Boja i prozirnost gotovog medija. Lančana reakcija urana i lančana reakcija osjeta

119. Reakcije Pandija i Nonnea - Apelta

Kao reagens za izvođenje Pandijeve reakcije koristi se supernatant prozirna tekućina koja se dobije snažnim mućkanjem 100 g tekuće karbolne kiseline sa 1000 ml destilirane vode. Za dobivanje taloga i bistra tekućina(reagens), ova smjesa se najprije stavi u termostat na 3-4 sata, a zatim se drži na sobnoj temperaturi 2-3 dana.

Na tamni papir stavi se satno ili dijapozitivno staklo i na njega se nakapaju 2-3 kapi reagensa, zatim 1 kap cerebrospinalna tekućina. Ako se kap zamuti ili se po obodu pojavi konasto zamućenje, reakcija se smatra pozitivnom.

Za provođenje Nonne-Apeltove reakcije potrebne su vam čiste epruvete, zasićena otopina amonijevog sulfata, destilirana voda i tamni papir. Priprema se zasićena otopina amonijevog sulfata na sljedeći način: 0,5 g kemijski čistog neutralnog amonijevog sulfata stavi se u tikvicu od 1000 ml, zatim se ulije 100 ml destilirane vode zagrijane na 95 °C, protrese dok se sol potpuno ne otopi i ostavi nekoliko dana na sobnoj temperaturi. Nakon 2-3 dana otopina se filtrira i određuje pH. Reakcija bi trebala biti neutralna.

0,5-1 ml dobivene otopine ulije se u epruvetu i uz stijenku epruvete pažljivo se doda ista količina likvora. Nakon 3 minute procijenite rezultat. Pojava bjelkastog prstena ukazuje na pozitivnu reakciju. Zatim se sadržaj epruvete promućka, stupanj mutnoće odredi usporedbom s epruvetom u kojoj je destilirana voda. Rezultati reakcije procjenjuju se na pozadini crnog papira.

120. Reakcija Bordet - Zhangou

Vrijedan dijagnostički test kada se otkrije kronična gonoreja među osobama koje boluju od kroničnih upalne bolesti genitourinarni sustav. Prema literaturi, kada pravilnu upotrebu Ovom se metodom otkriva do 80% slučajeva gonoreje koji nisu otkriveni bakterioskopskim ili bakteriološkim metodama.

Bordet-Zhangova reakcija može biti trag kao posljedica prethodne bolesti ili primjene gonovakcine za dijagnostiku (imunobiološka metoda provokacije) kao i za terapiju (liječenje kroničnih upalnih procesa genitourinarnog sustava u žena po Baksheevu) Svrha. Stoga je prije izvođenja potrebno pažljivo prikupiti anamnezu,

Reakcija također može biti lažno pozitivna kada se mlijeko primjenjuje, koristi u ljekovite svrhe pirogenal.

Shodno tome, pozitivna Bordet-Giangu reakcija ne služi kao nepobitan dokaz prisutnosti gonokokna infekcija, baš kao ni negativan, ne može biti dokaz nepostojanja gonoreje. Međutim pozitivni rezultati tijekom dugog vremenskog razdoblja liječnik bi se trebao usredotočiti na pronalaženje izvora gonokokne infekcije u tijelu.

Kao antigen koristi se usmrćena kultura gonokoka koja sadrži 3-4 milijarde mikrobnih tjelešaca u 1 ml. Gonokokni antigen se konzervira otopinom formaldehida i ulije u ampule od 1-5 ml. Neotvorene ampule prikladne su 6 mjeseci, otvorene se mogu čuvati 2-3 dana u sterilnoj tubi u hladnjaku na temperaturi od 3-5°C,

Reakcija fiksacije Bordet-Giangu komplementa provodi se slično kao Wassermanova reakcija (vidi br. 121). Gonokokni antigen se razrijedi izotoničnom otopinom natrijeva klorida prema titru navedenom na naljepnici ampule. Reakcija se najčešće provodi u volumenu od 2,5 ml, stoga se na 0,5 ml razrijeđenog 1:5 ispitnog seruma u svaku epruvetu dodaje 0,5 ml razrijeđenog antigena. Preostalih 1,5 ml je 1 ml hemolitičkog sustava i 0,5 ml komplementa.

Reakcija se smatra pozitivnom ako je izražena u različitim stupnjevima odgoda hemolize u ispitivanom serumu. U kontroli (krvni serum zdravi ljudi) opaža se potpuna hemoliza.

121. Wassermanova reakcija

Krvni serum bolesnika sa sifilisom sadrži reagine i antitijela. Reagini imaju svojstvo spajanja s kardiolipinskim antigenom. Specifična protutijela protiv Treponema pallidum kombiniraju se sa specifičnim antigenima. Rezultirajuće komplekse antigen-protutijelo apsorbira komplement dodan u reakciji. Indikacija se provodi uvođenjem hemolitičkog sustava (eritrociti ovaca + hemolitički serum).

Za izvođenje reakcije potrebno je:

a) izotonična otopina natrijeva klorida;

b) ultrazvučni treponemski (čuvati u hladnjaku na +4 °C) i kardiolipin (čuvati na sobnoj temperaturi) antigeni;

c) komplement, koji je krvni serum dobiven punkcijom srca 5-10 zdravih zamoraca. Može se čuvati u hladnjaku 2 mjeseca, pod uvjetom
konzerviranje 4% otopinom Borna kiselina i 5% otopina natrijevog sulfata;

d) hemolizin - hemolitički krvni serum kunića imuniziran ovčjim eritrocitima različitog titra (čuvati u hladnjaku na 4 °C);

e) crvena krvna zrnca ovaca dobivena punkcijom jugularna vena. Krv se skuplja u sterilnu posudu sa staklenim kuglicama (za miješanje), mućka se 15 minuta. Fibrinski ugrušci se odvajaju filtracijom kroz sterilnu gazu. Defibrirana krv može se čuvati u hladnjaku do 5 dana.

Ponekad je potrebno duže čuvanje ovčje krvi, pa se ona konzervira posebnim konzervansom (6 g glukoze, 4,5 g borne kiseline, 100 ml izotonične otopine natrijevog klorida) koji se kuha u vodenoj kupelji. 20 minuta dnevno tijekom 3 dana Za 100 ml defibrinirane ovčje krvi potrebno je 15 ml konzervansa. Ovako konzervirana defibrirana krv čuva se u hladnjaku.

Glavnom eksperimentu prethodi nekoliko faza.

Pacijent iz lakatna vena uzeti 5-10 ml krvi i obraditi serum. U djece se krv može uzeti iz temporalne vene ili reza na peti. Punkcija se vrši sterilnim instrumentima, štrcaljkom i iglom.
prethodno ispran izotoničnom otopinom natrijeva klorida.

Krv za istraživanje uzima se na prazan želudac; 3-4 dana prije studije, pacijentu je zabranjeno konzumiranje opojne droge, preparati digitalisa, uzeti alkohol.

Studija se ne smije provoditi u bolesnika s povišena temperatura tijela, nakon ozljeda, operacija, anestezije, nedavnih zaraznih bolesti, u žena tijekom menstruacije, u trudnica (u zadnjih 10 dana trudnoće), trudnica (u prvih 10 dana nakon rođenja), kao iu novorođenčadi ( u prvih 10 dana života) .

Dobivena krv u sterilnoj epruveti stavlja se u termostat na temperaturu od 37 °C 15-30 minuta. Dobiveni ugrušak se sterilnim staklenim štapićem odvoji od stijenki epruvete i stavi na jedan dan u hladnjak. Izdvojeni prozirni serum (iznad ugruška) odsisa se Pasteur-ovom pipetom gumenom bulbom ili se pažljivo prelije u drugu sterilnu epruvetu i inaktivira u vodenoj kupelji 30 minuta na temperaturi od 56 °C. Ovako pripremljen serum za pokus može se čuvati u hladnjaku do 5-6 dana.

Antigeni se razrjeđuju u skladu s metodom i titrom naznačenim na etiketi.

Pripremite hemolitički sustav. Da bi se to učinilo, defibrinirana ovčja krv ili crvena krvna zrnca u količini potrebnoj za reakciju se centrifugiraju, plazma se pažljivo odvoji, a sediment se ispere s 5-6 volumena izotonične otopine natrijevog klorida dok supernatant ne postane potpuno bezbojan. Iz sedimenta se priprema 3%-tna suspenzija crvenih krvnih stanica u izotoničnoj otopini natrijevog klorida u trostrukom titru.

Otopina hemolitičkog seruma i suspenzija ovčjih eritrocita brzo se pomiješaju i stave u termostat na 30 minuta.

Suhi komplement se razrijedi izotoničnom otopinom natrijevog klorida u omjeru 1:10, normalni inaktivirani ljudski serum - 1:5.

Komplement se titrira u 30 epruveta smještenih u stalak od 10 epruveta u 3 reda. U dva reda se titrira u prisutnosti dva antigena, u trećem - s izotoničnom otopinom natrijevog klorida. Pet epruveta su kontrolne: dvije za odgovarajuća dva antigena i po jedna za praćenje komplementa, hemolitičkog seruma i izotonične otopine natrijevog klorida za hemotoksičnost; ispunite ih na sljedeći način:

Epruvete se stavljaju u termostat na 45 minuta, nakon čega se provjeravaju. Ne bi trebalo biti hemolize ni u jednoj epruveti.

Komplement u razrjeđenju 1:10 ulijeva se u 10 epruveta 1. reda stalka u dozama: 0,1, 0,16, 0,2, 0,24, 0,3, 0,36, 0,4, 0,44, 0,5 i 0,55 ml. Sadržaju svake epruvete dodajte izotoničnu otopinu natrijeva klorida do 1 ml i dobro promiješajte. 0,25 ml smjese iz svake epruvete prenese se u odgovarajuće epruvete 2. i 3. reda. Stalak s epruvetama se protrese, u 3. red epruveta doda se 0,5 ml hemolitičkog sustava, ponovno protrese i stavi u termostat na 37 °C 45 minuta. Normalni ljudski krvni serum razrijeđen izotoničnom otopinom natrijeva klorida u omjeru 1:5 ulije se u svih 30 epruveta po 0,25 ml.

Antigen I (treponemalni ultrazvučni), razrijeđen titrom izotoničnom otopinom natrijevog klorida, 0,25 ml doda se u 10 epruveta 1. reda; antigen II (kardiolipin u istom razrjeđenju i u istoj količini) - u 10 epruveta 2. reda. U 10 epruveta 3. reda ulije se 0,25 ml izotonične otopine natrijevog klorida, preostalih 0,25 ml se izlije. Nakon inkubacije u termostatu, 0,5 ml hemolitičkog sustava doda se u 20 epruveta (1. i 2. red), protrese i ponovno stavi u termostat na 45 minuta.

Nakon 45 minuta određuje se radna doza komplementa, odnosno njegov titar uz porast od 15-20%.

Smatra se titrom komplementa minimalni iznos, uzrokujući potpunu hemolizu crvenih krvnih zrnaca ovaca u prisutnosti antigena i normalnog ljudskog krvnog seruma.

Glavni pokus je da se svaki ispitni inaktivirani serum, razrijeđen u omjeru 1:5 izotoničnom otopinom natrijevog klorida, ulije u 0,25 ml u tri epruvete. U prvu epruvetu dodajte 0,25 ml antigena I, u drugu 0,25 ml antigena II, a u treću (kontrola) 0,25 ml izotonične otopine natrijeva klorida. U sve epruvete također se dodaje 0,25 ml komplementa razrijeđenog na radnu dozu. Sve epruvete se stave u termostat na 45 minuta, zatim se u njih doda 0,5 ml hemolitičkog sustava, protrese i stavi u termostat na 45-50 minuta. Rezultat pokusa bilježi se nakon početka potpune hemolize u kontrolnim epruvetama.

Rezultati reakcije ocjenjuju se plusevima: potpuna odgoda hemolize (jako pozitivna reakcija) ++++, značajna (pozitivna reakcija) +++, djelomična (slabo pozitivna reakcija) ++, beznačajna (dvojbena reakcija) - ±, nema odgode hemolize (negativna reakcija) - .

Na kvantitativna metoda Da bi se provela Wassermanova reakcija, pokus se provodi sa sve manjim volumenom seruma razrijeđenog izotoničnom otopinom natrijevog klorida.

Shema glavnog pokusa Wassermanove reakcije

Klinički značaj Wassermanove reakcije teško je precijeniti. Izvodi se kod svih pacijenata prije tretmana, ali posebno značenje ona ima na latentni sifilis, poraz unutarnji organi i živčani sustav.

Rezultati Wassermanove reakcije karakteriziraju kvalitetu pruženog liječenja, što daje osnovu da se liječeni pacijenti brišu iz registra u određenom roku.

Kod primarnog sifilisa Wassermanova reakcija obično je pozitivna krajem 6. tjedna od trenutka infekcije; s sekundarnim svježim sifilisom pozitivan je u gotovo 100% slučajeva, s sekundarnim rekurentnim sifilisom - u 98-100%; tercijarno aktivan - u 85%; tercijarno skriveno - u 60% slučajeva.

Wassermanova reakcija se provodi dva puta za sve trudnice, pacijente sa somatskim, živčanim, mentalnim i kožne bolesti, kao i utvrđene populacije. Istodobno, pozitivne i slabo pozitivne rezultate reakcije treba tretirati kritički, jer se mogu pojaviti na kraju trudnoće i nakon poroda, kod hipertireoze, malarije, lepre, karijesa. maligni tumor, zarazne bolesti, kolagenoze itd. Stoga, ako postoji kliničke manifestacije Prije svega treba uzeti u obzir njihove bolesti, kao i podatke bakterioskopije.

Istodobno, postoje čimbenici koji mogu iskriviti pravu prirodu dobivenih rezultata Wassermanove reakcije: loše oprano laboratorijsko stakleno posuđe (tragovi kiseline i lužine u epruvetama), dugotrajno skladištenje krvi uzete za istraživanje, konzumacija masti i alkohola od strane pacijenata prije pregleda, menstruacije i sl.

U svim slučajevima preporučljivo je provesti sveobuhvatan pregled bolesnika, uključujući, osim Wassermanove reakcije, i RIBT (vidi 122, 123, 124) itd.

122. Sachs-Vitebsky reakcija (citokolička)

Koristi se za otkrivanje sifilisa. Temelji se na stvaranju taloga pri miješanju krvnog seruma pacijenta s antigenom.

Da bi se pripremio antigen, mišići nekoliko goveđih srca su očišćeni od tetiva, fascija i masti, samljeveni u stroju za mljevenje mesa i ekstrahirani 5-strukim volumenom 96% etilnog alkohola tijekom 15 dana uz svakodnevno mućkanje od 20 minuta. Dobiveni ekstrakt se upari u vodenoj kupelji u porculanskoj šalici pod vakuumom. Ostatku (jarko žuta masa lipoida) dodaje se vrući 96% etilni alkohol u količini od 1/3 volumena uzetog za ekstrakciju mišića.

Ekstrakt se drži 3 dana na sobnoj temperaturi, filtrira (in hladna voda) i dodati 0,3-0,6% otopinu kristalnog kolesterola, ovisno o rezultatima titracije s pozitivnim i negativnim serumom. Čuvajte citokolični antigen na sobnoj temperaturi u zatvorenim ampulama ili začepljenim epruvetama.

Metodologija. 1 ml citokolnog antigena brzo se doda u 2 ml izotonične otopine natrijevog klorida i ostavi na sobnoj temperaturi 15 minuta dok se ne pojave ljuskice. U epruvetu s 0,2 ml inaktiviranog seruma dodati 0,1 ml antigenske emulzije, mućkati 3 minute i ostaviti 30 minuta, nakon čega je dodano 1 ml izotonične otopine natrijeva klorida.

U kontrolnu epruvetu s antigenom dodajte 1,2 ml izotonične otopine natrijeva klorida i 0,1 ml emulzije antigena. U kontroli ne smije biti pahuljica. Rezultati reakcije uzimaju se u obzir vizualno ili pomoću povećala i označavaju se, ovisno o broju pahuljica koje ispadnu, plusevima (++++, +++, ++). Ako je reakcija negativna, nema ljuskica, ali sadržaj epruvete može lagano opalescentirati.

Godine 1931. P. Sachs i E. Witebsky predložili su modifikaciju ove tehnike, koja se sastoji u razrjeđivanju antigena u dvije faze: dodajte 2 dijela izotonične otopine natrijevog klorida na 1 dio antigena, ostavite na sobnoj temperaturi 5 minuta i dodati još 9 dijelova izotonične otopine natrijevog klorida. Također se preporučuje razrijediti antigen s 2% otopinom natrijevog klorida, što, prema autorima, povećava osjetljivost reakcije. Moguća je i kvantitativna modifikacija reakcije razrjeđivanjem seruma (1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64 itd.).

Reakcija je vrlo osjetljiva, traje malo (oko 1 sat), a rezultati se očitavaju odmah.

123. Reakcija imobilizacije Treponema pallidum (RIBT)

Reakcijom se u krvnom serumu oboljelih od sifilisa otkrivaju protutijela i komplement koji imobiliziraju Treponemu pallidum.

U primarnom sifilisu, RIBT je pretežno negativan, u sekundarnom - pozitivan u 92-96% slučajeva, u tercijarnom - u 92-100%, u živčanom sustavu i kongenitalnom sifilisu - u 86-89% slučajeva.

Pozitivni rezultati RIBT zabilježeni su kod sarkoida, eritematoze, dijabetesa, malignih tumora, virusni hepatitis, ciroza jetre, malarija, lepra, infektivna mononukleoza, neke bolesti toplih zemalja (pinta, aftemija itd.).

Antigen je suspenzija blijedog treponema uzetog iz testisa kunića zaraženog sifilisom unošenjem u testis 0,75-1 ml suspenzije blijedog treponema u izotoničnoj otopini natrijevog klorida (50 životinja po vidnom polju).

Materijal iz testisa treba uzeti 6-8 dana nakon što je životinja zaražena. Prije uzimanja antigena kunić se usmrti iskrvarenjem (punkcijom srca ili karotidna arterija). Tkivo testisa se zdrobi i napuni krvnim serumom zdravog kunića, razrijedi izotoničnom otopinom natrijeva klorida, mućka -30 minuta, a zatim centrifugira 10 minuta (1000 okretaja u minuti). Tekućina supernatanta se mikroskopski ispituje. U svakom vidnom polju mora biti najmanje 10-15 Treponema pallidum.

Komplement je pripremljen na uobičajeni način iz krvi zamoraca.

Za provođenje RIBT potrebno je: 1,2 ml 0,2% otopine želatine, 2,8 ml 5% otopine albumina, 1,6 ml suspenzije Treponema pallidum; pH okoline je 7,2. Ovoj smjesi se dodaje 0,15 ml komplementa (koktel). Paralelno se izvode dva testa: s aktivnim (pokus) i reaktivnim (kontrola) komplementima.

Melangeuri se pune testnim serumom do oznake “1”, a zatim koktelom do oznake “2” i zatvaraju sterilnim gumenim prstenom.

Istodobno se slična reakcija provodi s očito pozitivnim i očito negativnim serumima.

Melangeuri se numeriraju i stavljaju u termostat na temperaturu od 35 °C 18-20 sati, nakon čega se po parovima vade iz termostata (pokus - kontrola) i sadržaj se prelije u odgovarajuće epruvete. Na predmetno staklo nanesu se 2 kapi: lijevo je pokus, desno kontrola, poklopi pokrovnim staklom i mikroskop u tamnom vidnom polju.

Prvo se proučavaju rezultati kontrole: utvrđuje se postotak pokretne i nepokretne Treponema pallidum. Formula za izračun: X = (A - B)/A * 100, gdje je A broj mobilnih pallidum treponema u kontroli; B - broj pokretnih treponema pallidum u pokusu.

Primjer: (24 - 19) / 24 * 100 = 21%.

Procjene rezultata RIBT: ispod 20% - negativno. 21-30% - sumnjivo, 31-50% - slabo pozitivno, preko 50% - pozitivno.

Antigen, komplement i pomoćni, indikatorski ili hemolitički sustav - hemolitički serum i ovčji eritrociti.

Ako se u prvom sustavu stvara specifični kompleks antigen + antitijelo, tada se komplement adsorbira (kombinira s tim kompleksom) i u drugom sustavu ne dolazi do hemolize.

Reakcija zahtijeva:

1. Testni serum, koji se dobiva iz krvi uzete punkcijom lakatne vene pacijenta. Nakon zgrušavanja krvi, serum se usisava u posebnu epruvetu i inaktivira 30 minuta na 56 °C u vodenoj kupelji.

2. Antigen - suspenzija ubijenih gonokoka.

3. Crvena krvna zrnca ovaca dobivaju se iz sterilno sakupljene defibrinirane krvi. Ispiru se centrifugiranjem 3 puta novim obrocima fiziološke otopine. U reakciji se koristi 3% suspenzija crvenih krvnih stanica.

4. Hemolitički serum priprema se unaprijed imunizacijom kunića crvenim krvnim stanicama ovaca. Prije upotrebe serum se titrira.

5. Komplement - svježi serum zamorca. Iz srca zamorčića se štrcaljkom usisava krv, a nakon zgrušavanja izdvaja se serum. Prije pokusa titrira se radna doza komplementa. Za to se uzme osnovno razrjeđenje komplementa 1:10 i ulije u epruvete od 0,1 do 0,5, nakon čega se volumen svake epruvete namjesti na 1,5 ml fiziološkom otopinom.

Istodobno se priprema hemolitički sustav - razrijeđen u trostrukom titru, hemolitički serum + 3% suspenzija ovčjih eritrocita. Oba sastojka su u različitim volumenima i drže se u termostatu 30 minuta (senzibilizacija smjese), nakon čega se smjesa dodaje po 1 ml u epruvete i stavlja u termostat 30 minuta. 2 epruvete služe kao kontrola:

1. 1 ml hemolitičkog sustava + 1,5 ml fiziološke otopine;

2. 0,5 ml komplementa 1:10 + 0,5 ml suspenzije crvenih krvnih stanica + 1,5 ml fiziološke otopine.

Titar komplementa je minimalna količina pri kojoj još uvijek dolazi do hemolize. Za postavljanje reakcije uzmite radnu dozu komplementa, povećanu u odnosu na titar za 20-25%, tj. obično količinu komplementa koja je prisutna u pretposljednjoj epruveti s hemolizom. Povećanje doze komplementa je nužno jer u reakciji aktivnost komplementa može biti donekle potisnuta drugim sastojcima reakcije (antigen, serum).
43) RSK Wasserman

Postavlja se za dijagnozu sifilisa kako bi se otkrila antitijela, kao i utvrdila učinkovitost specifična terapija. Temelji se na principu Bordet-Gengou reakcije vezanja komplementa. Značajna razlika između Wassermanove reakcije je nespecifičnost antigena: lipoidni ekstrakti iz normalni organiživotinje

Za izvođenje Wassermanove reakcije potrebno je imati bolesnikov serum, dijagnostiku, križno reagirajuće antigene br. 1, br. 2, komplement, hemolitički serum, ovčje eritrocite, fiziološka otopina.

Dijagnostikum broj 1 - specifičan, treponemal.

Dijagnostikum br. 2 - nespecifičan, kardiolipinski antigen, koji su visoko pročišćeni ekstrakti goveđeg srca s konstantnim kemijskim sastavom lipoida. Lipoidi, autor kemijski sastav su bliski lipoidima Treponema pallidum, stoga, iako nisu specifični, fiksiraju antitijela protiv spirohete.

Ti se antigeni proizvode centralno i koriste se razrijeđeni u reakciji prema titru navedenom na etiketi.

Istovremeno s glavnim pokusom postavljaju se 2 kontrole: s očito negativnim i s očito pozitivnim serumima.

Postavljanje glavnog eksperimenta

Najprije se inaktivirani i razrijeđeni ispitni serum u omjeru 1:5 ulije u 4 epruvete. Zatim se u 2 epruvete (br. 1, br. 2) uliju antigeni, au 3. epruvetu fiziološka otopina. Nakon toga se u sve epruvete dodaje radna doza komplementa. Nakon miješanja sastojaka, stalak s epruvetama se stavlja u termostat na 37 °C na 30 minuta. Nakon držanja u termostatu, hemolitički sustav se dodaje u sve epruvete. Epruvete se ponovno stave u termostat na 2 sata i zatim ostave na sobnoj temperaturi. Sutradan se bilježi rezultat, procjenjuje se stupanj intenziteta reakcije, četiri plusa (++++), tri (+++), dva (++) i jedan (+) - ovisno o intenzitetu boje tekućine i veličine sedimenta crvenih krvnih stanica na dnu. Potpuna hemoliza označena je (-) minusom. Ako postoji oštro odstupanje između rezultata s različitim antigenima, pokus se ponavlja s novim dijelom krvi.
44) RIT-r. Imobilizacija Treponema pallidum.

Ova reakcija se koristi kao u dijagnostičke svrhe, i za priznanje lažno pozitivni rezultati standardne serološke reakcije, posebno za latentni sifilis.

RIBT je da u prisutnosti imobilizina u serumu bolesnika sa sifilisom i aktivnog komplementa treponema pallidum gubi svoju pokretljivost.

RIBT se stavlja u sterilne kutije. Reakcija uključuje ispitivani serum, komplement i antigen.

U RIBT, antigen je suspenzija blijede treponeme iz testisa kunića u rani datumi(7-8 dana nakon infekcije) sifilitički orhitis. Poseban suspenzijski medij čuva vitalnost Treponema pallidum najmanje jedan dan. Komplement se koristi u RIBT zamorci. RIBT se javlja u anaerobnim uvjetima. Epruvete sa sastojcima stavljaju se u mikroanaerostat iz kojeg se atmosferski zrak i ubrizgava se mješavina plinova (95 dijelova dušika i 5 dijelova ugljični dioksid). Mikroanaerostat s epruvetama stavlja se u termostat (35°C) 18-20 sati.

Paralelno s formulacijom reakcije, kontrolne studije s pozitivnim i negativnim krvnim serumom uzetim iz prethodnog iskustva.

Rezultati RIBT-a procjenjuju se nakon uklanjanja cijevi iz termostata (tj. nakon 18-20 sati eksperimenta). Pasteurovom pipetom kap sadržaja epruvete nanese se na predmetno staklo koje se prekrije pokrovnim staklom i pregleda pod mikroskopom tamnog polja (objektiv 40, okular 10). Kada je imobilizirano do 20% Treponema pallidum, reakcija se smatra negativnom, od 21 do 30% - sumnjivom, od 31 do 50% slabo pozitivnom, od 51 do 100% - pozitivnom. Postotak imobilizacije Treponema pallidum određuje se pomoću posebne tablice.

45) Opson-fagocitna reakcija

Mehanizam: pojačana fagocitoza mikrobnih stanica pod utjecajem prijateljskih učinaka protutijela, imunološkog seruma i komplementa.

Komponente reakcije:

1) antigen - dnevna mikrobna kultura;

3) komplement - svježi serum zamorca;

4) fagociti – suspenzija leukocita.

Opsonini su antitijela koja se nalaze u normalnom i imunološkom serumu i pripremaju mikrobe za fagocitozu.

Reakcija se provodi u posebnim epruvetama pri t = 37° minuta. Zatim se pripremaju razmazi iz svake epruvete, izbroji se 100 fagocita i odredi broj fagocitiranih mikrokontrola.

Opsonični indeks = fagocitni indeks. serum/fagocitni indeks normalnog seruma

Što je veći opsonični indeks (mora biti >1) seruma koji se testira, a samim time i veći je! bruceloza).

Koristi se za određivanje opsonina - protutijela koja stimuliraju fagocitnu aktivnost leukocita, tj. serodijagnostika infekcija, kao što je bruceloza.

Do jačanja fagocitoze dolazi zbog vezanja opsonina s aktivnim centrima (Rav fragment) na bakterijske determinante, a zatim uz pomoć Pc fragmenata na Pc receptore fagocita. Normalni serum sadrži male količine opsonina, koji svoje djelovanje ispoljavaju u prisutnosti komplementa. U imunološkom serumu ima više opsonina, a njihova aktivnost manje ovisi o komplementu.

Komponente:

Testni serum

Normalni serum

Dnevna mikrobna kultura (npr. stafilokokna)

Fagociti - suspenzija neutrofila

Inkubirajte na 37°C 30 minuta. Iz svake epruvete pripremaju se razmazi, boje po Romanovsky-Giemsi i pod mikroskopom se broji broj mikroba u 100 ili više neugrofila, t.j. odrediti fagocitni indikator.

Fagocitni indikator - broj mikroba koje apsorbira jedan neutrofil.

Opsonični indeks - fagocitni pokazatelj imunološkog (testnog) seruma / fagocitni pokazatelj normalnog seruma.

Što je veći opsonički indeks (mora biti > 1), veća je otpornost.

Opson-fagocitni indeks je digitalni pokazatelj = broj fagocita x procjena fagocitoze (ovisno o broju apsorbiranih mikroba). Maksimalna vrijednost je -75.

46) RN na miševima za utvrđivanje egzotoksina

Ova reakcija temelji se na sposobnosti specifičnog antitoksičnog seruma da neutralizira egzotoksin.

Protutijela u imunološkom serumu sposobna su neutralizirati štetno djelovanje mikroba ili njihovih toksina na osjetljive stanice i tkiva, što je povezano s blokadom mikrobnih antigena protutijelima, odnosno njihovom neutralizacijom.

Reakcija neutralizacije (RN) provodi se unošenjem mješavine antigen-protutijelo u životinje ili u osjetljive test objekte (kultura stanica, embriji). U nedostatku štetnih učinaka mikroorganizama ili njihovih antigena ili toksina u životinja i testnih objekata, govore o neutralizirajućem učinku imunološkog seruma i, prema tome, specifičnosti interakcije kompleksa antigen-antitijelo.

Za izvođenje reakcije, ispitni materijal, za koji se očekuje da sadrži egzotoksin, miješa se s antitoksični serum, držati u termostatu i davati životinjama (zamorci, miševi). Kontrolnim životinjama ubrizgan je filtrat ispitivanog materijala, koji nije tretiran serumom. Ako se egzotoksin neutralizira antitoksičnim serumom, životinje u pokusnoj skupini ostat će žive. Kontrolne životinje će uginuti od posljedica egzotoksina.

Reakcija neutralizacije egzotoksina nastaje kada on stupi u interakciju s antitoksičnim serumom (antitijela protiv toksina). Kao rezultat stvaranja kompleksa antigen-antitijelo, toksin gubi svoja toksična svojstva.

Reakcija neutralizacije provodi se kako bi se otkrili i titrirali toksini, toksoidi ili antitoksini.

Otrovi se dobivaju filtriranjem tekućine hranjivi medij ili ispitni materijal na kojem su rasle toksigene bakterije. Tretiranjem formaldehidom 30-45 dana na temperaturi od 37°C, toksin se pretvara u toksoid, koji se koristi za imunizaciju životinja za dobivanje antitoksičnog seruma.

In vivo reakcija neutralizacije. Da bi se odredila vrsta toksina, miješa se s dijagnostičkim antitoksičnim serumom i ta smjesa se ubrizgava bijelim miševima. Prilikom neutralizacije toksina antitoksičnim serumom, miševi ne umiru.

Reakcijom neutralizacije utvrđuje se antitoksična imunost u djece s difterijom (Schick test) i šarlahom (Dick test). Da biste to učinili, određena količina odgovarajućeg toksina (1/40 DLM) ubrizgava se intradermalno u područje podlaktice. Ako u tijelu postoje antitoksini, toksin će se neutralizirati i reakcija će biti negativna. U nedostatku antitoksina u tijelu, upalna reakcija na mjestu ubrizgavanja toksina.
47) RN (Reakcija neutralizacije) kod miševa za identifikaciju virusa krpeljni encefalitis

Virus KME je patogen za brojne laboratorijske i divlje životinje. Najosjetljiviji su novorođeni i mladi bijeli miševi. Nakon infekcije u mozgu, intraperitonealno, intramuskularno, ove životinje razvijaju encefalitis, koji završava smrću životinja. Među domaćim životinjama na virus KME su najosjetljivije koze, manje ovce i krave, a slabo osjetljivi konji. Virus KBE ima citopatogeno djelovanje (CPE), uzrokujući citopatske promjene u primarnim i kontinuiranim kulturama stanica svinjskog embrionalnog bubrega (PEB i PES) i razmnožava se bez izraženog CPE u mnogim drugim stanične kulture. U mozgu zaraženih miševa i tekućini kulture zaraženih kultura dolazi do nakupljanja virusa KME i specifičnih virusnih antigena: fiksacija komplementa, hemaglutinacija, precipitacija itd.

TBE virus Dugo vrijemečuva se na niskim temperaturama ( optimalan način rada-60 stupnjeva C i niže), dobro podnosi liofilizaciju, može se u osušenom stanju čuvati dugi niz godina, ali se brzo inaktivira na sobnoj temperaturi. Kuhanje ga ubije za 2 minute, a u vrućem mlijeku na 60 stupnjeva. C umire za 20 minuta.

Formalin, fenol, alkohol i druga sredstva za dezinfekciju te ultraljubičasto zračenje također djeluju inaktivirajuće.

Reakcija neutralizacije temelji se na sposobnosti specifičnih imunoloških seruma da ugase infektivni učinak virusa. Primjenjivo u dva smjera:

1) za tipizaciju izoliranih virusa;

2) za titraciju antitijela u serumima preboljelih.

Postavljanje reakcije:

1. Na laboratorijskim životinjama. Kriteriji prisutnosti virusa

služi smrti laboratorijskih životinja. Izračunava se LD50

Maksimalno razrjeđenje virusne suspenzije, koje

uzrokovala smrt 50% zaraženih životinja. Za

Provodi se identifikacija virusa krpeljnog encefalitisa

intracerebralna infekcija bijelih miševa.

2. U kulturama tkiva. Rezultati se uzimaju u obzir

Prema citopatskom učinku (CPE)

Prema metodi ispitivanja boje koja se temelji na promjeni boje

Hemadsorpcijom.

3. U kokošjem embriju. Rezultati se bilježe prema

pojava boginja duž korioalantoisne membrane.

48) RTGA

Ova reakcija se koristi u virološkoj praksi:

Određivanje vrste virusa (na staklu);

Za otkrivanje u serumu bolesnika (prošireno).

Pri postavljanju indikativne reakcije inhibicije hemaglutinacije na staklo se nanese 1 kap tipospecifičnog imunološkog seruma, zatim 1 kap ispitivanog materijala i 1 kap 5% suspenzije crvenih krvnih stanica.

Računanje rezultata: vrsta virusa određena je serumom s kojim nije došlo do reakcije, budući da imunološki serum specifičan za izolirani virus potiskuje njegovu hemaglutinirajuću aktivnost, a crvene krvne stanice ne aglutiniraju.
49) RIF

Svjetleće fluorokromne boje (fluoriscein izotiocijanat itd.) koriste se kao oznake.

Postoje razne modifikacije RIF-a. Za ekspresnu dijagnostiku zaraznih bolesti, Koons RIF se koristi za identifikaciju mikroba ili njihovih antigena u ispitivanom materijalu.

Postoje dvije metode RIF-a prema Koonsu: izravna i neizravna.

Izravne RIF komponente:

1) materijal koji se ispituje (stolica koja se ispušta iz nazofarinksa, itd.);

2) označeni specifični imunološki serum koji sadrži AT-la na željeni antigen;

3) izotonična otopina natrijeva klorida.

Bris ispitivanog materijala tretira se obilježenim antiserumom.

Javlja se reakcija AG-AT. Tijekom luminiscentnog mikroskopskog pregleda, fluorescencija se otkriva u području gdje su lokalizirani kompleksi AG-AT.

Komponente neizravnog RIF-a:

1) materijal koji se proučava;

2) specifični antiserum;

3) antiglobulinski serum (AT-la protiv imunoglobulina), obilježen fluorihromom;

4) Izotonična otopina natrijeva klorida.

Bris iz ispitivanog materijala najprije se obradi imunološkim serumom na željeni antigen, a zatim obilježenim antiglobulinskim serumom.

Luminescentni AG-AT kompleksi - označeni AT detektiraju se pomoću fluorescentnog mikroskopa.

Prednost neizravne metode je u tome što nema potrebe pripremati veliki izbor fluorescentno specifičnih seruma, već se koristi samo jedan fluorescentni antiglobulinski serum.

Postoji i 4-komponentni tip neizravnog RIF-a, kada se dodatno uvodi komplement (serum zamorca). U pozitivnoj reakciji nastaje kompleks AG-AT – obilježenog – AT-komplementa.

Reakcija se odnosi na serološke reakcije koji uključuju obilježene antigene ili antitijela.

Provodi se izravnim i neizravnim metodama.

Na izravna metoda otkriti antigen u materijalu od pacijenta. Koristi se dijagnostički fluorescentni serum koji sadrži imunoglobuline izolirane iz imunoloških seruma i obilježene fluorokromima.

Specifični antigen detektira se u obliku svijetlozelenih luminiscentnih konglomerata, a pozadina preparata je obojena narančasto-crvenom bojom.

Komponente reakcije izravne imunofluorescencije:

1) materijal koji se proučava;

2) specifični luminiscentni serum;

3) fluorescentni mikroskop.

Kod dijagnosticiranja gripe razlikuje se od uzročnika parainfluence i adenovirusna infekcija. Nazofaringealni bris se tretira fluorescentnim serumom protiv gripe ili imunoglobulinom protiv influence.

Rezultat “+” u obliku zelenog sjaja dobiva se nakon 3 sata.

Neizravnom metodom otkrivaju se i titriraju specifična protutijela. Titar seruma je njegovo maksimalno razrjeđenje pri kojem se bilježi fluorescencija "+ +".

Komponente reakcije neizravne imunofluorescencije

Za traženje antigena tijekom brze dijagnostike:

1) ispitni materijal (antigen);

2) specifični serum;

3) antiglobulinski luminiscentni serum

4) fluorescentni mikroskop.

/ specifična faza

Antitijela u serumu adsorbiraju se na antigen.

// nespecifična faza

Koristi se antiglobulinski serum s antitijelima obilježenim fluorokromima. Nastaje kompleks antigen + antitijelo (I) + antiglobulinski serum (II) koji svijetli.