Колір та прозорість готового середовища. Ланцюгова реакція урану та ланцюгова реакція сенсацій

119. Реакції Панді та Нонне - Апельта

Як реактив для проведення реакції Панді використовують надосадову прозору рідину, яку отримують при сильному збовтуванні 100 г рідкої карболової кислоти з 1000 мл дистильованої води. Для отримання осаду та прозорої рідини(реактиву) цю суміш поміщають спочатку на 3-4 год термостат, а потім 2-3 дні витримують при кімнатній температурі.

Годинне або предметне скло кладуть на темний папір і наносять на нього 2-3 краплі реактиву, потім 1 краплю спинномозкової рідини. При помутнінні краплі або появі ниткоподібної каламуті на її периферії реакцію вважають позитивною.

Для проведення реакції Нонне - Апельта необхідні чисті пробірки, насичений розчин сульфату амонію, дистильована вода, темний папір. Насичений розчин амонію сульфату готують наступним чином: у колбу ємністю 1000 мл поміщають 0,5 г хімічно чистого нейтрального амонію сульфату, потім наливають 100 мл дистильованої води, підігрітої до 95 °С, збовтують до повного розчинення солі і залишають на кілька днів при кімнатній температурі. Через 2-3 дні розчин фільтрують та визначають рН. Реакція має бути нейтральною.

У пробірку наливають 0,5-1 мл отриманого розчину і обережно по стінці пробірки додають таку кількість спинномозкової рідини. Через 3 хвилини оцінюють результат. Поява білуватого кільця свідчить про позитивну реакцію. Потім вміст пробірки збовтують, визначають ступінь помутніння, порівнюючи з пробіркою, що містить дистильовану воду. Результати реакції оцінюють і натомість чорного паперу.

120. Реакція Борде – Жангу

Цінний діагностичний тест при виявленні хронічної гонореїсеред осіб, які страждають на хронічні Запальними захворюваннями сечостатевої системи. За даними літератури, при правильному використанніцього методу виявляють до 80% випадків гонореї, що не виявлена ​​бактеріоскопічним або бактеріологічним методом.

Реакція Борде - Жангу може бути слідовою внаслідок перенесеного раніше захворювання або застосування гоновакцини з діагностичною (імунобіологічний метод провокації), а також лікувальною (лікування хронічних запальних процесів сечостатевої системи у жінок за Бакшеєвим) метою. Тому перед її проведенням необхідно ретельно зібрати анамнез,

Реакція може бути хибнопозитивною при введенні молока, використанні в лікувальних ціляхпірогеналу.

Отже, позитивна реакція Борде - Жангу не є безперечним доказом наявності гонококової інфекції, як і негативна може бути свідченням відсутності гонореї. Однак позитивні результатиїї протягом тривалого часу повинні націлити лікаря на пошук вогнища гонококової інфекції в організмі.

Як антиген використовують убиту гонококову культуру, що містить 3-4 млрд. мікробних тіл в 1 мл. Гонококовий антиген консервують розчином формальдегіду і розливають в ампули по 1-5 мл. Не розкриті ампули придатні протягом 6 місяців, розкриті можна зберігати 2-3 дні в стерильній пробірці в холодильній камері при температурі 3-5 °С,

Реакцію зв'язування комплементу Борде – Жангу проводять аналогічно реакції Вассермана (див. № 121). Гонококовий антиген розводять ізотонічним розчином хлориду натрію відповідно зазначеному на етикетці ампули титру. Реакцію проводять найчастіше в обсязі 2,5 мл, тому до 0,5 мл розведеної 1:5 досліджуваної сироватки додають у кожну пробірку по 0,5 мл розведеного антигену. Інші 1,5 мл складають 1 мл гемолітичної системи та 0,5 мл комплементу.

Реакцію вважають позитивною за наявності вираженої в різного ступенязатримки гемолізу у випробуваній сироватці. У контролі (сироватка крові здорових людей) спостерігається повний гемоліз.

121. Реакція Вассермана

У сироватці крові хворих на сифіліс знаходяться реагіни та антитіла. Реагіни мають властивість вступати в сполуки з кардіоліпіновим антигеном. Специфічні антитіла проти блідої трепонеми вступають у поєднання зі специфічними антигенами. Комплекси антиген - антитіло, що утворилися, сорбують комплементом, що додається в реакцію. Індикацію проводять шляхом запровадження гемолітичної системи (еритроцити барана + гемолітична сироватка).

Для проведення реакції потрібні:

а) ізотонічний розчин хлориду натрію;

б) ультраозвучений трепонемний (зберігають у холодильнику при температурі +4 °С) та кардіоліпіновий (зберігають при кімнатній температурі) антигени;

в) комплемент, що є сироваткою крові, отриманої при пункції серця 5-10 здорових гвінейських свинок. Може зберігатися в холодильнику протягом 2 місяців за умови
консервування 4% розчином борної кислотита 5 % розчином натрію Сульфату;

г) гемолізин - гемолітична сироватка крові кролика, імунізована еритроцитами барана з різними титрами (зберігають у холодильнику при температурі 4 ° С);

д) еритроцити барана, одержувані пункцією яремної вени. Кров збирають у стерильну банку зі скляними кульками (для перемішування), струшують 15 хв. Згустки фібрину відокремлюють фільтруванням через стерильну марлю. Дефібриновану кров можна зберігати в холодильнику до 5 діб.

Іноді виникає необхідність більш тривалого зберігання крові барана, у зв'язку з чим її консервують спеціальним консервантом (6 г глюкози, 4,5 г борної кислоти, 100 мл ізотонічного розчину натрію хлориду), який кип'ятять на водяній бані по 20 хв на день протягом 3 добу. На 100 мл дефібринованої крові барана потрібно 15 мл консерванту. Консервовану таким чином дефібриновану кров зберігають у холодильнику.

Проведенню основного досвіду передує кілька етапів.

У хворого з ліктьової вениберуть 5-10 мл крові та обробляють сироватку. У дітей кров можна взяти із скроневої вени чи розрізу на п'яті. Пункцію роблять стерильними інструментами, шприц та голку
попередньо промивають ізотоничним розчином натрію хлориду.

Кров для дослідження беруть натще; за 3-4 дні до дослідження хворому забороняють вживати наркотичні засобипрепарати наперстянки, приймати алкоголь.

Не слід проводити дослідження у хворих з підвищеною температуроютіла, після травми, операції, наркозу, перенесених нещодавно інфекційних захворювань, у жінок під час менструації, у вагітних (в останні 10 днів вагітності), породіль (у перші 10 днів після пологів), а також новонароджених (у перші 10 днів життя) .

Отриману кров у стерильній пробірці поміщають на 15-30 хв термостат при температурі 37 °С. Згусток, що утворився, відокремлюють від стінок пробірки стерильною скляною паличкою і ставлять в холодильник на добу. Прозору сироватку (над згустком) відсмоктують пастерівською піпеткою за допомогою гумової груші або обережно зливають в іншу стерильну пробірку і інактивують на водяній бані протягом 30 хв при температурі 56 °С. Приготовану таким чином для досвіду сироватку можна зберігати у холодильнику до 5-6 днів.

Антигени розводять відповідно способу та титру, зазначеним на етикетці.

Готують гемолітичну систему. Для цього дефібриновану кров або еритроцити барана в кількості, необхідній для проведення реакції, центрифугують, плазму обережно відокремлюють, а осад промивають 5-6 об'ємами ізотонічного розчину натрію хлориду доти, поки надосадова рідина не стане абсолютно безбарвною. З осаду готують 3% завись еритроцитів в ізотонічному розчині хлориду натрію по потрійному титру.

Розчин гемолітичної сироватки та завись еритроцитів барана швидко змішують і поміщають у термостат на 30 хв.

Сухий комплемент розводять ізотонічним розчином хлориду натрію в пропорції 1:10, нормальну інактивовану сироватку людини- 1:5.

Комплемент титрують у 30 пробірках, поміщених у штатив по 10 пробірок у 3 ряди. У двох рядах його титрують у присутності двох антигенів, у третьому – з ізотонічним розчином натрію хлориду. П'ять пробірок є контрольними: дві для відповідних двох антигенів та по одній - для контролю комплементу, гемолітичної сироватки та ізотонічного розчину натрію хлориду на гемотоксичність; заповнюють їх наступним чином:

Пробірки поміщають на 45 хв термостат, після чого їх перевіряють. Гемолізу не повинно бути в жодній пробірці.

Комплемент у розведенні 1:10 розливають у 10 пробірок 1-го ряду штатива в дозах: 0,1, 0,16, 0,2,0,24, 0,3, 0,36,0,4,0,44, 0,5 та 0,55 мл. До кожної пробірки додають ізотонічний розчин натрію хлориду до 1 мл і ретельно перемішують. По 0,25 мл суміші з кожної пробірки переносять у відповідні пробірки 2-го та 3-го рядів. Штатив з пробірками струшують, в 3-й ряд пробірок додають по 0,5 мл гемолітичної системи, знову струшують і поміщають на 45 хв термостат при температурі 37 °С. Нормальну сироватку крові людини, розведену ізотонічним розчином хлориду натрію в пропорції 1:5, по 0,25 мл розливають у всі 30 пробірок.

Антиген I (трепонемний ультраозвучений), розведений титром ізотонічним розчином натрію хлориду, по 0,25 мл додають в 10 пробірок 1-го ряду; антиген II (кардіоліпіновий у тому ж розведенні та в тій же кількості) - у 10 пробірок 2-го ряду. У 10 пробірок 3-го ряду доливають по 0,25 мл ізотонічного розчину натрію хлориду, 0,25 мл, що залишилися, виливають. Після інкубації в термостаті 20 пробірок (1-го і 2-го ряду) додають по 0,5 мл гемолітичної системи, струшують і повторно поміщають в термостат на 45 хв.

Через 45 хв визначають робочу дозу комплементу, тобто його титр з надбавкою в межах 15-20 %.

Титром комплементу вважають його мінімальна кількість, що викликає повний гемоліз еритроцитів барана у присутності антигену та нормальної сироватки крові людини

Основний досвід полягає в тому, що кожну випробувану інактивовану сироватку, розведену в пропорції 1: 5 ізотонічним розчином хлориду натрію, розливають по 0,25 мл в три пробірки. У першу пробірку додають 0,25 мл антигену I, другу - 0,25 мл антигену II, в третю (контроль) -0,25 мл ізотонічного розчину натрію хлориду. У всі пробірки додають також 0,25 мл розведеного до робочої дози комплементу. Усі пробірки поміщають на 45 хв термостат, потім у них додають по 0,5 мл гемолітичної системи, струшують і ставлять термостат на 45-50 хв. Результат досвіду реєструють після настання повного гемолізу контрольних пробірках.

Результати реакції оцінюють плюсами: повна затримка гемолізу (резкопозитивна реакція) ++++, значна (позитивна реакція) +++, часткова (слабкопозитивна реакція) ++, незначна (сумнівна реакція) - ±, відсутність затримки гемолізу (негативна реакція) - .

При кількісний методпроведення реакції Вассермана досвід ставлять зі зменшуючимися обсягами сироватки, розведеної ізотонічним розчином натрію хлориду.

Схема проведення основного досвіду реакції Вассермана

Клінічне значення реакції Вассермана важко переоцінити. Її проводять усім хворим до початку лікування, але особливе значеннявона має при прихований сифіліс, поразка внутрішніх органівта нервової системи.

Результати реакції Вассермана характеризують якість проведеного лікування, що дає підставу в певні терміни знімати з обліку хворих, що лікувалися.

При первинному сифіліс реакція Вассермана позитивна зазвичай наприкінці 6-го тижня з моменту зараження; при вторинному свіжому сифілісі вона позитивна майже у 100% випадків, при вторинному рецидивному – у 98-100%; третинному активному - у 85%; третинному прихованому - у 60% випадків.

Реакцію Вассермана проводять дворазово всім вагітним, хворим із соматичними, нервовими, психічними та шкірними хворобами, і навіть декретованим контингентам населення. У той же час к.позитивним і слабопозитивним результатам реакції слід ставитися критично, оскільки вони можуть бути наприкінці вагітності та після пологів, при гіпертиреозі, малярії, проказі, розпаді злоякісної пухлини, інфекційних захворюваннях, колагенозах та ін. Тому за наявності клінічних проявівхвороби їх слід враховувати, поряд із даними бактеріоскопії, насамперед.

Разом з тим є фактори, які можуть спотворити справжній характер отриманих результатів реакції Вассермана: погано вимитий лабораторний посуд (сліди кислоти та лугу в пробірках), тривале зберігання крові, взятої для дослідження, вживання хворими на жири та алкоголь перед обстеженням, період менструації та ін.

У всіх випадках бажано проводити комплексне обстеження хворого, що включає, крім реакції Вассермана, також РІБТ (див. 122, 123, 124) та ін.

122. Реакція Заксу – Вітебського (цитохолева)

Застосовується виявлення сифілісу. Заснована на утворенні осаду при змішуванні сироватки крові хворого на антиген.

Для приготування антигену м'язи кількох бичачих сердець очищають від сухожиль, фасцій, жиру, подрібнюють на м'ясорубці та екстрагують 5-кратним об'ємом 96% етилового спирту протягом 15 днів при щоденному 20-хвилинному струшуванні. Отриманий екстракт випарюють на водяній бані у фарфоровій чашці під вакуумом. До залишку (яскраво-жовтої маси ліпоїдів) додають гарячий 96% етиловий спирт у кількості 1/3 обсягу взятих для екстрагування м'язів.

Екстракт тримають 3 дні при кімнатній температурі, фільтрують (в холодній воді) і додають 0,3-0,6% розчин кристалічного холестерину в залежності of результатів титрування позитивними та негативними сироватками. Зберігають цитохолевий антиген при кімнатній температурі в запаяних ампулах або закупорених пробірках.

Методика. До 2 мл ізотонічного розчину хлориду натрію швидко доливають 1 мл цитохолевого антигену і залишають при кімнатній температурі на 15 хв до появи пластівців. Пробірку до 0,2 мл інактивованої сироватки додають 0,1 мл антигенної емульсії, струшують протягом 3 хв і залишають у спокої на 30 хв, після чого додають 1 мл ізотонічного розчину натрію хлориду.

У контрольну пробірку з антигеном додають 1,2 мл ізотонічного розчину хлориду натрію і 0,1 мл антигенної емульсії. У контролі пластівців не повинно бути. Результати реакції враховують візуально або за допомогою лупи і позначають в залежності від кількості пластівців, що випали плюсами (++++, +++, ++). При негативній реакції пластівців немає, але вміст пробірки може трохи опалесцювати.

У 1931 р. П. Sachs і Е. Witebsky запропонували модифікацію даної методики, що полягає в тому, що антиген розводять двофазно: до 1 частини антигену додають 2 частини ізотонічного розчину натрію хлориду, витримують при кімнатній температурі 5 хв і додають ще 9 частин натрію хлориду. Рекомендовано також розводити антиген 2% розчином хлориду натрію, що, на думку авторів, підвищує чутливість реакції. Можлива і кількісна модифікація реакції з розведенням сироватки (1:4, 1:8, 1: 16, 1:32, 1: 64 тощо).

Реакція досить чутлива, займає мало часу (близько 1 год), результати читаються відразу.

123. Реакція іммобілізації блідих трепонем (РІБТ)

За допомогою реакції у сироватці крові хворих на сифіліс виявляють антитіла та комплемент, що знерухомлюють бліду трепонему.

При первинному сифілісі РІБТ переважно негативна, при вторинному – позитивна у 92-96 % випадків, при третинному – у 92-100 %, при сифілісі нервової системи та вродженому – у 86-89 % випадків.

Позитивні результати РІБТ відзначені при саркоїді, еритематозі, діабеті, злоякісних пухлинах, вірусному гепатиті, цирозі печінки, малярії, лепрі, інфекційному мононуклеозі, деяких хворобах спекотних країн (пінта, фрамбезія та ін).

Антигеном служить завись блідих трепонем, взятих з яєчок кролика, зараженого сифілісом шляхом введення в яєчко 0,75-1 мл суспензії блідих трепонем в ізотонічному розчині натрію хлориду (50 особин у полі зору).

Матеріал із яєчка слід брати через 6-8 днів після зараження тварини. Перед взяттям антигену кролика забивають методом знекровлення (пункція серця або сонної артерії). Тканину яєчка подрібнюють і заливають сироваткою крові здорового кролика, розведеної ізотонічним розчином натрію хлориду, струшують протягом -30 хв, а потім центрифугують 10 хв (1000 оборотів в 1 хв). Надосадову рідину мікроскопують. У кожному полі зору має бути не менше 10-15 блідих трепонем.

Комплемент готують звичайним способомз крові гвінейських свинок.

Для проведення РІБТ необхідні: 1,2 мл 0,2% розчину желатину, 2,8 мл 5% розчину альбуміну, 1,6 мл суспензії блідих трепонем; рН середовища – 7,2. До зазначеної суміші додають 0,15мл комплементу (коктейль). Паралельно ставлять дві проби: з активним (досвід) та реактивним (контроль) комплементами.

У меланжери до позначки «1» набирають сироватку, що досліджується, а потім до позначки «2» - коктейль і закривають їх стерильним гумовим кільцем.

Одночасно аналогічну реакцію проводять із свідомо позитивною і свідомо негативною сироватками.

Меланжери нумерують і ставлять у термостат при температурі 35 °С на 18-20 год, після чого попарно (досвід - контроль) вилучають їх із термостату та вміст виливають у відповідні пробірки. На предметне скло наносять 2 краплі: ліворуч – досвід, праворуч – контроль, накривають покривним склом та мікроскопують у темному полі зору.

Спочатку вивчають результати контролю: визначають відсоток рухливих та нерухомих блідих трепонем. Формула підрахунку: X = (А - В)/А * 100, де А - кількість рухливих блідих трепонем у контролі; В - кількість рухливих блідих трепонем у досвіді.

Приклад: (24 – 19) / 24*100 = 21 %.

Оцінки результатів РИБТ: нижче 20% – негативний. 21-30% - сумнівний, 31-50% - слабопозитивний, понад 50% -позитивний.

Антиген, комплемент та допоміжна, індикаторна або гемолітична система – гемолітична сироватка та еритроцити барана.

Якщо першій системі утворюються специфічний комплекс антиген + антитіло, то комплемент адсорбується (з'єднується з цим комплексом) і гемолізу у другій системі немає.

Для реакції потрібно:

1. Випробувана сироватка, яка виходить із крові, взятої пункцією ліктьової вени хворого. Після згортання крові сироватка відсмоктується в окрему пробірку і інактивується 30 хвилин при 56 ° С на водяній бані.

2. Антиген - завись убитих гонококів.

3. Еритроцити барана отримують із стерильно взятої де-фібринованої крові. Їх відмивають, центрифугуючи 3 рази з новими порціями фізіологічного розчину. У реакції використовують 3% завись еритроцитів.

4. Гемолітична сироватка готується заздалегідь шляхом імунізації кролів еритроцитами барана. Перед вживанням проводиться титрування сироватки.

5. Комплемент – свіжа сироватка морської свинки. З серця морської свинки шприцом насмоктується кров, після згортання відокремлюється сироватка. Перед досвідом вититрується робоча доза комплементу. Для цього беруть основне розведення комплементу 1:10 і розливають його пробірками від 0.1 до 0,5, після чого об'єм у кожній пробірці доводять фізіологічним розчином до 1,5 мл.

Одночасно заготовляють гемолітичну систему -розведена в потрійному титрі, гемолітична сироватка + 3% завись еритроцитів барана. Обидва інгредієнти в різних обсягах і витримують у термостаті 30 хвилин (сенсибілізація суміші), після чого суміш додають по 1 мл пробірки і поміщають в термостат на 30 хвилин. Контролем служать 2 пробірки:

1. 1 мл гемолітичної системи + 1,5 мл фізіологічного розчину;

2. 0,5 мл комплементу 1:10 + 0,5 мл суспензії еритроцитів + ​​1,5 мл фізіологічного розчину.

Титром комплементу називається його мінімальна кількість, коли ще відбувається гемоліз. Для постановки реакції беруть робочу дозу комплементу, збільшену проти титру на 20-25%, тобто, зазвичай, кількість комплементу, яка є в передостанній пробірці з гемолізом. Збільшення дози комплементу необхідне тому, що у реакції активність комплементу може виявитися дещо пригніченою іншими інгредієнтами реакції (антиген, сироватка).
43) РСК Вассермана

Ставиться для діагностики сифілісу з виявлення антитіл, і навіть визначення ефективності специфічної терапії. Вона ґрунтується на принципі реакції зв'язування комплементу Борде-Жангу. Істотною відмінністю реакції Вассермана є неспецифічність антигену: як антиген вживають ліпоїдні екстракти з нормальних органівтварин

Для постановки реакції Вассермана необхідно мати сироватку хворого, діагностикуми перехреснореагують антигени № 1, № 2, комплемент, гемолітичну сироватку, еритроцити барана, фізіологічний розчин.

Діагностикум №1 – специфічний, трепонемний.

Діагностикум № 2 – неспецифічний, кардіоліпіновий антиген, які є високоочищеними екстрактами бичачого серця, що мають постійний хімічний склад ліпоїдів. Ліпоїди, за хімічного складублизькі до ліпоїдів блідої трепонеми, тому, хоч і не є специфічними, але фіксують антитіла проти спірохети.

Зазначені антигени випускаються централізовано й у реакцію вживаються розведеними відповідно до титру, вказаному на етикетці.

Одночасно з основним досвідом ставлять 2 контролю: із свідомо негативною і із свідомо позитивною сироватками.

Постановка основного досвіду

Спочатку в 4 пробірки розливається інактивована та розведена 1:5 випробувана сироватка. Потім у 2 пробірки розливаються антигени (№ 1, № 2), у 3 пробірку - фізіологічний розчин. Після цього до всіх пробірок додається робоча доза комплементу. Після змішування інгредієнтів штатив з пробірками міститься в термостат при 37 ° С на 30 хвилин. Після витримування у термостаті до всіх пробірок додається гемолітична система. Пробірки знову поміщають у термостат на 2 години, потім залишають при кімнатній температурі. Наступного дня відзначають результат Ступінь інтенсивності реакції оцінюється, чотири плюси (++++), три (+++) два (++) та один (+) - залежно від інтенсивності забарвлення рідини та величини осаду еритроцитів на дні. Повний гемоліз позначається (-) мінусом. При різкому розбіжності результатів з різними антигенами повторюють досвід з новою порцією крові.
44) РІТ-р. Іммобілізація блідої трепонеми.

Цю реакцію застосовують як у діагностичних цілях, так і для розпізнавання хибнопозитивних результатівстандартних серологічних реакцій, особливо при прихованому сифілісі.

РІБТ полягає в тому, що в присутності іммобілізинів сироватки хворих на сифіліс і активний комплемент бліді трепонеми втрачають рухливість.

РИБТ ставлять у стерильних боксах. У реакції беруть участь випробувана сироватка, комплемент та антиген.

У РІБТ антигеном є завись блідих трепонем з яєчка кролика ранні терміни(7-8 діб після зараження) сифілітичного орхіту. Спеціальне середовище суспензії зберігає життєздатність блідих трепонемів не менше доби. У РІБТ застосовують комплемент морських свинок. РІБТ протікає в анаеробних умовах. Пробірки з інгредієнтами поміщають у мікроанаеростат, з якого відсмоктується атмосферне повітряі нагнітається газова суміш (95 частин азоту та 5 частин Вуглекислий газ). Мікроанаеростат з пробірками поміщають термостат (35°С) на 18-20 годин.

Паралельно з постановкою реакції роблять контрольні дослідженняз позитивною та негативною сироваткою крові, взятими з попереднього досвіду.

Оцінку результатів РІБТ проводять після отримання пробірок з термостата (тобто через 18-20 годин досвіду). Пастерівської піпеткою на предметне скло наносять краплю вмісту пробірки, яку накривають покривним склом та досліджують у темному полі мікроскопа (об'єктив 40, окуляр 10). При іммобілізації до 20% блідих трепонем реакцію вважають негативною, від 21 до 30% – сумнівною, від 31 до 50% слабопозитивною, від 51 до 100% – позитивною. Відсоток іммобілізації блідих трепонем визначають за спеціальною таблицею.

45) Опсоно-фагоцитарна реакція

Механізм: посилення фагоцитозу мікробних клітин під впливом співдружнього впливу антитіл, імунної сироватки та комплементу.

Компоненти реакції:

1) антиген – добова мікробна культура;

3) комплемент – свіжа сироватка морської свинки;

4) фагоцити – лейкоцитарна завись.

Опсоніни - це антитіла, які містяться в нормальних та імунних сироватках та готують мікроби до фагоцитозу.

Реакція ставиться у спеціальних пробірках при t = 37 ° хвилин. Потім з кожної пробірки готують мазки, вважають, 100 фагоцитів і визначають число фагоцитованихмікрсконтролі.

Опсонічний індекс = фагоцитарний показник. сироватки/фагоцитарний показник нормальної сироватки

Чим вищий опсонічний індекс (має бути >1), досліджувана сироватка, і, отже, тим вищий їм! бруцельоз).

Застосовується для визначення опсонінів - антитіл, що стимулюють фагоцитарну активність лейкоцитів, тобто. серодіагностики інфекцій, наприклад, бруцельозу.

Посилення фагоцитозу відбувається рахунок приєднання опсонинів з активними центрами (Рав-фрагмент) до детермінантів бактерій, та був з допомогою Рс-фрагментов до Рс-рецепторам фагоцитів. У нормальній сироватці міститься невелика кількість опсонінів, які виявляють свою дію у присутності комплементу. В імунній сироватці опсонінів більше, і їхня активність меншою мірою залежить від комплементу.

Компоненти:

Досліджувана сироватка

Нормальна сироватка

Добова мікробна культура (напр., стафілококова)

Фагоцити - завись нейтрофілів

Інкубація при 37 ° С протягом 30 хвилин. З кожної пробірки готують мазки, фарбують по Романівському-Гімзі і вважають під мікроскопом кількість бактерій, в 100 і більше нейгрофілах, тобто. визначають фагоцитарний показник.

Фагоцитарний показник – кількість мікробів, поглинених одним нейтрофілом.

Опсонічний індекс фагоцитарний показник імунної (досліджуваної) сироватки/фагоцитарний показник нормальної сироватки.

Чим вище опсонічний індекс (має бути > 1), тим вищий імунітет.

Опсоно-фагоцитарний індекс - це цифровий показник = кількість фагоцитів x оцінка фагоцитозу (залежно від кількості поглинених мікробів). Максимальний показник –75.

46) РН на мишах з метою встановлення екзотоксин

В основі цієї реакції лежить здатність специфічної антитоксичної сироватки нейтралізувати екзотоксин.

Антитіла імунної сироватки здатні нейтралізувати шкідливу дію мікробів або їх токсинів на чутливі клітини і тканини, що пов'язано з блокадою мікробних антигенів антитілами, тобто їх нейтралізацією.

Реакцію нейтралізації (РН) проводять шляхом введення суміші антиген-антитіло тварин або в чутливі тест-об'єкти (культуру клітин, ембріони). За відсутності у тварин та тест-об'єктів ушкоджуючої дії мікроорганізмів або їх антигенів, токсинів говорять про нейтралізуючу дію імунної сироватки і, отже, про специфічність взаємодії комплексу антиген-антитіло.

Для проведення реакції досліджуваний матеріал, в якому передбачається наявність екзотоксин, змішують з антитоксичною сироваткою, витримують у термостаті та вводять тваринам (морським свинкам, мишам). Контрольним тваринам вводять фільтрат досліджуваного матеріалу, не оброблений сироваткою. У разі, якщо відбудеться нейтралізація екзотоксину антитоксичною сироваткою, тварини дослідної групи залишаться живими. Контрольні тварини загинуть внаслідок дії екзотоксину.

Реакція нейтралізації екзотоксин відбувається при його взаємодії з антитоксичною сироваткою (антитіла-антитоксини). В результаті утворення комплексу антиген-антитіло токсин втрачає свої отруйні властивості.

Реакцію нейтралізації проводять з метою виявлення та титрування токсинів, анатоксинів або антитоксинів.

Токсини одержують шляхом фільтрування рідкої живильного середовищачи досліджуваного матеріалу, де розмножувалися токсигенні бактерії. При обробці формаліном протягом 30-45 днів при температурі 37°С токсин перетворюється на анатоксин, який використовують для імунізації тварин з метою одержання антитоксичної сироватки.

Реакція нейтралізації вvivo. Для визначення типу токсину його змішують з діагностичною антитоксичною сироваткою, і цю суміш вводять білим мишам. При нейтралізації токсину антитоксичною сироваткою миші не гинуть.

Реакцію нейтралізації використовують для визначення антитоксичного імунітету у дітей при дифтерії (проба Шика) та скарлатині (проба Діка). Для цього в область передпліччя внутрішньошкірно вводять певну кількість відповідного токсину (1/40 DLM). За наявності антитоксинів в організмі відбудеться нейтралізація токсину і реакція буде негативною. За відсутності антитоксинів в організмі виникає запальна реакціяна місці введення токсину.
47) РН (Реакція Нейтралізації) на мишах з метою ідентифікації вірусу кліщового енцефаліту

Вірус КЕ патогенний для низки лабораторних та диких тварин. Найбільшу чутливість мають новонароджені та молоді білі миші. Після зараження в мозок інтраперитонеально, внутрішньом'язово у цих тварин розвивається енцефаліт, що закінчується загибеллю тварин. З сільськогосподарських тварин найбільш сприйнятливі до вірусу КЕ кози, менш сприйнятливі вівці та корови, і слабко сприйнятливі коні. Вірус КЕ має цитопатогенну дію (ЦПД), викликаючи цитопатичні зміни в первинних і перевиваються культурах клітин нирок ембріона свині (СПЕВ та ПЕМ) і розмножується без вираженого ЦПД у багатьох інших клітинних культурах. У мозку інфікованих мишей та культуральної рідини заражених культур відбувається накопичення вірусу КЕ та специфічних вірусних антигенів: комплементзв'язуючих, гемагглютинуючих, преципітуючих та ін.

Вірус КЕ довгий часзберігається за низьких температур ( оптимальний режим-60 град. С і нижче) добре переносить ліофілізацію, у висушеному стані зберігається багато років, але швидко інактивується при кімнатній температурі. Кип'ятіння вбиває його через 2 хвилини, а гарячому молоці при 60 град. З гине через 20 хвилин.

Інактивуючу дію мають також формалін, фенол, спирт та інші дезінфікуючі речовини, ультрафіолетове випромінювання.

Реакція нейтралізації ґрунтується на здатності специфічних імунних сироваток гасити інфекційну дію вірусів. Застосовується у двох напрямках:

1) для типування виділених вірусів;

2) для титрування антитіл у сироватках перехворіли.

Постановка реакції:

1. На лабораторних тваринах. Критерієм наявності вірусу

служить загибель лабораторних тварин. Розраховується LD50

Граничне розведення вірусної суспензії, яке

викликало загибель 50% заражених тварин. Для

ідентифікації вірусу кліщового енцефаліту проводять

внутрішньомозкове зараження білих мишей.

2. У тканинних культурах. Облік результатів проводять

За цитопатичною дією (ЦПД)

За методом кольорової проби, що базується на зміні кольору

По гемадсорбції.

3. У Куриному ембріоні. Облік результатів проводиться за

появі оспін за хоріоналантоїсною оболонкою.

48) РТГА

Ця реакція застосовується у вірусологічній практиці:

Для визначення типу вірусу (на склі);

Для виявлення у сироватці хворих (розгорнута).

При постановці орієнтовної реакції гальмування гемаглютинації на скло наносять по 1 краплі імунних сироваток типоспецифічних, потім додають по 1 краплі випробуваного матеріалу і 1 краплі 5% суспензії еритроцитів.

Облік результатів: тип вірусу визначають по тій сироватці, з якою реакція не відбулася, оскільки імунна сироватка, специфічна для виділеного вірусу, пригнічує його гемаглютинуючу активність, і еритроцити не аглютинуються.
49) РІФ

Як мітки використовуються флюорохромні барвники, що світяться (ізотіоціонатфлюорисцеїну та ін.).

Існують різні модифікації РІФ. Для експрес-діагностики інфекційних захворювань - для виявлення мікробів або їх антигенів у матеріалі, що досліджується, застосовується РІФ по Кунсу.

Виділяють два методи РІФ за Кунсом: прямий і непрямий.

Компоненти прямої РІФ:

1) досліджуваний матеріал (випорожнення, що відокремлюється носоглоткою та ін);

2) мічена специфічна імунна сироватка, що містить АТ-ла до шуканого антигену;

3) ізотонічний розчин натрію хлориду.

Мазок з досліджуваного матеріалу обробляють міченою антисироваткою.

Відбувається реакція АГ-АТ. При люмінесцентному мікроскопічному дослідженні на тій ділянці, де локалізуються комплекси АГ-АТ, виявляють флюоресценцію - світіння.

Компоненти непрямої РІФ:

1) досліджуваний матеріал;

2) специфічна антисироватка;

3) антиглобулінова сироватка (АТ-ла проти імуноглобуліну), мічена флюорихромом;

4) Ізотонічний розчин хлориду натрію.

Мазок з досліджуваного матеріалу спочатку обробляють імунною сироваткою до антигену, а потім - міченою антиглобулінової сироваткою.

Комплекси АГ-АТ, що світяться, - мічені АТ виявляються за допомогою люмінесцентного мікроскопа.

Перевага непрямого методу полягає в тому, що немає необхідності приготування широкого набору флюоресціюючих специфічних сироваток, а застосовується лише одна антиглобулінова сироватка, що флюорескує.

Також виділяють 4-компонентний різновид непрямий РІФ, коли додатково вводиться комплемент (сироватка морської свинки). При позитивній реакції утворюється комплекс АГ-АТ – мічені – АТ-комплемент.

Реакція відноситься до серологічних реакційза участю мічених антигенів або антитіл.

Проводиться прямим та непрямим методами.

При прямому методівиявляють антиген у матеріалі від хворого. Використовується діагностична флюоресцентна сироватка, що містить імуноглобуліни, виділені з імунних сироваток та мічені флюорохромами.

Специфічний антиген виявляється у вигляді яскраво-зелених люмінесцентних конгломератів, а тло препарату забарвлюється в оранжево-червоний колір.

Компоненти реакції прямої імунофлюоресценції:

1) досліджуваний матеріал;

2) специфічна люмінесцентна сироватка;

3) люмінесцентний мікроскоп.

При діагностиці грипу проводять диференціацію від збудників парагрипу та аденовірусної інфекції. Носоглоточний мазок обробляють флюоресцентною грипозною сироваткою або грипозним імуноглобуліном.

"+" результат у вигляді зеленого світіння отримують через 3 години.

При непрямому методі проводять виявлення та титрування специфічних антитіл. Титром сироватки називається її максимальне розведення, у якому відзначається флюоресценція на «++».

Компоненти реакції непрямої імунофлюоресценції

Для пошуку антигену при експрес-діагностиці:

1) досліджуваний матеріал (антиген);

2) специфічна сироватка;

3) антиглобулінова люмінесцентна сироватка

4) люмінесцентний мікроскоп.

/ фаза специфічна

Сироваткові антитіла адсорбуються на антигені.

// фаза неспецифічна

Використовується антиглобулінова сироватка з антитілами, міченими флюорохромами. Утворюється комплекс антиген+антитіло (I) + антиглобулінова сироватка (II), що світиться.