Serološke reakcije. Reakcija taloženja

Ovaj će se članak usredotočiti na fenomen reakcije taloženja. Ovdje ćemo se osvrnuti na značajke ovog fenomena, fenomen difuzije, opće karakteristike, ulogu u ljudskom životu i još mnogo toga.

Uvod u fenomen

Precipitacija je fenomen serološkog tipa, tijekom kojeg topivi antigeni stupaju u interakciju s protutijelima i, kao rezultat, nastaje talog.
Opća karakteristika reakcije taloženja je oblik usklađenog utjecaja antigena i antitijela. Ove vrste interakcija omogućuju određivanje prisutnosti nepoznatih antigena u ispitivanoj tvari dodavanjem poznatih protutijela i antigena. Proces taloženja bez prisutnosti soli odvijat će se lošije, a najbolji optimum je u rasponu od 7,0-7,4 pH.

Komponente reakcije

Među komponentama reakcije taloženja razlikuju se tri glavna elementa:

1. Antigen koji je molekularne prirode. U fino je usitnjenom stanju, drugim riječima, topiv je. Također se takav antigen naziva precipitogen, koji je lizat ili ekstrakt tkiva, itd. Precipitogen ima karakterističnu razliku od aglutinogena, koja leži u veličini čestica od kojih se sastoji. Aglutinogen ima svojstvenu veličinu stanice, dok su precipitogeni proporcionalni veličini molekule. Otopina antigena karakterizira transparentnost.
2. Antitijelo koje se nalazi u ljudskom krvnom serumu, kao iu imunološkom dijagnostičkom serumu koji sadrži proučavana antitijela.
3. Elektroliti su otopina natrijevog klorida, koju karakterizira izotonično stanje.

Dobivanje precipitogena

Reakcija taloženja je nemoguća bez precipitogena, koji se dobiva mljevenjem materijala i izdvajanjem iz njih proteinskih antigena. Ekstrakcija se odvija kuhanjem ili drugim metodama.
Upečatljiv primjer precipitogena su lizati, kao i ekstrakti tkiva i organa, krvni serum, razne vrste filtrata na bazi bujonskih kultura mikroba, kao i slani ekstrakti mikroorganizama i autolizatnih tvari.

Staging u oborinama

Sada pogledajmo metodu postavljanja reakcije taloženja.
Provodi se prstenasta reakcija taloženja koja se odvija u posebno pripremljenim epruvetama. Serum se unosi u šupljinu posude, izlijevajući ga duž stijenke pomoću vrha pipete. Zatim se odgovarajuća količina precipitogena pažljivo nanese na vrh, a zatim se epruveta iz vodoravnog postavi u okomiti položaj. Postavljanje i uzimanje u obzir reakcije oborine vrlo je skrupulozna operacija. Rezultat se uzima u obzir nakon pojave bijelog prstena na granici između antigena i antitijela. Ako reagirajući elementi reakcije odgovaraju jedan drugome, tada oni komuniciraju, ali to postaje vidljivo nakon dugog vremenskog razdoblja njihove interakcije.
Reakcija taloženja također se provodi u Petrijevoj zdjelici ili na stakalcu, gdje se prenosi agar gel, nanoseći ga u malom sloju. Nakon što se stvrdne, u gelu se izreže mali broj jažica u koje će se staviti antigeni i antitijela. Postoje dva načina izvođenja ove radnje: metoda radijalne imunodifuzije i dvostruka imunodifuzija.

Opće informacije

Mehanika taloženja je slična uređaju za aglutinaciju. Kada je izložen utjecaju seruma imunološkog tipa, antigen, koji je već reagirao, smanjuje svoj Važan uvjet je prozirnost i seruma i antigena.
Registriranje reakcije može se poboljšati naslagivanjem antigena na antitijela. Kao rezultat toga, može se uočiti pojava taloga u obliku prstena. Ova pojava naziva se prstenasto taloženje i provodi se u posebnim cijevima promjera 2,5 do 3,5 mm. Jedan od najrasprostranjenijih primjera taložne reakcije je dijagnoza antraksa.
Precipitacija omogućuje određivanje razine toksigenosti kulture difterije u agaru.
Tijekom reakcije koja se razmatra dolazi do taloženja antigenskih kompleksa i antitijela. Precipitacija je imunološki fenomen koji omogućuje određivanje količine antitijela u krvnom serumu oboljelih ili cijepljenih ljudi i životinja.

Posljedica titracije

Važno je znati da podaci dobiveni titracijom gornje metode nisu kvantitativni. Za izradu i analizu kvantitativne procjene sadržanog broja protutijela, M. Heidelberger i E. Kabat razvili su posebnu reakcijsku tehniku ​​koja se temelji na traženju i identifikaciji zone ekvivalencije. Miješanje dobno specifičnog broja antigena s konstantnim volumenom antiseruma dovodi do povećanja inicijalno stvorenog precipitata, a zatim se ponovno smanjuje zbog povećanja sposobnosti otapanja antigenskih kompleksa. Određivanjem količine antitijela u supernatantima koji se nalaze u svakoj epruveti, možete ustanoviti da u određenom broju zdjelica s antitijelima neće biti tekućine. Ovdje će se u usporedbi s drugim epruvetama formirati najveći talog. Zahvaljujući tome i oduzimanju precipitata antigenskog proteina od ukupne vrijednosti proteina, moguće je dobiti točnu vrijednost antitijela sadržanih u volumenu specifično proučavanog seruma. Zatim se količina proteinskih molekula u talogu određuje količinom dušika ili kolorimetrijskim metodama.

Procjena vrijednosti

Procjena vrijednosti precipitacije u dijagnostičkoj metodologiji mora uzeti u obzir vjerojatnost prisutnosti u imunološkom serumu antitijela koje nema svojstvo precipitina, što znači da se sam precipitat ne mora formirati nakon reakcije s antigenima. Na popisu takvih molekula nalaze se djelomična protutijela i neke vrste iz skupine gama A-globulina.

Reakcija taloženja u laboratorijskim uvjetima nalazi svoju primjenu u različitim vrstama modifikacija. Na primjer, reakcija termoprecipitacije koristi se za otkrivanje bakterijskih antigena botulizma, antraksa itd., koji nisu podložni toplinskoj denaturaciji. Za razliku od prstenastog taloženja, ova vrsta reakcije koristi filtrate dotičnog materijala u kuhanom stanju.
Taloženje u složenoj smjesi ne dopušta karakterizaciju svojstava pojedinih elemenata smjese. U takvim slučajevima, osoba pribjegava metodi taloženja u agaru, a također koristi imunoelektroferezu.

Difuzna oborina

U ovom području istraživanja postoji koncept difuzne taložne reakcije (DPR). Temelji se na sposobnosti protutijela i topivih antigena da difundiraju u gel. Difuzija je sposobnost molekule određene tvari da prodre u molekule druge tvari, što je uzrokovano toplinskim gibanjem.
Gel je sustav disperznog tipa u kojem je tekuća faza ravnomjerno raspoređena u čvrstoj fazi. Najčešće se za ovu reakciju koristi agar gel.
Nakon zadavanja parametara pod kojima molekule mogu difundirati jedna prema drugoj, njihov će susret biti popraćen stvaranjem kompleksa antigen + antitijelo. Takva neoplazma može difundirati dok je u samom gelu, i precipitirati će u obliku trake koja se može otkriti golim okom. Ako su antigen i antitijelo homologni, vrpca se neće formirati.
Stvaranje uvjeta pod kojima će se odvijati difuzija dok ste u sloju agara uključuje izlijevanje komponenti, ali ukupan broj jažica i njihov relativni položaj određuje vrsta problema koji treba riješiti. RPD daje osobi mogućnost otkrivanja i identifikacije nepoznatih izoliranih virusa testiranjem korištenjem poznatog seruma antitijela.

Primjena

Precipitacija se široko koristi ne samo u dijagnostici bolesti, već također nalazi svoju primjenu u sudskoj medicini. Teško je zamisliti analizu u kojoj je moguće utvrditi vrstu krvi, dio organa ili tkiva koje se nalazi na zločinačkom oružju, a koja ne koristi reakciju taloženja. Pritom se koriste taložni serumi koji se dobivaju imunizacijom različitih životinja i ptica. Važno je da je razina titra u serumu najmanje 1:10 000, a mora imati i dovoljnu specifičnost. Iz otkrivene mrlje krvi ili njezine kore radi se izvadak za fizikalni pregled. otopina, koja će potom biti izložena taloženju seruma. Pomoću ove reakcije moguće je odrediti vrste proteina tkiva i organa i ljudi i životinja. Dobivanje mutnih ekstrakata tjera na pribjegavanje taloženju na agaru.

zaključke

Analizirajući informacije koje smo pročitali, možemo zaključiti da su reakcije precipitacije izuzetno važne za ljude, jer omogućuju dijagnosticiranje različitih antigena pomoću antitijela; ovaj fenomen se također široko koristi u sudskoj medicini i omogućuje prepoznavanje vrste krvi, tkiva ili organa u odnosu na određeni predmet. Postoji više vrsta i načina taloženja koji se koriste u skladu s nastalim potrebama problema koji se rješava.

Precipitacijska reakcija (RP) je stvaranje i taloženje kompleksa topljivog molekularnog antigena s protutijelima u obliku oblaka koji se naziva precipitat. Nastaje miješanjem antigena i antitijela u ekvivalentnim količinama; višak jednog od njih smanjuje razinu formiranja imunološkog kompleksa.

RP se stavlja u epruvete (reakcija prstenaste precipitacije), u gelove, hranjive podloge itd. Raširene su varijante RP u polutekućem agaru ili agaroznom gelu: dvostruka imunodifuzija po Ouchterlonyju, radijalna imunodifuzija, imunoelektroforeza itd.

Mehanizam. Provodi se prozirnim koloidno topivim antigenima ekstrahiranim iz patološkog materijala, okolišnih objekata ili čistih bakterijskih kultura. Reakcija koristi prozirne dijagnostičke precipitirajuće serume s visokim titrom protutijela. Za titar precipitirajućeg seruma uzima se najveće razrjeđenje antigena, koje u interakciji s imunološkim serumom uzrokuje stvaranje vidljivog taloga - zamućenja.

Reakcija prstenaste precipitacije provodi se u uskim epruvetama (promjera 0,5 cm), u koje se doda 0,2-0,3 ml taloženog seruma. Zatim se pomoću Pasteurove pipete polagano nanosi 0,1-0,2 ml otopine antigena. Epruvete se pažljivo premjeste u okomiti položaj.Reakcija se bilježi nakon 1-2 minute.U slučaju pozitivne reakcije pojavljuje se talog u obliku bijelog prstena na granici između seruma i ispitivanog antigena.U kontrolnih epruveta, ne stvara se talog.

15. Reakcija koja uključuje komplement: reakcija hemolize, reakcija fiksacije komplementa. Mehanizam, komponente, primjena.

Reakcija fiksacije komplementa (CFR) je da kada antigeni i antitijela odgovaraju jedno drugom, formiraju imunološki kompleks na koji je preko Fc fragmenta antitijela vezan komplement (C), tj. komplement je vezan kompleksom antigen-antitijelo. Ako se kompleks antigen-antitijelo ne formira, tada komplement ostaje slobodan.

Specifična interakcija AG i AT praćena je adsorpcijom (vezivanjem) komplementa. Budući da proces fiksacije komplementa nije vizualno vidljiv, J. Bordet i O. Zhang predložili su korištenje hemolitičkog sustava (crvene krvne stanice ovaca + hemolitički serum) kao indikatora, koji pokazuje je li komplement fiksiran

AG-AT kompleks. Ako AG i AT odgovaraju jedan drugome, tj. formiran je imunološki kompleks, tada je komplement vezan tim kompleksom i ne dolazi do hemolize. Ako AT ne odgovara AG, tada se kompleks ne formira i komplement, ostajući slobodan, spaja se s drugim sustavom i uzrokuje hemolizu.

Komponente. Reakcija vezanja komplementa (CFR) je složena serološka reakcija. Za njegovu provedbu potrebno je 5 sastojaka i to: AG, AT i komplement (prvi sustav), ovčji eritrociti i hemolitički serum (drugi sustav).

Antigen za CSC mogu biti kulture raznih ubijenih mikroorganizama, njihovi lizati, komponente bakterija, patološki promijenjeni i normalni organi, tkivni lipidi, virusi i materijali koji sadrže virus.

Kao nadopuna koristi se svježi ili osušeni serum zamorca.

Mehanizam. RSK se provodi u dvije faze: 1. faza - inkubacija smjese koja sadrži tri komponente antigen + antitijelo + komplement; 2. faza (indikator) - detekcija slobodnog komplementa u smjesi dodavanjem hemolitičkog sustava koji se sastoji od ovčjih eritrocita i hemolitičkog seruma koji sadrži protutijela na njih. U 1. fazi reakcije, kada se stvara kompleks antigen-antitijelo, komplement se veže, a zatim u 2. fazi neće doći do hemolize eritrocita senzibiliziranih protutijelima; reakcija je pozitivna. Ako antigen i antitijelo ne odgovaraju jedno drugom (nema antigena ili antitijela u ispitivanom uzorku), komplement ostaje slobodan i u 2. fazi će se pridružiti kompleksu eritrocit - antieritrocitno antitijelo, uzrokujući hemolizu; negativna reakcija.Primjena. RSC se koristi za dijagnosticiranje mnogih zaraznih bolesti, posebice sifilisa (Wassermannova reakcija)

Imunodijagnostičke reakcije. Reakcije antigen-protutijelo i reakcije s obilježenim komponentama. Koristi se za identifikaciju mikroorganizama i dijagnostiku zaraznih bolesti.

Imunološke reakcije koriste se u dijagnostičkim i imunološkim studijama kod bolesnih i zdravih ljudi. U tu svrhu koriste serološke metode(od lat. serum - sirutka i logotipi - nastavu), odnosno metode proučavanja antitijela i antigena pomoću reakcija antigen-antitijelo utvrđenih u krvnom serumu i drugim tekućinama, te tjelesnim tkivima.

Otkrivanje protutijela protiv antigena patogena u krvnom serumu pacijenta omogućuje postavljanje dijagnoze bolesti. Serološkim istraživanjima također se identificiraju mikrobni antigeni, različite biološki aktivne tvari, krvne grupe, tkivni i tumorski antigeni, imunološki kompleksi, stanični receptori itd.

Kod izolacije mikroba iz bolesnika, uzročnik se identificira proučavanjem njegovih antigenskih svojstava pomoću imunoloških dijagnostičkih seruma, tj. krvnih seruma hiperimuniziranih životinja koji sadrže specifična protutijela. Ovo je tzv serološka identifikacija mikroorganizama.

U mikrobiologiji i imunologiji naširoko se koriste reakcije aglutinacije, precipitacije, reakcije neutralizacije, reakcije koje uključuju komplement, uz korištenje obilježenih protutijela i antigena (radioimunološki, enzimski imunotest, imunofluorescentne metode). Navedene reakcije razlikuju se po registriranom učinku i tehnici izrade, no sve su bazične. temelje se na reakciji interakcije antigena s protutijelom i koriste se za otkrivanje i protutijela i antigena. Imunološke reakcije karakterizira visoka osjetljivost i specifičnost.

Ispod su principi i dijagrami glavnih imunodijagnostičkih reakcija. Detaljna tehnika za postavljanje reakcija data je u. praktične smjernice za imunodijagnostiku.

Reakcija aglutinacije – RA(od lat. agluti- nacija- adhezija) je jednostavna reakcija u kojoj protutijela vežu korpuskularne antigene (bakterije, eritrocite ili druge stanice, netopljive čestice na kojima su adsorbirani antigeni, kao i makromolekularne nakupine). Javlja se u prisutnosti elektrolita, na primjer, kada se doda izotonična otopina natrijeva klorida.

Koriste se različite mogućnosti reakcije aglutinacije: ekstenzivna, indikativna, neizravna itd. Reakcija aglutinacije očituje se stvaranjem pahuljica ili sedimenta.

RA se koristi za:

određivanje protutijela u krvnom serumu pacijenata, na primjer, s brucelozom (Wrightova, Heddelsonova reakcija), trbušnog tifusa i paratifusne groznice (Vidalova reakcija) i drugih zaraznih bolesti;

određivanje uzročnika izoliranog od pacijenta;

određivanje krvnih grupa monoklonskim antitijelima protiv aloantigena eritrocita.

Odrediti antitijela kod bolesnika stavitidetaljna reakcija aglutinacije: dodati u razrjeđenja krvnog seruma bolesnika dijagnostikum(suspenzija ubijenih mikroba) i nakon nekoliko sati inkubacije na 37 °C bilježi se najveće razrjeđenje seruma (titar seruma) pri kojem dolazi do aglutinacije, odnosno do stvaranja taloga.

Priroda i brzina aglutinacije ovise o vrsti antigena i protutijela. Primjer su osobitosti interakcije dijagnostikuma (O- i R-antigena) sa specifičnim antitijelima. Reakcija aglutinacije sa O-dijagnostikum(bakterije ubijaju toplinom, zadržavaju toplinsku stabilnost O-antigen) javlja se u obliku sitnozrnaste aglutinacije. Reakcija aglutinacije s H-diagnosticumom (bakterije ubijene formaldehidom, zadržavajući termolabilni flagelarni H-antigen) je gruba i odvija se brže.

Ako je potrebno odrediti uzročnika izoliranog od pacijenta, staviti indikativna reakcija aglutinacije, pomoću dijagnostičkih antitijela (aglutinirajući serum), tj. provodi se serotipizacija uzročnika. Indikativna reakcija provodi se na predmetnom staklu. Čista kultura uzročnika izolirana od bolesnika dodaje se kapi dijagnostičkog aglutinirajućeg seruma u razrjeđenju 1:10 ili 1:20. U blizini se nalazi kontrola: umjesto seruma nanosi se kap otopine natrijevog klorida. Kada se u kapi koja sadrži serum i mikrobe pojavi flokulentni sediment, a opsežna reakcija aglutinacije u epruvetama s rastućim razrjeđenjima aglutinirajućeg seruma u koji se dodaju 2-3 kapi suspenzije uzročnika. Aglutinacija se uzima u obzir količinom sedimenta i stupnjem bistrine tekućine. Reakcija se smatra pozitivnom ako se uoči aglutinacija u razrjeđenju bliskom titru dijagnostičkog seruma. Istodobno se uzimaju u obzir kontrole: serum razrijeđen izotoničnom otopinom natrijevog klorida treba biti proziran, suspenzija mikroba u istoj otopini treba biti jednoliko mutna, bez sedimenta.

Različite srodne bakterije mogu se aglutinirati istim dijagnostičkim aglutinirajućim serumom, što otežava njihovu identifikaciju. Stoga koriste adsorbirani aglutinirajući serumi, iz kojih su protutijela koja unakrsno reagiraju uklonjena adsorpcijom na srodne bakterije. Takvi serumi zadržavaju antitijela koja su specifična samo za određenu bakteriju. Proizvodnju posebnih monoreceptorskih dijagnostičkih aglutinirajućih seruma predložio je A. Castellani (1902.).

Neizravna (pasivna) reakcija hemaglutinacije (RNGA, RPGA) temelji se na korištenju eritrocita s antigenima ili antitijelima adsorbiranim na njihovoj površini, čija interakcija s odgovarajućim antitijelima ili antigenima krvnog seruma uzrokuje sljepljivanje eritrocita i ispadanje na dno testa. cijev ili ćelija V u obliku nazubljenog sedimenta (sl. 13.2). U slučaju negativne reakcije, crvena krvna zrnca se talože ■ u obliku „gumbića“. Tipično, protutijela se otkrivaju u RNGA pomoću antigenskog dijagnostikuma eritrocita, koji se sastoji od eritrocita s adsorbiranim na ih s antigenima. Ponekad se koristi dijagnostika antitijela eritrocita, na kojima se antitijela adsorbiraju. Na primjer, botulinum toksin se može detektirati dodavanjem eritrocitnog protutijela na botulinum toksin (ova reakcija se zove reverzna reakcija neizravne hemaglutinacije- RONG). RNGA se koristi za dijagnosticiranje zaraznih bolesti i određivanje gonadotropnog hormona V urin prilikom utvrđivanja trudnoće, za prepoznavanje preosjetljivosti na lijekove, hormone iu nekim drugim slučajevima.

Reakcija koaglutinacije . Stanice patogena određuju se pomoću stafilokoka prethodno tretiranih imunodijagnostičkim serumom. Stafilokok koji sadrži protein A, imati afiniteta prema Fc - fragment imunoglobulina, nespecifično adsorbira antimikrobna antitijela, koja zatim stupaju u interakciju s aktivnim centrima s odgovarajućim mikrobima izoliranim od pacijenata. Kao rezultat koaglutinacije nastaju pahuljice koje se sastoje od stafilokoka, dijagnostičkih antitijela u serumu i otkrivenog mikroba.

Reakcija inhibicije hemaglutinacije (RTGA) temelji se na blokadi, supresiji virusnih antigena imunološkim serumskim antitijelima, zbog čega virusi gube sposobnost aglutinacije crvenih krvnih stanica (slika 13.3). RTGA se koristi za dijagnosticiranje mnogih virusnih bolesti, čiji uzročnici (virusi gripe, ospica, rubeola, krpeljni encefalitis itd.) mogu aglutinirati crvena krvna zrnca raznih životinja.

Reakcija aglutinacije za određivanje krvnih grupa koristi se za uspostavljanje ABO sustava (vidi odjeljak 10.1.4.1) korištenjem aglutinacije crvenih krvnih stanica s antitijelima imunološkog seruma protiv antigena krvne grupe A (II), B (III). Kontrola je: serum koji ne sadrži antitijela, tj AB (GU) krvne grupe; antigeni sadržani u crvenim krvnim stanicama skupina A (II), B (III). Negativna kontrola ne sadrži antigene, tj. koriste se eritrociti skupine 0 (I).

U reakcije aglutinacije za određivanje Rh faktora(vidi odjeljak 10.1.4.1) koristite anti-Rhesus serume (barem dvije različite serije). Ako na membrani proučavanih eritrocita postoji Rh antigen, dolazi do aglutinacije tih stanica. Kao kontrola služe standardni Rh pozitivni i Rh negativni eritrociti svih krvnih grupa.

Reakcija aglutinacije za određivanje anti-rezus antitijela (indirektni Coombsov test)koristi se u bolesnika s intravaskularnom hemolizom. U nekih od ovih bolesnika otkrivaju se anti-rezus antitijela, koja su nepotpuna i monovalentna. Oni specifično djeluju na Rh-pozitivne eritrocite, ali ne uzrokuju njihovu aglutinaciju. Prisutnost takvih nepotpunih protutijela utvrđuje se neizravnim Coombsovim testom. Da bi se to postiglo, sustavu anti-Rh protutijela + Rh-pozitivni eritrociti dodaje se antiglobulinski serum (antitijela protiv humanih imunoglobulina), što uzrokuje aglutinaciju eritrocita (slika 13.4). Pomoću Coombsove reakcije dijagnosticiraju se patološka stanja povezana s intravaskularnom lizom eritrocita imunološkog podrijetla, na primjer, hemolitička bolest novorođenčadi: eritrociti Rh-pozitivnog fetusa spajaju se s nepotpunim antitijelima na Rh faktor koji cirkuliraju u krvi, a koji imaju prošao kroz placentu od Rh-negativne majke.

Reakcije taloženja

Reakcija taloženja - RP (odlat. praecipito- precipitat) - to je stvaranje i taloženje kompleksa topljivog molekularnog antigena s protutijelima u obliku zamućenja, tzv. talog. Nastaje miješanjem antigena i antitijela u ekvivalentnim količinama; višak jednog od njih smanjuje razinu formiranja imunološkog kompleksa.

Reakcije taloženja izvode se u epruvetama (reakcija taloženja prstena), u gelovima, hranjivim medijima itd. Različite reakcije taloženja u polutekućim gelovima agara ili agaroze postale su široko rasprostranjene: dvostruka imunodifuzija po Ouchterlonyju. radijalna imunodifuzija, imunoelektroforeza i tako dalje.

Prstenasta reakcija taloženja . Reakcija se provodi u uskim epruvetama za taloženje s imunološkim serumom, na koji je slojevito nanesen topljivi antigen. Uz optimalan omjer antigena i protutijela, na granici ovih dviju otopina stvara se neprozirni prsten taloga (slika 13.5). Višak antigena ne utječe na rezultat reakcije taloženja prstena zbog postupne difuzije reagensa do granice tekućine. Ako se kao antigeni u reakciji prstenaste precipitacije koriste prokuhani i filtrirani vodeni ekstrakti organa ili tkiva, tada se ta reakcija naziva reakcija termoprecipitacije (Ascolijeva reakcija, s antraksom/

Reakcija dvostruke imunodifuzije po Ouchterunyju . Za postavljanje reakcije otopljeni agar gel se izlije u tankom sloju na staklenu ploču i nakon što se stvrdne izrezuju se jažice veličine 2-3 mm. Antigeni i imunološki serumi stavljaju se odvojeno u te jažice, koje difundiraju jedna prema drugoj. Na mjestu susreta, u jednakim omjerima, stvaraju talog u obliku bijele pruge. U višekomponentnim sustavima pojavljuje se nekoliko linija precipitata između jažica s različitim antigenima i serumskim protutijelima; za identične antigene, linije precipitata se spajaju; za neidentične se sijeku (sl. 13.6).

Reakcija radijalne imunodifuzije . Imuni serum s rastopljenim agar gelom ravnomjerno se izlije na staklo. Nakon skrućivanja u gelu prave se jažice u koje se stavlja antigen u različitim razrjeđenjima. Antigen, difundirajući u gel, formira prstenaste precipitacijske zone oko jažica s protutijelima (slika 13.7). Promjer precipitacijskog prstena proporcionalan je koncentraciji antigena. Reakcija se koristi za određivanje sadržaja imunoglobulina različitih klasa, komponenti sustava komplementa itd. U krvi.

Imunoelektroforeza- kombinacija elektroforeze i imunoprecipitacije: smjesa antigena se unosi u jažice gela i elektroforezom razdvaja u gelu. Zatim se u utor paralelno sa zonama elektroforeze unosi imunološki serum, čija antitijela, difundirajući u gel, formiraju precipitacijske linije na mjestu susreta s antigenom.

Reakcija flokulacije(prema Ramonu) (od lat. floccus - wool flakes) - pojava opalescencije ili flokulentne mase (imunoprecipitacije) u epruveti tijekom reakcije toksin-antitoksin ili toksoid-antitoksin. Koristi se za određivanje aktivnosti antitoksičnog seruma ili toksoida.

Imunološka elektronska mikroskopija- elektronska mikroskopija mikroba, često virusa, tretiranih odgovarajućim antitijelima. Virusi tretirani imunološkim serumom stvaraju imunološke nakupine (mikroprecipitate). Oko viriona formira se "vijenac" protutijela, u kontrastu s fosfovolframovom kiselinom ili drugim elektronoptički gustim pripravcima.

Reakcije koje uključuju komplement

Reakcije koje uključuju komplementtemelje se na aktivaciji komplementa kompleksom antigen-antitijelo (reakcija fiksacije komplementa, radijalna hemoliza itd.).

Reakcija fiksacije komplementa (RSK) je da kada antigeni i antitijela odgovaraju jedno drugom, oni tvore imunološki kompleks, na koji, kroz Fc -fragment antitijela je vezan za komplement (C), tj. komplement je vezan kompleksom antigen-antitijelo. Ako se kompleks antigen-antitijelo ne formira, tada komplement ostaje slobodan (slika 13.8). RSK se provodi u dvije faze: 1. faza - inkubacija smjese koja sadrži tri komponente antigen + antitijelo + komplement; 2. faza (indikator) - detekcija slobodnog komplementa u smjesi dodavanjem hemolitičkog sustava koji se sastoji od ovčjih eritrocita i hemolitičkog seruma koji sadrži protutijela na njih. U 1. fazi reakcije, kada se stvara kompleks antigen-antitijelo, komplement se veže, a zatim u 2. fazi neće doći do hemolize eritrocita senzibiliziranih protutijelima; reakcija je pozitivna. Ako antigen i antitijelo ne odgovaraju jedno drugom (nema antigena ili antitijela u ispitivanom uzorku), komplement ostaje slobodan i u 2. fazi će se pridružiti kompleksu eritrocit - antieritrocitno antitijelo, uzrokujući hemolizu; reakcija je negativna.

RSC se koristi za dijagnosticiranje mnogih zaraznih bolesti, posebice sifilisa (Wassermannova reakcija).

Reakcija radijalne hemolize (RRH) ) stavljen u jažice agar gela koji sadrži ovčje crvene krvne stanice i komplement. Nakon unošenja hemolitičkog seruma (protutijela protiv crvenih krvnih zrnaca ovaca) u jažice gela, oko njih se formira zona hemolize (kao rezultat radijalne difuzije antitijela). Na ovaj način moguće je odrediti aktivnost komplementa i hemolitičkog seruma, kao i antitijela u krvnom serumu oboljelih od gripe, rubeole i krpeljnog encefalitisa. Da bi se to postiglo, odgovarajući antigeni virusa adsorbiraju se na eritrocite, a pacijentov krvni serum se dodaje u jažice gela koji sadrži te eritrocite. Antivirusna protutijela stupaju u interakciju s virusnim antigenima adsorbiranim na eritrocitima, nakon čega

Zatim se komponente komplementa pridružuju ovom kompleksu, uzrokujući hemolizu.

Reakcija imunološke adherencije (IAR) ) temelji se na aktivaciji sustava komplementa korpuskularnim antigenima (bakterije, virusi) tretiranim imunološkim serumom. Uslijed toga nastaje aktivirana treća komponenta komplementa (C3b) koja se veže za korpuskularni antigen kao dio imunološkog kompleksa. Eritrociti, trombociti i makrofagi imaju receptore za C3b, zbog čega, kada se te stanice pomiješaju s imunološkim kompleksima koji nose C3b, dolazi do njihove kombinacije i aglutinacije.

Reakcija neutralizacije

Protutijela imunološkog seruma sposobna su neutralizirati štetno djelovanje mikroba ili njihovih toksina na osjetljive stanice i tkiva, što je povezano s blokadom mikrobnih antigena protutijelima, tj. neutralizacija. Reakcija neutralizacije(RN) provodi se unošenjem mješavine antigen-protutijelo u životinje ili u osjetljive test objekte (kultura stanica, embriji). U nedostatku štetnih učinaka mikroorganizama ili njihovih antigena ili toksina u životinja i testnih objekata, oni govore o neutralizirajućem učinku imunološkog seruma i, prema tome, specifičnosti interakcije kompleksa antigen-antitijelo (slika 13.9).

Reakcija imunofluorescencije - RIF (Coonsova metoda)

Postoje tri glavne vrste metode: izravna, neizravna (slika 13.10), s komplementom. Koonsova reakcija je brza dijagnostička metoda za identifikaciju mikrobnih antigena ili određivanje antitijela.

Izravna RIF metoda temelji se na činjenici da tkivni antigeni ili mikrobi tretirani imunološkim serumima s antitijelima obilježenim fluorokromima mogu svijetliti u UV zrakama fluorescentnog mikroskopa.

Bakterije u razmazu tretiranom takvim luminescentnim serumom svijetle po obodu stanice u obliku zelene granice.

Indirektna RIF metoda sastoji se od identificiranja kompleksa antigen-antitijelo pomoću antiglobulinskog (antitijela) seruma obilježenog fluorokromom. Da biste to učinili, razmazi iz suspenzije mikroba tretiraju se antitijelima iz antimikrobnog dijagnostičkog seruma kunića. Zatim se isperu antitijela koja nisu vezana na mikrobne antigene, a antitijela koja su ostala na mikrobima detektiraju se tretiranjem razmaza antiglobulinskim (anti-zečjim) serumom obilježenim fluorokromima. Kao rezultat toga nastaje kompleks mikrob + antimikrobna zečja protutijela + antizečja protutijela obilježena fluorokromom. Ovaj kompleks promatra se fluorescentnim mikroskopom, kao i kod izravne metode.

Enzimska imunosorbentna metoda ili analiza (ELISA)

ELISA -otkrivanje antigena pomoću njihovih odgovarajućih antitijela konjugiranih na enzim tag (peroksidaza hrena, beta-galaktozidaza ili alkalna fosfataza). Nakon spajanja antigena s imunološkim serumom obilježenim enzimom, u smjesu se dodaje supstrat/kromogen. Supstrat se cijepa enzimom, a boja produkta reakcije se mijenja - intenzitet boje je upravno proporcionalan broju vezanih molekula antigena i antitijela.

Čvrsta faza ELISA - najčešća varijanta imunološkog testa, kada se jedna od komponenti imunološke reakcije (antigen ili antitijela) sorbira na čvrstom nosaču, na primjer, u jažicama polistirenskih ploča

Pri određivanju protutijela u jažice pločica s sorbiranim antigenom redom se dodaju bolesnikov krvni serum, antiglobulinski serum obilježen enzimom i supstrat (kromogen) za enzim.

Svaki put nakon dodavanja druge komponente, nevezani reagensi se uklanjaju iz jažica temeljitim pranjem. Ako je rezultat pozitivan, mijenja se boja otopine kromogena. Nosilac čvrste faze može se senzibilizirati ne samo antigenom, već i antitijelima. Potom se u jažice sa sorbiranim antitijelima dodaje željeni antigen, dodaje se imunološki serum protiv antigena obilježenog enzimom, a zatim se dodaje supstrat za enzim.

Konkurentna ELISA opcija . ciljni antigen i enzimom obilježeni antigen međusobno se natječu za vezanje ograničene količine imunoloških serumskih protutijela. Još jedan test - antitijela koja tražite

a obilježena protutijela međusobno se natječu za antigene.

Radioimunološka metoda ili analiza (RIA)

Vrlo osjetljiva metoda koja se temelji na reakciji antigen-antitijelo pomoću antigena ili antitijela obilježenih radionuklidom (125 J, 14 C, 3 H, 51 Cr itd.). Nakon njihove interakcije, nastali radioaktivni imunološki kompleks se odvaja i njegova radioaktivnost se određuje u odgovarajućem brojaču (beta ili gama zračenje):

intenzitet zračenja izravno je proporcionalan broju vezanih molekula antigena i protutijela.

Na čvrsta faza RIA verzija jedna od komponenti reakcije (antigen ili antitijela) sorbira se na čvrstu podlogu, na primjer, u jažicama polistirenskih mikroploča. Druga opcija metode je konkurentni RIA.željeni antigen i antigen obilježen radionuklidom međusobno se natječu za vezanje ograničene količine protutijela imunološkog seruma. Ova se opcija koristi za određivanje količine antigena u ispitivanom materijalu.

RIA se koristi za identifikaciju mikrobnih antigena, određivanje hormona, enzima, lijekova i imunoglobulina, kao i drugih tvari sadržanih u ispitivanom materijalu u malim koncentracijama - 10~ |0 -I0~ 12 g/l. Metoda predstavlja određenu opasnost za okoliš.

Imunobloting

Imunobloting (IB)- visoko osjetljiva metoda koja se temelji na kombinaciji elektroforeze i ELISA ili RIA.

Antigen se izolira elektroforezom u poliakrilamidnom gelu, zatim prenosi (blotiranje - s engleskog. mrlja, mrlja) iz gela na aktivirani papir ili nitroceluloznu membranu i razvijena pomoću ELISA. Tvrtke proizvode takve trake s "mrljama"

antigeni. Na ove trakice nanosi se serum pacijenta. Zatim se nakon inkubacije pacijent ispere od nevezanih antitijela i aplicira serum protiv humanih imunoglobulina obilježenih enzimom. Kompleks antigen + antitijelo pacijenta + antitijelo protiv humanog Ig formiran na traci detektira se dodavanjem supstrata/kromogena koji mijenja boju pod djelovanjem enzima (slika 13.12).

IB se koristi kao dijagnostička metoda za HIV infekciju itd.

13.1. Reakcije antigen-protutijelo i njihova primjena

Kada se uvede antigen, u tijelu se stvaraju antitijela. Protutijela su komplementarna antigenu koji je uzrokovao njihovu sintezu i sposobna su se na njega vezati. Vezanje antigena za antitijela sastoji se od dvije faze. Prva faza je specifična, u kojoj dolazi do brzog vezanja antigene determinante na aktivno središte Fab fragmenta protutijela. Treba napomenuti da je vezanje posljedica van der Waalsovih sila, vodika i hidrofobnih interakcija. Snaga veze određena je stupnjem prostorne podudarnosti između aktivnog mjesta protutijela i epitopa antigena. Nakon specifične faze počinje sporija faza - nespecifična, koja se očituje vidljivom fizikalnom pojavom (npr. stvaranje ljuskica pri aglutinaciji i sl.).

Imunološke reakcije su interakcije između antitijela i antigena, a te su reakcije specifične i vrlo osjetljive. Oni se široko koriste u medicinskoj praksi. Uz pomoć imunoloških reakcija mogu se riješiti sljedeći problemi:

Određivanje nepoznatih protutijela poznatim antigenima (antigenski dijagnostikum). Ovaj zadatak se javlja kada je potrebno odrediti antitijela na patogen u krvnom serumu pacijenta (serodijagnostika). Pronalaženje protutijela omogućuje potvrdu dijagnoze;

Određivanje nepoznatih antigena pomoću poznatih antitijela (dijagnostički serum). Ova studija se provodi kada se identificira kultura patogena izolirana iz pacijentovog materijala (serotipizacija), kao i kada se otkriva

mikrobni antigeni i njihovi toksini u krvi i drugim biološkim tekućinama. Postoje mnoge vrste imunoloških reakcija koje se razlikuju po tehnici postavljanja i zabilježenom učinku. To su reakcije aglutinacije (RA), reakcije precipitacije (RP), reakcije s komplementom (RSC), reakcije s obilježenim komponentama (RIF, ELISA, RIA).

13.2. Reakcija aglutinacije

Reakcija aglutinacije (RA) je imunološka reakcija interakcije antigena s protutijelima u prisutnosti elektrolita, a antigen je u korpuskularnom stanju (eritrociti, bakterije, čestice lateksa s adsorbiranim antigenima). Tijekom aglutinacije antitijelima se lijepe korpuskularni antigeni, što se očituje stvaranjem pahuljastog taloga. Stvaranje pahuljica nastaje zbog činjenice da antitijela imaju dva aktivna centra, a antigeni su polivalentni, tj. imaju nekoliko antigenih determinanti. RA se koristi za identifikaciju patogena izoliranog iz materijala pacijenta, kao i za otkrivanje antitijela na patogen u krvnom serumu pacijenta (na primjer, Wrightova i Heddlesonova reakcija za brucelozu, Widalova reakcija za trbušni tifus i paratifus).

Najjednostavniji način dijagnosticiranja RA je reakcija na staklu, to je aproksimativni RA, kojim se utvrđuje uzročnik izoliran od bolesnika. Kada se utvrdi reakcija, na predmetno staklo se nanosi dijagnostički aglutinirajući serum (u razrjeđenju 1:10 ili 1:20), zatim se dodaje kultura od bolesnika. Reakcija je pozitivna ako se u kapi pojavi flokulantni talog. U blizini se nalazi kontrola: umjesto seruma nanosi se kap otopine natrijevog klorida. Ako dijagnostički aglutinirajući serum nije adsorbiran 1, tada se razrjeđuje (do titra - razrjeđenja do kojeg treba doći do aglutinacije), tj. staviti prošireni RA u epruvete s povećanjem

1 Neadsorbirani aglutinirajući serum može aglutinirati srodne bakterije koje imaju zajedničke antigene (križne reakcije). Stoga koristeadsorbirani aglutinirajući serumi, iz kojih su protutijela koja unakrsno reagiraju uklonjena adsorpcijom na srodne bakterije. Takvi serumi zadržavaju antitijela koja su specifična samo za određenu bakteriju.

razrjeđenja aglutinirajućeg seruma, u koji se dodaju 2-3 kapi suspenzije uzročnika izoliranog od bolesnika. Aglutinacija se uzima u obzir količinom sedimenta i stupnjem bistrine tekućine u epruvetama. Reakcija se smatra pozitivnom ako se uoči aglutinacija u razrjeđenju bliskom titru dijagnostičkog seruma. Reakcija je popraćena kontrolama: serum razrijeđen izotoničnom otopinom natrijevog klorida treba biti proziran, suspenzija mikroba u istoj otopini mora biti jednoliko mutna, bez taloga.

Za određivanje protutijela na patogen u krvnom serumu pacijenta koristi se RA u punoj mjeri. Prilikom postavljanja, u epruvetama se razrijedi bolesnikov krvni serum i u epruvete se doda jednaka količina suspenzije dijagnostikuma (suspenzija ubijenih mikroba). Nakon inkubacije odredi se najveće razrjeđenje seruma pri kojem je došlo do aglutinacije, tj. nastao je precipitat (titar seruma). U tom slučaju dolazi do reakcije aglutinacije s O-diagnosticumom (bakterije ubijene toplinom, zadržavajući termostabilni O-antigen) u obliku sitnozrnate aglutinacije. Reakcija aglutinacije s H-diagnosticumom (bakterije ubijene formaldehidom, zadržavajući termolabilni flagelarni H-antigen) je gruba i odvija se brže.

Neizravna (pasivna) reakcija hemaglutinacije(RNGA ili RPGA) je vrsta RA. Ova metoda je vrlo osjetljiva. Uz pomoć RNGA mogu se riješiti dva problema: odrediti antitijela u krvnom serumu bolesnika kojemu je dodan antigenski eritrocitni dijagnostikum, a to su eritrociti na koje su adsorbirani poznati antigeni; utvrditi prisutnost antigena u ispitivanom materijalu. U tom slučaju, reakcija se ponekad naziva reakcija reverzne neizravne hemaglutinacije (RONHA). Tijekom postupka ispitivanom materijalu dodaje se eritrocitni dijagnostikum antitijela (eritrociti na površini kojih su adsorbirana antitijela). U ovoj reakciji crvena krvna zrnca djeluju kao prijenosnici i pasivno sudjeluju u stvaranju imunoloških nakupina. Uz pozitivnu reakciju, pasivno zalijepljene crvene krvne stanice prekrivaju dno rupice u ravnomjernom sloju s nazubljenim rubovima ("kišobran"); u nedostatku aglutinacije, crvene krvne stanice nakupljaju se u središnjem udubljenju rupe, tvoreći kompaktni "gumb" s oštro definiranim rubovima.

Reakcija koaglutinacije koristi se za određivanje stanica patogena (antigena) pomoću antitijela adsorbiranih na Staphylococcus aureus, koji sadrži protein A. Protein A ima afinitet prema Fc fragmentu imunoglobulina. Zahvaljujući tome, antitijela se vežu na stafilokoke neizravno preko Fc fragmenta, a Fab fragmenti su usmjereni prema van i mogu komunicirati s odgovarajućim mikrobima izoliranim od pacijenata. U tom slučaju nastaju pahuljice.

Reakcija inhibicije hemaglutinacije (HAI) koristi se u dijagnostici virusnih infekcija i samo infekcija uzrokovanih hemaglutinirajućim virusima. Ovi virusi na svojoj površini sadrže protein - hemaglutinin, koji je odgovoran za reakciju hemaglutinacije (HRA) kada se virusima dodaju crvena krvna zrnca. RTGA uključuje blokiranje virusnih antigena antitijelima, zbog čega virusi gube sposobnost aglutinacije crvenih krvnih stanica.

Coombsova reakcija - RA za određivanje nepotpunih protutijela. Kod nekih zaraznih bolesti, kao što je bruceloza, nepotpuna protutijela na uzročnika cirkuliraju u krvnom serumu bolesnika. Nepotpuna protutijela nazivaju se blokirajućim protutijelima jer imaju jedno mjesto vezanja antigena, a ne dva, kao potpuna protutijela. Stoga se pri dodavanju antigenskog dijagnostikuma nepotpuna antitijela vežu za antigene, ali ih ne lijepe. Za manifestiranje reakcije dodaje se antiglobulinski serum (protutijela na humane imunoglobuline) koji će dovesti do aglutinacije imunoloških kompleksa (antigenski dijagnostikum + nepotpuna antitijela) nastalih u prvoj fazi reakcije.

Neizravna Coombsova reakcija koristi se u bolesnika s intravaskularnom hemolizom. U nekih od ovih bolesnika otkrivena su nepotpuna monovalentna anti-Rhesus protutijela. Oni specifično djeluju na Rh-pozitivne eritrocite, ali ne uzrokuju njihovu aglutinaciju. Zbog toga se u sustav anti-Rh protutijela + Rh-pozitivni eritrociti dodaje antiglobulinski serum koji uzrokuje aglutinaciju eritrocita. Pomoću Coombsove reakcije dijagnosticiraju se patološka stanja povezana s intravaskularnom lizom eritrocita imunološkog podrijetla, na primjer, hemolitička bolest novorođenčadi uzrokovana Rh sukobom.

RA za određivanje krvnih grupa temelji se na aglutinaciji eritrocita protutijelima imunološkog seruma na antigene krvne grupe A(II), B(III). Kontrola je serum koji ne sadrži antitijela, tj. serumske AB(IV) krvne grupe, te eritrocitnih antigena grupa A(P) i B(III). Crvena krvna zrnca skupine 0(I) koriste se kao negativna kontrola jer nemaju antigene.

Za određivanje Rh faktora koriste se anti-Rh serumi (barem dvije različite serije). Ako na membrani proučavanih eritrocita postoji Rh antigen, dolazi do aglutinacije tih stanica.

13.3. Reakcija taloženja

RP je imunološka reakcija interakcije protutijela s antigenima u prisutnosti elektrolita, a antigen je u topljivom stanju. Tijekom taloženja dolazi do taloženja topljivih antigena protutijelima, što se očituje zamućenjem u obliku precipitacijskih traka. Stvaranje vidljivog taloga se opaža kada se oba reagensa pomiješaju u ekvivalentnim omjerima. Višak jednog od njih smanjuje broj istaloženih imunoloških kompleksa. Postoje različiti načini za izvođenje reakcije taloženja.

Prstenasta reakcija taloženja smješteni u taložne cijevi malog promjera. Imunološki serum se dodaje u epruvetu i topljivi antigen se pažljivo slojevito postavlja. Ako je rezultat pozitivan, na granici dviju otopina stvara se mliječni prsten. Prstenasta precipitacijska reakcija, kojom se utvrđuje prisutnost antigena u organima i tkivima, čiji se ekstrakti kuhaju i filtriraju, naziva se termoprecipitacijska reakcija (Ascolijeva reakcija za određivanje termostabilnog antraks antigena).

Ouchterlony dvostruka imunodifuzijska reakcija. Ova reakcija se provodi u agar gelu. U sloju gela jednake debljine, jažice su izrezane na određenoj udaljenosti jedna od druge i ispunjene antigenom, odnosno imunološkim serumom. Nakon toga, antigeni i antitijela difundiraju u gel, međusobno se susreću i formiraju imunološke komplekse, koji se talože u gelu i postaju vidljivi kao precizne linije.

prehrana. Ova reakcija se može koristiti za identifikaciju nepoznatih antigena ili antitijela, kao i za ispitivanje sličnosti između različitih antigena: ako su antigeni identični, linije taloženja se spajaju, ako antigeni nisu identični, linije precipitacije se sijeku, ako su antigeni djelomično identične, nastaje ostruga.

Reakcija radijalne imunodifuzije. Protutijela se dodaju u otopljeni agar gel i gel se nanosi u ravnomjernom sloju na staklo. U gelu se izrezuju jažice i u njih se dodaje standardni volumen otopina antigena različitih koncentracija. Tijekom inkubacije, antigeni difundiraju radijalno iz jažice i, susrećući se s antitijelima, formiraju precipitacijski prsten. Sve dok višak antigena ostaje u jažici, dolazi do postupnog povećanja promjera precipitacijskog prstena. Ova se metoda koristi za određivanje antigena ili protutijela u ispitnoj otopini (na primjer, za određivanje koncentracije imunoglobulina različitih klasa u krvnom serumu).

Imunoelektroforeza. Mješavina antigena se najprije elektroforetski odvoji, zatim se taloženi antiserum doda u utor koji ide duž smjera kretanja proteina. Antigeni i antitijela difundiraju u gel jedni prema drugima; međusobno djelujući, tvore lučne oborinske linije.

Reakcija flokulacije(prema Ramonu) - vrsta reakcije taloženja koja se koristi za određivanje aktivnosti antitoksičnog seruma ili toksoida. Reakcija se provodi u epruvetama. U epruveti u kojoj su toksoid i antitoksin u jednakom omjeru uočava se zamućenje.

13.4. Reakcija fiksacije komplementa

Antitijela, u interakciji s odgovarajućim antigenom, vežu dodani komplement (1. sustav). Indikator fiksacije komplementa su eritrociti senzibilizirani hemolitičkim serumom, t.j. antitijela na crvena krvna zrnca (2. sustav). Ako komplement nije fiksiran u 1. sustavu, tj. Ako ne dođe do reakcije antigen-protutijelo, senzibilizirane crvene krvne stanice su potpuno lizirane (negativna reakcija). Kada je komplement fiksiran imunološkim kompleksima 1. sustava nakon dodavanja senzibiliziranih eritrocita, hemoliza iz

odsutan (pozitivna reakcija). Reakcija vezanja komplementa koristi se za dijagnosticiranje zaraznih bolesti (gonoreja, sifilis, gripa itd.).

13.5. Reakcija neutralizacije

Mikrobi i njihovi toksini štetno djeluju na organe i tkiva ljudskog tijela. Protutijela se mogu vezati za ove štetne agense i blokirati ih, tj. neutralizirati. Dijagnostička reakcija neutralizacije temelji se na ovoj značajki protutijela. Provodi se unošenjem mješavine antigen-antitijelo u životinje ili u osjetljive test objekte (kultura stanica, embriji). Na primjer, za otkrivanje toksina u materijalu pacijenta, životinjama 1. skupine se ubrizgava materijal od pacijenta. Životinjama 2. skupine ubrizgan je sličan materijal, prethodno tretiran odgovarajućim antiserumom. Životinje 1. skupine ugibaju ako u materijalu postoji toksin. Druga skupina životinja preživi, ​​štetni učinak toksina se ne očituje jer se neutralizira.

13.6. Reakcije s obilježenim antitijelima ili antigenima

13.6.1. Reakcija imunofluorescencije (RIF, Koonsova metoda)

Ova metoda se koristi za ekspresnu dijagnostiku. Može se koristiti za otkrivanje i mikrobnih antigena i antitijela.

Izravna RIF metoda- imunološka reakcija interakcije protutijela s antigenima, a protutijela su obilježena fluorokromom - tvari koja je sposobna emitirati kvante svjetlosti određene valne duljine kada je izložena svjetlosti određene valne duljine. Osobitost ove metode je potreba za uklanjanjem neizreagiranih komponenti kako bi se isključila detekcija nespecifične luminiscencije. Da biste to učinili, isperite antitijela koja nisu reagirala. Rezultati se procjenjuju pomoću fluorescentnog mikroskopa. Bakterije u razmazu tretiranom takvim luminiscentnim serumom svijetle na tamnoj pozadini duž periferije stanice.

Indirektna RIF metoda koristi se češće od prethodnog. Ova reakcija se provodi u dvije faze. U prvoj fazi, antigeni međusobno

komuniciraju s odgovarajućim protutijelima, tvoreći imunološke komplekse. Sve komponente koje nisu reagirale (tj. nisu dio imunoloških kompleksa) moraju se ukloniti pranjem. U drugoj fazi, dobiveni kompleks antigen-antitijelo detektira se pomoću fluorokromiziranog antiglobulinskog seruma. Kao rezultat toga nastaje kompleks mikroba + antimikrobna zečja protutijela + protutijela na zečje imunoglobuline, obilježene fluorokromom. Rezultati se procjenjuju pomoću fluorescentnog mikroskopa.

13.6.2. Enzimska imunosorbentna metoda ili analiza

ELISA je najčešća suvremena metoda koja se koristi za dijagnostiku virusnih, bakterijskih, protozoalnih infekcija, posebice za dijagnostiku HIV infekcije, virusnog hepatitisa itd.

Postoji mnogo modifikacija ELISA testa. Nekompetitivni ELISA test čvrste faze široko se koristi. Provodi se u polistirenskim pločama s 96 jažica (kruta faza). Prilikom provođenja reakcije potrebno je u svakoj fazi isprati neizreagirane komponente. Pri određivanju protutijela u jažice na kojima su sorbirani antigeni dodaje se ispitivani krvni serum, zatim antiglobulinski serum obilježen enzimom. Reakcija se provodi dodavanjem supstrata za enzim. U prisutnosti enzima supstrat se mijenja, a kompleks enzim-supstrat odabire se tako da produkt koji nastaje u reakciji bude obojen. Dakle, s pozitivnom reakcijom uočava se promjena boje otopine. Za određivanje antigena, čvrsti nosač se senzibilizira antitijelima, zatim se uzastopno dodaje ispitivani materijal (antigeni) i serum obilježen enzimima na antigene. Za odvijanje reakcije dodaje se supstrat za enzim. Kod pozitivne reakcije dolazi do promjene boje otopine.

13.6.3. Imunobloting

Ova metoda se temelji na kombinaciji elektroforeze i ELISA. Prilikom izvođenja imunoblotinga (blotiranje od engl. mrlja- spot) složena mješavina antigena najprije se podvrgava elektroforezi u poliakrilamidnom gelu. Dobiveni frakcionirani anti-

genski peptidi se prenose na nitroceluloznu membranu. Mrlje se zatim tretiraju enzimom obilježenim antitijelima na specifični antigen, tj. provesti ELISA blot. Imunobloting se koristi u dijagnostici infekcija kao što je HIV.

13.6.4. Imunološka elektronska mikroskopija

Metoda uključuje mikroskopiranje virusa (rjeđe drugih mikroba) u elektronskom mikroskopu, prethodno tretiranih odgovarajućim imunološkim serumom obilježenim elektronski optički gustim preparatima, na primjer feritinom, proteinom koji sadrži željezo.

13.7. Protočna citometrija

Krvne stanice diferenciraju se na temelju laserske citofluorometrije. Da bi se to postiglo, željene stanice se boje fluorescentnim monoklonskim antitijelima na CD antigene. Uzorak krvi, nakon tretiranja obilježenim antitijelima, prolazi kroz tanku cjevčicu i kroz nju prolazi laserska zraka koja pobuđuje fluorokrom da svijetli. Intenzitet fluorescencije korelira s gustoćom antigena na površini stanice i može se kvantitativno izmjeriti pomoću cijevi fotomultiplikatora. Dobiveni rezultati se pretvaraju u histogram.

Protočnom citometrijom utvrđuje se imunološki status (sadržaj glavnih populacija limfocita, sadržaj intracelularnih i izvanstaničnih citokina, funkcionalna aktivnost NK stanica, aktivnost fagocitoze itd.).

U obliku naoblake koja se naziva talog. Nastaje miješanjem antigena i antitijela u ekvivalentnim količinama; višak jednog od njih smanjuje razinu formiranja imunološkog kompleksa. Reakcija taloženja provodi se u epruvetama (reakcija prstenaste precipitacije), u gelovima, hranjivim podlogama itd. Raširene su varijante reakcije taloženja u polutekućem agaru ili agaroznom gelu: dvostruka imunodifuzija po Ouchterlonyju, radijalna imunodifuzija, imunoelektroforeza. itd.
Prstenasta reakcija taloženja. Reakcija se provodi u uskim epruvetama za taloženje: topljivi antigen se nanosi na imunološki serum. Uz optimalan omjer antigena i protutijela, na granici tih dviju otopina stvara se neprozirni prsten taloga (slika 7.50). Ako se u reakciji kao antigeni koriste prokuhani i filtrirani ekstrakti tkiva, tada se ta reakcija naziva termoprecipitacijska reakcija (Ascolijeva reakcija, u kojoj se otkriva hapten antraksa).

Riža. 7.50.

Ouchterlony dvostruka imunodifuzijska reakcija.

Za postavljanje reakcije tanki sloj otopljenog agar gela izlije se na staklenu ploču i nakon stvrdnjavanja u njemu se izrežu jažice. Antigeni i imunološki serumi stavljaju se odvojeno u jažice gela, koje difundiraju jedna prema drugoj. Na mjestu susreta, u jednakim omjerima, stvaraju talog u obliku bijele pruge (sl. 7.51). U višekomponentnim sustavima pojavljuje se nekoliko linija precipitata između jažica s antigenima i protutijelima; Kod identičnih antigena linije precipitata se spajaju, a kod neidentičnih antigena se križaju.

Riža. 7.51

Imuni serum s rastopljenim agar gelom ravnomjerno se izlije na staklo. Nakon stvrdnjavanja u gelu prave se jažice u koje se stavlja antigen (Ag) u različitim razrjeđenjima. Antigen, difundirajući u gel, formira prstenaste precipitacijske zone oko jažica s antitijelima. Promjer precipitacijskog prstena proporcionalan je koncentraciji antigena (slika 7.52). Reakcija se koristi za određivanje imunoglobulina raznih klasa, komponenti sustava komplementa itd. u krvnom serumu.

Riža. 7.52.

Kombinacija elektroforeze i imunoprecipitacije: smjesa antigena se unosi u jažice gela i razdvaja u gelu pomoću elektroforeze, zatim se dodaje imunološki serum u utor gela paralelno sa zonama elektroforeze. Protutijela iz imunološkog seruma difundiraju u gel i formiraju precipitacijske linije na mjestu "susreta" s antigenom (slika 7.53).

Riža. 7.53.

Reakcija flokulacije (prema Ramonu) (od lat. floccus- vunene ljuskice) - pojava opalescencije ili flokulentne mase (imunoprecipitacija) u epruveti tijekom reakcije toksin-antitoksin ili toksoid-antitoksin (slika 7.54.). Koristi se za određivanje aktivnosti antitoksičnog seruma ili toksoida.

Riža. 7.54.

Sojevi uzročnika difterije - C. diphtheriae mogu biti toksigeni (stvaraju egzotoksin) i netoksigeni. Stvaranje egzotoksina ovisi o prisutnosti u bakterijama profaga koji nosi tox gen koji kodira nastanak egzotoksina. U slučaju bolesti, svi se izolati testiraju na toksigenost - stvaranje egzotoksina difterije reakcijom taloženja na agaru (slika 7.55).

Riža. 7.55