Kolor i przezroczystość gotowego medium. Reakcja łańcuchowa uranu i rewelacyjna reakcja łańcuchowa

119. Pandey i Nonne - Reakcje Apelta

Jako odczynnik do przeprowadzenia reakcji Pandey'a stosuje się klarowny supernatant, który otrzymuje się przez energiczne wytrząsanie 100 g ciekłego kwasu karbolowego z 1000 ml wody destylowanej. Do osadów i klarowny płyn(odczynnik), tę mieszaninę najpierw umieszcza się w termostacie na 3-4 godziny, a następnie utrzymuje w temperaturze pokojowej przez 2-3 dni.

Umieść szkiełka zegarkowe lub szkiełko na ciemnym papierze i nanieś na nie 2-3 krople odczynnika, następnie 1 kroplę płyn mózgowo-rdzeniowy. Jeśli kropla zmętnieje lub na jej obrzeżach pojawi się nitkowate zmętnienie, reakcję uważa się za pozytywną.

Do przeprowadzenia reakcji Nonne-Apelta wymagane są czyste probówki, nasycony roztwór siarczanu amonu, woda destylowana i ciemny papier. Przygotowuje się nasycony roztwór siarczanu amonu w następujący sposób: 0,5 g chemicznie czystego obojętnego siarczanu amonu umieszcza się w kolbie o pojemności 1000 ml, następnie wlewa się 100 ml wody destylowanej ogrzanej do 95 ° C, wstrząsa się do całkowitego rozpuszczenia soli i pozostawia na kilka dni w temperaturze pokojowej. Po 2-3 dniach roztwór przesącza się i określa pH. Reakcja musi być neutralna.

0,5-1 ml otrzymanego roztworu wlewa się do probówki i ostrożnie dodaje taką samą ilość płynu mózgowo-rdzeniowego wzdłuż ścianki probówki. Po 3 minutach oceń wynik. Pojawienie się białawego pierścienia wskazuje na pozytywną reakcję. Następnie zawartość probówki wstrząsa się, stopień zmętnienia określa się przez porównanie z probówką zawierającą wodę destylowaną. Wyniki reakcji ocenia się na tle czarnego papieru.

120. Reakcja Bordeta-Jangu

Cenny test diagnostyczny w identyfikacji przewlekła rzeżączka wśród osób przewlekle choroby zapalne układ moczowo-płciowy. Według literatury, kiedy prawidłowe użycie Metoda ta ujawnia do 80% przypadków rzeżączki niewykrytej metodą bakterioskopową lub bakteriologiczną.

Reakcja Bordeta-Jangu może być śladowa w wyniku przebytej choroby lub stosowania gonoszczepionki w celach diagnostycznych (immunobiologiczna metoda prowokacji), jak i leczniczych (leczenie przewlekłych procesów zapalnych układu moczowo-płciowego u kobiet wg Baksheeva) zamiar. Dlatego przed jego wykonaniem należy dokładnie zebrać wywiad,

Reakcja może być również fałszywie dodatnia po wprowadzeniu mleka, użyj w celów leczniczych pirogenny.

Dlatego pozytywna reakcja Bordeta-Jangu nie służy jako niepodważalny dowód obecności infekcja gonokokowa, jak i ujemne nie mogą świadczyć o braku rzeżączki. Jednakże pozytywne rezultaty przez długi czas lekarz powinien skierować go na poszukiwanie ogniska infekcji gonokokowej w organizmie.

Jako antygen stosuje się zabitą hodowlę gonokoków, zawierającą 3-4 miliardy ciał drobnoustrojów na 1 ml. Antygen gonokokowy konserwuje się roztworem formaldehydu i wlewa do ampułek o pojemności 1-5 ml. Nieotwarte ampułki nadają się do 6 miesięcy, otwarte można przechowywać 2-3 dni w sterylnej probówce w lodówce w temperaturze 3-5°C,

Reakcję wiązania dopełniacza Borde-Zhanga przeprowadza się podobnie do reakcji Wassermana (patrz nr 121). Antygen gonokokowy rozcieńcza się izotonicznym roztworem chlorku sodu zgodnie z mianem wskazanym na etykiecie ampułki. Reakcję najczęściej przeprowadza się w objętości 2,5 ml, dlatego do 0,5 ml rozcieńczonej 1:5 surowicy testowej dodaje się do każdej probówki po 0,5 ml rozcieńczonego antygenu. Pozostałe 1,5 ml to 1 ml układu hemolitycznego i 0,5 ml dopełniacza.

Reakcję uważa się za pozytywną w obecności różne stopnie opóźnienia hemolizy w badanej surowicy. W kontroli (surowica krwi zdrowi ludzie) obserwuje się całkowitą hemolizę.

121. Reakcja Wassermana

W surowicy krwi pacjentów z kiłą znajdują się reaginy i przeciwciała. Reaginy mają zdolność wchodzenia w związki z antygenem kardiolipinowym. Specyficzne przeciwciała przeciwko Treponema pallidum łączą się ze specyficznymi antygenami. Powstałe kompleksy antygen-przeciwciało są absorbowane przez dopełniacz dodany do reakcji. Wskazania dokonuje się przez wprowadzenie układu hemolitycznego (erytrocyty owcze + surowica hemolityczna).

Aby reakcja zaszła:

a) izotoniczny roztwór chlorku sodu;

b) antygeny krętkowe poddane ultradźwiękom (przechowywane w lodówce w temperaturze +4°C) i kardiolipinowe (przechowywane w temperaturze pokojowej);

c) dopełniacz, którym jest surowica krwi uzyskana przez nakłucie serca 5-10 zdrowych świnek morskich. Pod warunkiem, że można przechowywać w lodówce do 2 miesięcy
konserwowanie 4% roztworu kwas borowy i 5% roztwór siarczanu sodu;

d) hemolizyna - hemolityczna surowica krwi króliczej immunizowanej erytrocytami owiec o różnym mianie (przechowywana w lodówce w temperaturze 4°C);

e) erytrocyty owiec otrzymane przez nakłucie Żyła szyjna. Krew zbiera się do sterylnego słoika ze szklanymi kulkami (do mieszania), wstrząsa przez 15 minut. Skrzepy fibrynowe oddziela się przez filtrację przez sterylną gazę. Odwłóknioną krew można przechowywać w lodówce do 5 dni.

Czasami istnieje potrzeba dłuższego przechowywania krwi owczej, dlatego konserwuje się ją specjalnym środkiem konserwującym (6 g glukozy, 4,5 g kwasu borowego, 100 ml izotonicznego roztworu chlorku sodu), który gotuje się w łaźni wodnej przez 20 minut dziennie przez 3 dni Na 100 ml odwłóknionej krwi owczej potrzeba 15 ml środka konserwującego. Odwłókniona krew zakonserwowana w ten sposób jest przechowywana w lodówce.

Główny eksperyment poprzedzony jest kilkoma etapami.

U pacjenta z żyła łokciowa pobrać 5-10 ml krwi i przetworzyć surowicę. U dzieci krew można pobrać z żyły skroniowej lub z nacięcia w pięcie. Nakłucie wykonuje się sterylnymi narzędziami, strzykawką i igłą
wstępnie przemyte izotonicznym roztworem chlorku sodu.

Krew do badań pobierana jest na czczo; 3-4 dni przed badaniem pacjentowi nie wolno używać leki, preparaty naparstnicy, spożywać alkohol.

Badania nie należy wykonywać u pacjentów z podniesiona temperatura organizmu, po urazach, zabiegach chirurgicznych, znieczuleniach, przebytych chorobach zakaźnych, u kobiet w okresie menstruacji, u ciężarnych (w ostatnich 10 dniach ciąży), rodzących (w pierwszych 10 dniach po porodzie), a także u noworodków (w pierwszych 10 dni życia).

Pobraną krew w sterylnej probówce umieszcza się na 15-30 minut w termostacie o temperaturze 37°C. Powstały skrzep oddziela się od ścianek probówki sterylnym szklanym prętem i umieszcza w lodówce na jeden dzień. Oddzieloną przezroczystą surowicę (powyżej skrzepu) odsysa się pipetą Pasteura za pomocą gumowej gruszki lub ostrożnie wlewa do innej sterylnej probówki i inaktywuje w łaźni wodnej przez 30 minut w temperaturze 56 °C. Serum przygotowane w ten sposób do eksperymentu można przechowywać w lodówce do 5-6 dni.

Antygeny rozcieńcza się zgodnie z metodą i mianem podanym na etykiecie.

Przygotuj układ hemolityczny. W tym celu odwłóknioną krew lub erytrocyty owcze w ilości niezbędnej do reakcji odwirowuje się, osocze ostrożnie oddziela, a osad przemywa 5-6 objętościami izotonicznego roztworu chlorku sodu, aż supernatant stanie się całkowicie bezbarwny. Z osadu przygotowuje się 3% zawiesinę erytrocytów w izotonicznym roztworze chlorku sodu według potrójnego miana.

Roztwór surowicy hemolitycznej i zawiesinę erytrocytów owczych szybko miesza się i umieszcza w termostacie na 30 minut.

Suchy dopełniacz rozcieńcza się izotonicznym roztworem chlorku sodu w stosunku 1:10, normalna inaktywowana ludzka surowica - 1:5.

Dopełniacz jest miareczkowany w 30 probówkach umieszczonych w stojaku po 10 probówek w 3 rzędach. W dwóch rzędach jest miareczkowany w obecności dwóch antygenów, w trzecim - izotonicznym roztworem chlorku sodu. Pięć probówek stanowi kontrolę: dwie dla odpowiednich dwóch antygenów i po jednej dla kontroli dopełniacza, surowicy hemolitycznej i izotonicznego roztworu chlorku sodu pod kątem hemotoksyczności; wypełnij je tak:

Probówki umieszcza się w termostacie na 45 minut, po czym sprawdza. Hemolizy nie powinno być w żadnej probówce.

Dopełniacz w rozcieńczeniu 1:10 wlewa się do 10 probówek pierwszego rzędu statywu w dawkach: 0,1, 0,16, 0,2, 0,24, 0,3, 0,36, 0,4, 0,44, 0,5 i 0,55 ml. Do zawartości każdej probówki dodać izotoniczny roztwór chlorku sodu do objętości 1 ml i dokładnie wymieszać. 0,25 ml mieszaniny z każdej probówki przenosi się do odpowiednich probówek drugiego i trzeciego rzędu. Wstrząsnąć statywem z probówkami, do trzeciego rzędu probówek dodać 0,5 ml układu hemolitycznego, ponownie wstrząsnąć i umieścić na 45 minut w termostacie w temperaturze 37°C. Normalną ludzką surowicę krwi rozcieńczoną izotonicznym roztworem chlorku sodu w stosunku 1:5, 0,25 ml wlewa się do wszystkich 30 probówek.

Antygen I (USG krętków), rozcieńczony w mianie izotonicznym roztworem chlorku sodu, dodaje się 0,25 ml do 10 probówek pierwszego rzędu; antygen II (kardiolipina w tym samym rozcieńczeniu iw tej samej ilości) - w 10 probówkach drugiego rzędu. 0,25 ml izotonicznego roztworu chlorku sodu wlewa się do 10 probówek trzeciego rzędu, wlewa pozostałe 0,25 ml. Po inkubacji w termostacie do 20 probówek (1 i 2 rząd) dodaje się 0,5 ml układu hemolitycznego, wstrząsa i ponownie umieszcza w termostacie na 45 minut.

Po 45 minutach określa się roboczą dawkę dopełniacza, czyli jego miano z dodatkiem w zakresie 15-20%.

Uważa się, że miano dopełniacza jest minimalna ilość, powodując całkowitą hemolizę erytrocytów baranich w obecności antygenu i normalnej ludzkiej surowicy krwi.

Główne doświadczenie polega na tym, że każdą badaną inaktywowaną surowicę, rozcieńczoną w stosunku 1: 5 izotonicznym roztworem chlorku sodu, wlewa się do 0,25 ml w trzech probówkach. Do pierwszej probówki dodać 0,25 ml antygenu I, do drugiej 0,25 ml antygenu II, do trzeciej (kontrolnej) 0,25 ml izotonicznego roztworu chlorku sodu. Do wszystkich probówek dodać po 0,25 ml dopełniacza rozcieńczonego do dawki roboczej. Wszystkie probówki umieszcza się w termostacie na 45 minut, następnie dodaje się do nich 0,5 ml układu hemolitycznego, wstrząsa i umieszcza w termostacie na 45-50 minut. Wynik doświadczenia rejestruje się po rozpoczęciu całkowitej hemolizy w probówkach kontrolnych.

Wyniki reakcji oceniane są plusami: całkowite opóźnienie hemolizy (reakcja silnie pozytywna) ++++, znaczące (reakcja dodatnia) +++, częściowe (reakcja słabo pozytywna) ++, nieistotne (reakcja wątpliwa) - ±, brak opóźnienia w hemolizie (reakcja ujemna) - .

Na Metoda ilościowa przeprowadzając reakcję Wassermanna, doświadczenie opiera się na zmniejszających się objętościach surowicy rozcieńczonej izotonicznym roztworem chlorku sodu.

Schemat przeprowadzenia głównego doświadczenia reakcji Wassermana

Kliniczne znaczenie reakcji Wassermana jest trudne do przecenienia. Jest przeprowadzany dla wszystkich pacjentów przed rozpoczęciem leczenia, ale specjalne znaczenie ona ma o godz kiła utajona, Pokonać narządy wewnętrzne i układ nerwowy.

Wyniki reakcji Wassermana charakteryzują jakość leczenia, co daje podstawę do wyrejestrowania leczonych pacjentów w określonym czasie.

W kile pierwotnej reakcja Wassermana jest zwykle dodatnia pod koniec 6 tygodnia od momentu zakażenia; z wtórną świeżą kiłą jest dodatni w prawie 100% przypadków, z wtórnym nawrotem - w 98-100%; trzeciorzędowy aktywny - w 85%; trzeciorzędowy ukryty - w 60% przypadków.

Reakcję Wassermana przeprowadza się dwukrotnie u wszystkich kobiet w ciąży, pacjentów z chorobami somatycznymi, nerwowymi, psychicznymi i choroby skórne, a także zadekretowane kontyngenty ludności. Jednocześnie dodatnie i słabo dodatnie wyniki reakcji należy traktować krytycznie, ponieważ mogą występować pod koniec ciąży i po porodzie, z nadczynnością tarczycy, malarią, trądem, próchnicą guz złośliwy, choroby zakaźne, kolagenozy itp. Dlatego w obecności objawy kliniczne chorób, należy je brać pod uwagę, wraz z danymi z bakterioskopii, w pierwszej kolejności.

Jednocześnie istnieją czynniki, które mogą zniekształcić prawdziwy charakter wyników reakcji Wassermana: źle umyte szkło laboratoryjne (ślady kwasów i zasad w probówkach), długotrwałe przechowywanie krwi pobieranej do badań, spożywanie tłuszczów i alkoholu przez pacjentki przed badaniem, miesiączką itp.

We wszystkich przypadkach pożądane jest przeprowadzenie kompleksowego badania chorego, obejmującego oprócz reakcji Wassermanna także RIBT (patrz 122, 123, 124) itp.

122. Reakcja Sachsa - Vitebsky (cytocholic)

Służy do wykrywania kiły. Polega na powstawaniu osadu, gdy surowica krwi pacjenta jest mieszana z antygenem.

W celu przygotowania antygenu mięśnie kilku serc wołowych oczyszcza się ze ścięgien, powięzi, tłuszczu, rozdrabnia w maszynce do mięsa i ekstrahuje 5-krotną objętością 96% etanolu przez 15 dni z codziennym 20-minutowym wytrząsaniem. Otrzymany ekstrakt odparowuje się na łaźni wodnej w porcelanowym kubku pod zmniejszonym ciśnieniem. Do pozostałości (jasnożółta masa lipidów) dodaje się gorący 96% alkohol etylowy w ilości 1/3 objętości mięśni pobranych do ekstrakcji.

Ekstrakt przechowuje się przez 3 dni w temperaturze pokojowej, przesącza (w zimna woda) i dodać 0,3-0,6% roztwór krystalicznego cholesterolu, w zależności od wyników miareczkowania z surowicami dodatnimi i ujemnymi. Przechowywać antygen cytocholowy w temperaturze pokojowej w zamkniętych ampułkach lub zamkniętych probówkach.

Metodologia. Do 2 ml izotonicznego roztworu chlorku sodu szybko wlewa się 1 ml antygenu cytocholowego i pozostawia w temperaturze pokojowej na 15 minut, aż pojawią się płatki. Dodać 0,1 ml emulsji antygenowej do 0,2 ml inaktywowanej surowicy, wstrząsać przez 3 minuty i pozostawić na 30 minut, następnie dodać 1 ml izotonicznego roztworu chlorku sodu.

Do probówki kontrolnej z antygenem dodaje się 1,2 ml izotonicznego roztworu chlorku sodu i 0,1 ml emulsji antygenowej. W kontroli nie powinno być żadnych płatków. Wyniki reakcji są brane pod uwagę wizualnie lub za pomocą szkła powiększającego i są wskazywane w zależności od ilości płatków, które wypadły z plusami (++++, +++, ++). Przy negatywnej reakcji nie ma płatków, ale zawartość tuby może być lekko opalizująca.

W 1931 roku P. Sachs i E. Witebsky zaproponowali modyfikację tej techniki, polegającą na rozcieńczeniu antygenu w dwóch fazach: 2 części izotonicznego roztworu chlorku sodu dodaje się do 1 części antygenu, trzyma w temperaturze pokojowej przez 5 minut i dodaje się kolejne 9 części izotonicznego roztworu chlorku sodu. Zaleca się również rozcieńczenie antygenu 2% roztworem chlorku sodu, co zdaniem autorów zwiększa czułość reakcji. Możliwa jest również ilościowa modyfikacja reakcji rozcieńczeniem surowicy (1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64 itd.).

Reakcja jest dość czuła, trwa krótko (około 1 godziny), a jej wyniki są odczytywane natychmiast.

123. Reakcja unieruchomienia bladego treponemy (RIBT)

Za pomocą reakcji w surowicy krwi pacjentów z kiłą wykrywa się przeciwciała i dopełniacz, które unieruchamiają blady treponema.

W przypadku kiły pierwotnej RIBT jest przeważnie ujemna, wtórna - dodatnia w 92-96% przypadków, trzeciorzędowa - w 92-100%, z kiłą układu nerwowego i wrodzona - w 86-89% przypadków.

Pozytywne wyniki RIBT odnotowano w sarkoidozie, rumieniu, cukrzycy, nowotworach złośliwych, Wirusowe zapalenie wątroby, marskość wątroby, malaria, trąd, mononukleoza zakaźna, niektóre choroby gorących krajów (kufel, ziele itp.).

Antygenem jest zawiesina krętka bladego pobrana z jąder królika zakażonego kiłą przez wprowadzenie do jądra 0,75-1 ml zawiesiny krętka bladego w izotonicznym roztworze chlorku sodu (50 osobników na pole widzenia).

Materiał z jąder należy pobrać 6-8 dni po zakażeniu zwierzęcia. Przed pobraniem antygenu królika poddaje się ubojowi przez wykrwawienie (nakłucie serca lub tętnica szyjna). Tkankę jądra rozgniata się i wypełnia zdrową króliczą surowicą krwi rozcieńczoną izotonicznym roztworem chlorku sodu, wytrząsa się przez -30 minut, a następnie wiruje przez 10 minut (1000 obrotów na minutę). Supernatant jest badany mikroskopowo. W każdym polu widzenia powinno być co najmniej 10-15 jasnych krętków.

Uzupełnienie jest przygotowywane w zwykły sposób z krwi świnek morskich.

Do RIBT potrzebujesz: 1,2 ml 0,2% roztworu żelatyny, 2,8 ml 5% roztworu albuminy, 1,6 ml jasnej zawiesiny treponemy; średnie pH - 7,2. Do tej mieszaniny dodaje się 0,15 ml dopełniacza (koktajlu). Równolegle umieszcza się dwie próbki: z aktywnymi (eksperyment) i reaktywnymi (kontrolnymi) dopełniaczami.

Badaną surowicę pobiera się do melanży do kreski „1”, a następnie zbiera się koktajl do kreski „2” i zamyka się sterylnym gumowym pierścieniem.

W tym samym czasie przeprowadza się podobną reakcję z wyraźnie pozytywnymi i oczywiście negatywnymi surowicami.

Melangery numeruje się i umieszcza w termostacie w temperaturze 35°C na 18-20 godzin, po czym wyjmuje się je parami z termostatu (doświadczenie - kontrola) i zawartość przelewa się do odpowiednich probówek. Na szkiełko nanosi się 2 krople: po lewej - doświadczenie, po prawej - kontrolę, przykryto szkiełkiem nakrywkowym i oglądano pod mikroskopem w ciemnym polu widzenia.

Najpierw bada się wyniki kontroli: określa się procent ruchomych i nieruchomych bladych treponem. Wzór zliczania: X = (A - B) / A * 100, gdzie A to liczba ruchomych bladych krętków w kontroli; B - liczba ruchomych bladych krętków w eksperymencie.

Przykład: (24 - 19) / 24 * 100 = 21%.

Szacunki wyników RIBT: poniżej 20% - ujemne. 21-30% - wątpliwe, 31-50% - słabo pozytywne, powyżej 50% - pozytywne.

Antygen, dopełniacz i pomocniczy, wskaźnikowy lub układ hemolityczny - surowica hemolityczna i erytrocyty owcze.

Jeżeli w pierwszym układzie tworzy się swoisty kompleks antygen + przeciwciało, wówczas dopełniacz jest adsorbowany (połączony z tym kompleksem) iw drugim układzie nie dochodzi do hemolizy.

Reakcja wymaga:

1. Surowica badana, którą otrzymuje się z krwi pobranej przez nakłucie żyły łokciowej pacjenta. Po skrzepnięciu krwi surowicę zasysa się do oddzielnej probówki i inaktywuje przez 30 minut w temperaturze 56 °C w łaźni wodnej.

2. Antygen - zawiesina zabitych gonokoków.

3. Erytrocyty owiec uzyskuje się ze sterylnej odwłóknionej krwi. Przemywa się je przez 3-krotne odwirowanie z nowymi porcjami solanki. W reakcji stosuje się 3% zawiesinę erytrocytów.

4. Surowicę hemolityczną przygotowuje się wcześniej przez immunizację królików erytrocytami baranimi. Surowica jest miareczkowana przed użyciem.

5. Uzupełnienie - świeża surowica świnki morskiej. Krew jest wysysana z serca świnki morskiej za pomocą strzykawki, po skrzepnięciu oddziela się surowicę. Przed eksperymentem miareczkuje się roboczą dawkę dopełniacza. Aby to zrobić, weź główne rozcieńczenie dopełniacza 1:10 i wlej je do probówek od 0,1 do 0,5, po czym objętość w każdej probówce dostosuj solą fizjologiczną do 1,5 ml.

W tym samym czasie przygotowuje się układ hemolityczny - rozcieńczoną w potrójnym mianie surowicę hemolityczną + 3% zawiesinę erytrocytów owczych. Oba składniki są w różnych objętościach i trzymane w termostacie przez 30 minut (uczulenie mieszaniny), po czym mieszaninę dodaje się w 1 ml do probówek i umieszcza w termostacie na 30 minut. 2 probówki służą jako kontrola:

1. 1 ml układu hemolitycznego + 1,5 ml soli fizjologicznej;

2. 0,5 ml dopełniacza 1:10 + 0,5 ml zawiesiny erytrocytów + 1,5 ml soli fizjologicznej.

Miano dopełniacza to minimalna ilość, przy której nadal zachodzi hemoliza. W celu wywołania reakcji pobiera się roboczą dawkę dopełniacza, powiększoną w stosunku do miana o 20-25%, czyli zwykle ilość dopełniacza, która znajduje się w przedostatniej probówce z hemolizą. Zwiększenie dawki dopełniacza jest konieczne, ponieważ w reakcji aktywność dopełniacza może być nieco stłumiona przez inne składniki reakcji (antygen, surowica).
43) RSK Wasserman

Służy do diagnozowania kiły w celu wykrycia przeciwciał, a także określenia skuteczności specyficzna terapia. Opiera się na zasadzie reakcji wiązania dopełniacza Borde-Gangou. Istotną różnicą w reakcji Wassermana jest niespecyficzność antygenu: ekstrakty lipidowe z normalne narządy Zwierząt

Do ustawienia reakcji Wassermana niezbędne jest posiadanie surowicy pacjenta, diagnostyki, antygenów reagujących krzyżowo nr 1, nr 2, dopełniacza, surowicy hemolitycznej, erytrocytów baranich, solankowy.

Diagnosticum nr 1 - specyficzne, krętkowe.

Diagnosticum nr 2 - niespecyficzne, antygen kardiolipiny, które są wysokooczyszczonymi ekstraktami serca bydlęcego o stałym składzie chemicznym lipidów. Lipoidy wg skład chemiczny są zbliżone do lipoidów treponema pallidum, dlatego chociaż nie są swoiste, wiążą przeciwciała przeciwko krętkom.

Antygeny te są wytwarzane centralnie i stosowane w reakcji w rozcieńczeniu zgodnie z mianem podanym na etykiecie.

Równocześnie z głównym doświadczeniem umieszcza się 2 kontrole: z surowicami wyraźnie ujemnymi iz wyraźnie dodatnimi.

Konfigurowanie głównego doświadczenia

Najpierw do 4 probówek przelewa się inaktywowaną i rozcieńczoną w stosunku 1:5 surowicę testową. Następnie antygeny (nr 1, nr 2) wlewa się do 2 probówek, do trzeciej probówki wlewa się sól fizjologiczną. Następnie do wszystkich probówek dodaje się roboczą dawkę dopełniacza. Po wymieszaniu składników statyw z probówkami umieszcza się w termostacie o temperaturze 37°C na 30 minut. Po przechowywaniu w termostacie do wszystkich probówek dodaje się układ hemolityczny. Probówki ponownie umieszcza się w termostacie na 2 godziny, a następnie pozostawia w temperaturze pokojowej. Następnego dnia odnotowuje się wynik, ocenia się stopień nasilenia reakcji, cztery plusy (++++), trzy (+++), dwa (++) i jeden (+) - w zależności od intensywności koloru cieczy i wielkości osadu erytrocytów na dnie. Całkowitą hemolizę wskazuje (-) minus. Przy ostrej rozbieżności między wynikami z różnymi antygenami eksperyment powtarza się z nową porcją krwi.
44) RIT-r. Unieruchomienie bladego treponemy.

Ta reakcja jest stosowana m.in cele diagnostyczne i za uznanie wyniki fałszywie dodatnie standardowe reakcje serologiczne, zwłaszcza w przypadku kiły utajonej.

RIBT polega na tym, że w obecności immobilizyn w surowicy pacjentów z kiłą i aktywnym dopełniaczem blade krętki tracą ruchliwość.

RIBT umieszcza się w sterylnych pudełkach. W reakcji biorą udział surowica testowa, dopełniacz i antygen.

W RIBT antygen jest zawiesiną jasnego treponema z jądra królika wczesne daty(7-8 dni po zakażeniu) syfilityczne zapalenie jąder. Specjalne podłoże zawiesinowe zachowuje żywotność bladego treponemy przez co najmniej jeden dzień. Dopełniacz jest używany w RIBT świnki morskie. RIBT przebiega w warunkach beztlenowych. Probówki ze składnikami umieszcza się w mikroaerostacie, z którego powietrze atmosferyczne i wtryskuje się mieszaninę gazową (95 części azotu i 5 części dwutlenek węgla). Mikroanaerostat wraz z probówkami umieszcza się w termostacie (35°C) na 18-20 godzin.

Równolegle ze sformułowaniem reakcji, badania kontrolne z dodatnią i ujemną surowicą krwi pobraną z wcześniejszych doświadczeń.

Wyniki RIBT są oceniane po wyjęciu probówek z termostatu (tj. po 18-20 godzinach doświadczenia). Za pomocą pipety Pasteura kroplę zawartości probówki nanosi się na szklane szkiełko, które przykrywa szkiełkiem nakrywkowym i bada w ciemnym polu mikroskopu (obiektyw 40, okular 10). Przy unieruchomieniu do 20% bladych krętków reakcję uważa się za negatywną, od 21 do 30% - wątpliwą, od 31 do 50% słabo pozytywną, od 51 do 100% - pozytywną. Procent unieruchomienia bladego treponemy określa się zgodnie ze specjalną tabelą.

45) Opson-fagocytarna reakcja

Mechanizm: wzmożona fagocytoza komórek drobnoustrojów pod wpływem przyjaznego działania przeciwciał, surowicy odpornościowej i dopełniacza.

Składniki reakcji:

1) antygen – codzienna hodowla drobnoustrojów;

3) dopełniacz - świeża surowica świnki morskiej;

4) fagocyty - zawiesina leukocytów.

Opsoniny to przeciwciała występujące w normalnych i odpornościowych surowicach, które przygotowują drobnoustroje do fagocytozy.

Mieszaninę reakcyjną umieszcza się w specjalnych probówkach w temperaturze t=37° minut. Następnie z każdej probówki przygotowuje się rozmazy, liczy 100 fagocytów i określa liczbę fagocytowanych mikrokontroli.

Indeks opsoniczny = indeks fagocytarny. surowica/wskaźnik fagocytarny normalnej surowicy

Im wyższy indeks opsonowy (powinien wynosić >1) badanej surowicy, a zatem tym wyższy! bruceloza).

Służy do oznaczania opsonin – przeciwciał stymulujących aktywność fagocytarną leukocytów, tj. serodiagnostyka zakażeń, takich jak bruceloza.

Wzmocnienie fagocytozy następuje dzięki przyłączeniu opsonin z aktywnymi centrami (fragment Pav) do determinantów bakteryjnych, a następnie za pomocą fragmentów Pc do receptorów Pc fagocytów. Normalna surowica zawiera niewielkie ilości opsonin, które działają w obecności dopełniacza. W surowicy odpornościowej jest więcej opsonin, a ich aktywność jest mniej zależna od dopełniacza.

Składniki:

Serum w trakcie badań

normalna surowica

Codzienna hodowla drobnoustrojów (np. gronkowce)

Fagocyty - zawiesina neutrofili

Inkubować w temperaturze 37°C przez 30 minut. Z każdej probówki przygotowuje się rozmazy, barwi się metodą Romanovsky'ego-Giemsy i liczy się liczbę drobnoustrojów pod mikroskopem w 100 lub więcej neugrofilach, tj. określić indeks fagocytarny.

Indeks fagocytarny - liczba drobnoustrojów wchłoniętych przez jeden neutrofil.

Indeks opsonowy indeks fagocytarny surowicy odpornościowej (testowanej) / indeks fagocytarny normalnej surowicy.

Im wyższy indeks opsoniczny (powinien być > 1), tym wyższa odporność.

Indeks opsonofagocytarny jest wskaźnikiem cyfrowym = liczba fagocytów x wynik fagocytozy (w zależności od liczby połkniętych drobnoustrojów). Maksymalny wynik to -75.

46) RN na myszach w celu ustalenia egzotoksyny

Ta reakcja opiera się na zdolności specyficznej antytoksycznej surowicy do neutralizacji egzotoksyny.

Przeciwciała surowicy odpornościowej są w stanie zneutralizować szkodliwy wpływ drobnoustrojów lub ich toksyn na wrażliwe komórki i tkanki, co wiąże się z blokadą antygenów drobnoustrojów przez przeciwciała, czyli ich neutralizacją.

Reakcję neutralizacji (RN) przeprowadza się poprzez wprowadzenie mieszaniny antygen-przeciwciało do zwierząt lub do wrażliwych obiektów testowych (hodowla komórkowa, zarodki). W przypadku braku szkodliwego działania mikroorganizmów lub ich antygenów, toksyn u zwierząt i obiektów testowych, mówią o neutralizującym działaniu surowicy odpornościowej, a zatem o specyfice interakcji kompleksu antygen-przeciwciało.

W celu przeprowadzenia reakcji miesza się materiał testowy, w którym spodziewana jest obecność egzotoksyny serum antytoksyczne, trzymane w termostacie i podawane zwierzętom (świnki morskie, myszy). Zwierzętom kontrolnym wstrzykuje się przesącz badanego materiału, nie traktowany surowicą. W przypadku, gdy nastąpi neutralizacja egzotoksyny surowicą antytoksyczną, zwierzęta z grupy doświadczalnej pozostaną przy życiu. Zwierzęta kontrolne umrą w wyniku działania egzotoksyny.

Reakcja neutralizacji egzotoksyny zachodzi, gdy wchodzi ona w interakcję z surowicą antytoksyczną (przeciwciała-antytoksyny). W wyniku powstania kompleksu antygen-przeciwciało toksyna traci swoje właściwości toksyczne.

Reakcję neutralizacji przeprowadza się w celu wykrycia i miareczkowania toksyn, toksoidów lub antytoksyn.

Toksyny uzyskuje się przez filtrowanie cieczy pożywka wzrostowa lub badanego materiału, na którym namnażały się bakterie toksyczne. Po obróbce z formaliną przez 30-45 dni w temperaturze 37°C toksyna zamienia się w anatoksynę, którą stosuje się do immunizacji zwierząt w celu uzyskania surowicy antytoksycznej.

Reakcja neutralizacji in vivo. Aby określić rodzaj toksyny, miesza się ją z diagnostyczną surowicą antytoksyczną i tę mieszaninę podaje się białym myszom. Gdy toksyna zostanie zneutralizowana antytoksyczną surowicą, myszy nie umierają.

Reakcja neutralizacji służy do określenia odporności antytoksycznej u dzieci chorych na błonicę (test Schicka) i szkarlatynę (test Dicka). W tym celu pewną ilość odpowiedniej toksyny (1/40 DLM) wstrzykuje się śródskórnie w obszar przedramienia. Jeśli w organizmie znajdują się antytoksyny, toksyna zostanie zneutralizowana, a reakcja będzie negatywna. W przypadku braku antytoksyn w organizmie odpowiedź zapalna w miejscu wstrzyknięcia.
47) RN (reakcja neutralizacji) na myszach w celu identyfikacji wirusa kleszczowe zapalenie mózgu

Wirus KZM jest patogenny dla wielu zwierząt laboratoryjnych i dzikich. Noworodki i młode białe myszy są najbardziej wrażliwe. Po zakażeniu mózgu, dootrzewnowo, domięśniowo, zwierzęta te rozwijają zapalenie mózgu, które kończy się śmiercią zwierząt. Spośród zwierząt gospodarskich kozy są najbardziej podatne na wirusa KZM, owce i krowy są mniej podatne, a konie są słabo podatne. Wirus KZM ma działanie cytopatogenne (CPE), powodując zmiany cytopatyczne w pierwotnych i przeszczepionych hodowlach embrionalnych komórek nerki świni (SPEV i RPE) i namnaża się bez wyraźnego CPE w wielu innych. hodowle komórkowe. W mózgu zakażonych myszy i płynie hodowlanym zakażonych kultur gromadzi się wirus KZM i specyficzne antygeny wirusowe: wiążące dopełniacz, hemaglutynujące, strącające itp.

wirus KZM długi czas konserwowane w niskich temperaturach ( tryb optymalny-60 stopni C i poniżej), dobrze znosi liofilizację, w stanie wysuszonym pozostaje przez wiele lat, ale szybko ulega inaktywacji w temperaturze pokojowej. Gotowanie zabija go po 2 minutach, aw gorącym mleku o temperaturze 60 stopni. C umiera po 20 minutach.

Formalina, fenol, alkohol i inne środki dezynfekujące, promieniowanie ultrafioletowe również mają działanie inaktywujące.

Reakcja neutralizacji opiera się na zdolności swoistych surowic odpornościowych do gaszenia zakaźnego działania wirusów. Stosuje się go w dwóch kierunkach:

1) do wpisywania izolowanych wirusów;

2) do miareczkowania przeciwciał w surowicach wyleczonych pacjentów.

Przygotowanie reakcji:

1. Na zwierzętach laboratoryjnych. Kryteria obecności wirusa

jest śmierć zwierząt laboratoryjnych. Oblicza się LD50

Maksymalne rozcieńczenie zawiesiny wirusa, które

spowodował śmierć 50% zakażonych zwierząt. Do

przeprowadzana jest identyfikacja wirusa kleszczowego zapalenia mózgu

infekcja śródmózgowa białych myszy.

2. W kulturach tkankowych. Przeprowadzane jest rozliczanie wyników

Przez działanie cytopatyczne (CPE)

Metodą badania kolorów opartą na zmianie koloru

Przez hemadsorpcję.

3. W zarodku kurczaka. Rozliczanie wyników odbywa się zgodnie z

pojawienie się dziobów wzdłuż błony omoczniowo-naczyniowej.

48) RTGA

Ta reakcja jest stosowana w praktyce wirusologicznej:

Aby określić rodzaj wirusa (na szkle);

Do wykrywania w surowicy pacjentów (wdrożony).

Podczas ustalania przybliżonej reakcji hamowania hemaglutynacji, na szklankę nakłada się 1 kroplę specyficznej dla typu surowicy odpornościowej, następnie dodaje się 1 kroplę materiału testowego i 1 kroplę 5% zawiesiny erytrocytów.

Uwzględnianie wyników: rodzaj wirusa określa surowica, z którą nie wystąpiła reakcja, ponieważ surowica odpornościowa specyficzna dla wyizolowanego wirusa hamuje jego aktywność hemaglutynującą, a erytrocyty nie aglutynują.
49) RIF

Jako etykiety stosuje się świecące barwniki fluorochromowe (izotiocyjanian fluorisceiny itp.).

Istnieją różne modyfikacje RIF. Do ekspresowej diagnostyki chorób zakaźnych – do wykrywania drobnoustrojów lub ich antygenów w badanym materiale stosuje się RIF wg Koonsa.

Według Koonsa istnieją dwie metody RIF: bezpośrednia i pośrednia.

Bezpośrednie komponenty RIF:

1) badany materiał (wypróżnienie oddzielone nosogardłem itp.);

2) wyznakowaną specyficzną surowicę odpornościową zawierającą AT-1a na żądany antygen;

3) izotoniczny roztwór chlorku sodu.

Rozmaz z badanego materiału traktuje się znakowaną surowicą odpornościową.

Zachodzi reakcja AG-AT. Badanie mikroskopem luminescencyjnym w obszarze, w którym zlokalizowane są kompleksy AG-AT, ujawnia fluorescencję - luminescencję.

Pośrednie składniki RIF:

1) badany materiał;

2) specyficzna antysurowica;

3) surowica antyglobulinowa (AT-1a przeciw immunoglobulinie) znakowana fluorochromem;

4) Izotoniczny roztwór chlorku sodu.

Rozmaz z materiału testowego jest najpierw traktowany surowicą odpornościową na pożądany antygen, a następnie znakowaną surowicą antyglobulinową.

Świetliste kompleksy AG-AT - znakowane AT są wykrywane za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Zaletą metody pośredniej jest to, że nie ma potrzeby przygotowywania szerokiej gamy surowic swoistych dla fluorescencji i używana jest tylko jedna fluorescencyjna surowica antyglobulinowa.

Izoluje się również 4-składnikową odmianę pośredniego RIF, gdy dodatkowo wprowadza się dopełniacz (surowicę świnki morskiej). Przy pozytywnej reakcji powstaje kompleks AG-AT - oznaczony - dopełniacz AT.

Reakcja dotyczy reakcje serologiczne z udziałem znakowanych antygenów lub przeciwciał.

Odbywa się to metodami bezpośrednimi i pośrednimi.

Na metoda bezpośrednia wykryć antygen w materiale pobranym od pacjenta. Stosuje się diagnostyczną surowicę fluorescencyjną, która zawiera immunoglobuliny wyizolowane z surowic odpornościowych i znakowane fluorochromami.

Specyficzny antygen występuje w postaci jasnozielonych świecących konglomeratów, a tło preparatu zmienia kolor na pomarańczowo-czerwony.

Składniki bezpośredniej reakcji immunofluorescencyjnej:

1) badany materiał;

2) specyficzne serum luminescencyjne;

3) mikroskop luminescencyjny.

Podczas diagnozowania grypy różnicowanie przeprowadza się od patogenów paragrypy i zakażenie adenowirusem. Wymaz z nosogardzieli jest traktowany fluorescencyjną surowicą grypy lub immunoglobuliną grypy.

Wynik „+” w postaci zielonej poświaty uzyskuje się po 3 godzinach.

W metodzie pośredniej wykrywane są i miareczkowane specyficzne przeciwciała. Miano surowicy jest jej maksymalnym rozcieńczeniem, przy którym fluorescencja jest oznaczona jako „+ +”.

Składniki pośredniej reakcji immunofluorescencyjnej

Aby wyszukać antygen w diagnostyce ekspresowej:

1) materiał testowy (antygen);

2) specyficzna surowica;

3) luminescencyjne serum antyglobulinowe

4) mikroskop luminescencyjny.

/ specyficzne dla fazy

Przeciwciała z surowicy adsorbują się na antygenie.

// niespecyficzna faza

Stosowana jest surowica antyglobulinowa znakowana fluorochromem. Powstaje świecący kompleks antygen + przeciwciało (I) + surowica antyglobulinowa (II).