гельмінтологічні методи. Дослідження на ентеробіоз та теніїдози

Для виявлення фрагментів гельмінтів фекалії переглядають неозброєним, потім змішують з водою та досліджують невеликими порціями у чашці Петрі на темному тлі. Усі підозрілі частинки поміщають на предметне скло у краплю води та досліджують під лупою. Можна добову порцію помістити в циліндр із додаванням 5-10-кратної кількості води. Після розмішування посудину залишають до повного осадження завислих частинок. Поверхневий шаррідини зливають та наливають чисту воду. Відмитий осад проглядають невеликими порціями в неозброєним оком або під лупою. Для виявлення яєць застосовують мікроскопічні методи дослідження.

Метод нативного мазка. Не велика кількістькалу з різних місцьдосліджуваної порції розтирають на предметному склі в краплі 50% розчину гліцерину, ізотонічного розчину натрію хлориду або води. Суміш накривають покривним склом та переглядають під мікроскопом.

Метод випливання по Фюлеборну. Одну частину випорожнень розмішують у 20 частинах насиченого розчину хлориду натрію ( питома вага 1,18), що додається невеликими порціями. Великі частинки, що спливли на поверхню, негайно видаляють, а суміш залишають на 45 хв. Протягом цього часу яйця гельмінтів, що мають меншу питому вагу, ніж розчин натрію хлориду, спливають на поверхню. Поверхневу плівку знімають дротяною петлею діаметром близько 1 см і переносять на предметне скло для дослідження під мікроскопом.

Метод Калантарян. Ефективність методу випливання підвищується при заміні хлориду натрію насиченим розчином азотнокислого натрію. В цьому випадку суміш витримують 10-15 хв.

Поверхневу плівку, що утворюється після відстоювання суміші калу з розчином натрію хлориду або азотнокислого натрію, можна знімати і предметним склом. З цією метою баночку, налиту до країв сумішшю випорожнень з розчином солі, накривають предметним склом так, щоб нижня його поверхня стикалася з рідиною. Після відстоювання скло знімають і швидко повернувши догори поверхнею, на якій знаходиться плівка, переглядають під мікроскопом.

Зішкріб сперіанальних складок (для виявлення яєць гостриків та онкосфер бичачого ціп'яка) роблять вранці до туалету. Дерев'яним шпателем, змоченим у воді або в 50% розчині гліцерину, виробляють зіскоблювання навколо анального отвору. Отриманий матеріал переносять на предметне скло у краплю води або 50% розчину гліцерину та переглядають під мікроскопом. Шпатель можна замінити вологим ватним тампоном, яким протирають періанальну область, потім добре прополіскують у воді. Воду центрифугують і досліджують осад під мікроскопом.

Метод Берманна (для виявлення личинок). Металеву сітку з нанесеними на неї 5-6 г фекалій зміцнюють на скляній вирві, вставленій у штатив. На нижній кінець вирви надягають гумову трубку із затискачем. Вирву наповнюють водою, підігрітою до t° 50°, так, щоб Нижня частинасітки з фекаліями стикалася з водою. Личинки активно переходять у воду і накопичуються у нижній частині гумової трубки. Через 4 години рідину спускають центрифужні пробірки, центрифугують і осад переглядають під мікроскопом.

Аналіз мокротиння, носового слизу та вагінальних виділеньдля виявлення яєць легеневої трематоди парагонімусу, личинок аскарид та анкілостомід, яєць гостриків, фрагментів ехінококового міхура. Досліджувану порцію слизу (виділень) намазують на скло та переглядають на чорному та білому тлі макроскопічно, а потім під мікроскопом. Можна додати до досліджуваного матеріалу 25% розчин антиформіну, ретельно збовтати і витримати 1-1,5 години для розчинення слизу. Суміш центрифугують і досліджують осад під мікроскопом.

Аналіз дуоденального та шлункового соку для виявлення яєць печінкових трематод, анкілостомід, личинок Strongyloides. Всі три порції дуоденального вмісту, отримані при центрифугують, і осад досліджують під мікроскопом. Також досліджують і .

Дослідження тканин. Для виявлення личинок трихінелл шматочки біопсованого м'яза ретельно розщеплюють на волоконця, здавлюють між компресорним склом (товсте скло з гвинтами) і досліджують під мікроскопом із затіненим світлом. Для виявлення цистицерків м'язи розшаровують препарувальними голками, виділений пляшечку очищають від навколишньої тканини, здавлюють між двома предметними склом і досліджують під лупою.

Аналіз крові (для виявлення личинок філярій). Досліджують висячу краплю на покривному склі, окантованому вазеліном. Можна 0,3 мл крові змішати з 10-кратною кількістю 3% розчину. Суміш центрифугують і досліджують осад під мікроскопом. Для збагачення препаратів до 1 мл венозної кровідодають 3 мл 2% розчину формаліну або 5-кратну кількість рідини, що складається з 95 мл 5% розчину формаліну, 5 мл оцтової кислотита 2 мл концентрованого спиртового розчину гематоксиліну. Суміш центрифугують, осад промивають водою дистильованою шляхом і досліджують під мікроскопом. Для диференціювання різних видівФілярій досліджують мазки, забарвлені за методом Гімзи – Романовського.

Методи імунологічної діагностики. Застосовують (аглютинації, зв'язування комплементу) та алергічні діагностичні проби (див.) з відповідного виду гельмінта.

Гельмінтологічні методидослідження. Мал. Яйця гельмінтів. 1-10 – яйця круглих хробаків(нематод): 1 – 3 – аскариди (1 – запліднене яйце, 2 – запліднене яйце без білкової оболонки, 3 – незапліднене яйце); 4 - аскариди котячої; 5 -аскариди м'ясоїдних; 5-гострики; 7 - волосоголовець; 8 – томінксу; 9 - анкілостомід; 10 - трихо-стронгілід. 11-15 - яйця стрічкових хробаків(цестод): 11 - ціп'янка бичачого; 12 - ціп'яка карликового; 13 - ціп'яка щурячого; 14 - ціп'яка гарбузового; 15-стрічка широкого. 16 - 24 - яйця сисунів (трематод): 16 - трематоди (шистосоми) японської; 17 - трематоди (шистосоми) сечі - статевий; 18 – трематоди (шистосоми) Мансона; 19 - трематоди (парогонімус) легеневої; 20 - трематоди (описторхіс) сибірської (котячої); 21 - трематоди (клонорхіс) китайської; 22 – трематоди (метагонімусу) кишкової; 23 - трематоди (фасциоли) печінкової; 24 - трематоди (дикроцеліум) ланцетоподібної.

Ефективним та зручним методом гельмінтологічного дослідження є вивчення товстого мазка по Като, Суть якого полягає у виявленні яєць гельмінтів в товстому мазку фекалій, просвітлених гліцерином і підфарбованих малахітовою зеленню. Склад суміші Като – 6 мл 3% водного розчинумалахітової зелені, 500 мл гліцерину, 500 мл 6% розчину фенолу. Розчин стабільний, може зберігатись при кімнатній температурі. Для приготування препаратів шматочки фекалій завбільшки з горошину наносять на предметне скло, покривають плівкою гідрофільного целофану, витриманого в суміші Като протягом 24 год, і придавлюють його до скла рівномірного розподілуматеріалу. Просвітлені протягом 40-60 хв мазки мікроскопують. Підраховують виявлені яйця гельмінтів і морфологічними ознакамивизначають їх видову приналежність. Метод дозволяє виявити яйця аскарид, волосоголовець, цестод, трематод, меншою мірою - анкілостомід і карликового ціп'яка.

Широко застосовуються також методи збагачення. Принцип флотаційних методів полягає у суспендуванні фекалій у сольовому розчині, що має велику відносну щільність у порівнянні з яйцями гельмінтів, внаслідок чого вони виринають на поверхню. Під мікроскопом досліджується вміст поверхневої плівки. Як збагачувальні суміші використовують розчини: кухонну сіль - 400 г в 1 л води (відносна щільність по Фюллеборну -1,18); азотнокислий натрій - 1 кг в 1 л води (відносна щільність по "Калантарян-1,38); азотнокислий натрій - 900 г та азотнокислий калій - 400 г в 1 л води (відносна щільність по Брудастову та Красноносу-1,48). розчини кип'ятять та охолоджують.
Для дослідження вносять 5-10 г фекалій у скляну або фаянсову склянку, додають до неї 100-200 мл. сольового розчинуі ретельно розмішують. Потім видаляють великі частки, що спливли, дерев'яним шпателем або совочком з паперу або картону і відразу ж прикладають до поверхневої плівки широке предметне скло так, щоб сольовий розчин і предметне скло повністю стикалися. Після 30-40-хвилинного відстоювання суміші знімають предметне скло, кладуть під мікроскоп плівкою догори і ретельно переглядають всю поверхню. Щоб уникнути висихання, можна додати 2-3 краплі 50% розчину гліцерину. Поверхневу плівку можна знімати також дротяною петлею. Ефективність флотаційних методів підвищується зі збільшенням відносної щільності сольових розчинів. За допомогою цих методів можна виявляти яйця нематод, цестод та трематод.

Для виявлення яєць у фекаліях застосовують метод седиментації за Красильниковим.. Фекалії змішують з 1% розчином детергенту ( пральний порошок"Лотос" та ін.) у співвідношенні 1:10 до утворення суспензії. Під впливом детергенту розчиняються різні компоненти фекалій (білки, жири, тканинні елементи). Через 30 хв вміст пробірки струшують протягом 1-2 хв, після чого центрифугують 5 хв. З осаду готують препарати та переглядають під мікроскопом.
У польових умовах, і навіть при масових обстеженнях населення ураженість гельмінтами зручно застосовувати метод товстого мазка по Като. У стаціонарних умовпри обстеженні хворих краще використовувати найбільш ефективні флотаційні методи. При використанні цих методів під час мікроскопії доцільно підраховувати виявлені у препараті яйця. При дотриманні стандартності навішування або об'єму, взятих для дослідження фекалій (наприклад, 1 чайна або столова ложка), і єдиного єдиного обсягу сольових розчинів можна орієнтовно судити про інтенсивність інвазій. Цей кількісний облік може бути корисним при обґрунтуванні призначеного лікування та оцінці ефективності проведеної дегельмінтизації. Крім того, для встановлення інтенсивності інфекції можуть бути використані інші більш точні кількісні методи, зокрема метод Столла.

Для діагностики теніарингоспу та ентеробіозузастосовують метод дослідження періанально-ректальних зіскрібків. Дерев'яним шпателем, змоченим у 50% розчині гліцерину, роблять зіскрібок з періанальних складок вранці до дефекації в колі заднього проходуі нижніх відділівпряма кишка. Отриманий матеріал, очищений зі шпателя краєм покривного скла, поміщають на предметне скло до краплі 50% розчину гліцерину, накривають покривним склом та досліджують під мікроскопом. Можна також дослідити смужку целюлозної стрічки, яку спочатку притискають клейкою стороною до пернальних складок, потім поміщають на предметне скло і мікроскопують.

Виявлення личинок нематод у фекаліях за методом Бермана. Метод ґрунтується на термотропній властивості личинок. Для дослідження беруть 1 столову ложку фекалій, поміщають в металеву сітку або сітку з кількох шарів марлі на дротяному каркасі. Сітку встановлюють у вирву, укріплену в штативі. До лійки приєднується гумова трубка із затискачем. Піднявши сітку, лійку заповнюють водою (температура +40°...+50°С) так, щоб нижня частина сітки була занурена у воду. Личинки з фекалій активно мігрують у теплу водуі, осідаючи, накопичуються в нижній частині вирви. Через 2-4 години затиск відкривають, воду спускають в центрифужну пробірку і центрифугують протягом 2-3 хв. Потім зливають надосадову рідину, осад переносять на предметне скло і переглядають під мікроскопом, де шукають рухливі личинки збудника стронгілоїдозу.

Метод Харада та Морі дозволяє диференціювати личинки анкілостом та некаторами. Личинки анкілостомід культивують на фільтрувальному папері. З цією метою 0,5 г свіжих фекалій, взятих у хворого не пізніше ніж через 1 годину після дефекації, наносять на смужки фільтрувального паперу, розміром 12X1,5 см, залишаючи обидва кінці смужки чистими. Один кінець смужки занурюють у пробірку, четверта частина якої заповнена водою, а інший затискають пробкою. Пробірки ставлять у термостат за нормальної температури +26... + 28°С. Личинки, що розвинулися з яєць, опускаються по фільтрувальному паперу і осідають на дно пробірки. Через 5-6 днів смужку паперу видаляють, а рідину, що залишилася в пробірці, досліджують під лупою або центрифугують. Осад, що утворився при центрифугуванні, досліджують під світловим мікроскопом. При використанні замість пробірок чотиригранних скляних банок (розміром 15ХЮХ7 см), до стінок яких прикріплюють по 4 паперові смужки, ефективність аналізів підвищується (Г. М. Маруашвілі з співавт., 1966).

Методи дослідження на шистосомози . Дослідження фекалій - порцію фекалій змішують з 250 мл води, проціджують через 3 шари марлі в конічний посуд, який наповнюють доверху водою. Через 30 хв шар рідини зливають, до осаду доливають свіжу порцію води. Осад промивають до отримання прозорої надосадової рідини та мікроскопують.

Метод лярвоскопії - в колбу Ерленмейєра з напаяною збоку скляною трубочкою, спрямованою вгору, поміщають 20-25 г фекалій і промивають водопровідною водою. Потім колбу накривають темним папером, залишивши світла напаяну скляну трубочку при температурі +25...+30°С. Мирацидії, що вилупилися, концентруються у меніска в бічній трубочці, де їх можна бачити за допомогою лупи або неозброєним оком. Дослідження сечі -100 мл сечі, зібраної в період між 10 год. ранку і 14 год. дня, або добову порцію відстоюють, а потім центрифугують при 1500 об/хв. Отриманий осад наносять на предметне скло і мікроскопують. ВООЗ рекомендує метод фільтрування всієї порції сечі. Після фільтрування фільтри обробляють формаліном або підігрівають (щоб убити яйця), а потім зволожують водним розчином нінгідрину. У підсушених препаратах зародки яєць набувають фіолетового забарвлення.

Застосування імунологічних методів дослідження для діагностики шистосомозів пов'язано з труднощами, так як дорослі шистосоми та їх яйця містять велику кількість антигенів, що викликають імунні реакції, які є видоспецифічними (Д. Бредлі, 1979).

У нашій країні для встановлення імунологічних реакцій при гельмінтозах випускається цілий рядстандартних діагностикумів. Практичне застосуваннямають алергічна шкірна пробана ехінококоз і альвеококоз, РЛА з ехінококовим антигеном, РСК на холоді, реакція преципітації на холоді в різних модифікаціях (кільцева преципітація, преципітація в пробірках або капілярах, які ставляться з трихінельозним, цистицерсказним і містицеркозним. Стандартні діагностикуми для встановлення вищезгаданих серологічних реакцій виготовляються підприємствами з виробництва бактерійних препаратів. До діагностикумів, що випускаються, підприємство-виробник додає докладні інструкціїпро правила зберігання, терміни придатності препарату та настанови щодо застосування відповідних антигенів з технікою постановки реакції.

У Останніми рокамиПерелік серологічних реакцій, які застосовуються для діагностики гельмінтозів, значно розширився. З цією метою використовуються наступні реакції: РІГА, непрямої імунофлюоресценції (РІФ), імунодифузії в гелі (РІД), зустрічного імуноелектрофорезу (ВІЕФ), РЕМА. Ці реакції можуть використовуватися при аскаридозі, токсокарозі, трихінельозі, анкілостомідозі, філяріатозах, ехінококозі та альвеококкозі, опісторгозі, шистосомозі, парагонімозі. Однак для цих реакції в нашій країні не випускаються стандартні діагностикуми і не регламентована техніка їх постановки. Окремі лабораторії, в основному наукові, готують самостійно специфічні антигени та застосовують їх у різних модифікаціях. Опис цих методів широко представлено в літературі і не є суворо уніфікованим. Інтерпретація даних імунологічного аналізу повинна ґрунтуватися на вивченні динаміки імунної відповіді з урахуванням рівня специфічності та чутливості кожної застосовуваної серологічної реакції. Тому при постановці діагнозу, а також при сероепідеміологічних обстеженнях населення доцільно користуватися кількома найбільш чутливими реакціями. З цих позицій добре зарекомендували себе реакції ВІЕФ та РЕМА, які відрізняються високою чутливістюі досить високою специфічністю (П. Амбруаз-Тома, 1978; І. Є. Балад, 1979; Г. М. Негряну, 1980; А. М. Пономарьова, 1981; А. Я. Лисенка, 1978 та ін). Ефективність РЕМА перевірена при амебіазі, лейшманіозі, трипаносомозі та токсоплазмозі (Г. А. Єрмолін, 1980).

Розділ III. Діагностика гельмінтозів та методи гельмінтологічних досліджень

Необхідно обстежити на гельмінтози всіх хворих, які звертаються за медичною допомогою, і особливо хворих, які звертаються до педіатра, терапевта та невропатолога зі скаргами на явища з боку шлунково-кишковий тракт, нервової системита з анемією. Якщо лікар не завжди може застосувати лабораторні методи дослідження, опитати хворого про виділення у нього гельмінтів зобов'язаний кожен медичний працівник, який надає допомогу в амбулаторії або стаціонарі.

За наявності наведених у відповідних розділах клінічних показань слід уточнити діагноз за допомогою лабораторних методівдослідження на гельмінтози

У зв'язку з переважанням кишкових гельмінтозівнайбільше практичне значеннямає дослідження випорожнень.

Методи дослідження випорожнень на гельмінтози

Випорожнення доставляються в лабораторію в чистому скляному посуді (близько чверті склянки випорожнень, взятих із різних місць однієї порції); при плановому обстеженні допускається доставка випорожнень до лабораторії в сірникових або лубочних коробочках.

Для контролю дегельмінтизації доставляється (за призначенням лікаря) вся порція випорожнень, зібрана після прийому протиглистного засобута проносного (у великих закритих скляних банках, цебрах).

Мікроскопічне дослідження випорожнення є основним при діагностиці кишкових гельмінтозів; йому завжди має передувати загальний макроскопічний огляд фекалій виявлення члеників великих цестод, гостриків, аскарид та інших.

Випорожнення повинні бути свіжими або консервованими (5% розчині формаліну), так як висихання різко змінює структуру яєць. Крім того, при стоянні фекалій відбувається швидкий розвитокяєць деяких гельмінтів (наприклад, анкілостом), що ускладнює діагностику.

Згідно з інструкцією Міністерства охорони здоров'я СРСР, необхідно досліджувати випорожнення одночасно за методом Фюллеборна та нативного мазка.

Нативний мазок

Нативний мазок: невеликий шматочок фекалій (з горошину), взятий сірником, скляною або дерев'яною паличкою з різних місць доставленої порції, ретельно розтирають на склі в краплі 50% розчину гліцерину або у фізіологічному розчині, або у воді. Накривають покривним склом, злегка натискаючи останнє (препарувальною голкою). Мазок має бути тонким, прозорим та рівномірним. Він застосовується лише як доповнення до інших методів, що дають збагачення препарату. Переглядати слід не менше двох препаратів.

З метою виявлення личинок гельмінтів (а також їх яєць) нативний мазок робиться таким чином (по Шульману): 2-3 г фекалій ретельно розмішують «закручуванням» скляною паличкою в емульсію з п'ятикратною кількістю чистої води або фізіологічного розчину. Під час розмішування личинки накопичуються біля скляної палички, тому відразу після закінчення розмішування краплю емульсії швидко переносять скляною паличкою на предметне скло, накривають покривним та досліджують. С. Д. Любченко (1936) довела, що метод закручування є ефективнішим, ніж метод мазка, особливо щодо яєць аскарид. На підставі роботи С. Д. Любченка ми вважаємо за доцільне замінити метод мазка методом закручування.

Метод Фюлеборна

Метод Фюлеборна: 5-10 г фекалій, взятих з різних місць, поміщають у баночку ємністю 50-100 мл і ретельно розтирають скляною або дерев'яною паличкою в насиченому розчині кухонної солі(400 г цієї солі розчиняють в 1 л води, нагрівають до кипіння і фільтрують через шар вати або марлі; розчин вживається холодний: питома вага 1,2). Розчин доливають поступово, поки не вийде рівномірна суспензія, причому загальна кількість розчину, що приливається, повинна бути приблизно в 20 разів більше кількостіфекалій. Для перемішування фекалій Фюллеборн рекомендував вживати чайні склянки, але зручніше готувати суспензію в баночках для мазі ємністю 50-100 мл, використовуючи по дві баночки на кожен аналіз (або в склянках ємністю 100 мл).

Відразу після приготування суспензії з поверхні її видаляють шпателем, металевим совочком або шматочком чистого паперу великі частки, що спливли на поверхню ( рослинні утворення, неперетравлені залишки їжі та ін), після чого суміш залишають стояти на 1-1,5 години. Після цього з поверхні суміші знімають всю плівку дотиком дротяної або платинової петлі (плашмя) діаметром не більше 1 см, зігнутої під прямим кутом; плівку струшують на предметне скло та накривають покривним склом. Під кожне покривне скло (18х18 мм) поміщають 3-4 краплі. Усього слід приготувати не менше 4 препаратів (на кожний препарат – одне покривне скло). Петлю прожарюють на вогні та промивають водою після кожного аналізу.

За методом Фюллеборна швидко та легко виявляються яйця всіх нематод (за винятком незапліднених яєць аскарид) та яйця карликового ціп'яка.

Метод Бермана застосовується для дослідження випорожнень на личинки гельмінтів (при стронгілоїдозі). Цей метод полягає в наступному: 5 г фекалій на металевій сітці (для цих цілей зручна цедилка для молока) поміщають на скляну вирву, прикріплену до штатива. На нижній кінець вирви надягають гумову трубку із затискачем.

Сітку з калом піднімають і наливають у вирву нагріту приблизно до 50° воду таким чином, щоб нижня частина сітки з калом була занурена у воду. Личинки активно переходять у воду і скупчуються у нижній частині гумової трубки. Через 2-4 години відкривають затискач і рідину спускають в одну або дві центрифужні пробірки.

Після центрифугування протягом 1-2 хвилин верхню частинурідини швидко зливають, а осад наносять краплями на предметне скло і досліджують під покривним склом або розподіляють тонким шаромна 2-3 великі стекла і тоді досліджують без покривного скла.

Метод Бермана застосовується також і для дослідження ґрунту на наявність личинок анкілостом.

Метод Столла

Метод Столла застосовується визначення інтенсивності інвазії. У спеціальну скляну колбочку наливають децинормальний розчин їдкого натру до мітки 56 см 3 , а потім додають випорожнення до тих пір, поки рівень рідини не досягне 60 см 3 , тобто 4 см 3 . Після збовтування зі скляними намистами беруть для дослідження 0,075 мл суміші і досліджують під одним-двома звичайними покривними склом. Отриману суму множать на 200, щоб отримати кількість яєць, що містяться в 1 см 3 випорожнень.

Дослідження дуоденального вмісту

Дуоденальний сік і пухирну жовч, отримані звичайним шляхом за допомогою зондування (а пухирну жовч і після рефлексу з жовчного міхура), ретельно змішують з рівним об'ємом етилового ефіру; суміш центрифугують, після чого осад досліджують під мікроскопом. Крім осаду, мікроскопічного дослідженняобов'язково піддаються плаваючі в рідині пластівці, в яких можуть бути яйця гельмінтів. При дослідженні на яйця гельмінтів шлункового соку та блювотних мас можна користуватися цією ж методикою.

Дослідження дуоденального соку та вмісту шлунка необхідно проводити при підозрі на глистяні захворюванняпечінки, жовчного міхура (описторгосп, фасціолез, дикроцеліоз) та дванадцятипалої кишки(стронгілоїдоз).

Дослідження мокротиння

Мокроту розтирають по скляній пластинці, щільно накривають іншою скляною пластинкою і розглядають неозброєним оком на світлому і чорному тлі, а також під лупою при світлі, що проходить. Окремі шматочки мокротиння («іржаві» скупчення, уривки тканин тощо) наносять тонким шаром на предметне скло, щільно накривають його покривним і досліджують при малому і великому збільшеннімікроскоп.

а) Для діагносцування цистицеркозу шкіри, підшкірної клітковиниабо м'язів, асептично вирізаний шматочок відповідної тканини досліджують спочатку не озброєним оком. Ділянки тканин розсувають за допомогою препарувальних голок з метою виявлення видимого простим окомбульбашки – цистицерка (фото А); його довжина 6-20 мм, ширина 5-10 мм. При виявленні пляшечки, підозрілої на цистицерк, він роздавлюється між двома предметними стеклами і розглядається під мікроскопом. Цистицерк (Cistycercus cellulosae) визначається за наявності сколексу з чотирма присосками та віночком гачків (фото Б).

Фото.А - цистицерки з вивернутими назовні сколекс; Б - Головка свинячого ціп'яка.

б) Для діагносцування трихінельозу асептично вирізаний шматочок м'яза (двоголового або литкового) ретельно подрібнюють у 50% розчині гліцерину на найтонші волоконця за допомогою препарувальних голок. Подрібнені м'язи здавлюються між двома предметними склом і досліджуються при малому збільшенні мікроскопа в затемненому полі зору. Дослідження м'язів на трихінельоз рекомендується проводити не раніше ніж на 8-й день захворювання. Личинки трихінелл знаходяться в м'язах у згорнутому спіраллю положенні: вони укладені в лимонні капсули.

Фото.А-Личинки трихінелл у м'язах; Б - Звапні капсули трихінелл.

Рентгеноскопія

Найчастіше рентгеноскопія застосовується для діагносцування ехінококозу і рідше – цистицеркозу. Цистицерки виявляються при рентгеноскопії тільки після звапніння (у випадках тривалого захворювання). За останні роки рентгеноскопія застосовується і для діагносцування аскаридозу як у ранній личинковій стадії, так частково і в кишковій стадії.

У період міграції личинок аскарид (і анкілостомід) у легенях виявляються нестійкі, іноді множинні запальні вогнища; одночасно у крові з'являється значна еозинофілія.

Статевозрілі аскариди добре видно при рентгеноскопії кишечнику уражених осіб. Цей метод, незважаючи на його складність та громіздкість, має бути використаний як додатковий для діагностики аскаридозу у випадках з негативним копрологічним аналізом. За даними Є. С. Геселевич, із 180 хворих на аскаридоз, виявлених при рентгеноскопії, у 54 у калі не було виявлено яєць аскарид (дивися).

Гельмінтологічні методи досліджень. Методи діагностики гельмінтозів поділяють на прямі, засновані на безпосередньому виявленні самих гельмінтів або їх фрагментів, а також личинок і яєць гельмінтів (методи дослідження фекалій, сечі, жовчі та дуоденального вмісту, мокротиння, крові та тканин, матеріалу, отриманого при зіскрібці з пери піднігтьових просторів), і непрямі, за допомогою яких виявляють вторинні зміни, що виникають в організмі людини в результаті життєдіяльності гельмінтів (дослідження морфологічного складу крові, імунологічні методидіагностики гельмінтозів, рентгенологічні дослідження тощо). З прямих методів найбільш поширені копрологічні, які поділяються на макро- та мікрогельмінтоскопічні. У окремих випадках використовують спеціальні методи.

Макрогельмітоскопічні методи дослідженняспрямовані на пошуки гельмінтів або їх фрагментів (сколексів, члеників, частин стробіл цестод). Їх застосовують для діагностики тих гельмінтозів, при яких яйця не виділяються з екскрементами хворого або виділяються в невеликій кількості і не завжди (наприклад, при ентеробіоз у фекаліях виявляють гострики, при теніїдозах - членики).

Для виявлення у фекаліях гостриків чи члеників цестод проводять перегляд фекалій неозброєним оком. Для диференціальної діагностикиТенідоз рекомендується перегляд розріджених водою фекалій окремими невеликими порціями в чорних фотографічних кюветах або в чашках Петрі на темному тлі. Великі утворення, підозрілі на фрагменти гельмінтів, розглядають під лупою між двома предметними шибками. Якщо ж по клінічним показаннямприпускають виявлення дрібних гельмінтів або голівок цестод після лікування, то підозрілі частки розглядають під лупою в краплі гліцерину, а в разі потреби і під мікроскопом.

Мікрогельмінтоскопічні методи дослідження(якісні) спрямовані на виявлення яєць та личинок гельмінтів. Застосовують метод товстого мазка з целофановою покривною платівкою за Като. Суміш Като складається з 6 мл 3% водного розчину малахітової зелені, 500 млгліцерину та 500 мл 6% розчину фенолу. Платівки по Като (гідрофільний целофан розрізають на частини розміром 20 40 мм) занурюють на 24 году суміш Като так, щоб вони прилягали один до одного (3-5 млрозчину Като на 100 платівок). 100 мгфекалій наносять на предметне скло, накривають целофановою покривною пластинкою по Като і придавлюють так, щоб фекалії розмазалися по предметному склу в межах целофанової пластинки. Мазок залишають за кімнатної температури для освітлення на 40-50 хв,після цього переглядають під мікроскопом. У жарку пору року щоб уникнути висихання препарату на пластинку приготовленого препарату кладуть вологу губку.

Для повного виявлення гельмінтів всіх видів метод товстого мазка з целофановою покривною платівкою за Като необхідно використовувати у поєднанні з одним із методів збагачення. Найбільш поширеними є метод Калантарян і метод Фюллеборна.

Метод Калантарян: у склянках із широким горлом об'ємом 100 млретельно розмішують скляною паличкою. гфекалій, поступово доливаючи насичений розчин нітрату натрію. кгазотнокислого натрію на 1 лводи при кип'ятінні) до країв склянки. Великі частинки, що спливли на поверхню, видаляють паперовим совочком. До поверхні сольового розчину прикладають предметне скло (сольовий розчин додають до повного дотику суміші з предметним склом). Через 20-30 хвпредметне скло знімають та плівку переглядають під мікроскопом. За відсутності цієї солі можна використовувати насичений розчин кухонної солі за Фголлеборном (400 гсолі в 1 лводи при кип'ятінні).

У зв'язку з тим, що яйця, що мають велику питому вагу (непліднені яйця аскарид, трематодні яйця і великих цестод), не спливають, крім дослідження поверхневого шару рідини, при використанні методу Фюллеборна необхідно переглянути під мікроскопом 2-4 препарати з осаду.

Спеціальні лабораторні методи досліджень різних гельмінтози.

7.7. Методи визначення життєздатності яєць та личинок гельмінтів

Життєздатність яєць гельмінтів визначають за зовнішньому вигляду, шляхом фарбування вітальними фарбами, культивуванням в оптимальних умовахта постановкою біологічної проби.

7.7.1. Визначення життєздатності яєць або личинок гельмінтів на вигляд

Яйця гельмінтів мікроскопують спочатку при малому, потім за великому збільшенні. У деформованих і мертвих яєць гельмінтів оболонка розірвана або прогнута всередину, мутна плазма, розпушена. У сегментованих яєць кулі дроблення (бластоміри) нерівного розміру, неправильної формичасто зрушені до одного полюса. Іноді зустрічаються аномальні яйця, які, маючи зовнішні потворності, розвиваються нормально. У живих личинок аскарид дрібна зернистість є лише у середній частині тіла, у міру їх загибелі вона поширюється у всьому тілі, з'являються великі блискучі гіалінові вакуолі, звані " нитки перлів " .

Для визначення життєздатності зрілих яєць аскарид, волосоголовців, гостриків слід викликати активні рухиличинок легким підігрівом препарату (до температури не вище 37 ° С). Життєздатність личинок аскарид та волосоголовців зручніше спостерігати після їх виділення із шкаралупи яйця натисканням на покривне скло препарату препарувальною голкою або пінцетом.

У інвазійних личинок аскарид часто помічається чехлик, що відшарувався на головному кінці, а в личинок власоголовів, що закінчили розвиток в яйці, на цьому місці при великому збільшенні виявляється стилет. У загиблих личинок гельмінтів незалежно від місця перебування (у яйці чи поза ним) помічають розпад тіла. При цьому внутрішня структура личинки стає глибчастою або зернистою, а тіло каламутним і непрозорим. У тілі виявляються вакуолі, але в кутикулі - розриви.

Життєздатність онкосфер теніїд (бичачого, свинячого ціп'яків та ін.) визначають за рухом зародків при впливі на них травних ферментів. Яйця поміщають на годинникове скло зі шлунковим соком собаки або штучним соком дуоденальним. Склад останнього: панкреатину – 0,5 г, натрію бікарбонату – 0,09 г, дистильованої води – 5 мл. Годинникове скло з яйцями ставлять у термостат при 36 - 38 ° С на 4 години. При цьому живі зародки звільняються від оболонок. Оболонки живих онкосфер також розчиняються в підкисленому пепсині та в лужному розчинітрипсину через 6 - 8 годин у термостаті при 38 °С.

Якщо помістити яйця тенід в 1% розчин натрію сульфіду або 20% розчин натрію гіпохлориду, або ж в 1% розчин хлорної води при 36 - 38 ° С, зрілі і живі зародки звільняються від оболонок і не змінюються протягом 1 добу. Незрілі та мертві онкосфери зморщуються або набухають і різко збільшуються, а потім розчиняються протягом 10 хвилин - 2 годин. Живі зародки теніїд також активно рухаються в суміші 1% розчину натрію хлориду, 0,5% розчину натрію гідрокарбонату і жовчі при 36 - 38 °С.

Життєздатність адолескаріїв фасціол, зібраних на рослинах та інших об'єктах водойм, перевіряють дослідженням їх на предметному склі у фізіологічному розчині під мікроскопом із нагрівальним столиком. При підігріванні личинки трематоди, що у цисті, починають рухатися.

Для визначення життєздатності яєць карликового ціп'яка найпростіша методика Іоніної Н.С.: у живих яєць медіанна пара ембріональних гаків або паралельна латеральним, або останні утворюють з медіанною кут біля основи менше 45°. У мертвих яєць латеральні пари утворюють біля основи кут з медіанною парою більше 45° або гаки безладно розкидані (втрачається їхнє парне розташування); іноді спостерігається зморщування зародка, утворення зернистості. Більш точний метод, заснований на появі онкосферних рухів при різкій зміні температур: від 5 - 10° до 38 - 40 °С.

Визначення життєздатності незрілих яєць нематод слід вивчати у вологій камері (чашках Петрі), поміщаючи яйця аскарид у 3%-ний розчин формаліну, приготований на ізотонічному розчині натрію хлориду при температурі 24 - 30 ° С, яйця власоголові в 3 соляної кислотипри температурі 30 – 35 °С; яйця гостриків в ізотонічному розчині хлориду натрію при температурі 37 °С. Чашки Петрі слід відкривати 1 - 2 рази на тиждень для кращої аерації та знову зволожувати фільтрувальний папір чистою водою.

Спостереження за розвитком яєць гельмінтів ведуть не менше 2 разів на тиждень. Відсутність ознак розвитку протягом 2 - 3 місяців свідчить про їхню нежиттєздатність. Ознаками розвитку яєць гельмінтів є спочатку стадії дроблення, розподіл вмісту яйця на окремі бластомери. Протягом перших днів розвивається до 16 бластомірів, які переходять у другу стадію - морулу і т.д.

Яйця анкілостомід культивують у скляному циліндрі (висотою 50 см та діаметром 7 см), закритому пробкою. Суміш із рівних обсягівстерильного піску, деревного вугілляі випорожнень з яйцями анкілостомід, розведену водою до напіврідкої консистенції, обережно наливають на дно циліндра за допомогою скляної трубки. Протягом 1 - 2-добового відстоювання в темряві при температурі 25 - 30 ° С з яєць вилуплюються рабдитоподібні личинки, а через 5 - 7 діб вони стають вже філярієвидними: личинки виповзають вгору по стінках циліндра, де видно навіть неозброєним оком.

Яйця трематод, які природно розвиваються у воді, наприклад опісторхісів, дифілоботріїд, фасціол та інших, поміщають на годинникове скло, чашку Петрі або в іншу посудину, наливають невеликий шар звичайної води. При культивуванні яєць фасціол слід врахувати, що вони розвиваються швидше в темряві, при цьому в живих яйцях при температурі 22-24 ° С через 9-12 діб формується мірацидій. При мікроскопуванні яєць, що розвиваються, трематод добре помітні рухи мірацидію. Мірацидій фасціоли з оболонок яйця виходить лише на світлі.

Метод Фюлеборну. Личинки анкілостомід і стронгілід культивують на агарі в чашці Петрі з тваринним вугіллям. Після витримування в термостаті при температурі 25 - 30 ° С протягом 5 - 6 годин личинки розповзаються по агару, залишаючи доріжку з бактерій.

Метод Харада та Морі. У пробірки, вміщені в штатив, додають 7 мл дистильованої води. Дерев'яною паличкою беруть 0,5 г випорожнень і роблять мазок на фільтрувальному папері (15 х 150 мм) за 5 см від лівого краю (цю операцію проводять на аркуші паперу, щоб захистити поверхню лабораторного столу). Потім смужку з мазком вставляють пробірку так, щоб вільний від мазка лівий кінець досягав дна пробірки. Накривають верхній кінець шматком целофану і щільно охоплюють гумкою. На пробірці пишуть номер прізвище обстежуваного. У такому стані пробірки зберігають 8-10 діб при температурі 28 °С. Для вивчення личинок знімають та видаляють целофанову кришку і витягують пінцетом смужку фільтрувального паперу. При цьому слід виявляти обережність, оскільки невелика кількість інвазійних личинок може пересуватися до верхнього кінця фільтрувального паперу або стінки пробірки і проникати під поверхню целофану.

Пробірки поміщають у гарячу водяну банюпри температурі 50 °С на 15 хвилин, після чого вміст їх струшують і швидко переливають у 15-мілілітрову пробірку для осадження личинок. Після центрифугування надосадову рідину видаляють, а осад переносять на предметне скло, покривним покривним склом і мікроскопують під малим збільшенням.

Для диференціального діагнозуфілярієподібних личинок необхідно скористатися даними таблиці 3.

Таблиця 3

ДИФЕРЕНЦІЙНА ДІАГНОСТИКА ФІЛЯРІЄВИДНИХ ЛИЧИНОК A. DUODENALE, N. AMERICANUS, S. STERCORALIS, trICHOStrONGYLUS SP.

Личинки	Розміри	Характерні ознаки
A. duodenale	Довжина тіла близько 660 мкм, чохлика – 720 нм.	Смугастість чохлика менш виражена, ротовий виступ менш помітний, передній кінець тіла (але не чохлика) тупий, діаметр кишкової трубки менше, ніж бульбус стравоходу, хвостовий кінець тупий
N. americanus	Довжина тіла близько 590 мкм, чохлика – 660 нм.	Чехлик помітно вичерпано, особливо в хвостовій частині тіла, ротовий виступ здається темним, передній кінець тіла (але не чохлика) закруглений подібно до вузького кінця курячого яйця, передня частина кишкової трубки такого діаметру, як бульбус стравоходу, хвостовий кінець різко загострений.
S. stercoralis	Довжина тіла близько 500 мкм	Личинка без чохлика, стравохід складає близько половини довжини тіла, хвіст тупий або розгалужений
Trichostrongylus sp.	Довжина тіла близько 750 мкм	Просвіт кишківника не прямий, а зигзагоподібний, хвостовий кінець закруглений і має форму кнопки

7.7.2. Методи фарбування яєць та личинок гельмінтів

Мертві тканини здебільшого сприймають фарби швидше, ніж живі. Ці особливості використовують у гельмінтології для визначення життєздатності яєць та личинок гельмінтів. Однак у окремих випадках деякі фарби краще сприймаються живими тканинами, ніж мертвими.

Для диференціального визначення живих і мертвих яєць та личинок застосовують такі фарби та способи.

Для фарбування живих та мертвих тканин часто використовують лейкобазу метиленового синього. Жива клітинаабо тканина редукує метиленовий синій в безбарвну лейкобазу, мертва тканина не має такої здатності, тому набуває забарвлення.

Критерієм стану яйця є забарвлення зародка, але з оболонки. Така його здатність пов'язана з умовами загибелі яйця. У тих випадках, коли волокниста оболонка в мертвому яйці не втрачає властивостей напівпроникності, вона не пропускатиме барвники, отже, мертвий зародок не фарбуватиметься. Забарвлений зародок завжди свідчить про загибель яйця.

Для фарбування яєць аскарид можна використовувати метиленовий синій у розчині молочної кислоти з їдким лугом (метиленового синього 0,05 г, їдкого натру 0,5 г, молочної кислоти - 15 мл). Живі яйця забарвлення не сприймають; фарбуються в синій колірзародки мертвих яєць. Фарбування личинок аскарид основним розчином фарби діаманткрезилового синього концентрації 1:10000 здійснюють наступним чином: на предметне скло наносять краплю рідини з яйцями аскарид і краплю основного розчину фарби. Препарат накривають покривним склом, яке щільно притискають до предметного скла при легкому постукуванні препарувальною голкою. Під мікроскопом спостерігають кількість личинок, що вийшли, і ступінь їх офарблюваності; після цього цей же препарат переглядають повторно через 2 - 3 години. Живими вважаються лише недеформовані личинки, які не забарвилися протягом 2 годин. Мертві личинки або не виходять з яєць, або забарвлюються при розриві шкаралупи (частково або повністю).

При визначенні життєздатності яєць аскаридій птахів можливе фарбування препаратів 5%-ним спиртовим розчиномйоду. При його нанесенні препарат зародки мертвих яєць аскаридий протягом 1 - 3 сек. фарбуються в оранжевий колір.

Мертві яйця опісторхісів і онкосфери бичачого ціп'яка забарвлюються розчином толуїдинового синього (1:1000), а мертві онкосфери бичачого ціп'яка - розчином діаманткрезилового синього (1:10000). При цьому набувають кольору зародка та оболонки як мертвих, так і живих яєць. Тому після фарбування яйця та онкосфери відмивають у чистій водіта додатково забарвлюють їх сафраніном (у розведенні 1:10000 спирту 10 °С). Спирт видаляє фарбу з оболонок, а сафранін забарвлює червоний колір. В результаті живі яйця забарвлюються у червоний колір; яйця з мертвими зародками – у синій, а оболонка залишається червоною. Мертві зародки онкосфер бичачого ціп'яка швидко, протягом декількох хвилин, забарвлюються в яскраво-червоний або рожевий колірсафраніном або в синій колір діаманткрезиловим синім у розведенні 1:4000, або індигокарміном у розведенні 1:1000 - 1:2000. Живі ембріони не змінюються під впливом цих фарб навіть через 2 - 7 годин.

Для визначення життєздатності яєць карликового ціп'яка рекомендується використовувати такі фарби:

1. Діаманткреазиловий синій (1:8000) – через 1 годину у мертвих яєць особливо яскраво забарвлюється онкосфера, яка різко виділяється на блідому або безбарвному тлі решти яйця.

2. Сафранін (1:8000 при дії протягом 2 годин та 1:5000 – протягом 3 – 5 годин).

3. 50%-ний розчин пирогалловой кислоти у розведенні 1:2 - при дії протягом 1 години при температурі 29 - 30 ° С (чим нижче температура, тим триваліший процес фарбування).

7.7.3. Люмінесцентний метод дослідження яєць та личинок гельмінтів

Люмінесцентна мікроскопія дає можливість диференціювати живі та мертві об'єкти без ушкодження яйця. Для флюоресценції використовуються не ультрафіолетові промені, а синьо-фіолетова частина видимого світла, зі звичайним мікроскопом та предметним склом; до освітлювача ОІ-18 додають спеціальний набіркольорові фільтри.

Живі та мертві яйця аскарид, гостриків, карликових ціп'яків, бичачого ціп'яка, широкого лентеця та інших гельмінтів люмінескують неоднаково. Це явище спостерігається як при первинній люмінесценції без застосування барвників, так і при фарбуванні флюорохромами (акридиновий помаранчевий, корифосфін, примулін, ауролін, сульфат берлерину, тріпафлавін, риванол, акрихін та ін.).

Незабарвлені, живі несегментовані яйця, аскарид світяться яскраво-зеленим світлом з жовтуватим відтінком; у мертвих яєць оболонка випромінює зелене світлозначно яскравіше, ніж темно-зелена зародкова частина; у яєць аскарид з личинкою проявляється лише оболонка, а в мертвих – і оболонка, і личинка яскраво-жовтого кольору.

Непігментовані і несегментовані живі яйця гостриків і карликових ціп'яків випромінюють зеленувато-жовте світло, у мертвих яєць інтенсивно люмінескує оболонка на тлі темно-зеленої зародкової маси.

При вторинній люмінесценції (при фарбуванні акридин помаранчевим у розведенні 1:10000 та 1:50000 від 30 хвилин до 2 годин) оболонка живих та мертвих нематод, трематод та цестод люмінескує неоднаково.

Шкаралупа живих і мертвих яєць аскарид, токсокар, гостриків, карликових ціп'яків, пацюкових ціп'яків, бичачого ціп'яка, лентеців забарвлюється в оранжево-червоний колір. Зародки живих яєць аскарид, токсаскарисів, щурячого ціп'яка, широкого лентеця і онкосфери бичачого ціп'яка люмінескують тьмяним темно-зеленим або сіро-зеленим кольором. Мертві зародки яєць цих гельмінтів випромінюють "гарячий" оранжево-червоний колір. Живі личинки гостриків і токсокар (звільнені від шкаралупи яйця) випромінюють тьмяне сіро-зелене світло, при їх загибелі колір змінюється від головного кінця в світло-зелений, потім жовтий, помаранчевий і, нарешті, в яскраво-оранжевий.

При фарбуванні флюорохромами - корифосфілом, примуліном у мертвих яєць аскарид і волосоголовців спостерігається свічення від лілово-жовтого до мідно-червоного кольору. Життєздатні яйця не люмінескують, а фарбуються в темно-зелений колір.

Живі яйця трематод (парагонімусів та клонорхісів) не люмінескують після фарбування акридиновим помаранчевим, а від мертвих яєць виходить жовтувато-зелений колір.

Метод люмінесценції може бути застосований і визначення життєздатності личинок гельмінтів. Так, флюорохромовані розчином акридинового помаранчевого (1:2000) личинки стронгілятів, рабдитат світяться: живі – зеленим (з відтінком), мертві – яскраво-оранжевим світлом.

Живі мірацидії, що вийшли з оболонки, випромінюють тьмяне блакитне світло з ледь помітним світло-жовтим віночком вій, але через 10 - 15 хвилин після загибелі проявляються яскравим світлом, що горить, світло-зеленим, а потім - оранжево-червоним світлом.

7.7.4. Метод біологічної проби

Наприклад, для визначення життєздатності яєць аскаридат (аскариди свинячі, людини, токсокари, токсаскарис та ін) на одну тварину (морські свинки, миші) необхідно не менше 100 - 300 яєць з личинкою, що розвинулася. Яйця аскаридат в ізотонічному розчині хлориду натрію вводять піпеткою через рот миші або морської свинки. Через 6 - 7 діб тварину забивають, розкривають та досліджують її печінку та легені окремо на наявність личинок аскаридат. Для цього печінка та легені подрібнюють ножицями на дрібні шматочки та досліджують їх за методом Бермана чи Супряги (розділ 6.1.2).

Якщо тварин заражали живими інвазійними яйцями, то при розтині у печінці та легенях виявляють мігруючі личинки аскаридат.

У разі зараження яйця фасціол у фекаліях лабораторних тварин можна виявити у кроликів через 2 місяці, у морських свинок- через 50 діб, у мишей – через 35 – 40 діб.

Для більш швидкого отримання відповіді лабораторних тварин розкривають через 20 – 30 діб та досліджують печінку на наявність молодих фасціол.

Для визначення життєздатності яєць карликового ціп'яка також рекомендується їх згодовування незараженим ними раніше білим мишам з наступним розкриттям тварин через 92 - 96 годин та виявленням цистицеркоїдів у кишкових ворсинках або цестод у просвіті кишечника.

Для визначення життєздатності яєць опісторхісів рекомендується метод (Герман С.М., Беер С.А., 1984), заснований на фізико-хімічній активації залози вилуплення мірацидію та стимуляції рухової активностіличинки, що призводить до відкривання кришечки яйця та активного виходу мірацидію в експериментальних умовах.

Завис яєць опісторхісів у воді попередньо охолоджують до 10 - 12 ° С (усі наступні операції здійснюють при кімнатній температурі 19 - 20 ° С). У центрифужну пробірку вносять 1 краплю суспензії, що містить 100 - 150 яєць. Пробірку ставлять у штатив на 5 – 10 хвилин. За цей час усі яйця встигають опуститись на дно. Потім смужкою фільтрувальним папером обережно відсмоктують надлишок води і добирають в пробірку 2 краплі спеціального середовища. Середовище готують на 0,005 М Тріс-HCl буфері; в буфер додають 12 - 13%-ний розчин етанолу та барвник (фуксин, сафранін, еозин, метиленовий синій і т.д.). Пробірку струшують, її вміст переносять на предметне скло піпеткою і залишають на 10 хвилин, злегка похитуючи. Потім додають 2 краплі зазначеного середовища. Препарат готовий до мікроскопування під звичайним світловим мікроскопом при 20-кратному збільшенні.

За цей час у життєздатних личинок відкривається кришечка, і мірацидій активно виходить у вказане середовище. Завдяки наявності в ній етанолу вони через 2 - 5 хвилин знерухомлюються і потім забарвлюються за допомогою барвника. Їх легко можна виявити та порахувати при мікроскопуванні.