Серологічні реакції. Реакція преципітації

Ця стаття буде присвячена явищу реакції преципітації. Тут ми розглянемо особливості постановки цього явища, явище дифузії, загальну характеристику, що у житті людини та багато іншого.

Ознайомлення із явищем

Преципітація - це серологічного типу, у ході якого відбувається взаємодія розчинних антигенів з антитілами і внаслідок цього спостерігається випадання осаду - преципітату.
Загальна характеристика реакції преципітації є формою узгодженого впливу антигену та антитіла. Такі типи взаємодії дозволяють визначати наявність невідомих антигенів у досліджуваній речовині за допомогою додавання відомих антитіл та антигенів. Процес преципітації без присутності солей протікатиме гірше, а найкращий оптимум лежить у межах діапазону від 7,0-7,4 pH.

Складові елементи реакції

Серед компонентів реакції преципітації виділяють три основні елементи:

1. Антиген, що має природу молекулярного характеру. Він перебуває у стані дрібнодисперсного типу, іншими словами, він розчинний. А також такий антиген називають преципітогеном, який є лізатом або екстрактом тканини та ін. Преципітоген має характерну відмінність від аглютиногену, яке укладено у розмірі частинок, з яких він складається. Аглютиногену властивий розмір клітин, а преципітогени порівнюються з величиною молекули. Розчин антигену характеризується прозорістю.
2. Антитіло, що знаходиться в сироватці людської крові, а також в імунній діагностичній сироватці, що містить у собі вивчені антитіла.
3. Електроліти - це розчин натрію хлорид, якому властиво ізотонічне стан.

Одержання преципітогену

Постановка реакції преципітації неможлива без преципітогену, який одержують за допомогою подрібнення матеріалів та вилучення з них антигенів білкової природи. Видобування відбувається за допомогою кип'ятіння чи інших способів.
Яскравим прикладом преципітогенів є лізати, а також тканинні та органні екстракти, сироватки крові, різноманітні види фільтратів, що базуються на бульйонних культурах з мікробів, а також сольовий екстракт мікроорганізмів та аутолізатні речовини.

Постановка у преципітації

Тепер розглянемо спосіб постановки реакції преципітації.
Проводиться кільцепреципітаційна реакція, яка протікає у спеціально підготовлених пробірках. У порожнину посуду вносять сироватку, розливаючи її на стіні з допомогою носика піпетки. Далі, зверху акуратно виробляють нашарування відповідної кількості преципітогену, а потім пробірку приводять у вертикальне положення з горизонтального. Постановка та облік реакції преципітації - це дуже скрупульозні операції. Облік результату проводиться після появи білого кільця на межі між антигеном та антитілом. Якщо елементи реакції, що реагують, відповідають один одному, то вони зв'язуються, але це стає помітним після тривалого проміжку часу їх взаємодії.
Реакцію преципітації проводять також у чашці Петрі або на предметному склі, куди переносять агаровий гель, завдаючи його невеликим шаром. Після його застигання в гелі вирізують невелику кількість лунок, які будуть поміщені антигени і антитіла. Існує два способи здійснення подібної дії: метод радіальної імунодифузії та подвійної імунодифузії.

Загальні відомості

Механіка роботи преципітації схожа на пристрій аглютинації. Піддаючись впливу сироватки імунного типу, антиген, що вже вступив у реагування, зменшує свою важливу умову є прозорість як сироватки, так і антигену.
Поліпшити реєстрацію реакції можна в тому випадку, якщо здійснювати нашарування антигенів на антитіла. Внаслідок цього можна спостерігати появу преципітатів у формі кільця. Це називається кільцепреципітацією і проводиться у спеціальних пробірках, мають діаметр від 2,5 до 3,5 мм. Одним із найпоширеніших прикладів реакції преципітації може бути діагностування сибірки.
Преципітація дає змогу визначати рівень токсигенності дифтерійної культури у агарі.
У ході аналізованої реакції відбувається осадження антигенних комплексів та антитіл. Преципітація є імунологічним феноменом, що дозволяє визначати кількість вмісту антитіл у сироватках крові хворої або вакцинованої людини та тварин.

Наслідок титрування

Важливо знати, що дані, отримані шляхом титрування вищезазначеного методу, не мають кількісного виразу. Щоб створити і проаналізувати кількісну оцінку антитіл, що міститься, була розроблена М. Гейдельбергером і Е. Кабатом спеціальна методика реакції, в основі якої залягає пошук і виявлення зони еквівалентності. Змішування вікового числа антигенів з постійною величиною об'єму антисироватки призводить до зростання преципітату, що спочатку утворюється, а далі знову відбувається його зниження внаслідок збільшення здатності до розчинення комплексів антигену. Визначивши кількість антитіл у надосадових рідинах, що містяться в кожній пробірці, можна виявити, що у певному числі посуду з антитілами рідина буде відсутня. Тут буде утворено, порівняно з іншими пробірками, найбільший преципітат. Завдяки цьому і віднімання із загальної величини білків антигенного білкового преципітату, можна отримати точну величину антитіл, що містяться в обсязі конкретно досліджуваної сироватки. Далі кількість білкових молекул преципітату визначається за кількістю азоту або за допомогою колориметричних методів.

Оцінка значень

Оцінка значень преципітації в діагностичній методології повинна враховувати ймовірність наявності в імунній сироватці антитіла, що не має властивості преципітину, з чого випливає, що сам преципітат може не утворитися після реагування з антигенами. До списку таких молекул входять неповні антитіла та деякі види групи гамма-А-глобулінів.

Реакція преципітації за умов лабораторій знаходить своє застосування у різноманітних видах модифікацій. Наприклад, реакція термопреципітації застосовується виявлення бактеріальних антигенів ботулізму, сибірських виразок тощо. буд., які піддаються денатурації термічного типу. На відміну від кільцепреципітації, подібний тип реакції використовує фільтрати матеріалу, що розглядається в прокип'яченому стані.
преципітації у складній суміші не дозволяє давати характеристику властивостям окремих елементів суміші. У таких випадках людина вдається до методу преципітації в агарі, а також використовують імуноелектроферез.

Преципітація дифузного характеру

У цій галузі досліджень існує поняття про реакцію дифузної преципітації (РПД). Вона ґрунтується на здібностях до дифузії в гелі антитіл і розчинених антигенів. Дифузія - це вміння молекули певної речовини проникати в молекули іншої, що обумовлюється тепловим рухом.
Гель - це система дисперсного типу, в якій рідинна фаза рівномірно розподіляється в твердій фазі. Найчастіше для такої реакції експлуатують гель агару.
Після надання параметрів, за умов яких молекули зможуть дифундувати по відношенню один до одного, їхня зустріч супроводжуватиметься утворенням комплексу антигену + антитіло. Таке новоутворення здатне дифундувати, перебуваючи в самому гелі, і воно випадатиме в осад, набуваючи смуги, яку можна виявити неозброєними очима. У разі гомологічності антигену та антитіла смуга утворюватися не буде.
Створення умов, у яких проходитиме дифузія, перебуваючи в агаровом шарі, передбачає заливку компонентів, тоді як загальна кількість лунок та його взаєморозташування визначається типом завдання, яку потрібно вирішити. РПД дає людині можливість виявляти та ідентифікувати невідомі виділені віруси за допомогою дослідження, з використанням свідомо відомої сироватки з антитіл.

Застосування

Преципітація широко використовується у діагностиці захворювань, а й знаходить своє застосування в судово-медичної експертизі. Важко уявити аналіз, у якому можна визначити видову приналежність крові, частини органу чи тканини, знайденого знаряддям злочину, у якому використовується реакція преципітації. У ході цього процесу використовують преципітуючі сироватки, які отримують шляхом імунізації різних тварин та птахів. Важливо, щоб рівень титру в сироватці був не менше 1:10000, а також він повинен мати достатню специфічність. З виявленої цятки крові або її скоринки виготовляють витяжку на фіз. розчині, яка надалі буде схильна до впливу преципітуючої сироватки. За цією реакції можна встановлювати види тканинних та органних білків як людини, так і тварини. Отримання каламутних витяжок змушує вдаватися до преципітації на агарі.

Висновки

Аналізуючи прочитану інформацію, можна зробити висновок, що реакції преципітації вкрай важливі для людини, оскільки дозволяють діагностувати різні антигени за допомогою антитіл, також дане явище широко застосовується в судово-медичній експертизі і дозволяє ідентифікувати тип крові, тканини або органу стосовно конкретного суб'єкта. Існує кілька видів і способів преципітації, які використовуються відповідно до потреб потреб вирішуваної задачі.

Реакція преципітації (РП) - це формування та осадження комплексу молекулярного розчинного антигену з антитілами у вигляді помутніння, званого преципітатом. Він утворюється при змішуванні антигенів та антитіл в еквівалентних кількостях; надлишок одного з них знижує рівень утворення імунного комплексу.

РП ставлять в пробірках (реакція кільцепреципітації), в гелях, поживних середовищах та ін.

Механізм. Проводиться з прозорими колоїдними розчинними антигенами, які екстраговані з патологічного матеріалу, об'єктів зовнішнього середовища або чистих культур бактерій. У реакції використовують прозорі діагностичні преципітуючі сироватки з високими титрами антитіл. За титр преципітуючої сироватки приймають найбільше розведення антигену, яке при взаємодії з імунною сироваткою викликає утворення видимого преципітату -помутніння.

Реакція кільцепреципітації ставиться у вузьких пробірках (діаметр 0,5 см), в які вносять по 0,2-0,3 мл сироватки, що преципітує. Потім пастерівською піпеткою повільно нашаровують 0,1-0,2 мл розчину антигену. Пробірки обережно переводять у вертикальне положення. Облік реакції проводять через 1-2 хв. У разі позитивної реакції на кордоні між сироваткою і досліджуваним антигеном з'являється преципітат у вигляді білого кільця. У контрольних пробірках преципітату не утворюється.

15. Реакція за участю комплементу: реакція гемолізу, реакція зв'язування комплементу. Механізм, компоненти, застосування.

Реакція зв'язування комплементу (РСК) полягає в тому, що відповідно один одному антигени і антитіла утворюють імунний комплекс, до якого через Fc-фрагмент антитіл приєднується комплемент (С), тобто відбувається зв'язування комплементу комплексом антиген-антитіло. Якщо ж комплекс антиген-антитіло не утворюється, то комплемент залишається вільним.

Специфічна взаємодія АГ та AT супроводжується адсорбцією (зв'язуванням) комплементу. Оскільки процес зв'язування комплементу не проявляється візуально, Ж. Борде та О. Жангу запропонували використовувати як індикатор гемолітичну систему (еритроцити барана + гемолітична сироватка), яка показує, чи комплемент фіксовано.

комплексом АГ-АТ. Якщо АГ та AT відповідають один одному, тобто утворився імунний комплекс, то комплемент зв'язується цим комплексом і гемолізу не відбувається. Якщо AT відповідає АГ, то комплекс не утворюється і комплемент, залишаючись вільним, з'єднується з другою системою і викликає гемоліз.

компоненти. Реакція зв'язування комплементу відноситься до складних серологічних реакцій. Для її проведення необхідні 5 інгредієнтів, а саме: АГ, AT та комплемент (перша система), еритроцити барана та гемолітична сироватка (друга система).

Антигеном для РЗК можуть бути культури різних вбитих мікроорганізмів, їх лізати, компоненти бактерій, патологічно змінених і нормальних органів, тканинних ліпідів, віруси та матеріали, що містять вірус.

Як комплемент використовують свіжу або суху сироватку морської свинки.

Механізм. РСК проводять у дві фази: 1-а фаза - інкубація суміші, що містить три компоненти антиген + антитіло + комплемент; 2-я фаза (індикаторна) - виявлення суміші вільного комплементу шляхом додавання до неї гемолітичної системи, що складається з еритроцитів барана, і гемолітичної сироватки, що містить антитіла до них. У 1-й фазі реакції при утворенні комплексу антиген-антитіло відбувається зв'язування ним комплементу, і тоді у 2-й фазі гемолізу сенсибілізованих антитілами еритроцитів не відбудеться; реакція позитивна. Якщо антиген і антитіло не відповідають один одному (у досліджуваному зразку немає антигену або антитіла), комплемент залишається вільним і у 2-й фазі приєднається до комплексу еритроцит - антитірітроцитарне антитіло, викликаючи гемоліз; реакція негативна. Застосування. РЗК застосовують для діагностики багатьох інфекційних хвороб, зокрема сифілісу (реакція Вассермана)

Імунодіагностичні реакції. Реакції антиген-анітелу та реакції з міченими компонентами. Використання з метою ідентифікації мікроорганізмів та діагностики інфекційних захворювань.

Імунні реакції використовують при діагностичних та імунологічних дослідженнях у хворих та здорових людей. З цією метою застосовують серологічні методи(Від лат. serum - сироватка та logos - вчення), тобто методи вивчення антитіл та антигенів за допомогою реакцій антиген-антитіло, що визначаються в сироватці крові та інших рідинах, а також тканинах організму.

Виявлення в сироватці крові хворого на антитіл проти антигенів збудника дозволяє поставити діагноз хвороби. Серологічні дослідження застосовують також для ідентифікації антигенів мікробів, різних біологічно активних речовин, груп крові, тканинних та пухлинних антигенів, імунних комплексів, рецепторів клітин та ін.

При виділенні мікроба від хворого проводять ідентифікацію збудника шляхом вивчення його антигенних властивостей за допомогою імунних діагностичних сироваток, тобто сироваток крові гіперімунізованих тварин, що містять специфічні антитіла. Це так звана серологічна ідентифікаціямікроорганізмів.

У мікробіології та імунології широко застосовуються реакції аглютинації, преципітації, нейтралізації, реакції за участю комплементу, з використанням мічених антитіл та антигенів (радіоімунологічний, імуноферментний, імунофлюоресцентний методи). Перелічені реакції розрізняються за ефектом, що реєструється, і технікою постановки, проте, всі вони осно- . вани на реакції взаємодії антигену з антитілом і застосовуються для виявлення як антитіл, так і антигенів. Реакції імунітету характеризуються високою чутливістю та специфічністю.

Нижче наводяться принципи та схеми основних імунодіагностичних реакцій. Детальна техніка постановки реакцій дана в. практичних посібниках з імунодіагностики.

Реакція аглютинації – РА(Від лат. aggluti- natio- склеювання) - проста постановка реакція, при якій відбувається зв'язування антитілами корпускулярних антигенів (бактерій, еритроцитів або інших клітин, нерозчинних частинок з адсорбованими на них антигенами, а також макромолекулярних агрегатів). Вона протікає за наявності електролітів, наприклад, при додаванні ізотонічного розчину натрію хлориду.

Застосовуються різні варіанти реакції аглютинації: розгорнута, орієнтовна, непряма та ін. Реакція аглютинації проявляється утворенням пластівців або осаду

РА використовують для:

визначення антитіл у сироватці крові хворих, наприклад, при бруцельозі (реакції Райта, Хеддельсона), черевному тифі та паратифах (реакція Відаля) та інших інфекційних хворобах;

визначення збудника, виділеного від хворого;

визначення груп крові з використанням моноклональних антитіл проти ало-антигенів еритроцитів.

Для визначення у хворого антитіл ставлятьрозгорнуту реакцію аглютинації:до розведення сироватки крові хворого додають діагностикум(завись вбитих мікробів,) і за кілька годин інкубації при 37 °З відзначають найбільше розведення сироватки (титр сироватки), у якому відбулася аглютинація, т. е. утворився осад.

Характер і швидкість аглютинації залежить від виду антигену і антитіл. Прикладом є особливості взаємодії діагностикумів (О та Я-антигенів) зі специфічними антитілами. Реакція аглютинації з О-діагностикумом(бактерії, вбиті нагріванням, що зберегли термостабільний О-антиген)відбувається у вигляді дрібнозернистої аглютинації. Реакція аглютинації з Н-діагностикумом (бактерії, вбиті формаліном, що зберегли термолабільний джгутиковий Н-антиген) - великобавовняна і протікає швидше.

Якщо потрібно визначити збудник, виділений від хворого, ставлять орієнтовну реакцію аглютинації,застосовуючи діагностичні антитіла (аглютинуючу сироватку), тобто проводять серотипування збудника. Орієнтовну реакцію проводять на предметному склі. До краплі діагностичної аглютинуючої сироватки у розведенні 1:10 або 1:20 додають чисту культуру збудника, виділеного від хворого. Поруч ставлять контроль: замість сироватки наносять краплю розчину хлориду натрію. При появі в краплі із сироваткою та мікробами пластівеподібного осаду ставлять розгорнуту реакцію аглютинаціїв пробірках з розведеннями, що збільшуються, агглютинирующей сироватки, до яких додають по 2-3 краплі суспензії збудника. Аглютинацію враховують за кількістю осаду та ступенем просвітлення рідини. Реакцію вважають позитивною, якщо аглютинація відзначається у розведенні, близькому до титру діагностичної сироватки. Одночасно враховують контролі: сироватка, розведена ізотонічним розчином хлориду натрію, повинна бути прозорою, завись мікробів в тому ж розчині - рівномірно каламутною, без осаду.

Різні споріднені бактерії можуть аглютинуватися однією і тією ж діагностичною аглютинуючою сироваткою, що ускладнює їх ідентифікацію. Тому користуються адсорбованими аглютинуючими сироватками,з яких видалені перехресно реагують антитіла шляхом адсорбції їх родинними бактеріями. У таких сироватках зберігаються антитіла, специфічні лише до цієї бактерії. Отримання таким:^особом монорецепторних діагностичних аглютинуючих сироваток було запропоновано А. Кастеляні (1902).

Реакція непрямої (пасивної) гемаглютинації (РНГА, РПГА) заснована на використанні еритроцитів з адсорбованими на їх поверхні антигенами або антитілами, взаємодія яких з відповідними антитілами або антигенами сироватки крові бальних викликає склеювання та випадання еритроцитів на дно пробірки або комірки ввигляді фестончастого осаду (рис. 13.2). При негативній реакції еритроцити осідають у вигляді «гудзика». Зазвичай у РНГА виявляють антитіла за допомогою антигенного еритроцитарного діагностикуму, який є еритроцитами з адсорбованими. наних антигенами. Іноді застосовують антильні еритроцитарні діагностики, на яких адсорбовані антитіла. Наприклад, можна виявити ботулінічний токсин, додаючи до нього еритроцитарний антильний ботулінічний діагностикум (таку реакцію називають реакцією зворотної непрямої гемаглютинації- РОНГА). РНГА застосовують для діагностики інфекційних хвороб, визначення гонадотропного гормону. всечі при встановленні вагітності, для виявлення підвищеної чутливості до лікарських препаратів, гормонів та деяких інших випадках.

Реакція коаглютинації . Клітини збудника визначають за допомогою стафілококів, попередньо оброблених імунною діагностичною сироваткою. Стафілококи, що містять білок А,має спорідненість до Fc -фрагменту імуноглобулінів, неспецифічно адсорбують антимікробні антитіла, які потім взаємодіють активними центрами з відповідними мікробами, виділеними від хворих. В результаті коаглютинації утворюються пластівці, що складаються зі стафілококів, антитіл діагностичної сироватки та обумовленого мікроба.

Реакція гальмування гемаглютинації (РТГА) заснована на блокаді, придушенні антигенів вірусів антитілами імунної сироватки, внаслідок чого віруси втрачають властивість аглютинувати еритроцити (рис. 13.3). РТГА застосовують для діагностики багатьох вірусних хвороб, збудники яких (віруси грипу, кору, краснухи, кліщового енцефаліту та ін) можуть аглютинувати еритроцити різних тварин.

Реакцію аглютинації для визначення груп крові застосовують для встановлення системи АВО (див. Розд. 10.1.4.1) за допомогою аглютинації еритроцитів антитілами імунної сироватки проти антигенів груп крові А (II), В (III). Контролем служать: сироватка, що не містить антитіл, тобто сироватка AB (ГУ)групи крові; антигени, що містяться в еритроцитах груп А (ІІ), В (ІІІ). Негативний контроль не містить антигенів, тобто використовують еритроцити групи 0 (І).

У реакції аглютинації для визначення резус-фактора(див. Розд. 10.1.4.1) використовують антирезусні сироватки (не менше двох різних серій). За наявності на мембрані досліджуваних еритроцитів резус-антигена відбувається аглютинація цих клітин. Контролем служать стандартні резус-позитивні та резус-негативні еритроцити всіх груп крові.

Реакцію аглютинації визначення антирезусних антитіл (непряму реакцію Кумбса)застосовують у хворих при внутрішньосудинному гемолізі. У деяких хворих виявляють антирезусні антитіла, які є неповними, одновалентними. Вони специфічно взаємодіють із резус-позитивними еритроцитами, але не викликають їх аглютинації. Наявність таких неповних антитіл визначають у непрямій реакції Кумбса. Для цього в систему антирезусні антитіла + резус-позитивні еритроцити додають антиглобулінову сироватку (антитіла проти імуноглобулінів людини), що спричиняє аглютинацію еритроцитів (рис. 13.4). За допомогою реакції Кумбса діагностують патологічні стани, пов'язані з внутрішньосудинним лізисом еритроцитів імунного генезу, наприклад, гемолітичну хворобу новонароджених: еритроцити резус-позитивного плоду з'єднуються з циркулюючими в крові неповними антитілами до резус-фактору, які перейшли через резус-фактор.

Реакції преципітації

Реакція преципітації - РП (відлат. praeci-pito- осаджувати,) - це формування та осадження комплексу розчинного молекулярного антигену з антитілами у вигляді помутніння, званого преципітатом.Він утворюється при змішуванні антигенів та антитіл в еквівалентних кількостях; надлишок одного з них знижує рівень утворення імунного комплексу.

Реакції преципітації ставлять у пробірках (Реакція кільцепреципітації),у гелях, поживних середовищах та ін. Широкого поширення набули різновиди реакції преципітації в напіврідкому гелі агару або агарози: подвійна імунодифузія по Оухтерлоні. радіальна імунодифузія, імуноелектро-форезта ін.

Реакція кільцепреципітації . Реакцію проводять у вузьких преципітаційних пробірках з імунною сироваткою, на яку нашаровують розчинний антиген. При оптимальному співвідношенні антигену та антитіл на межі цих двох розчинів утворюється непрозоре кільце преципітату (рис. 13.5). Надлишок антигену не впливає на реакцію кільцепреципітації внаслідок поступової дифузії реагентів до межі рідини. Якщо як антигени в реакції кільцепреципітації використовують прокип'ячені і профільтровані водні екстракти органів або тканин, то така реакція називається реакцією термопреципіта- ІІІ (реакція Асколі,при сибірці/

Реакція подвійної імунодифузії по Оухтерюні . Для постановки реакції розтоплений агаровий гель тонким шаром виливають на скляну пластинку і після затвердіння в ньому вирізають лунки розміром 2-3 мм. У ці лунки роздільно поміщають антигени та імунні сироватки, які дифундують назустріч один одному. У місці зустрічі в еквівалентних співвідношеннях вони утворюють преципітату у вигляді білої смуги. У багатокомпонентних систем між лунками з різними антигенами та антитілами сироватки з'являється кілька ліній преципітату; у ідентичних антигенів лінії преципітату зливаються; у неідентичних – перетинаються (рис. 13.6).

Реакція радіальної імунодифузії . Імунну сироватку з розплавленим агаровим гелем поступово наливають на скло. Після застигання в гелі роблять лунки, які поміщають антиген в різних розведеннях. Антиген, дифузуючи в гель, утворює з антитілами кільце- зони преципітації навколо лунок (рис. 13.7). Діаметр кільця преципітації пропорційний концентрації антигену. Реакцію використовують для визначення вмісту в крові імуноглобулінів різних класів, компонентів системи комплементу та ін.

Імуноелектрофорез- поєднання методу електрофорезу та імунопреципітації: суміш антигенів вноситься в лунки гелю і поділяється в гелі за допомогою електрофорезу. Потім у канавку паралельно зонам електрофорезу зносять імунну сироватку, антитіла якої, дифузуючи в гель, утворюють у місці - зустрічі з антигеном лінії преципітації.

Реакція флоккуляції(за Рамоном) (від лат. floccus -пластівці вовни) - поява опалесценції або пластів'єподібної маси (імунопреципітації) в пробірці при реакції токсин-антитоксин або анатоксин-антитоксин. Її застосовують визначення активності антитоксичної сироватки чи анатоксина.

Імунна електронна мікроскопія- Електронна мікроскопія мікробів, частіше вірусів, оброблених відповідними антитілами. Віруси, оброблені імунною сироваткою, утворюють імунні агрегати (мікропреципітати). Навколо віріонів утворюється «віночок» з антитіл, контрастований фосфорновольфрамовою кислотою або іншими електронно-оптично щільними препаратами.

Реакції за участю комплементу

Реакції за участю комплементузасновані на активації комплементу комплексом антиген-антитіло (реакція зв'язування комплементу, радіального гемолізу та ін.).

Реакція зв'язування комплементу (РСК) полягає в тому, що відповідно один одному антигени і антитіла утворюють імунний комплекс, до якого через Fc -Фрагмент антитіл приєднується комплемент (С), тобто відбувається зв'язування комплементу комплексом антиген-антитіло. Якщо ж комплекс антиген-антитіло не утворюється, то комплемент залишається вільним (рис. 13.8). РСК проводять у дві фази: 1-а фаза - інкубація суміші, що містить три компоненти антиген + антитіло + комплемент; 2-я фаза (індикаторна) - виявлення суміші вільного комплементу шляхом додавання до неї гемолітичної системи, що складається з еритроцитів барана, і гемолітичної сироватки, що містить антитіла до них. У 1-й фазі реакції при утворенні комплексу антиген-антитіло відбувається зв'язування ним комплементу, і тоді у 2-й фазі гемолізу сенсибілізованих антитілами еритроцитів не відбудеться; реакція позитивна. Якщо антиген і антитіло не відповідають один одному (у досліджуваному зразку немає антигену або антитіла), комплемент залишається вільним і у 2-й фазі приєднається до комплексу еритроцит - антиеритроцитарне антитіло, викликаючи гемоліз; реакція негативна.

РЗК застосовують для діагностики багатьох інфекційних хвороб, зокрема сифілісу (реакція Вассермана).

Реакцію радіального гемолізу (РРГ) ) ставлять у лунках гелю з агару, що містить еритроцити барана та комплемент. Після внесення в лунки гелю гемолітичної сироватки (антитіл проти еритроцитів барана) навколо них (внаслідок радіальної дифузії антитіл) утворюється зона гемолізу. Таким чином можна визначити активність комплементу та гемолітичної сироватки, а також антитіла у сироватці крові у хворих на грип, краснуху, кліщовий енцефаліт. Для цього на еритроцитах адсорбують відповідні антигени вірусу, а лунки гелю, що містить дані еритроцити, додають сироватку крові хворого. Противірусні антитіла взаємодіють з вірусними антигенами, адсорбованими на еритроцитах, після чого

го до цього комплексу приєднуються компоненти комплементу, викликаючи гемоліз.

Реакція імунного прилипання (РІП) ) заснована на активації системи комплементу корпускулярними антигенами (бактеріями, вірусами), обробленими імунною сироваткою. Внаслідок цього утворюється активований третій компонент комплементу (СЗЬ), який приєднується до корпускулярного антигену у складі імунного комплексу. На еритроцитах, тромбоцитах, макрофагах є рецептори для СЗЬ, завдяки чому при змішуванні цих клітин з імунними комплексами, що несуть СЗЬ, відбуваються їх з'єднання та аглютинація.

Реакція нейтралізації

Антитіла імунної сироватки здатні нейтралізувати шкідливу дію мікробів або їх токсинів на чутливі клітини і тканини, що пов'язано з блокадою мікробних антигенів антитілами, тобто їх нейтралізацією. Реакцію нейтралізації(РН) проводять шляхом введення суміші антиген-антитіло тварин або в чутливі тест-об'єкти (культуру клітин, ембріони). За відсутності у тварин та тест-об'єктів ушкоджуючої дії мікроорганізмів або їх антигенів, токсинів говорять про нейтралізуючу дію імунної сироватки і, отже, про специфічність взаємодії комплексу антиген-антитіло (рис. 13.9).

Реакція імунофлюоресценції – РІФ (метод Кунса)

Розрізняють три основні різновиди методу: прямий, непрямий (рис. 13.10) з комплементом. Реакція Кунса є методом експрес-діагностики виявлення антигенів мікробів або визначення антитіл.

Прямий метод РІФ заснований на тому, що антигени тканин або мікроби, оброблені імунними сироватками з антитілами, міченими флюорохромами, здатні світитися в УФ променях люмінесцентного мікроскопа.

Бактерії в мазку, оброблені такою люмінесцентною сироваткою, світяться по периферії клітини у вигляді облямівки зеленого кольору.

Непрямий метод РІФ полягає у виявленні комплексу антиген-антитіло за допомогою антиглобулінової (проти антитіла) сироватки, міченої флюорохромом. Для цього мазки з суспензії мікробів обробляють антитілами антимікробної кролячої діагностичної сироватки. Потім антитіла, які не зв'язувалися антигенами мікробів, відмивають, а антитіла, що залишилися на мікробах, виявляють, обробляючи мазок антиглобулінової (антикроличої) сироваткою, міченою флюорохромами. В результаті утворюється комплекс мікроб + антимікробні кролячі антитіла + антикроличі антитіла, мічені флюорохромом. Цей комплекс спостерігають у люмінесцентному мікроскопі, як і за прямого методу.

Імуноферментний метод, або аналіз (ІФА)

ІФА -виявлення антигенів за допомогою відповідних їм антитіл, кон'югованих з ферментом-міткою (пероксидазою хрону, бета-галактозидазою або лужною фосфатазою). Після з'єднання антигену з міченою ферментом імунною сироваткою суміш додають субстрат/хромоген. Субстрат розщеплюється ферментом, і змінюється колір продукту реакції - інтенсивність забарвлення прямо пропорційна кількості молекул антигену і антитіл, що зв'язалися.

Твердофазний ІФА - найбільш поширений варіант імунологічного тесту, коли один із компонентів імунної реакції (антиген або антитіла) сорбований на твердому носії, наприклад у лунках полістиролових планшеток

При визначенні антитіл у лунки планшеток із сорбованим антигеном послідовно додають сироватку крові хворого, антиглобулінову сироватку, мічену ферментом, та субстрат (хромоген) для ферменту.

Щоразу після додавання чергового компонента з лунок видаляють реагенти, що не зв'язалися, шляхом ретельного промивання. При позитивному результаті змінюється колір хромогену розчину. Твердофазний носій можна сенсибілізувати як антигеном, а й антитілами. Тоді лунки з сорбованими антитілами вносять шуканий антиген, додають імунну сироватку проти антигену, мічену ферментом, а потім субстрату для ферменту.

Конкурентний варіант ІФА . потрібний антиген і мічений ферментом антиген конкурують один з одним за зв'язування обмеженої кількості антитіл імунної сироватки. Інший тест - шукані антитіла

та мічені антитіла конкурують один з одним за антигени.

Радіоімунологічний метод, або аналіз (РІА)

Високочутливий метод, заснований на реакції антиген-антитіло із застосуванням антигенів або антитіл, мічених радіонуклідом (125 J, 14 С, 3 Н, 51 Сг та ін.). Після їх взаємодії відокремлюють радіоактивний імунний комплекс, що утворився, і визначають його радіоактивність у відповідному лічильнику (бета- або гамма-випромінювання):

інтенсивність випромінювання прямо пропорційна кількості молекул антигену і антитіл, що зв'язалися.

При твердофазному варіанті РІА один із компонентів реакції (антиген або антитіла) сорбований на твердому носії, наприклад, у лунках мікропанелей з полістиролу. Інший варіант методу - Конкурентний РІА.потрібний антиген і мічений радіонуклідом антиген конкурують один з одним за зв'язування обмеженої кількості антитіл імунної сироватки. Цей варіант використовують визначення кількості антигену в досліджуваному матеріалі.

РІА застосовують виявлення антигенів мікробів, визначення гормонів, ферментів, лікарських речовин та імуноглобулінів, і навіть інших речовин, які у досліджуваному матеріалі в мінорних концентраціях - 10~ |0 -И0~ 12 г/л. Метод представляє певну екологічну небезпеку.

Імуноблот

Імуноблот (ІБ)- Високочутливий метод, заснований на поєднанні електрофорезу та ІФА або РІА.

Антиген виділяють за допомогою електрофорезу в поліакриламідному гелі, потім переносять його (блот - від англ. blot, пляма) з гелю на активований папір або нітроцелюлозну мембрану і виявляють за допомогою ІФА. Фірми випускають такі смужки із «блотами»

антигенів. На ці смужки наносять сироватку хворого. Потім після інкубації відмивають від антитіл хворого, що не зв'язалися, і наносять сироватку проти імуноглобулінів людини, мічену ферментом. Комплекс антиген + антитіло хворого + антитіло проти Ig людини, що утворився на смужці, виявляють додаванням субстрату/хромогену, що змінює забарвлення під дією ферменту (рис. 13.12).

ІБ використовують як діагностичний метод при ВІЛ-інфекції та ін.

13.1. Реакції антиген-антитіло та їх застосування

При введенні антигену організмі утворюються антитіла. Антитіла комплементарні антигену, що викликав їхній синтез, і здатні з ним зв'язуватися. Зв'язування антигенів з антитілами складається із двох фаз. Перша фаза - специфічна, коли відбувається швидке зв'язування антигенної детермінанти з активним центром Fab-фрагменту антитіл. Слід зазначити, що зв'язування обумовлено ван-дер-ваальсовими силами, водневими та гідрофобними взаємодіями. Міцність зв'язку визначається ступенем просторової відповідності активного центру антитіла та епітопу антигену. Після специфічної фази настає повільніша - неспецифічна, яка проявляється видимим фізичним явищем (наприклад, утворенням пластівців при аглютинації та ін.).

Імунні реакції - це взаємодія між антитілами і антигенами, причому ці реакції специфічні і мають високу чутливість. Вони широко використовуються у медичній практиці. За допомогою імунних реакцій можна вирішити такі завдання:

Визначення невідомих антитіл за відомими антигенами (антигенний діагностикум). Таке завдання стоїть, коли необхідно визначити у сироватці крові хворого антитіл до збудника (серодіагностика). Знаходження антитіл дозволяє підтвердити діагноз;

Визначення невідомих антигенів за відомими антитілами (діагностична сироватка). Це дослідження проводять за ідентифікації культури збудника, виділеної з матеріалу хворого (серотипування), а також при виявленні

антигенів мікробів та їх токсинів у крові та інших біологічних рідинах. Існує багато різновидів імунних реакцій, що відрізняються за технікою постановки та реєструється ефект. Це реакції аглютинації (РА), преципітації (РП), реакції за участю комплементу (РСК), реакції з використанням мічених компонентів (РІФ, ІФА, РІА).

13.2. Реакція аглютинації

Реакція аглютинації (РА) – це імунна реакція взаємодії антигену з антитілами у присутності електролітів, причому антиген знаходиться у корпускулярному стані (еритроцити, бактерії, частинки латексу з адсорбованими антигенами). При аглютинації відбувається склеювання корпускулярних антигенів антитілами, що проявляється утворенням пластівцевого осаду. Освіта пластівців відбувається з допомогою те, що антитіла мають два активних центру, а антигени поливалентны, тобто. мають кілька антигенних детермінантів. РА застосовують для ідентифікації збудника, виділеного з матеріалу хворого, а також для виявлення у сироватці крові хворого антитіл до збудника (наприклад, реакції Райта та Хеддлсона при бруцельозі, реакція Відаля при черевному тифі та паратифах).

Найпростіший спосіб постановки РА - реакція на склі, це орієнтовна РА, яка застосовується визначення збудника, виділеного від хворого. При постановці реакції на предметне скло наносять діагностичну аглютинуючу сироватку (в розведенні 1:10 або 1:20), потім вносять культуру від хворого. Реакція позитивна, якщо в краплі з'являється пластівцевий осад. Поруч ставлять контроль: замість сироватки наносять краплю розчину хлориду натрію. Якщо діагностична аглютинуюча сироватка неадсорбована 1 то її розводять (до титру - розведення, до якого повинна відбуватися аглютинація), тобто. ставлять розгорнуту РА в пробірках з зростаючими

1 Неадсорбована аглютинуюча сироватка може аглютинувати споріднені бактерії, що мають загальні (перехресно реагують) антигени. Тому користуютьсяадсорбованими аглютинуючими сироватками, з яких видалені перехресно реагують антитіла шляхом адсорбції їх родинними бактеріями. У таких сироватках зберігаються антитіла, специфічні лише до цієї бактерії.

розведеннями аглютинуючої сироватки, до яких додають по 2-3 краплі суспензії збудника, виділеного від хворого. Аглютинацію враховують за кількістю осаду та ступенем просвітлення рідини у пробірках. Реакцію вважають позитивною, якщо аглютинація відзначається у розведенні, близькому до титру діагностичної сироватки. Реакція супроводжується контролюми: сироватка, розведена ізотонічним розчином натрію хлориду, має бути прозорою, завись мікробів у тому ж розчині - рівномірно каламутною, без осаду.

Для визначення сироватці крові хворого антитіл до збудника використовують розгорнуту РА. При її постановці в пробірках розводять сироватку крові хворого і додають у пробірки рівну кількість суспензії діагностикуму (суспензії вбитих мікробів). Після інкубації визначають найбільше розведення сироватки, у якому сталася аглютинація, тобто. утворився осад (титр сироватки). При цьому реакція аглютинації з О-діагностикумом (бактерії, вбиті нагріванням, що зберегли термостабільний О-антиген) відбувається у вигляді дрібнозернистої аглютинації. Реакція аглютинації з Н-діагностикумом (бактерії, вбиті формаліном, що зберегли термолабільний джгутиковий Н-антиген) - великобавовняна і протікає швидше.

Реакція непрямої (пасивної) гемаглютинації(РНГА чи РПГА) є різновидом РА. Цей метод має високу чутливість. За допомогою РНГА можна вирішити два завдання: визначити антитіла в сироватці крові хворого, до якої додають антигенний еритроцитарний діагностикум, що є еритроцитами, на яких адсорбовані відомі антигени; визначити наявність антигенів у досліджуваному матеріалі. І тут реакцію іноді називають реакцією зворотної непрямої гемаглютинацією (РОНГА). При постановці до досліджуваного матеріалу додають антильний еритроцитарний діагностикум (еритроцити з адсорбованими на поверхні антитілами). Еритроцити у цій реакції виконують роль носіїв та пасивно залучаються до утворення імунних агрегатів. При позитивній реакції пасивно склеєні еритроцити покривають дно лунки рівним шаром з фестончастими краями (парасолька); за відсутності аглютинації еритроцити накопичуються в центральному заглибленні лунки, утворюючи компактний «гудзик» з різко окресленими краями.

Реакція коаглютинаціївикористовується для визначення клітин збудника (антигенів) за допомогою антитіл, адсорбованих на Staphylococcus aureus,містить білок А. Білок А має спорідненість до Fc-фрагменту імуноглобулінів. Завдяки цьому антитіла зв'язуються зі стафілококом опосередковано через Fc-фрагмент, а Fab-фрагменти орієнтовані назовні та здатні взаємодіяти з відповідними мікробами, виділеними від хворих. При цьому утворюються пластівці.

Реакція гальмування гемаглютинації (РТГА)використовується при діагностиці вірусних інфекцій, причому тільки інфекцій, що викликаються гемагглютинуючими вірусами. Ці віруси містять на своїй поверхні білок – гемаглютинін, який відповідальний за реакцією гемаглютинації (РДА) при додаванні до вірусів еритроцитів. РТГА полягає у блокуванні антитілами вірусних антигенів, внаслідок чого віруси втрачають здатність аглютинувати еритроцити.

Реакція КумбсаРА визначення неповних антитіл. При деяких інфекційних захворюваннях, наприклад, при бруцельозі, у сироватці крові хворого циркулюють неповні антитіла до збудника. Неповні антитіла називають блокуючими, оскільки вони мають одну антигензв'язувальну ділянку, а не дві, як повноцінні антитіла. Тому при додаванні антигенного діагностикуму неповні антитіла зв'язуються з антигенами, але не склеюють їх. Для прояву реакції додають антиглобулінову сироватку (антитіла до імуноглобулінів людини), яка призведе до аглютинації імунних комплексів (антигенний діагностикум + неповні антитіла), що утворилися у першій стадії реакції.

Непряму реакцію Кумбса застосовують у хворих при внутрішньосудинному гемолізі. У деяких хворих виявляють неповні одновалентні антирезусні антитіла. Вони специфічно взаємодіють з резусположительными еритроцитами, але з викликають їх аглютинації. Тому в систему антирезусні антитіла + резус-позитивні еритроцити додають антиглобулінову сироватку, що спричиняє аглютинацію еритроцитів. За допомогою реакції Кумбса діагностують патологічні стани, пов'язані з внутрішньосудинним лізисом еритроцитів імунного генезу, наприклад, гемолітичну хворобу новонароджених, зумовлену резус-конфліктом.

РА визначення груп кровізаснована на аглютинації еритроцитів антитілами імунної сироватки до антигенів груп крові А(II), B(III). Контролем є сироватка, яка містить антитіл, тобто. сироватка AB(IV) групи крові, та антигени еритроцитів груп А(П) та B(III). Як негативний контроль застосовують еритроцити групи 0(I), оскільки вони не мають антигенів.

Для визначення резус-фактора використовують антирезусні сироватки (не менше двох різних серій). За наявності на мембрані досліджуваних еритроцитів резус-антигена відбувається аглютинація цих клітин.

13.3. Реакція преципітації

РП - це імунна реакція взаємодії антитіл з антигенами в присутності електролітів, причому антиген знаходиться в розчинному стані. При преципітації відбувається осадження розчинних антигенів антитіл, що проявляється помутнінням у вигляді смуг преципітації. Утворення видимого преципітату спостерігається при змішуванні обох реагентів у еквівалентних співвідношеннях. Надлишок одного з них знижує кількість імунних комплексів, що осаджуються. Існують різні способи постановки реакції преципітації.

Реакція кільцепреципітаціїставиться у преципітаційних пробірках з малим діаметром. У пробірку вносять імунну сироватку та обережно нашаровують розчинний антиген. При позитивному результаті межі двох розчинів утворюється кільце молочного кольору. Реакція кільцепреципітації, за допомогою якої визначають наявність антигенів в органах та тканинах, екстракти яких кип'ятять і фільтрують, називається реакцією термопреципітації (реакція Асколі для визначення термостабільного сибіркового антигену).

Реакція подвійної імунодифузії по Оухтерлоні.Ця реакція проводиться у агаровому гелі. У шарі гелю рівномірної товщини на певній відстані один від одного вирізають лунки та заповнюють їх антигеном та імунною сироваткою відповідно. Після цього антигени та антитіла дифундують у гель, зустрічаються один з одним і утворюють імунні комплекси, які преципітують у гелі і стають видимими як лінії преци-

питації. Цю реакцію можна використовувати для визначення невідомих антигенів або антитіл, а також для перевірки подібності між різними антигенами: якщо антигени ідентичні, лінії преципітації зливаються, якщо антигени неідентичні, лінії преципітації перетинаються, якщо антигени частково ідентичні формується шпора.

Реакція радіальної імунодифузії.У розплавлений агаровий гель додають антитіла і гель наносять рівномірним шаром на скло. У гелі вирізують лунки і вносять у них стандартний обсяг різних концентрації розчинів антигену. Під час інкубації антигени радіально дифундують з лунки і, зустрівшись з антитілами, утворюють кільце преципітації. Доки в лунці зберігається надлишок антигену, відбувається поступове збільшення діаметра кільця преципітації. Цей метод використовується для визначення антигенів або антитіл у досліджуваному розчині (наприклад, для визначення концентрації імуноглобулінів різних класів у сироватці крові).

Імуноелектрофорез.Попередньо електрофоретично розділяють суміш антигенів, потім в канавку, що йде вздовж напрямку руху білків, вносять антисироватку, що преципітує. Антигени та антитіла дифундують у гель назустріч один одному; взаємодіючи, вони утворюють дугоподібні лінії преципітації.

Реакція флоккуляції(за Рамоном) – різновид реакції преципітації, яка використовується для визначення активності антитоксичної сироватки або анатоксину. Реакцію проводять у пробірках. У пробірці, де анатоксин та антитоксин знаходяться в еквівалентному співвідношенні, спостерігається помутніння.

13.4. Реакція зв'язування комплементу

Антитіла, взаємодіючи з відповідним антигеном, пов'язують доданий комплемент (перша система). Індикатором зв'язування комплементу є еритроцити, сенсибілізовані гемолітичної сироваткою, тобто. антитілами до еритроцитів (2-я система). Якщо комплемент не фіксується у 1-й системі, тобто. не відбувається реакція антиген-антитіло, сенсибілізовані еритроцити повністю лізуються (негативна реакція). При зв'язуванні комплементу імунними комплексами 1-ї системи після додавання сенсибілізованих еритроцитів гемоліз від-

є (позитивна реакція). Реакція зв'язування комплементу використовується для діагностики інфекційних хвороб (гонореї, сифілісу, грипу та ін.).

13.5. Реакція нейтралізації

Мікроби та їх токсини надають шкідливу дію на органи та тканини організму людини. Антитіла здатні зв'язуватися з цими агентами, що ушкоджують, і блокувати їх, тобто. нейтралізувати. На цій особливості антитіл засновано діагностичну реакцію нейтралізації. Її проводять шляхом введення суміші антиген-антитіло тварин або в чутливі тест-об'єкти (культуру клітин, ембріони). Наприклад, для виявлення токсинів у матеріалі хворого тваринам 1-ї групи вводять матеріал хворого. Тварини 2-ї групи вводять аналогічний матеріал, попередньо оброблений відповідною антисироваткою. Тварини 1-ї групи за наявності токсину у матеріалі гинуть. Друга група тварин виживає, що ушкоджує дію токсину не проявляється, оскільки відбувається його нейтралізація.

13.6. Реакції з використанням мічених антитіл чи антигенів

13.6.1. Реакція імунофлюоресценції (РІФ, метод Кунса)

Цей метод використовується для експрес-діагностики. З його допомогою можна виявляти мікробні антигени, так і антитіла.

Прямий метод РІФ- імунна реакція взаємодії антитіл з антигенами, причому антитіла мітять флюорохромом - речовиною, здатною при попаданні світла певної довжини хвилі випускати кванти світла також певної довжини хвилі. Особливість постановки цього методу полягає в необхідності видалення компонентів, що не прореагували, щоб виключити виявлення неспецифічного світіння. Для цього проводять відмивання від антитіл, що не прореагували. Результати оцінюють за допомогою люмінесцентного мікроскопа. Бактерії в мазку, оброблені такою сироваткою, що люмінескує, світяться на темному тлі по периферії клітини.

Непрямий метод РІФвикористовується частіше за попередній. Ця реакція проводиться у два етапи. На першому етапі антигени взаємо-

можуть діяти з відповідними антитілами, утворюючи імунні комплекси. Усі компоненти, які не прореагували (тобто не у складі імунних комплексів), мають бути видалені відмиванням. На другому етапі комплекс антиген-антитіло, що утворився, виявляється за допомогою флюорохромованої антиглобулінової сироватки. В результаті утворюється комплекс мікроб + антимікробні кролячі антитіла + антитіла до імуноглобулінів кролика, мічені флюорохромом. Результати оцінюють за допомогою люмінесцентного мікроскопа.

13.6.2. Імуноферментний метод чи аналіз

ІФА - найпоширеніший сучасний метод, який використовується для діагностики вірусних, бактеріальних, протозойних інфекцій, зокрема для діагностики ВІЛ-інфекції, вірусних гепатитів та ін.

Модифікацій ІФА дуже багато. Широко використовується неконкурентний твердофазний варіант ІФА. Його проводять у 96-лункових полістиролових планшетах (тверда фаза). При проведенні реакції необхідно на кожному етапі відмивати компоненти, що не прореагували. При визначенні антитіл у лунки, на яких сорбовані антигени, вносять сироватку крові, що досліджується, потім антиглобулінову сироватку, мічену ферментом. Виявляють реакцію, додаючи субстрат ферменту. У присутності ферменту субстрат змінюється, причому фермент субстратний комплекс підбирають таким чином, щоб продукт, що утворюється в реакції, був кольоровим. Таким чином, при позитивній реакції спостерігається зміна кольору розчину. Для визначення антигенів твердофазний носій сенсибілізується антитілами, потім послідовно вносяться досліджуваний матеріал (антигени) та сироватка до антигенів, мічена ферментом. Для прояву реакції вносять субстрат ферменту. Зміна кольору розчину відбувається за позитивної реакції.

13.6.3. Імуноблот

Цей метод заснований на поєднанні електрофорезу та ІФА. Під час проведення імуноблотінгу (блот від англ. blot- пляма) складну суміш антигенів спочатку піддають електрофорез в поліакриламідному гелі. Отримані фракціоновані анти-

генні пептиди переносять на нітроцелюлозну мембрану. Потім блоти обробляють антитілами до специфічного антигену, міченими ферментом, тобто. проводять ІФА блоти. Імуноблоттинг використовують у діагностиці інфекцій, наприклад ВІЛ.

13.6.4. Імунна електронна мікроскопія

Метод полягає в мікроскопуванні в електронному мікроскопі вірусів (рідше за інші мікроби), попередньо оброблених відповідною імунною сироваткою, міченою електроннооптично-щільними препаратами, наприклад феритином - залізовмісним білком.

13.7. Проточна цитометрія

Клітини крові диференціюють на основі лазерної цитофлюорометрії. Для цього шукані клітини забарвлюють флюоресцентними моноклональними антитілами до CD-антигенів. Зразок крові після обробки міченими антитілами пропускають через тонку трубку та через нього пропускають лазерний промінь, який збуджує свічення флюорохрому. Інтенсивність флюоресценції корелює із щільністю антигенів на поверхні клітин та може бути кількісно виміряна за допомогою фотопомножувача. Отримані результати перетворюються на гістограму.

Проточну цитометрію застосовують для визначення імунного статусу (зміст основних популяцій лімфоцитів, вміст внутрішньоклітинних та позаклітинних цитокінів, функціональна активність NK-клітин, активність фагоцитозу та ін.).

Як помутніння, званого преципітатом. Він утворюється при змішуванні антигенів та антитіл в еквівалентних кількостях; надлишок одного з них знижує рівень утворення імунного комплексу. Реакцію преципітації ставлять у пробірках (реакція кільцепреципітації), в гелях, поживних середовищах та ін.
Реакція кільцепреципітації. Реакцію проводять у вузьких преципітаційних пробірках: на імунну сироватку нашаровують розчинний антиген. При оптимальному співвідношенні антигену та антитіл на межі цих двох розчинів утворюється непрозоре кільце преципітату (рис. 7.50). Якщо в якості антигенів реакції використовують прокип'ячені і профільтровані екстракти тканин, то така реакція називається реакцією термопреципітації (реакція Асколі, при якій виявляють сибірковий гаптен).

Мал. 7.50.

Реакція подвійної імунодифузії по Оухтерлоні.

Для постановки реакції розтоплений гель агаровий тонким шаром виливають на скляну пластинку і після затвердіння в ньому вирізають лунки. У лунки гелю окремо поміщають антигени та імунні сироватки, які дифундують назустріч один одному. У місці зустрічі в еквівалентних співвідношеннях вони утворюють преципітату у вигляді білої смуги (рис. 7.51). У багатокомпонентних систем між лунками з антигенами та антитілами з'являється кілька ліній преципітату; у ідентичних антигенів лінії преципітату зливаються, у неідентичних – перетинаються.

Мал. 7.51

Імунну сироватку з розплавленим агаровим гелем поступово наливають на скло. Після застигання в гелі роблять лунки, які містять антиген (Аг) в різних розведеннях. Антиген, дифузуючи в гель, утворює з антитілами кільцеві зони преципітації навколо лунок. Діаметр кільця преципітації пропорційний концентрації антигену (рис. 7.52). Реакцію використовують визначення у сироватці крові імуноглобулінів різних класів, компонентів системи комплементу та інших.

Мал. 7.52.

Поєднання методу електрофорезу та імунопреципітації: суміш антигенів вноситься в лунки гелю і поділяється в гелі за допомогою електрофорезу, потім у канавку гелю паралельно зонам електрофорезу вносять імунну сироватку. Антитіла імунної сироватки дифундують у гель і утворюють у місці зустрічі з антигеном лінії преципітації (рис. 7.53).

Мал. 7.53.

Реакція флоккуляції (за Рамоном) (Від лат. floccus- пластівці вовни) - поява опалесценції або пластівеподібної маси (імунопреципітації) у пробірці при реакції токсин-антитоксин або анатоксин-антитоксин (рис. 7.54). Її застосовують визначення активності антитоксичної сироватки чи анатоксина.

Мал. 7.54.

Штами збудника дифтерії - С. diphtheriae можуть бути токсигенними (що продукують екзотоксин) та нетоксигенними. Утворення екзотоксин залежить від наявності в бактеріях профагу, що несе tox-ген, що кодує утворення екзотоксин. При захворюванні всі ізоляти тестуються на токсигенність – продукцію дифтерійного екзотоксин за допомогою реакції преципітації в агарі (рис. 7.55).

Мал. 7.55