošetrených imunodiagnostickým sérom. Stafylokoky obsahujúce bielkoviny A, majúci afinitu k Fc - fragment imunoglobulínov, nešpecificky adsorbujúce antimikrobiálne protilátky, ktoré následne interagujú s aktívnymi centrami so zodpovedajúcimi mikróbmi izolovanými od pacientov. V dôsledku koagulácie sa vytvárajú vločky pozostávajúce zo stafylokokov, diagnostických sérových protilátok a detekovaného mikróbu.

Reakcia inhibície hemaglutinácie (RTGA) je založená na blokáde, supresii vírusových antigénov imunitnými sérovými protilátkami, v dôsledku čoho vírusy strácajú schopnosť aglutinovať červené krvinky (obr. 13.3). RTGA sa používa na diagnostiku mnohých vírusových ochorení, ktorých pôvodcovia (vírusy chrípky, osýpky, rubeola, kliešťová encefalitída atď.) môžu aglutinovať červené krvinky rôznych zvierat.

Aglutinačná reakcia na stanovenie krvných skupín používa sa na vytvorenie systému ABO (pozri časť 10.1.4.1) pomocou aglutinácie červených krviniek s protilátkami imunitného séra proti antigénom krvných skupín A (II), B (III). Kontrolou je: sérum, ktoré neobsahuje protilátky, teda sérum AB (GU) krvné skupiny; antigény obsiahnuté v červených krvinkách skupín A (II), B (III). Negatívna kontrola neobsahuje antigény, t.j. používajú sa erytrocyty skupiny 0 (I).

IN aglutinačné reakcie na stanovenie Rh faktora(pozri časť 10.1.4.1) použite anti-Rhesus séra (najmenej dve rôzne série). Ak sa na membráne skúmaných erytrocytov nachádza Rh antigén, dochádza k aglutinácii týchto buniek. Ako kontrola slúžia štandardné Rh-pozitívne a Rh-negatívne erytrocyty všetkých krvných skupín.

Aglutinačná reakcia na stanovenie protilátok proti Rhesus (nepriamy Coombsov test)používa sa u pacientov s intravaskulárnou hemolýzou. U niektorých z týchto pacientov sa zistia protilátky proti Rhesus, ktoré sú neúplné a monovalentné. Špecificky interagujú s Rh-pozitívnymi erytrocytmi, ale nespôsobujú ich aglutináciu. Prítomnosť takýchto neúplných protilátok sa určuje nepriamym Coombsovým testom. K tomu sa do systému anti-Rh protilátok + Rh-pozitívnych erytrocytov pridáva antiglobulínové sérum (protilátky proti ľudským imunoglobulínom), ktoré spôsobuje aglutináciu erytrocytov (obr. 13.4). Pomocou Coombsovej reakcie sa diagnostikujú patologické stavy spojené s intravaskulárnou lýzou erytrocytov imunitného pôvodu, napríklad hemolytická choroba novorodenca: erytrocyty Rh pozitívneho plodu sa spájajú s nekompletnými protilátkami proti Rh faktoru cirkulujúcimi v krvi, ktoré majú prešli placentou od Rh-negatívnej matky.

Zrážacie reakcie

Zrážacia reakcia - RP (odlat. praecipito- precipitát) - ide o tvorbu a precipitáciu komplexu rozpustného molekulového antigénu s protilátkami vo forme zákalu, tzv. zrazenina. Vzniká zmiešaním antigénov a protilátok v ekvivalentných množstvách; nadbytok jedného z nich znižuje úroveň tvorby imunitných komplexov.

Zrážacie reakcie sa vykonávajú v skúmavkách (reakcia zrážania prstenca), v géloch, živných médiách atď. Rozmanité zrážacie reakcie v polotekutých géloch agaru alebo agarózy sa rozšírili: dvojitá imunodifúzia podľa Ouchterlonyho. radiálna imunodifúzia, imunoelektroforéza atď.

Reakcia zrážania kruhu . Reakcia sa uskutočňuje v úzkych precipitačných skúmavkách s imunitným sérom, na ktoré je navrstvený rozpustný antigén. Pri optimálnom pomere antigénu a protilátok sa na hranici týchto dvoch roztokov vytvorí nepriehľadný kruh precipitátu (obr. 13.5). Nadbytok antigénu neovplyvňuje výsledok reakcie zrážania kruhu v dôsledku postupnej difúzie činidiel na hranicu kvapaliny. Ak sa ako antigény v kruhovej precipitačnej reakcii použijú prevarené a prefiltrované vodné extrakty orgánov alebo tkanív, potom sa táto reakcia nazýva tzv. termoprecipitačná reakcia (Ascoliho reakcia, s antraxom/

Dvojitá imunodifúzna reakcia podľa Ouchterunyho . Na nastavenie reakcie sa na sklenenú platňu naleje tenká vrstva roztaveného agarového gélu a po vytvrdnutí sa vyrežú jamky s veľkosťou 2-3 mm. Antigény a imunitné séra sú umiestnené oddelene do týchto jamiek, ktoré difundujú smerom k sebe. V mieste stretnutia v rovnakých pomeroch tvoria zrazeninu vo forme bieleho pruhu. Vo viaczložkových systémoch sa medzi jamkami s rôznymi antigénmi a sérovými protilátkami objaví niekoľko línií precipitátu; pre identické antigény sa línie precipitátu spájajú; pri neidentických sa prelínajú (obr. 13.6).

Radiálna imunodifúzna reakcia . Imunitné sérum s roztaveným agarovým gélom sa rovnomerne naleje na pohár. Po stuhnutí v géli sa urobia jamky, do ktorých sa vloží antigén v rôznych riedeniach. Antigén difundujúci do gélu vytvára okolo jamiek s protilátkami prstencovité precipitačné zóny (obr. 13.7). Priemer precipitačného prstenca je úmerný koncentrácii antigénu. Reakcia sa používa na stanovenie obsahu imunoglobulínov rôznych tried, zložiek komplementového systému atď. v krvi.

Imunoelektroforéza- kombinácia elektroforézy a imunoprecipitácie: zmes antigénov sa zavedie do jamiek gélu a oddelí sa v géli pomocou elektroforézy. Potom sa do drážky rovnobežne so zónami elektroforézy zavedie imúnne sérum, ktorého protilátky difundujú do gélu a vytvárajú precipitačné línie v mieste stretnutia s antigénom.

Flokulačná reakcia(podľa Ramona) (z lat. vločka - vlnené vločky) - objavenie sa opalescencie alebo flokulentnej hmoty (imunoprecipitácia) v skúmavke počas reakcie toxín-antitoxín alebo toxoid-antitoxín. Používa sa na stanovenie aktivity antitoxického séra alebo toxoidu.

Imunitná elektrónová mikroskopia- elektrónová mikroskopia mikróbov, často vírusov, ošetrených vhodnými protilátkami. Vírusy ošetrené imunitným sérom tvoria imunitné agregáty (mikroprecipitáty). Okolo viriónov sa vytvára „korolla“ protilátok, na rozdiel od kyseliny fosfowolfrámovej alebo iných elektrónovo-opticky hustých prípravkov.

Reakcie zahŕňajúce komplement

Reakcie zahŕňajúce komplementsú založené na aktivácii komplementu komplexom antigén-protilátka (reakcia fixácie komplementu, radiálna hemolýza a pod.).

Reakcia fixácie komplementu (RSK) je, že keď si antigény a protilátky navzájom zodpovedajú, tvoria imunitný komplex, na ktorý sa cez Fc -fragment protilátky je pripojený ku komplementu (C), t.j. komplement je viazaný komplexom antigén-protilátka. Ak sa nevytvorí komplex antigén-protilátka, komplement zostáva voľný (obr. 13.8). RSK sa uskutočňuje v dvoch fázach: 1. fáza - inkubácia zmesi obsahujúcej tri zložky antigén + protilátka + komplement; 2. fáza (indikátor) - detekcia voľného komplementu v zmesi pridaním hemolytického systému pozostávajúceho z ovčích erytrocytov a hemolytického séra obsahujúceho protilátky proti nim. V 1. fáze reakcie, keď sa tvorí komplex antigén-protilátka, sa viaže komplement a následne v 2. fáze nedôjde k hemolýze erytrocytov senzibilizovaných protilátkami; reakcia je pozitívna. Ak sa antigén a protilátka nezhodujú (v testovanej vzorke nie je antigén alebo protilátka), komplement zostáva voľný a v 2. fáze sa spojí s komplexom erytrocyt - antierytrocytová protilátka, čo spôsobí hemolýzu; reakcia je negatívna.

RSC sa používa na diagnostiku mnohých infekčných chorôb, najmä syfilisu (Wassermannova reakcia).

Radiálna hemolytická reakcia (RRH) ) umiestnené do jamiek agarového gélu obsahujúceho ovčie červené krvinky a komplement. Po zavedení hemolytického séra (protilátky proti ovčím červeným krvinkám) do jamiek gélu sa okolo nich vytvorí hemolytická zóna (ako výsledok radiálnej difúzie protilátok). Týmto spôsobom je možné stanoviť aktivitu komplementu a hemolytického séra, ako aj protilátok v krvnom sére pacientov s chrípkou, rubeolou a kliešťovou encefalitídou. Na tento účel sa na erytrocyty adsorbujú zodpovedajúce antigény vírusu a do jamiek gélu obsahujúcich tieto erytrocyty sa pridá krvné sérum pacienta. Antivírusové protilátky interagujú s vírusovými antigénmi adsorbovanými na erytrocytoch, po ktorých

Potom sa k tomuto komplexu pripájajú zložky komplementu, čo spôsobuje hemolýzu.

Reakcia imunitnej adherencie (IAR) ) je založená na aktivácii komplementového systému korpuskulárnymi antigénmi (baktériami, vírusmi) ošetrenými imunitným sérom. V dôsledku toho sa vytvorí aktivovaná tretia zložka komplementu (C3b), ktorá sa naviaže na korpuskulárny antigén ako súčasť imunitného komplexu. Erytrocyty, krvné doštičky a makrofágy majú receptory pre C3b, vďaka čomu, keď sa tieto bunky zmiešajú s imunitnými komplexmi nesúcimi C3b, dochádza k ich kombinácii a aglutinácii.

Neutralizačná reakcia

Protilátky imunitného séra sú schopné neutralizovať škodlivý účinok mikróbov alebo ich toxínov na citlivé bunky a tkanivá, čo je spojené s blokádou mikrobiálnych antigénov protilátkami, t.j. neutralizácia. Neutralizačná reakcia(RN) sa vykonáva zavedením zmesi antigén-protilátka do zvierat alebo do citlivých testovacích objektov (bunková kultúra, embryá). Pri absencii škodlivých účinkov mikroorganizmov alebo ich antigénov alebo toxínov u zvierat a testovaných predmetov hovoria o neutralizačnom účinku imunitného séra, a teda o špecifickosti interakcie komplexu antigén-protilátka (obr. 13.9).

Imunofluorescenčná reakcia - RIF (Coonsova metóda)

Existujú tri hlavné typy metódy: priama, nepriama (obr. 13.10), s doplnkom. Koonsova reakcia je rýchla diagnostická metóda na identifikáciu mikrobiálnych antigénov alebo stanovenie protilátok.

Priama metóda RIF je založená na skutočnosti, že tkanivové antigény alebo mikróby ošetrené imunitným sérom s protilátkami značenými fluorochrómmi sú schopné žiariť v UV lúčoch fluorescenčného mikroskopu.

Baktérie v nátere ošetrenom takýmto luminiscenčným sérom žiaria pozdĺž obvodu bunky vo forme zeleného okraja.

Nepriama metóda RIF spočíva v identifikácii komplexu antigén-protilátka pomocou antiglobulínového (protilátkového) séra označeného fluorochrómom. Na tento účel sa nátery zo suspenzie mikróbov ošetria protilátkami z antimikrobiálneho králičieho diagnostického séra. Potom sa protilátky, ktoré nie sú naviazané na mikrobiálne antigény, premyjú a protilátky zostávajúce na mikróboch sa detegujú ošetrením náteru antiglobulínovým (antikráličím) sérom značeným fluorochrómami. Výsledkom je vytvorenie komplexu mikrób + antimikrobiálne králičie protilátky + antikráličie protilátky značené fluorochrómom. Tento komplex sa pozoruje vo fluorescenčnom mikroskope, ako pri priamej metóde.

Enzýmová imunosorbentová metóda alebo analýza (ELISA)

ELISA -detekcia antigénov pomocou ich zodpovedajúcich protilátok konjugovaných na značkový enzým (chrenová peroxidáza, beta-galaktozidáza alebo alkalická fosfatáza). Po spojení antigénu s enzýmom značeným imunitným sérom sa do zmesi pridá substrát/chromogén. Substrát sa štiepi enzýmom a mení sa farba reakčného produktu - intenzita farby je priamo úmerná počtu naviazaných molekúl antigénu a protilátky.

ELISA na pevnej fáze - najbežnejší variant imunologického testu, kedy sa jedna zo zložiek imunitnej reakcie (antigén alebo protilátky) sorbuje na pevný nosič, napríklad v jamkách polystyrénových platní

Pri stanovení protilátok sa krvné sérum pacienta, antiglobulínové sérum značené enzýmom a substrát (chromogén) pre enzým postupne pridávajú do jamiek doštičiek so sorbovaným antigénom.

Vždy po pridaní ďalšej zložky sa nenaviazané činidlá z jamiek odstránia dôkladným premytím. Ak je výsledok pozitívny, zmení sa farba roztoku chromogénu. Nosič na pevnej fáze môže byť senzibilizovaný nielen antigénom, ale aj protilátkami. Potom sa do jamiek so sorbovanými protilátkami pridá požadovaný antigén, pridá sa imunitné sérum proti antigénu označenému enzýmom a potom sa pridá substrát pre enzým.

Konkurenčná možnosť ELISA . cieľový antigén a enzýmom značený antigén si navzájom konkurujú o naviazanie obmedzeného množstva protilátok imunitného séra. Ďalší test - protilátky, ktoré hľadáte

a značené protilátky medzi sebou súťažia o antigény.

Rádioimunologická metóda alebo analýza (RIA)

Vysoko citlivá metóda založená na reakcii antigén-protilátka s použitím antigénov alebo protilátok značených rádionuklidom (125 J, 14 C, 3 H, 51 Cr atď.). Po ich interakcii sa výsledný rádioaktívny imunitný komplex oddelí a jeho rádioaktivita sa stanoví v príslušnom počítadle (beta alebo gama žiarenie):

intenzita žiarenia je priamo úmerná počtu naviazaných molekúl antigénu a protilátky.

O verzia RIA v pevnej fáze jedna z reakčných zložiek (antigén alebo protilátky) je sorbovaná na pevnom nosiči, napríklad v jamkách polystyrénových mikropanelov. Ďalšou možnosťou metódy je konkurenčné RIA. požadovaný antigén a rádionuklidom značený antigén si navzájom konkurujú o naviazanie obmedzeného množstva protilátok imunitného séra. Táto možnosť sa používa na určenie množstva antigénu v testovanom materiáli.

RIA sa používa na identifikáciu mikrobiálnych antigénov, stanovenie hormónov, enzýmov, liečiv a imunoglobulínov, ako aj iných látok obsiahnutých v testovanom materiáli v malých koncentráciách - 10~ |0 -I0~ 12 g/l. Metóda predstavuje určité nebezpečenstvo pre životné prostredie.

Imunoblotting

Imunoblotting (IB)- vysoko citlivá metóda založená na kombinácii elektroforézy a ELISA alebo RIA.

Antigén sa izoluje elektroforézou v polyakrylamidovom géli, potom sa prenesie (blotovanie - z angl. škvrna, farbenie) z gélu na aktivovaný papier alebo nitrocelulózovú membránu a vyvolané pomocou ELISA. Spoločnosti vyrábajú takéto pásy s „blotami“

antigény. Na tieto prúžky sa aplikuje pacientovo sérum. Potom sa po inkubácii pacient umyje od nenaviazaných protilátok a aplikuje sa sérum proti ľudským imunoglobulínom značené enzýmom. Komplex antigén + protilátka pacienta + protilátka proti ľudskému Ig vytvorený na prúžku sa deteguje pridaním substrátu/chromogénu, ktorý pôsobením enzýmu mení farbu (obr. 13.12).

IB sa používa ako diagnostická metóda pri infekcii HIV atď.

13.1. Reakcie antigén-protilátka a ich aplikácie

Po zavedení antigénu sa v tele tvoria protilátky. Protilátky sú komplementárne k antigénu, ktorý spôsobil ich syntézu a sú schopné sa naň viazať. Väzba antigénov na protilátky pozostáva z dvoch fáz. Prvá fáza je špecifická, v ktorej dochádza k rýchlej väzbe antigénneho determinantu na aktívne centrum Fab fragmentu protilátok. Je potrebné poznamenať, že väzba je spôsobená van der Waalsovými silami, vodíkom a hydrofóbnymi interakciami. Sila väzby je určená stupňom priestorovej zhody medzi aktívnym miestom protilátky a epitopom antigénu. Po špecifickej fáze nastupuje fáza pomalšia - nešpecifická, ktorá sa prejavuje viditeľným fyzikálnym javom (napríklad tvorba vločiek pri aglutinácii a pod.).

Imunitné reakcie sú interakcie medzi protilátkami a antigénmi a tieto reakcie sú špecifické a vysoko citlivé. Sú široko používané v lekárskej praxi. Pomocou imunitných reakcií je možné vyriešiť nasledujúce problémy:

Stanovenie neznámych protilátok známymi antigénmi (antigenic diagnosticum). Táto úloha nastáva, keď je potrebné stanoviť protilátky proti patogénu v krvnom sére pacienta (sérodiagnostika). Nájdenie protilátok vám umožňuje potvrdiť diagnózu;

Stanovenie neznámych antigénov pomocou známych protilátok (diagnostické sérum). Táto štúdia sa vykonáva pri identifikácii kultúry patogénu izolovanej z materiálu pacienta (sérotypizácia), ako aj pri detekcii

mikrobiálnych antigénov a ich toxínov v krvi a iných biologických tekutinách. Existuje mnoho typov imunitných reakcií, ktoré sa líšia technikou inscenovania a zaznamenaným účinkom. Ide o aglutinačné reakcie (RA), precipitačné reakcie (RP), reakcie zahŕňajúce komplement (RSC), reakcie s použitím značených komponentov (RIF, ELISA, RIA).

13.2. Aglutinačná reakcia

Aglutinačná reakcia (RA) je imunitná reakcia interakcie antigénu s protilátkami v prítomnosti elektrolytov a antigén je v korpuskulárnom stave (erytrocyty, baktérie, latexové častice s adsorbovanými antigénmi). Pri aglutinácii dochádza k zlepovaniu korpuskulárnych antigénov protilátkami, čo sa prejavuje tvorbou flokulentnej zrazeniny. K tvorbe vločiek dochádza vďaka tomu, že protilátky majú dve aktívne centrá, pričom antigény sú polyvalentné, t.j. majú niekoľko antigénnych determinantov. RA sa používa na identifikáciu patogénu izolovaného z materiálu pacienta, ako aj na detekciu protilátok proti patogénu v krvnom sére pacienta (napríklad Wrightova a Heddlesonova reakcia na brucelózu, Widalova reakcia na brušný týfus a paratýfus).

Najjednoduchším spôsobom diagnostiky RA je reakcia na skle, ide o približnú RA, ktorá sa používa na určenie patogénu izolovaného od pacienta. Po dosiahnutí reakcie sa na podložné sklíčko nanesie diagnostické aglutinačné sérum (v riedení 1:10 alebo 1:20), potom sa pridá kultúra od pacienta. Reakcia je pozitívna, ak sa v kvapke objaví vločkovitý sediment. V blízkosti je umiestnená kontrola: namiesto séra sa aplikuje kvapka roztoku chloridu sodného. Ak sa diagnostické aglutinačné sérum neadsorbuje 1, tak sa riedi (na titer - riedenie, na ktoré má dôjsť k aglutinácii), t.j. dávať expandovanú RA do skúmaviek so zvyšujúcim sa

1 Neadsorbované aglutinačné sérum môže aglutinovať príbuzné baktérie, ktoré majú bežné (skrížene reagujúce) antigény. Preto používajúadsorbované aglutinačné séra, z ktorých boli skrížene reagujúce protilátky odstránené adsorpciou na príbuzné baktérie. Takéto séra si zachovávajú protilátky, ktoré sú špecifické len pre danú baktériu.

riedenia aglutinačného séra, do ktorého sa pridajú 2-3 kvapky suspenzie patogénu izolovaného od pacienta. Aglutinácia sa zohľadňuje podľa množstva sedimentu a stupňa vyčírenia kvapaliny v skúmavkách. Reakcia sa považuje za pozitívnu, ak sa aglutinácia pozoruje v zriedení blízkom titru diagnostického séra. Reakcia je sprevádzaná kontrolami: sérum zriedené izotonickým roztokom chloridu sodného by malo byť priehľadné, suspenzia mikróbov v tom istom roztoku by mala byť rovnomerne zakalená, bez sedimentu.

Na stanovenie protilátok proti patogénu v krvnom sére pacienta sa používa RA v plnom rozsahu. Pri nastavovaní sa pacientovo krvné sérum zriedi v skúmavkách a do skúmaviek sa pridá rovnaké množstvo diagnostickej suspenzie (suspenzia usmrtených mikróbov). Po inkubácii sa určí najvyššie riedenie séra, pri ktorom došlo k aglutinácii, t.j. vytvorila sa zrazenina (sérový titer). V tomto prípade dochádza k aglutinačnej reakcii s O-diagnosticum (baktérie usmrtené teplom, zadržiavajúce termostabilný O-antigén) vo forme jemnozrnnej aglutinácie. Aglutinačná reakcia s H-diagnosticum (baktérie usmrtené formaldehydom, zadržiavajúce termolabilný bičíkový H-antigén) je hrubá a prebieha rýchlejšie.

Nepriama (pasívna) hemaglutinačná reakcia(RNGA alebo RPGA) je typ RA. Táto metóda je vysoko citlivá. Pomocou RNGA možno vyriešiť dva problémy: stanoviť protilátky v krvnom sére pacienta, ku ktorému sa pridáva antigénne erytrocytové diagnosticum, čo sú erytrocyty, na ktorých sú adsorbované známe antigény; určiť prítomnosť antigénov v testovanom materiáli. V tomto prípade sa reakcia niekedy nazýva reverzná nepriama hemaglutinačná reakcia (RONHA). Počas procedúry sa k testovanému materiálu pridáva protilátkové erytrocytové diagnosticum (erytrocyty s protilátkami adsorbovanými na ich povrchu). Pri tejto reakcii pôsobia červené krvinky ako nosiče a pasívne sa podieľajú na tvorbe imunitných agregátov. Pri pozitívnej reakcii pasívne prilepené červené krvinky pokrývajú dno otvoru v rovnomernej vrstve s vrúbkovanými okrajmi („dáždnik“); pri absencii aglutinácie sa červené krvinky hromadia v centrálnom vybraní otvoru a vytvárajú kompaktné „gombík“ s ostro ohraničenými okrajmi.

Koaglutinačná reakcia používa sa na stanovenie patogénnych buniek (antigénov) pomocou protilátok adsorbovaných na Staphylococcus aureus, obsahujúci proteín A. Proteín A má afinitu k Fc fragmentu imunoglobulínov. Vďaka tomu sa protilátky viažu na stafylokoka nepriamo cez Fc fragment a Fab fragmenty sú orientované smerom von a sú schopné interagovať so zodpovedajúcimi mikróbmi izolovanými od pacientov. V tomto prípade sa tvoria vločky.

Hemaglutinačná inhibičná reakcia (HAI) používané pri diagnostike vírusových infekcií a iba infekcií spôsobených hemaglutinačnými vírusmi. Tieto vírusy obsahujú na svojom povrchu proteín – hemaglutinín, ktorý je zodpovedný za hemaglutinačnú reakciu (HRA), keď sa k vírusom pridávajú červené krvinky. RTGA zahŕňa blokovanie vírusových antigénov protilátkami, v dôsledku čoho vírusy strácajú svoju schopnosť aglutinovať červené krvinky.

Coombsova reakcia - RA na stanovenie neúplných protilátok. Pri niektorých infekčných ochoreniach, ako je brucelóza, cirkulujú v krvnom sére pacienta neúplné protilátky proti patogénu. Nekompletné protilátky sa nazývajú blokujúce protilátky, pretože majú jedno väzbové miesto pre antigén a nie dve, ako kompletné protilátky. Preto, keď sa pridá antigénne diagnostické činidlo, neúplné protilátky sa viažu na antigény, ale nezlepujú ich. Na prejavenie reakcie sa pridáva antiglobulínové sérum (protilátky proti ľudským imunoglobulínom), čo povedie k aglutinácii imunitných komplexov (antigénne diagnosticum + neúplné protilátky) vytvorených v prvom štádiu reakcie.

Nepriama Coombsova reakcia sa používa u pacientov s intravaskulárnou hemolýzou. U niektorých z týchto pacientov sa zistia neúplné monovalentné protilátky proti Rhesus. Špecificky interagujú s Rh-pozitívnymi erytrocytmi, ale nespôsobujú ich aglutináciu. Preto sa do systému anti-Rh protilátok + Rh-pozitívne erytrocyty pridáva antiglobulínové sérum, ktoré spôsobuje aglutináciu erytrocytov. Pomocou Coombsovej reakcie sa diagnostikujú patologické stavy spojené s intravaskulárnou lýzou erytrocytov imunitného pôvodu, napríklad hemolytické ochorenie novorodenca spôsobené Rh konfliktom.

RA na stanovenie krvných skupín je založená na aglutinácii erytrocytov imunitnými sérovými protilátkami na antigény krvných skupín A(II), B(III). Kontrolou je sérum, ktoré neobsahuje protilátky, t.j. krvná skupina AB(IV) v sére a erytrocytové antigény skupín A(P) a B(III). Červené krvinky skupiny 0(I) sa používajú ako negatívna kontrola, pretože nemajú antigény.

Na stanovenie Rh faktora sa používajú anti-Rh séra (najmenej dve rôzne série). Ak sa na membráne skúmaných erytrocytov nachádza Rh antigén, dochádza k aglutinácii týchto buniek.

13.3. Zrážacia reakcia

RP je imunitná reakcia interakcie protilátok s antigénmi v prítomnosti elektrolytov a antigén je v rozpustnom stave. Pri precipitácii dochádza k zrážaniu rozpustných antigénov protilátkami, čo sa prejavuje zákalom vo forme precipitačných pásov. Tvorba viditeľnej zrazeniny sa pozoruje, keď sa obe činidlá zmiešajú v ekvivalentných pomeroch. Nadbytok jedného z nich znižuje počet vyzrážaných imunitných komplexov. Existujú rôzne spôsoby, ako uskutočniť zrážaciu reakciu.

Reakcia zrážania kruhu umiestnené v zrážacích skúmavkách s malým priemerom. Imunitné sérum sa pridá do skúmavky a opatrne sa navrství rozpustný antigén. Ak je výsledok pozitívny, na rozhraní dvoch roztokov sa vytvorí mliečny prstenec. Kruhová precipitačná reakcia, ktorá sa používa na stanovenie prítomnosti antigénov v orgánoch a tkanivách, ktorých extrakty sa varia a filtrujú, sa nazýva termoprecipitačná reakcia (Ascoliho reakcia na stanovenie termostabilného antraxového antigénu).

Ouchterlonyho dvojitá imunodifúzna reakcia. Táto reakcia sa uskutočňuje v agarovom géli. Vo vrstve gélu rovnomernej hrúbky sa vyrežú jamky v určitej vzdialenosti od seba a naplnia sa antigénom a imunitným sérom. Potom antigény a protilátky difundujú do gélu, stretávajú sa a vytvárajú imunitné komplexy, ktoré sa vyzrážajú v géli a stávajú sa viditeľnými ako presné čiary.

výživa. Táto reakcia sa môže použiť na identifikáciu neznámych antigénov alebo protilátok a tiež na testovanie podobnosti medzi rôznymi antigénmi: ak sú antigény identické, precipitačné línie sa spájajú, ak antigény nie sú identické, precipitačné línie sa pretínajú, ak sú antigény čiastočne identické, vzniká ostroha.

Radiálna imunodifúzna reakcia. Do roztopeného agarového gélu sa pridajú protilátky a gél sa nanesie v rovnomernej vrstve na sklo. V géli sa vyrežú jamky a pridá sa do nich štandardný objem roztokov antigénu rôznych koncentrácií. Počas inkubácie antigény radiálne difundujú z jamky a pri stretnutí s protilátkami vytvoria precipitačný prstenec. Pokiaľ v jamke zostáva nadbytok antigénu, dochádza k postupnému zväčšovaniu priemeru precipitačného prstenca. Táto metóda sa používa na stanovenie antigénov alebo protilátok v testovacom roztoku (napríklad na stanovenie koncentrácie imunoglobulínov rôznych tried v krvnom sére).

Imunoelektroforéza. Zmes antigénov sa najskôr elektroforeticky oddelí, potom sa do drážky v smere pohybu proteínu pridá zrážacie antisérum. Antigény a protilátky difundujú do gélu smerom k sebe; vzájomne pôsobiace tvoria oblúkovité zrážkové línie.

Flokulačná reakcia(podľa Ramona) - typ precipitačnej reakcie, ktorá sa používa na stanovenie aktivity antitoxického séra alebo toxoidu. Reakcia sa uskutočňuje v skúmavkách. V skúmavke, kde sú toxoid a antitoxín v ekvivalentnom pomere, sa pozoruje zákal.

13.4. Reakcia fixácie komplementu

Protilátky, ktoré interagujú s príslušným antigénom, viažu pridaný komplement (1. systém). Indikátorom fixácie komplementu sú erytrocyty senzibilizované hemolytickým sérom, t.j. protilátky proti červeným krvinkám (2. systém). Ak v 1. systéme nie je fixovaný doplnok, t.j. Ak nedôjde k reakcii antigén-protilátka, senzibilizované červené krvinky sú úplne lyzované (negatívna reakcia). Pri fixácii komplementu imunitnými komplexmi 1. systému po pridaní senzibilizovaných erytrocytov hemolýza z r.

chýba (pozitívna reakcia). Reakcia fixácie komplementu sa používa na diagnostiku infekčných ochorení (kvapavka, syfilis, chrípka atď.).

13.5. Neutralizačná reakcia

Mikróby a ich toxíny majú škodlivý účinok na orgány a tkanivá ľudského tela. Protilátky sú schopné naviazať sa na tieto škodlivé látky a blokovať ich, t.j. neutralizovať. Diagnostická neutralizačná reakcia je založená na tejto vlastnosti protilátok. Vykonáva sa zavedením zmesi antigén-protilátka do zvierat alebo do citlivých testovacích objektov (bunková kultúra, embryá). Napríklad na detekciu toxínov v materiáli pacienta sa zvieratám 1. skupiny vstrekne materiál od pacienta. Zvieratám z 2. skupiny sa injekčne podá podobný materiál vopred ošetrený vhodným antisérom. Zvieratá skupiny 1 uhynú, ak je v materiáli toxín. Druhá skupina živočíchov prežíva, škodlivý účinok toxínu sa neprejaví, pretože je neutralizovaný.

13.6. Reakcie využívajúce značené protilátky alebo antigény

13.6.1. Imunofluorescenčná reakcia (RIF, Koonsova metóda)

Táto metóda sa používa na expresnú diagnostiku. Môže sa použiť na detekciu mikrobiálnych antigénov aj protilátok.

Priama metóda RIF- imunitná reakcia interakcie protilátok s antigénmi a protilátky sú značené fluorochrómom - látkou schopnou vyžarovať svetelné kvantá určitej vlnovej dĺžky pri vystavení svetlu určitej vlnovej dĺžky. Zvláštnosťou tejto metódy je potreba odstrániť nezreagované zložky, aby sa vylúčila detekcia nešpecifickej luminiscencie. Za týmto účelom umyte nezreagované protilátky. Výsledky sa hodnotia pomocou fluorescenčného mikroskopu. Baktérie v nátere ošetrenom takýmto luminiscenčným sérom žiaria na tmavom pozadí pozdĺž obvodu bunky.

Nepriama metóda RIF sa používa častejšie ako predchádzajúci. Táto reakcia sa uskutočňuje v dvoch stupňoch. V prvej fáze sa antigény navzájom

interagujú so zodpovedajúcimi protilátkami a vytvárajú imunitné komplexy. Všetky zložky, ktoré nezreagovali (t.j. nie sú súčasťou imunitných komplexov), sa musia odstrániť umytím. V druhom štádiu sa výsledný komplex antigén-protilátka deteguje pomocou fluorochromovaného antiglobulínového séra. V dôsledku toho vzniká komplex mikrób + antimikrobiálne králičie protilátky + protilátky proti králičím imunoglobulínom, značený fluorochrómom. Výsledky sa hodnotia pomocou fluorescenčného mikroskopu.

13.6.2. Enzýmová imunosorbentná metóda alebo test

ELISA je najbežnejšia moderná metóda používaná na diagnostiku vírusových, bakteriálnych, protozoálnych infekcií, najmä na diagnostiku HIV infekcie, vírusovej hepatitídy atď.

Existuje veľa modifikácií ELISA. Široko sa používa nekompetitívna ELISA na pevnej fáze. Uskutočňuje sa v 96-jamkových polystyrénových platniach (tuhá fáza). Pri uskutočňovaní reakcie je potrebné v každom stupni zmyť nezreagované zložky. Pri stanovení protilátok sa do jamiek, na ktorých sa sorbujú antigény, pridá testované krvné sérum, potom sa antiglobulínové sérum označí enzýmom. Reakcia sa uskutočňuje pridaním substrátu pre enzým. V prítomnosti enzýmu sa substrát mení a komplex enzým-substrát sa volí tak, aby sa produkt vzniknutý pri reakcii zafarbil. Pri pozitívnej reakcii sa teda pozoruje zmena farby roztoku. Na stanovenie antigénov sa nosič v tuhej fáze senzibilizuje protilátkami, potom sa k antigénom postupne pridáva testovaný materiál (antigény) a enzýmom značené sérum. Aby reakcia prebehla, pridá sa substrát pre enzým. Pri pozitívnej reakcii nastáva zmena farby roztoku.

13.6.3. Imunoblotting

Táto metóda je založená na kombinácii elektroforézy a ELISA. Pri vykonávaní imunoblotovania (blotovanie z angličtiny. škvrna- spot) komplexná zmes antigénov sa najskôr podrobí elektroforéze v polyakrylamidovom géli. Výsledná frakcionovaná anti-

génové peptidy sa prenesú na nitrocelulózovú membránu. Bloty sa potom ošetria enzýmom značenými protilátkami proti špecifickému antigénu, t.j. vykonajte ELISA blot. Imunoblotting sa používa pri diagnostike infekcií, ako je HIV.

13.6.4. Imunitná elektrónová mikroskopia

Metóda zahŕňa mikroskopovanie vírusov (menej často iných mikróbov) v elektrónovom mikroskope, vopred ošetrenom vhodným imunitným sérom označeným elektrónovo-opticky hustými prípravkami, napríklad feritínom, proteínom obsahujúcim železo.

13.7. Prietoková cytometria

Krvné bunky sa diferencujú na základe laserovej cytofluorometrie. Na tento účel sa požadované bunky zafarbia fluorescenčnými monoklonálnymi protilátkami proti CD antigénom. Vzorka krvi po ošetrení značenými protilátkami prechádza cez tenkú skúmavku a cez ňu prechádza laserový lúč, ktorý vybudí fluorochróm, aby sa rozžiaril. Intenzita fluorescencie koreluje s hustotou antigénov na bunkovom povrchu a možno ju kvantitatívne merať pomocou skúmavky s fotonásobičom. Získané výsledky sa prevedú do histogramu.

Prietoková cytometria sa používa na stanovenie imunitného stavu (obsah hlavných populácií lymfocytov, obsah intracelulárnych a extracelulárnych cytokínov, funkčná aktivita NK buniek, aktivita fagocytózy atď.).

Vo forme zákalu nazývaného zrazenina. Vzniká zmiešaním antigénov a protilátok v ekvivalentných množstvách; nadbytok jedného z nich znižuje úroveň tvorby imunitných komplexov. Precipitačná reakcia sa uskutočňuje v skúmavkách (krúžková precipitačná reakcia), v géloch, živných médiách atď. Rozmanité varianty precipitačnej reakcie v polotekutom agare alebo agarózovom géli sú rozšírené: dvojitá imunodifúzia podľa Ouchterlonyho, radiálna imunodifúzia, imunoelektroforéza , atď.
Reakcia zrážania kruhu. Reakcia sa uskutočňuje v úzkych precipitačných skúmavkách: rozpustný antigén sa navrství na imunitné sérum. Pri optimálnom pomere antigénu a protilátok sa na hranici týchto dvoch roztokov vytvorí nepriehľadný kruh zrazeniny (obr. 7.50). Ak sa pri reakcii ako antigény použijú uvarené a prefiltrované tkanivové extrakty, potom sa táto reakcia nazýva termoprecipitačná reakcia (Ascoliho reakcia, pri ktorej sa deteguje antraxový haptén).

Ryža. 7,50.

Ouchterlonyho dvojitá imunodifúzna reakcia.

Na nastavenie reakcie sa tenká vrstva roztopeného agarového gélu naleje na sklenenú platňu a po vytvrdnutí sa do nej vyrežú jamky. Antigény a imunitné séra sa umiestnia oddelene do jamiek gélu, ktoré difundujú k sebe. V mieste stretnutia v ekvivalentných pomeroch tvoria zrazeninu vo forme bieleho pruhu (obr. 7.51). Vo viaczložkových systémoch sa medzi jamkami s antigénmi a protilátkami objaví niekoľko línií precipitátu; Pre identické antigény sa línie precipitátu spájajú a pre neidentické antigény sa pretínajú.

Ryža. 7.51

Imunitné sérum s roztaveným agarovým gélom sa rovnomerne naleje na pohár. Po vytvrdnutí v géli sa urobia jamky, do ktorých sa v rôznych riedeniach umiestni antigén (Ag). Antigén difundujúci do gélu vytvára kruhové precipitačné zóny okolo jamiek s protilátkami. Priemer precipitačného prstenca je úmerný koncentrácii antigénu (obr. 7.52). Reakcia sa používa na stanovenie imunoglobulínov rôznych tried, zložiek komplementového systému atď. v krvnom sére.

Ryža. 7.52.

Kombinácia elektroforézy a imunoprecipitácie: zmes antigénov sa zavedie do jamiek gélu a separuje sa v géli pomocou elektroforézy, potom sa do drážky gélu paralelne so zónami elektroforézy pridá imúnne sérum. Protilátky z imunitného séra difundujú do gélu a vytvárajú precipitačné línie v mieste „stretnutia“ s antigénom (obr. 7.53).

Ryža. 7.53.

Flokulačná reakcia (podľa Ramona) (z lat. vločka- vlnené vločky) - objavenie sa opalescencie alebo flokulentnej hmoty (imunoprecipitácia) v skúmavke počas reakcie toxín-antitoxín alebo toxoid-antitoxín (obr. 7.54). Používa sa na stanovenie aktivity antitoxického séra alebo toxoidu.

Ryža. 7.54.

Kmene pôvodcu záškrtu - C. diphtheriae môžu byť toxigénne (produkujúce exotoxín) a netoxické. Tvorba exotoxínu závisí od prítomnosti profága nesúceho tox gén kódujúci tvorbu exotoxínu v baktériách. V prípade ochorenia sa všetky izoláty testujú na toxigenitu – produkciu difterického exotoxínu pomocou agarovej precipitačnej reakcie (obr. 7.55).

Ryža. 7,55