Reakcje serologiczne. Reakcja wytrącania

Artykuł poświęcony będzie zjawisku reakcji strącania. Tutaj rozważymy cechy sformułowania tego zjawiska, zjawisko dyfuzji, ogólną charakterystykę, rolę w życiu człowieka i wiele więcej.

Znajomość zjawiska

Opad jest zjawiskiem typu serologicznego, podczas którego rozpuszczalne antygeny oddziałują z przeciwciałami, w wyniku czego obserwuje się wytrącanie - osad.
Ogólna charakterystyka reakcji precypitacji jest formą skoordynowanego wpływu antygenu i przeciwciała. Tego typu oddziaływania umożliwiają określenie obecności nieznanych antygenów w badanej substancji poprzez dodanie znanych przeciwciał i antygenów. Proces strącania bez obecności soli będzie przebiegał gorzej, a najlepsze optimum leży w zakresie 7,0-7,4 pH.

Składniki reakcji

Wśród składników reakcji strącania wyróżnia się trzy główne elementy:

1. Antygen o charakterze molekularnym. Jest w dobrym stanie, innymi słowy, jest rozpuszczalny. Taki antygen nazywany jest również precipitogenem, który jest lizatem lub ekstraktem tkankowym itp. Precypitogen ma charakterystyczną różnicę od aglutynogenu, która polega na wielkości cząstek, z których się składa. Aglutynogen ma wrodzoną wielkość komórki, a precypitogeny są współmierne do wielkości cząsteczki. Roztwór antygenu charakteryzuje się przezroczystością.
2. Przeciwciało znajdujące się w ludzkiej surowicy krwi, a także w immunodiagnostycznej surowicy zawierającej badane przeciwciała.
3. Elektrolity to roztwór chlorku sodu, który charakteryzuje się stanem izotonicznym.

Przygotowanie precypitogenu

Wywołanie reakcji precypitacji jest niemożliwe bez precypitogenu, który uzyskuje się poprzez mielenie materiałów i ekstrahowanie z nich antygenów białkowych. Ekstrakcja odbywa się przez gotowanie lub inne metody.
Uderzającym przykładem precypitogenów są lizaty, a także ekstrakty tkanek i narządów, surowica krwi, różnego rodzaju filtraty na bazie kultur bulionowych drobnoustrojów, a także solne ekstrakty mikroorganizmów i substancje autolizatowe.

Inscenizacja opadów

Rozważmy teraz metodę ustawiania reakcji strącania.
Przeprowadzana jest reakcja wytrącania pierścieniowego, która zachodzi w specjalnie przygotowanych probówkach. Serum wprowadza się do wnęki naczyń, wylewając ją na ścianę za pomocą dziobka do pipety. Następnie odpowiednią ilość precypitatu nakłada się ostrożnie na wierzch, a następnie rurkę przestawia się z poziomej do pozycji pionowej. Ustawienie i uwzględnienie reakcji strącania jest operacją bardzo drobiazgową. Wynik jest rejestrowany po pojawieniu się białego pierścienia na granicy antygenu i przeciwciała. Jeśli reagujące elementy reakcji odpowiadają sobie nawzajem, to są one połączone, ale staje się to zauważalne po długim czasie ich interakcji.
Reakcję wytrącania prowadzi się również na szalce Petriego lub na szkiełku, gdzie przenosi się żel agarowy, nakładając go w małej warstwie. Po stwardnieniu w żelu wycina się niewielką liczbę dołków, w których zostaną umieszczone antygeny i przeciwciała. Istnieją dwa sposoby wykonania tej czynności: metoda immunodyfuzji promieniowej i metoda podwójnej immunodyfuzji.

Informacje ogólne

Mechanika działania opadów jest zbliżona do działania urządzenia aglutynacyjnego. Pod wpływem surowicy typu immunologicznego antygen, który już zareagował, zmniejsza swój własny.Ważnym warunkiem jest przezroczystość zarówno surowicy, jak i antygenu.
Możliwa jest poprawa rejestracji reakcji, jeśli antygeny nakładają się na przeciwciała. W rezultacie można zaobserwować pojawienie się osadów w postaci pierścienia. Zjawisko to nazywane jest wytrącaniem pierścieniowym i odbywa się w specjalnych rurkach o średnicy od 2,5 do 3,5 mm. Jednym z najbardziej rozpowszechnionych przykładów reakcji strącania jest diagnoza wąglika.
Opady pozwalają określić poziom toksygenności hodowli błonicy w agarze.
W trakcie rozważanej reakcji wytrącają się kompleksy antygenowe i przeciwciała. Opady to zjawisko immunologiczne, które pozwala określić ilość przeciwciał w surowicy krwi osoby chorej lub zaszczepionej oraz zwierząt.

Konsekwencja miareczkowania

Ważne jest, aby wiedzieć, że dane uzyskane przez miareczkowanie wyżej wymienioną metodą nie są mierzalne. Aby stworzyć i przeanalizować ilościową ocenę zawartej liczby przeciwciał, M. Heidelberger i E. Kabat opracowali specjalną technikę reakcji, która opiera się na poszukiwaniu i identyfikacji strefy równoważności. Mieszanie liczby wiekowej antygenów ze stałą objętością surowicy odpornościowej prowadzi do wzrostu początkowo utworzonego osadu, a następnie ponownie zmniejsza się ze względu na wzrost zdolności do rozpuszczania kompleksów antygenowych. Określając ilość przeciwciał w supernatantach zawartych w każdej probówce, można stwierdzić, że w określonej liczbie naczyń z przeciwciałami będzie brakować płynu. Tutaj, w porównaniu z innymi probówkami, powstanie największy osad. Dzięki temu i odjęciu osadu białka antygenowego od całkowitej wartości białek możliwe jest uzyskanie dokładnej wartości przeciwciał zawartych w objętości specyficznie badanej surowicy. Ponadto ilość cząsteczek białka w osadzie jest określana przez ilość azotu lub metodami kolorymetrycznymi.

Szacowanie wartości

Ocena wartości wytrąceń w metodologii diagnostycznej powinna uwzględniać możliwość obecności w surowicy odpornościowej przeciwciała nie posiadającego właściwości precypityny, z czego wynika, że ​​sam osad nie może powstać po reakcji z antygeny. Lista takich cząsteczek obejmuje niekompletne przeciwciała oraz niektóre gatunki z grupy globulin gamma-A.

Reakcja strącania w warunkach laboratoryjnych znajduje zastosowanie w różnego rodzaju modyfikacjach. Na przykład reakcja termoprecypitacji służy do wykrywania bakteryjnych antygenów zatrucia jadem kiełbasianym, wąglika itp., które nie ulegają denaturacji termicznej. W przeciwieństwie do strącania pierścieniowego, ten typ reakcji wykorzystuje filtraty danego materiału w stanie gotowanym.
strącanie w złożonej mieszaninie nie pozwala na scharakteryzowanie właściwości poszczególnych składników mieszaniny. W takich przypadkach osoba ucieka się do metody precypitacji w agarze, a także stosuje immunoelektroferezę.

Rozproszone opady

W tej dziedzinie badań istnieje koncepcja reakcji strącania rozproszonego (RPD). Opiera się na zdolności do dyfuzji w żelu przeciwciał i rozpuszczalnych antygenów. Dyfuzja to zdolność cząsteczki pewnej substancji do wnikania w cząsteczki innej, co jest spowodowane ruchem termicznym.
Żel jest układem typu rozproszonego, w którym faza ciekła jest równomiernie rozprowadzona w fazie stałej. Najczęściej do takiej reakcji stosuje się żel agarowy.
Po podaniu parametrów, pod jakimi cząsteczki mogą dyfundować względem siebie, ich spotkaniu będzie towarzyszyć powstanie kompleksu antygen + przeciwciało. Taki nowotwór jest w stanie dyfundować, będąc w samym żelu, i wytrąca się, przybierając postać paska, który można wykryć gołym okiem. Jeśli antygen i przeciwciało są homologiczne, nie utworzy się prążek.
Stworzenie warunków, w których będzie miała miejsce dyfuzja w warstwie agaru, polega na wypełnieniu składników, ale całkowita liczba dołków i ich względne położenie jest określone przez rodzaj problemu, który należy rozwiązać. RPD umożliwia osobie wykrywanie i identyfikację nieznanych izolowanych wirusów poprzez testowanie przy użyciu znanych surowic przeciwciał.

Aplikacja

Opady mają szerokie zastosowanie nie tylko w diagnostyce chorób, ale również znajdują zastosowanie w kryminalistyce. Trudno sobie wyobrazić analizę, w której można by określić gatunek krwi, fragmentu organu lub tkanki znalezionej na broni kryminalnej, która nie wykorzystuje reakcji strącania. Podczas tego procesu wykorzystywane są strącające surowice, które uzyskuje się poprzez immunizację różnych zwierząt i ptaków. Ważne jest, aby poziom miana w surowicy nie był niższy niż 1:10000, a także musi mieć wystarczającą swoistość. Z wykrytej plamki krwi lub jej skorupy sporządza się ekstrakt do celów fizycznych. roztwór, który będzie dalej wystawiony na wytrącające się serum. Zgodnie z tą reakcją możliwe jest ustalenie rodzajów białek tkankowych i narządowych zarówno ludzi, jak i zwierząt. Uzyskanie mętnych ekstraktów zmusza do uciekania się do strącania na agarze.

wnioski

Analizując odczytane informacje, możemy stwierdzić, że reakcje wytrącania są niezwykle ważne dla osoby, ponieważ umożliwiają diagnozowanie różnych antygenów za pomocą przeciwciał, zjawisko to jest również szeroko stosowane w kryminalistycznym badaniu lekarskim i pozwala zidentyfikować rodzaj krwi, tkanki lub narządu w odniesieniu do konkretnego tematu. Istnieje kilka rodzajów i metod opadów atmosferycznych, które stosuje się zgodnie z pojawiającymi się potrzebami rozwiązywanego problemu.

Reakcja strącania (RP) to tworzenie i strącanie kompleksu rozpuszczalnego antygenu molekularnego z przeciwciałami w postaci chmury zwanej osadem. Powstaje przez zmieszanie antygenów i przeciwciał w równoważnych ilościach; nadmiar jednego z nich obniża poziom tworzenia kompleksu immunologicznego.

RP umieszcza się w probówkach (reakcja precypitacji pierścieniowej), w żelach, pożywkach itp. Powszechnie stosuje się odmiany RP w półpłynnym agarze lub żelu agarozowym: podwójna immunodyfuzja Ouchterlony'ego, immunodyfuzja promieniowa, immunoelektroforeza itp.

Mechanizm. Przeprowadza się ją za pomocą przezroczystych koloidalnych, rozpuszczalnych antygenów wyekstrahowanych z materiału patologicznego, obiektów środowiskowych lub czystych kultur bakteryjnych. W reakcji wykorzystuje się przezroczyste wytrącające surowice diagnostyczne o wysokich mianach przeciwciał. Za miano wytrącającej się surowicy przyjmuje się najwyższe rozcieńczenie antygenu, które w interakcji z surowicą immunologiczną powoduje powstanie widocznego osadu - zmętnienia.

Reakcję wytrącania pierścieniowego umieszcza się w wąskich probówkach (średnica 0,5 cm), do których dodaje się 0,2-0,3 ml wytrącającej się surowicy. Następnie za pomocą pipety Pasteura powoli nakłada się warstwy 0,1-0,2 ml roztworu antygenu. Probówki ostrożnie przenosi się do „pozycji pionowej. Reakcja jest rejestrowana po 1-2 minutach. W przypadku reakcji dodatniej pojawia się osad w postaci białego pierścienia na granicy między surowicą a badanym antygenem W probówkach kontrolnych nie tworzy się osad.

15. Reakcja z udziałem dopełniacza: reakcja hemolizy, reakcja wiązania dopełniacza. Mechanizm, komponenty, zastosowanie.

Reakcja wiązania dopełniacza (RCC) polega na tym, że gdy antygeny i przeciwciała odpowiadają sobie nawzajem, tworzą kompleks immunologiczny, do którego dopełniacz (C) jest przyłączony przez fragment Fc przeciwciał, tj. wiązanie dopełniacza zachodzi przez antygen-przeciwciało złożony. Jeśli kompleks antygen-przeciwciało nie zostanie utworzony, dopełniacz pozostaje wolny.

Specyficznemu oddziaływaniu AG i AT towarzyszy adsorpcja (wiązanie) dopełniacza. Ponieważ proces wiązania dopełniacza nie pojawia się wizualnie, J. Bordet i O. Zhangu zaproponowali zastosowanie układu hemolitycznego (erytrocyty baranie + surowica hemolityczna) jako wskaźnika, który pokazuje, czy dopełniacz jest utrwalony

Kompleks AG-AT. Jeśli AG i AT odpowiadają sobie nawzajem, tj. utworzył się kompleks immunologiczny, wówczas dopełniacz wiąże się z tym kompleksem i nie dochodzi do hemolizy. Jeśli AT nie odpowiada AG, to kompleks nie powstaje, a dopełniacz, pozostając wolny, łączy się z drugim układem i powoduje hemolizę.

Składniki. Test wiązania dopełniacza (RCC) jest złożonym testem serologicznym. Do jego realizacji potrzebnych jest 5 składników, a mianowicie: AG, AT i dopełniacz (system pierwszy), erytrocyty owcze oraz surowica hemolityczna (system drugi).

Antygenem dla CSC mogą być kultury różnych zabitych mikroorganizmów, ich lizaty, składniki bakterii, patologicznie zmienione i normalne narządy, lipidy tkankowe, wirusy i materiały zawierające wirusy.

Jako uzupełnienie stosuje się świeżą lub suchą surowicę świnki morskiej.

Mechanizm. RSK przeprowadza się w dwóch fazach: I faza - inkubacja mieszaniny zawierającej trzy składniki antygen + przeciwciało + dopełniacz; II faza (wskaźnik) - wykrycie wolnego dopełniacza w mieszaninie poprzez dodanie do niej układu hemolitycznego składającego się z erytrocytów barana i surowicy hemolitycznej zawierającej przeciwciała przeciwko nim. W I fazie reakcji, podczas tworzenia się kompleksu antygen-przeciwciało, dochodzi do wiązania dopełniacza, a następnie w II fazie nie dochodzi do hemolizy erytrocytów uczulonych przez przeciwciała; reakcja jest pozytywna. Jeśli antygen i przeciwciało nie pasują do siebie (w badanej próbce nie ma antygenu ani przeciwciała), dopełniacz pozostaje wolny i w II fazie dołączy do kompleksu erytrocyty-przeciwciała antyerytrocytowe, powodując hemolizę; reakcja jest negatywna Zastosowanie. RSK służy do diagnozowania wielu chorób zakaźnych, w szczególności kiły (reakcja Wassermana)

reakcje immunodiagnostyczne. Reakcje antygen-przeciwciało i reakcje ze znakowanymi składnikami. Służy do identyfikacji drobnoustrojów i diagnozy chorób zakaźnych.

Reakcje immunologiczne są wykorzystywane w badaniach diagnostycznych i immunologicznych u osób chorych i zdrowych. W tym celu zastosuj metody serologiczne(od łac. serum - surowica i logo - doktrynę), tj. metody badania przeciwciał i antygenów przy użyciu reakcji antygen-przeciwciało określonych w surowicy krwi i innych płynach, a także tkankach ciała.

Wykrycie przeciwciał przeciwko antygenom patogenu w surowicy krwi pacjenta umożliwia zdiagnozowanie choroby. Badania serologiczne są również wykorzystywane do identyfikacji antygenów drobnoustrojów, różnych substancji biologicznie czynnych, grup krwi, antygenów tkankowych i nowotworowych, kompleksów immunologicznych, receptorów komórkowych itp.

Po wyizolowaniu drobnoustroju od pacjenta patogen jest identyfikowany poprzez badanie jego właściwości antygenowych przy użyciu immunologicznych surowic diagnostycznych, tj. surowic krwi z hiperimmunizowanych zwierząt zawierających specyficzne przeciwciała. To tak zwane identyfikacja serologiczna mikroorganizmy.

W mikrobiologii i immunologii szeroko stosowane są aglutynacja, precypitacja, reakcje neutralizacji, reakcje z udziałem dopełniacza, przy użyciu znakowanych przeciwciał i antygenów (metody radioimmunologiczne, immunoenzymatyczne, immunofluorescencyjne). Wymienione reakcje różnią się rejestrowanym efektem i techniką wiązania, jednak wszystkie mają charakter podstawowy. furgonetki na reakcję interakcji antygenu z przeciwciałem i służą do wykrywania zarówno przeciwciał, jak i antygenów. Reakcje odpornościowe charakteryzują się wysoką czułością i swoistością.

Zasady i schematy głównych reakcji immunodiagnostycznych podano poniżej. Szczegółową technikę ustawiania reakcji podano w. praktyczne wskazówki dotyczące immunodiagnostyki.

Reakcja aglutynacji - RA(od łac. aglucja- naród- wiązanie) - prosta reakcja, w której przeciwciała wiążą antygeny korpuskularne (bakterie, erytrocyty lub inne komórki, nierozpuszczalne cząstki z zaadsorbowanymi na nich antygenami, a także agregaty wielkocząsteczkowe). Występuje w obecności elektrolitów, na przykład po dodaniu izotonicznego roztworu chlorku sodu.

Stosowane są różne warianty reakcji aglutynacji: ekspandowana, przybliżona, pośrednia itp. Reakcja aglutynacji objawia się tworzeniem płatków lub osadu

RA służy do:

oznaczanie przeciwciał w surowicy krwi pacjentów, na przykład z brucelozą (reakcja Wrighta, Heddelsona), tyfusem i gorączką paratyfusową (reakcja Vidala) i innymi chorobami zakaźnymi;

określenie patogenu izolowanego od pacjenta;

oznaczanie grup krwi przy użyciu przeciwciał monoklonalnych przeciwko allogenom erytrocytów.

Aby określić przeciwciała pacjenta położyćprzedłużona reakcja aglutynacji: dodać do rozcieńczeń surowicy krwi pacjenta diagnostyka(zawiesina zabitych drobnoustrojów) i po kilku godzinach inkubacji w 37°C odnotowuje się najwyższe rozcieńczenie surowicy (miano surowicy), przy którym wystąpiła aglutynacja, tj. utworzył się osad.

Charakter i szybkość aglutynacji zależą od rodzaju antygenu i przeciwciał. Przykładem jest interakcja diagnostycznych (antygenów O i R) ze specyficznymi przeciwciałami. Reakcja aglutynacji z O-diagnostyka(bakterie zabite ciepłem, zachowujące termostabilność) Antygen O) występuje w postaci drobnoziarnistej aglutynacji. Reakcja aglutynacji z H-diagnosticum (bakterie zabite przez formalinę, zachowujące termolabilny wiciowy antygen H) jest gruboziarnista i przebiega szybciej.

Jeśli konieczne jest określenie patogenu izolowanego od pacjenta, umieść orientowanie reakcji aglutynacji, przy użyciu przeciwciał diagnostycznych (surowica aglutynująca), tj. przeprowadza się serotypowanie patogenu. Przybliżoną reakcję przeprowadza się na szklanym szkiełku. Do kropli diagnostycznej surowicy aglutynującej w rozcieńczeniu 1:10 lub 1:20 dodać czystą hodowlę patogenu wyizolowanego od pacjenta. W pobliżu umieszcza się kontrolę: zamiast surowicy nanosi się kroplę roztworu chlorku sodu. Kiedy w kropli pojawi się kłaczkowaty osad z surowicą i drobnoustrojami, kładą rozległa reakcja aglutynacji w probówkach ze wzrastającymi rozcieńczeniami surowicy aglutynującej, do której dodaje się 2-3 krople zawiesiny patogenu. Aglutynację uwzględnia ilość osadu i stopień klarowania cieczy. Reakcję uznaje się za pozytywną, jeśli aglutynację obserwuje się w rozcieńczeniu zbliżonym do miana surowicy diagnostycznej. Jednocześnie brane są pod uwagę kontrole: surowica rozcieńczona izotonicznym roztworem chlorku sodu powinna być przezroczysta, zawiesina drobnoustrojów w tym samym roztworze powinna być jednolicie mętna, bez osadu.

Różne spokrewnione bakterie mogą ulegać aglutynacji przez tę samą diagnostyczną surowicę aglutynującą, co utrudnia ich identyfikację. Dlatego ciesz się adsorbowane surowice aglutynujące, z których usunięto krzyżowo reagujące przeciwciała przez adsorpcję przez pokrewne im bakterie. W takich surowicach pozostają przeciwciała specyficzne tylko dla tej bakterii. Przygotowanie w ten sposób monoreceptorowych surowic diagnostycznych aglutynujących zaproponował A. Castellani (1902).

Reakcja pośredniej (biernej) hemaglutynacji (RNHA, RPGA) opiera się na wykorzystaniu erytrocytów z antygenami lub przeciwciałami zaadsorbowanymi na powierzchni, których oddziaływanie z odpowiednimi przeciwciałami lub antygenami surowicy krwi kuli powoduje sklejanie się erytrocytów i opadanie na dno probówka lub cela w forma skallopowanego osadu (ryc. 13.2). Przy negatywnej reakcji erytrocyty osadzają się w postaci „guzika”. Zazwyczaj przeciwciała są wykrywane w RNHA za pomocą antygenowej diagnostyki erytrocytów, czyli erytrocytów z zaadsorbowanymi na je antygeny. Czasami stosujemy diagnostykę erytrocytów przeciwciał, na których adsorbowane są przeciwciała. Na przykład toksynę botulinową można wykryć, dodając do niej przeciwciało botulinum diagnosticum erytrocytów (ta reakcja nazywa się odwrotna reakcja hemaglutynacji pośredniej- RONGA). RNHA służy do diagnozowania chorób zakaźnych, oznaczania hormonu gonadotropowego w mocz po ustaleniu ciąży, w celu wykrycia nadwrażliwości na leki, hormony oraz w niektórych innych przypadkach.

Reakcja koagulacji . Komórki patogenne są określane przy użyciu gronkowców, wstępnie potraktowanych immunologiczną surowicą diagnostyczną. Białko zawierające gronkowce ALE, mieć powinowactwo do Fc -fragment immunoglobulin, niespecyficznie adsorbują przeciwciała przeciwdrobnoustrojowe, które następnie oddziałują z aktywnymi ośrodkami z odpowiednimi drobnoustrojami izolowanymi od pacjentów. W wyniku koagulacji powstają płatki składające się z gronkowców, diagnostycznych przeciwciał surowicy i oznaczanego drobnoustroju.

Reakcja hamowania hemaglutynacji (RTGA) opiera się na blokadzie, supresji antygenów wirusów przez przeciwciała surowicy odpornościowej, w wyniku czego wirusy tracą zdolność do aglutynacji czerwonych krwinek (ryc. 13.3). RTHA służy do diagnozowania wielu chorób wirusowych, których czynniki sprawcze (grypa, odra, różyczka, kleszczowe zapalenie mózgu itp.) mogą powodować aglutynację erytrocytów różnych zwierząt.

Reakcja aglutynacji w celu określenia grup krwi stosowany do ustalenia układu ABO (patrz rozdział 10.1.4.1) za pomocą aglutynacji erytrocytów z przeciwciałami surowicy odpornościowej przeciwko antygenom grup krwi A (II), B (III). Kontrole to: surowica bez przeciwciał, tj. surowica AB (GU) grupy krwi; antygeny zawarte w erytrocytach grup A (II), B (III). Kontrola negatywna nie zawiera antygenów, tj. stosuje się erytrocyty grupy 0 (I).

W reakcje aglutynacji w celu określenia czynnika Rh(patrz rozdział 10.1.4.1) użyj surowic anty-Rh (przynajmniej dwie różne serie). W obecności antygenu Rh na błonie badanych erytrocytów dochodzi do aglutynacji tych komórek. Standardowe erytrocyty Rh-dodatnie i Rh-ujemne ze wszystkich grup krwi służą jako kontrole.

Reakcja aglutynacji do oznaczania przeciwciał anty-Rhesus (pośrednia reakcja Coombsa)stosowany u pacjentów z hemolizą wewnątrznaczyniową. U niektórych z tych pacjentów wykrywane są przeciwciała anty-Rhesus, które są niekompletne, monowalentne. Oddziałują specyficznie z erytrocytami Rh-dodatnimi, ale nie powodują ich aglutynacji. Obecność takich niekompletnych przeciwciał określa się w pośredniej reakcji Coombsa. W tym celu do układu przeciwciał anty-Rh + erytrocytów Rh-dodatnich dodaje się surowicę antyglobulinową (przeciwciała przeciwko ludzkim immunoglobulinom), co powoduje aglutynację erytrocytów (ryc. 13.4). Za pomocą reakcji Coombsa rozpoznaje się stany patologiczne związane z wewnątrznaczyniową lizą erytrocytów pochodzenia immunologicznego, na przykład chorobę hemolityczną noworodka: erytrocyty płodu Rh-dodatniego łączą się z niekompletnymi przeciwciałami przeciwko krążącemu we krwi czynnikowi Rh łożysko od matki Rh-ujemnej.

Reakcje opadowe

Reakcja wytrącania - RP (odłac. praeci-pito- osad), to tworzenie i wytrącanie kompleksu rozpuszczalnego antygenu molekularnego z przeciwciałami w postaci zmętnienia, zwanego Osad. Powstaje przez zmieszanie antygenów i przeciwciał w równoważnych ilościach; nadmiar jednego z nich obniża poziom tworzenia kompleksu immunologicznego.

Reakcje wytrącania umieszczone w probówkach (reakcja strącania pierścienia), w żelach, pożywkach itp. Odmiany reakcji strącania w półpłynnym żelu agarowym lub agarozowym są szeroko stosowane: podwójna immunodyfuzja według Ouchterlony'ego. promieniowa immunodyfuzja, immunoelektroforeza itd.

Reakcja strącania pierścienia . Reakcję prowadzi się w wąskich wytrącających probówkach z surowicą odpornościową, na którą nakłada się warstwę rozpuszczalnego antygenu. Przy optymalnym stosunku antygenu i przeciwciał na granicy tych dwóch roztworów tworzy się nieprzezroczysty pierścień precypitacyjny (ryc. 13.5). Nadmiar antygenu nie wpływa na wynik reakcji precypitacji pierścienia ze względu na stopniową dyfuzję odczynników do granicy cieczy. Jeśli gotowane i przefiltrowane wodne ekstrakty narządów lub tkanek są używane jako antygeny w reakcji strącania pierścienia, to taka reakcja nazywana jest reakcja termoprecypitacji-iii (reakcja Ascoliego, z wąglikiem /

Podwójna reakcja immunodyfuzji Oukhteruni . Aby zainicjować reakcję, roztopiony żel agarowy wylewa się cienką warstwą na szklaną płytkę, a po stwardnieniu wycina się w niej otwory o średnicy 2-3 mm. W tych studzienkach oddzielnie umieszcza się antygeny i surowice odpornościowe, które dyfundują do siebie. W miejscu spotkania w równoważnych proporcjach tworzą osad w postaci białego paska. W systemach wieloskładnikowych kilka linii osadu pojawia się między studzienkami z różnymi antygenami i przeciwciałami surowicy; dla identycznych antygenów linie precypitatu łączą się; dla nieidentycznych przecinają się (ryc. 13.6).

Promieniowa reakcja immunodyfuzji . Serum odpornościowe ze stopionym żelem agarowym równomiernie wylewa się na szkło. Po zestaleniu się w żelu wykonuje się dołki, w których umieszcza się antygen w różnych rozcieńczeniach. Antygen dyfundując do żelu tworzy pierścieniowe strefy precypitacji wokół studzienek z przeciwciałami (ryc. 13.7). Średnica pierścienia strącającego jest proporcjonalna do stężenia antygenu. Reakcja służy do określenia poziomu immunoglobulin różnych klas we krwi, składników układu dopełniacza itp.

Immunoelektroforeza- połączenie metody elektroforezy i immunoprecypitacji: mieszanina antygenów jest wprowadzana do studzienek żelu i rozdzielana w żelu za pomocą elektroforezy. Następnie równolegle do stref elektroforezy do rowka wprowadza się surowicę immunologiczną, której przeciwciała, dyfundując do żelu, tworzą się w miejscu spotkania z antygenem linii precypitacji.

reakcja flokulacji(według Ramona) (od łac. kłacz- płatki wełny) - pojawienie się opalescencji lub kłaczkowatej masy (immunoprecypitacja) w probówce podczas reakcji toksyna-antytoksyna lub anatoksyna-antytoksyna. Służy do określania aktywności antytoksycznej surowicy lub toksoidu.

Immunologiczna mikroskopia elektronowa- mikroskopia elektronowa drobnoustrojów, częściej wirusów, leczonych odpowiednimi przeciwciałami. Wirusy traktowane surowicą odpornościową tworzą agregaty immunologiczne (mikroprecypitaty). Wokół wirionów tworzy się „korona” przeciwciał, skontrastowana z kwasem fosforowolframowym lub innymi preparatami o dużej gęstości elektronowej.

Reakcje z udziałem dopełniacza

Reakcje z udziałem dopełniaczaw oparciu o aktywację dopełniacza przez kompleks antygen-przeciwciało (reakcja wiązania dopełniacza, hemoliza promieniowa itp.).

Reakcja wiązania dopełniacza (RSK) polega na tym, że odpowiadając sobie nawzajem, antygeny i przeciwciała tworzą kompleks immunologiczny, do którego poprzez Fc - fragment przeciwciała łączy się z dopełniaczem (C), tj. wiązanie dopełniacza zachodzi z kompleksem antygen-przeciwciało. Jeśli kompleks antygen-przeciwciało nie zostanie utworzony, dopełniacz pozostaje wolny (ryc. 13.8). RSK przeprowadza się w dwóch fazach: I faza - inkubacja mieszaniny zawierającej trzy składniki antygen + przeciwciało + dopełniacz; II faza (wskaźnik) - wykrycie wolnego dopełniacza w mieszaninie poprzez dodanie do niej układu hemolitycznego składającego się z erytrocytów barana i surowicy hemolitycznej zawierającej przeciwciała przeciwko nim. W I fazie reakcji, podczas tworzenia się kompleksu antygen-przeciwciało, dochodzi do wiązania dopełniacza, a następnie w II fazie nie dochodzi do hemolizy erytrocytów uczulonych przez przeciwciała; reakcja jest pozytywna. Jeżeli antygen i przeciwciało nie odpowiadają sobie nawzajem (w badanej próbce nie ma antygenu ani przeciwciała), dopełniacz pozostaje wolny i w II fazie połączy się z kompleksem erytrocyty-przeciwciało antyerytrocytowe, powodując hemolizę; reakcja jest negatywna.

RSK służy do diagnozowania wielu chorób zakaźnych, w szczególności kiły (reakcja Wassermana).

Reakcja hemolizy promieniowej (RRH ) umieszczone w dołkach żelu agarowego zawierającego erytrocyty barana i dopełniacz. Po dodaniu surowicy hemolitycznej (przeciwciał przeciwko erytrocytom barana) do studzienek żelu, wokół nich tworzy się strefa hemolizy (w wyniku promieniowej dyfuzji przeciwciał). W ten sposób można określić aktywność dopełniacza i surowicy hemolitycznej, a także przeciwciał w surowicy krwi pacjentów z grypą, różyczką, kleszczowym zapaleniem mózgu. Aby to zrobić, odpowiednie antygeny wirusa są adsorbowane na erytrocytach, a surowica krwi pacjenta jest dodawana do studzienek żelu zawierającego te erytrocyty. Przeciwciała przeciwwirusowe wchodzą w interakcję z antygenami wirusowymi zaadsorbowanymi na erytrocytach po

Składniki dopełniacza przyłączają się do tego kompleksu, powodując hemolizę.

Reakcja adhezji immunologicznej (RIP ) opiera się na aktywacji układu dopełniacza przez antygeny korpuskularne (bakterie, wirusy) potraktowane surowicą odpornościową. W rezultacie powstaje aktywowany trzeci składnik dopełniacza (C3b), który przyłącza się do antygenu korpuskularnego jako część kompleksu immunologicznego. Na erytrocytach, płytkach krwi, makrofagach znajdują się receptory dla C3b, dzięki czemu po zmieszaniu tych komórek z kompleksami immunologicznymi zawierającymi C3b łączą się i aglutynują.

Reakcja neutralizacji

Przeciwciała surowicy odpornościowej są w stanie neutralizować szkodliwe działanie drobnoustrojów lub ich toksyn na wrażliwe komórki i tkanki, co jest związane z blokowaniem antygenów drobnoustrojów przez przeciwciała, tj. ich neutralizacja. Reakcja neutralizacji(RN) przeprowadza się przez wprowadzenie mieszaniny antygen-przeciwciało zwierzętom lub wrażliwym obiektom testowym (hodowla komórkowa, zarodki). W przypadku braku szkodliwego działania mikroorganizmów lub ich antygenów, toksyn u zwierząt i obiektów testowych, mówią o neutralizującym działaniu surowicy odpornościowej, a zatem o specyficzności oddziaływania kompleksu antygen-przeciwciało (ryc. 13.9).

Reakcja immunofluorescencyjna - RIF (metoda Koonsa)

Istnieją trzy główne odmiany metody: bezpośrednia, pośrednia (ryc. 13.10), z dopełnieniem. Reakcja Koonsa to szybka metoda diagnostyczna do wykrywania antygenów drobnoustrojów lub wykrywania przeciwciał.

Bezpośrednia metoda RIF opiera się na fakcie, że antygeny tkankowe lub drobnoustroje traktowane surowicami odpornościowymi z przeciwciałami znakowanymi fluorochromami są w stanie świecić w promieniach UV mikroskopu fluorescencyjnego.

Bakterie w rozmazie, potraktowane takim luminescencyjnym serum, świecą wzdłuż obwodu komórek w postaci zielonej obwódki.

Pośrednia metoda RIF jest identyfikacja kompleksu antygen-przeciwciało przy użyciu surowicy antyglobulinowej (przeciwciałowej) znakowanej fluorochromem. W tym celu rozmazy z zawiesiny drobnoustrojów traktuje się przeciwciałami przeciwdrobnoustrojowej surowicy diagnostycznej królika. Następnie przeciwciała, które nie są związane z antygenami drobnoustrojów, są wypłukiwane, a przeciwciała pozostające na drobnoustrojach są wykrywane przez traktowanie rozmazu surowicą antyglobulinową (przeciwkróliczą) znakowaną fluorochromami. W rezultacie powstaje złożony drobnoustrój + królicze przeciwciała przeciwdrobnoustrojowe + przeciwciała przeciwkrólicze znakowane fluorochromem. Kompleks ten obserwuje się pod mikroskopem fluorescencyjnym, podobnie jak w metodzie bezpośredniej.

Metoda ELISA lub analiza (ELISA)

ELISA -wykrywanie antygenów przy użyciu odpowiadających im przeciwciał sprzężonych z enzymem znakującym (peroksydaza chrzanowa, beta-galaktozydaza lub fosfataza alkaliczna). Po połączeniu antygenu ze znakowaną enzymatycznie surowicą odpornościową, do mieszaniny dodaje się substrat/chromogen. Substrat jest rozszczepiany przez enzym, a kolor produktu reakcji zmienia się – intensywność koloru jest wprost proporcjonalna do liczby związanych cząsteczek antygenu i przeciwciała.

ELISA w fazie stałej - najczęstszy wariant testu immunologicznego, w którym jeden ze składników odpowiedzi immunologicznej (antygen lub przeciwciała) jest sorbowany na nośniku stałym, np. w studzienkach płytek styropianowych

Podczas oznaczania przeciwciał surowica krwi pacjenta, surowica antyglobulinowa wyznakowana enzymem i substrat (chromogen) dla enzymu są kolejno dodawane do dołków płytek z zaadsorbowanym antygenem.

Każdorazowo po dodaniu kolejnego składnika niezwiązane odczynniki są usuwane z dołków poprzez dokładne przemycie. Z wynikiem pozytywnym zmienia się kolor roztworu chromogenu. Nośnik fazy stałej można uczulić nie tylko antygenem, ale także przeciwciałami. Następnie żądany antygen wprowadza się do studzienek z zaadsorbowanymi przeciwciałami, dodaje się surowicę odpornościową przeciwko antygenowi znakowanemu enzymem, a następnie dodaje się substrat dla enzymu.

Konkurencyjny test ELISA . antygen docelowy i antygen znakowany enzymem współzawodniczą ze sobą o wiązanie ograniczonej ilości przeciwciał surowicy odpornościowej. Kolejnym testem są przeciwciała, których szukasz

a znakowane przeciwciała konkurują ze sobą o antygeny.

Metoda radioimmunologiczna lub analiza (RIA)

Bardzo czuła metoda oparta na reakcji antygen-przeciwciało przy użyciu antygenów lub przeciwciał znakowanych radionuklidem (125 J, 14 C, 3 H, 51 Cr, itd.). Po ich interakcji powstały radioaktywny kompleks immunologiczny jest oddzielany i jego radioaktywność oznaczana jest w odpowiednim liczniku (promieniowanie beta lub gamma):

intensywność promieniowania jest wprost proporcjonalna do liczby związanych cząsteczek antygenu i przeciwciała.

Na wersja półprzewodnikowa RIA jeden ze składników reakcji (antygen lub przeciwciała) jest adsorbowany na stałym nośniku, na przykład w studzienkach mikromacierzy polistyrenowych. Inną wersją metody jest konkurencyjne OSR. antygen docelowy i antygen znakowany radionuklidem współzawodniczą ze sobą o wiązanie ograniczonej ilości przeciwciał surowicy odpornościowej. Ta opcja służy do określenia ilości antygenu w materiale testowym.

RIA służy do wykrywania antygenów drobnoustrojów, oznaczania hormonów, enzymów, substancji leczniczych i immunoglobulin, a także innych substancji zawartych w badanym materiale w niewielkich stężeniach - 10 ~|0 -I0 ~ 12 g / l. Metoda przedstawia pewne zagrożenie dla środowiska.

Immunoblotting

Immunoblotting (IB)- wysoce czuła metoda oparta na połączeniu elektroforezy i ELISA lub RIA.

Antygen izoluje się za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym, a następnie przenosi się (blotting - z języka angielskiego. plama, plamki) z żelu na aktywowany papier lub błonę nitrocelulozową i opracowane za pomocą testu ELISA. Firmy produkują takie paski z „plamami”

antygeny. Na te paski nakłada się surowicę pacjenta. Następnie, po inkubacji, pacjent jest wypłukiwany z niezwiązanych przeciwciał pacjenta i nakładana jest surowica przeciwko ludzkim immunoglobulinom wyznakowanym enzymem. Złożony antygen + przeciwciało pacjenta + przeciwciało przeciwko ludzkim Ig utworzone na pasku wykrywa się przez dodanie substratu/chromogenu, który zmienia kolor pod wpływem enzymu (ryc. 13.12).

IB jest stosowany jako metoda diagnostyczna w przypadku zakażenia wirusem HIV itp.

13.1. Reakcje antygen-przeciwciało i ich zastosowania

Po wstrzyknięciu antygenu w organizmie powstają przeciwciała. Przeciwciała są komplementarne do antygenu, który spowodował ich syntezę i są w stanie się z nim wiązać. Wiązanie antygenów z przeciwciałami składa się z dwóch faz. Pierwsza faza jest swoista, w której następuje szybkie wiązanie determinanty antygenowej z aktywnym centrum fragmentu Fab przeciwciał. Należy zauważyć, że wiązanie jest wynikiem sił van der Waalsa, oddziaływań wodorowych i hydrofobowych. Siłę wiązania określa stopień przestrzennej zgodności między miejscem aktywnym przeciwciała a epitopem antygenu. Po określonej fazie zaczyna się faza wolniejsza - niespecyficzna, co objawia się widocznym zjawiskiem fizycznym (np. tworzenie się płatków podczas aglutynacji itp.).

Reakcje immunologiczne to interakcje między przeciwciałami a antygenami, a reakcje te są specyficzne i bardzo czułe. Są szeroko stosowane w praktyce medycznej. Za pomocą reakcji immunologicznych można rozwiązać następujące zadania:

Oznaczanie nieznanych przeciwciał za pomocą znanych antygenów (diagnostyka antygenowa). Takie zadanie jest wtedy, gdy konieczne jest określenie przeciwciał przeciwko patogenowi w surowicy krwi pacjenta (serodiagnoza). Znalezienie przeciwciał pozwala potwierdzić diagnozę;

Oznaczanie nieznanych antygenów za pomocą znanych przeciwciał (surowica diagnostyczna). Badanie to przeprowadza się podczas identyfikacji kultury patogenu wyizolowanego z materiału pacjenta (serotypowanie), a także podczas wykrywania

antygeny drobnoustrojów i ich toksyny we krwi i innych płynach biologicznych. Istnieje wiele rodzajów reakcji immunologicznych, różniących się techniką ustawienia i rejestrowanym efektem. Są to reakcje aglutynacji (RA), precypitacja (RP), reakcje z udziałem dopełniacza (RCC), reakcje z wykorzystaniem znakowanych składników (RIF, ELISA, RIA).

13.2. Reakcja aglutynacji

Reakcja aglutynacji (RA) jest reakcją immunologiczną interakcji antygenu z przeciwciałami w obecności elektrolitów, a antygen jest w stanie korpuskularnym (erytrocyty, bakterie, cząsteczki lateksu z zaadsorbowanymi antygenami). Podczas aglutynacji antygeny korpuskularne są sklejane przez przeciwciała, co objawia się tworzeniem kłaczkowatego osadu. Tworzenie płatków następuje dzięki temu, że przeciwciała mają dwa aktywne centra, a antygeny są wielowartościowe, tj. mają wiele determinant antygenowych. RA służy do identyfikacji patogenu wyizolowanego z materiału pacjenta, a także do wykrycia przeciwciał przeciwko patogenowi w surowicy krwi pacjenta (na przykład reakcje Wrighta i Huddlesona w brucelozie, reakcja Vidala w tyfusie i gorączce paratyfusowej ).

Najłatwiejszym sposobem wywołania RZS jest reakcja na szkle, jest to przybliżone RZS, które służy do określenia patogenu izolowanego od pacjenta. Podczas ustawiania reakcji na szkiełku podstawowym nakładana jest diagnostyczna surowica aglutynująca (w rozcieńczeniu 1:10 lub 1:20), a następnie wprowadzana jest posiew od pacjenta. Reakcja jest pozytywna, jeśli w kropli pojawi się kłaczkowaty osad. W pobliżu umieszcza się kontrolę: zamiast surowicy nanosi się kroplę roztworu chlorku sodu. Jeśli diagnostyczna surowica aglutynująca jest nieadsorbowana 1, to jest rozcieńczana (do miana - rozcieńczenia, do którego powinna nastąpić aglutynacja), tj. umieścić ekspandowany RA w probówkach ze wzrostem

1 Nieadsorbowana surowica aglutynująca może aglutynować spokrewnione bakterie, które mają wspólne (reagujące krzyżowo) antygeny. Dlatego ciesz sięadsorbowane surowice aglutynujące, z których usunięto krzyżowo reagujące przeciwciała przez adsorpcję przez pokrewne im bakterie. W takich surowicach pozostają przeciwciała specyficzne tylko dla tej bakterii.

rozcieńczenia surowicy aglutynującej, do których dodaje się 2-3 krople zawiesiny patogenu izolowanego od pacjenta. Aglutynację uwzględnia się na podstawie ilości osadu i stopnia klarowania cieczy w probówkach. Reakcję uznaje się za pozytywną, jeśli aglutynację obserwuje się w rozcieńczeniu zbliżonym do miana surowicy diagnostycznej. Reakcji towarzyszą kontrole: surowica rozcieńczona izotonicznym roztworem chlorku sodu powinna być przezroczysta, zawiesina drobnoustrojów w tym samym roztworze powinna być jednolicie mętna, bez osadu.

Aby określić przeciwciała przeciwko patogenowi w surowicy krwi pacjenta, stosuje się rozszerzone RA. Po umieszczeniu w probówkach surowica krwi pacjenta jest rozcieńczana i do probówek dodawana jest równa ilość zawiesiny diagnostycznej (zawiesina zabitych drobnoustrojów). Po inkubacji określa się najwyższe rozcieńczenie surowicy, przy którym wystąpiła aglutynacja, tj. wytrącił się osad (miano surowicy). W tym przypadku reakcja aglutynacji z O-diagnosticum (bakterie zabite przez ogrzewanie, zachowujące termostabilny antygen O) zachodzi w postaci drobnoziarnistej aglutynacji. Reakcja aglutynacji z H-diagnosticum (bakterie zabite przez formalinę, zachowujące termolabilny wiciowy antygen H) jest gruboziarnista i przebiega szybciej.

Reakcja pośredniej (biernej) hemaglutynacji(RNGA lub RPGA) to rodzaj RZS. Ta metoda jest bardzo czuła. Za pomocą RNGA można rozwiązać dwa zadania: określić przeciwciała w surowicy krwi pacjenta, do których dodaje się antygenową diagnostykę erytrocytów, czyli erytrocyty, na których adsorbowane są znane antygeny; określić obecność antygenów w badanym materiale. W tym przypadku reakcja jest czasami nazywana odwrotną reakcją hemaglutynacji pośredniej (RONGA). Podczas określania stopnia zaawansowania do badanego materiału dodaje się erytrocyty diagnostyczne przeciwciała (erytrocyty z przeciwciałami zaadsorbowanymi na ich powierzchni). Erytrocyty w tej reakcji działają jako nośniki i są biernie zaangażowane w tworzenie agregatów immunologicznych. Przy pozytywnej reakcji biernie sklejone erytrocyty pokrywają dno studni równą warstwą o ząbkowanych krawędziach („parasol”); w przypadku braku aglutynacji erytrocyty gromadzą się w centralnym zagłębieniu otworu, tworząc zwarty „guzik” z ostro określonymi krawędziami.

Reakcja koagulacji służy do wykrywania komórek patogenów (antygenów) za pomocą przeciwciał zaadsorbowanych na Staphylococcus aureus, zawierające białko A. Białko A wykazuje powinowactwo do fragmentu Fc immunoglobulin. Z tego powodu przeciwciała wiążą się ze gronkowcem pośrednio przez fragment Fc, a fragmenty Fab są skierowane na zewnątrz i są zdolne do interakcji z odpowiednimi drobnoustrojami izolowanymi od pacjentów. W takim przypadku powstają płatki.

Reakcja hamowania hemaglutynacji (HITA) stosowany w diagnostyce infekcji wirusowych i tylko infekcji wywołanych przez wirusy hemaglutynujące. Wirusy te zawierają na swojej powierzchni białko - hemaglutyninę, które po dodaniu do wirusów erytrocytów jest odpowiedzialne za reakcję hemaglutynacji (RHA). RTGA polega na blokowaniu antygenów wirusowych przeciwciałami, w wyniku czego wirusy tracą zdolność do aglutynacji czerwonych krwinek.

reakcja Coombsa - RA do wykrywania niekompletnych przeciwciał. W niektórych chorobach zakaźnych, takich jak bruceloza, w surowicy krwi pacjenta krążą niekompletne przeciwciała przeciwko patogenowi. Niekompletne przeciwciała nazywane są blokującymi, ponieważ mają jedno miejsce wiązania antygenu, a nie dwa, jak pełne przeciwciała. Dlatego po dodaniu diagnostyki antygenowej niekompletne przeciwciała wiążą się z antygenami, ale nie sklejają ich ze sobą. Aby zamanifestować reakcję, dodaje się surowicę antyglobulinową (przeciwciała przeciwko ludzkim immunoglobulinom), co prowadzi do aglutynacji kompleksów immunologicznych (diagnostyka antygenowa + przeciwciała niekompletne) powstałych w pierwszym etapie reakcji.

Pośrednią reakcję Coombsa stosuje się u pacjentów z hemolizą wewnątrznaczyniową. U niektórych z tych pacjentów stwierdza się niekompletne monowalentne przeciwciała anty-Rhesus. Oddziałują specyficznie z erytrocytami Rh-dodatnimi, ale nie powodują ich aglutynacji. Dlatego do układu przeciwciał anty-Rh + erytrocytów Rh-dodatnich dodaje się surowicę antyglobulinową, co powoduje aglutynację erytrocytów. Za pomocą reakcji Coombsa diagnozuje się stany patologiczne związane z wewnątrznaczyniową lizą erytrocytów pochodzenia immunologicznego, na przykład chorobę hemolityczną noworodka spowodowaną konfliktem Rh.

RA do oznaczania grup krwi opiera się na aglutynacji erytrocytów przez przeciwciała surowicy odpornościowej do antygenów grup krwi A (II), B (III). Kontrolą jest surowica niezawierająca przeciwciał tj. grupy krwi AB (IV) surowicy oraz antygeny erytrocytów z grup A (P) i B (III). Erytrocyty grupy 0(I) stosuje się jako kontrolę negatywną, ponieważ nie zawierają antygenów.

Do określenia czynnika Rh stosuje się surowice anty-Rh (co najmniej dwie różne serie). W obecności antygenu Rh na błonie badanych erytrocytów dochodzi do aglutynacji tych komórek.

13.3. Reakcja wytrącania

RP to reakcja immunologiczna oddziaływania przeciwciał z antygenami w obecności elektrolitów, a antygen jest w stanie rozpuszczalnym. Podczas precypitacji rozpuszczalne antygeny są wytrącane przez przeciwciała, co objawia się zmętnieniem w postaci prążków precypitacyjnych. Tworzenie widocznego osadu obserwuje się, gdy oba odczynniki miesza się w równoważnych stosunkach. Nadmiar jednego z nich zmniejsza ilość wytrącanych kompleksów immunologicznych. Istnieje wiele sposobów na skonfigurowanie reakcji strącania.

Reakcja strącania pierścienia umieszczone w rurkach strącających o małej średnicy. Surowica immunologiczna jest dodawana do probówki i rozpuszczalny antygen jest starannie nakładany warstwami. Z wynikiem pozytywnym na granicy dwóch roztworów tworzy się mleczny pierścień. Reakcja precypitacji pierścieniowej, która określa obecność antygenów w narządach i tkankach, których ekstrakty są gotowane i filtrowane, nazywana jest reakcją termoprecypitacji (reakcja Ascoli w celu określenia termostabilnego antygenu wąglika).

Podwójna reakcja immunodyfuzji Ouchterlony'ego. Ta reakcja jest przeprowadzana na żelu agarowym. Dołki są wycinane w warstwie żelu o jednolitej grubości w pewnej odległości od siebie i wypełnione odpowiednio antygenem i surowicą odpornościową. Następnie antygeny i przeciwciała dyfundują do żelu, spotykają się i tworzą kompleksy immunologiczne, które wytrącają się w żelu i stają się widoczne jako linie precypitacji.

odżywianie. Reakcja ta może być wykorzystana do identyfikacji nieznanych antygenów lub przeciwciał, a także do sprawdzenia podobieństwa między różnymi antygenami: jeśli antygeny są identyczne, linie precypitacji łączą się; jeżeli antygeny nie są identyczne, linie precypitacji przecinają się; jeżeli antygeny są częściowo identyczny, powstaje ostroga.

Promieniowa reakcja immunodyfuzji. Do stopionego żelu agarowego dodaje się przeciwciała, a żel nakłada się równą warstwą na szkiełko. W żelu wycina się studzienki i wprowadza się do nich standardową objętość roztworów antygenu o różnych stężeniach. Podczas inkubacji antygeny dyfundują promieniście ze studzienki i po napotkaniu przeciwciał tworzą pierścień strącający. Dopóki w studzience znajduje się nadmiar antygenu, średnica pierścienia strącającego stopniowo się zwiększa. Ta metoda służy do oznaczania antygenów lub przeciwciał w roztworze testowym (na przykład do określenia stężenia immunoglobulin różnych klas w surowicy krwi).

Immunoelektroforeza. Mieszanina antygenów jest wstępnie rozdzielana przez elektroforezę, następnie wytrącająca się antysurowica jest wprowadzana do rowka biegnącego wzdłuż kierunku ruchu białka. Antygeny i przeciwciała dyfundują do żelu ku sobie; oddziałując, tworzą łukowate linie opadów.

reakcja flokulacji(według Ramona) - rodzaj reakcji strącania, która służy do określenia aktywności antytoksycznej surowicy lub toksoidu. Reakcja jest przeprowadzana w probówkach. W probówce, w której toksoid i antytoksyna są w równoważnym stosunku, obserwuje się zmętnienie.

13.4. Reakcja wiązania dopełniacza

Przeciwciała, oddziałując z odpowiednim antygenem, wiążą dodany dopełniacz (pierwszy układ). Wskaźnikiem wiązania dopełniacza są erytrocyty uczulone surowicą hemolityczną, tj. przeciwciała przeciwko erytrocytom (drugi system). Jeżeli dopełnienie nie jest ustalone w 1. systemie, tj. reakcja antygen-przeciwciało nie występuje, wtedy uczulone krwinki czerwone ulegają całkowitej lizie (reakcja negatywna). Gdy dopełniacz jest związany kompleksami immunologicznymi pierwszego układu, po dodaniu uczulonych erytrocytów hemoliza

nieobecny (reakcja pozytywna). Reakcja wiązania dopełniacza służy do diagnozowania chorób zakaźnych (rzeżączka, kiła, grypa itp.).

13.5. Reakcja neutralizacji

Mikroby i ich toksyny mają szkodliwy wpływ na narządy i tkanki ludzkiego ciała. Przeciwciała są w stanie wiązać się z tymi szkodliwymi czynnikami i blokować je, tj. zneutralizować. Diagnostyczna reakcja neutralizacji opiera się na tej właściwości przeciwciał. Przeprowadza się ją przez wprowadzenie mieszaniny antygen-przeciwciało zwierzętom lub wrażliwym obiektom testowym (hodowla komórkowa, zarodki). Na przykład, aby wykryć toksyny w materiale pacjenta, zwierzętom z pierwszej grupy wstrzykuje się materiał pacjenta. Zwierzętom z drugiej grupy wstrzykuje się podobny materiał, wstępnie potraktowany odpowiednią antysurowicą. Zwierzęta z I grupy giną w obecności toksyny w materiale. Druga grupa zwierząt przeżywa, szkodliwe działanie toksyny nie objawia się, ponieważ jest zneutralizowane.

13.6. Reakcje z użyciem znakowanych przeciwciał lub antygenów

13.6.1. Reakcja immunofluorescencyjna (RIF, metoda Koonsa)

Ta metoda służy do ekspresowej diagnostyki. Może wykrywać zarówno antygeny drobnoustrojów, jak i przeciwciała.

Bezpośrednia metoda RIF- reakcja immunologiczna interakcji przeciwciał z antygenami, a przeciwciała są znakowane fluorochromem - substancją zdolną do emitowania kwantów światła o określonej długości fali po uderzeniu światłem o określonej długości fali. Osobliwością ustawienia tej metody jest konieczność usunięcia nieprzereagowanych składników w celu wykluczenia wykrycia nieswoistej luminescencji. Aby to zrobić, przeprowadź pranie nieprzereagowanych przeciwciał. Wyniki ocenia się za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Bakterie w rozmazie potraktowanym takim luminescencyjnym serum świecą na ciemnym tle wzdłuż obwodu komórki.

Pośrednia metoda RIF używany częściej niż poprzedni. Ta reakcja jest przeprowadzana w dwóch etapach. W pierwszym etapie antygeny wzajemnie się

wchodzą w interakcje z odpowiednimi przeciwciałami, tworząc kompleksy immunologiczne. Wszystkie składniki, które nie przereagowały (tzn. nie wchodzą w skład kompleksów immunologicznych) należy usunąć przez mycie. W drugim etapie utworzony kompleks antygen-przeciwciało wykrywa się za pomocą surowicy antyglobulinowej fluorochromu. W rezultacie powstaje złożony drobnoustrój + królicze przeciwciała przeciwdrobnoustrojowe + przeciwciała przeciwko króliczym immunoglobulinom znakowanym fluorochromem. Wyniki ocenia się za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

13.6.2. Test immunologiczny lub test

ELISA jest najpowszechniejszą nowoczesną metodą stosowaną do diagnozowania infekcji wirusowych, bakteryjnych, pierwotniakowych, w szczególności do diagnozowania infekcji wirusem HIV, wirusowym zapaleniem wątroby itp.

Istnieje wiele modyfikacji ELISA. Powszechnie stosowany jest niekonkurencyjny test ELISA w fazie stałej. Przeprowadza się ją na 96-dołkowych płytkach polistyrenowych (faza stała). Podczas reakcji konieczne jest wypłukanie nieprzereagowanych składników na każdym etapie. Podczas oznaczania przeciwciał studzienki, na których adsorbowane są antygeny, wypełnia się badaną surowicą krwi, a następnie znakowaną enzymem surowicą antyglobulinową. Pokaż reakcję, dodając substrat dla enzymu. W obecności enzymu zmienia się substrat, a kompleks enzym-substrat dobiera się w taki sposób, aby powstały w reakcji produkt był zabarwiony. Tak więc przy pozytywnej reakcji obserwuje się zmianę koloru roztworu. W celu określenia antygenów nośnik w fazie stałej uczula się przeciwciałami, a następnie dodaje się kolejno materiał testowy (antygeny) i znakowaną enzymatycznie surowicę antygenową. W celu manifestacji reakcji wprowadza się substrat dla enzymu. Zmiana koloru roztworu następuje z reakcją pozytywną.

13.6.3. Immunoblotting

Ta metoda opiera się na połączeniu elektroforezy i testu ELISA. Podczas przeprowadzania immunoblottingu (blotting z języka angielskiego. plama- spot) złożona mieszanina antygenów jest najpierw poddawana elektroforezie w żelu poliakrylamidowym. Powstały frakcjonowany anty-

peptydy genowe są przenoszone na błonę nitrocelulozową. Bloty są następnie traktowane przeciwciałami znakowanymi enzymatycznie przeciwko specyficznemu antygenowi, tj. przeprowadzić ELISA blot. Immunoblotting stosuje się w diagnostyce infekcji, takich jak HIV.

13.6.4. Immunologiczna mikroskopia elektronowa

Metoda polega na mikroskopii w mikroskopie elektronowym wirusów (rzadko innych drobnoustrojów), uprzednio poddanych działaniu odpowiedniej surowicy odpornościowej znakowanej preparatami gęstymi elektronowo-optycznie, np. ferrytyną, białkiem zawierającym żelazo.

13.7. cytometrii przepływowej

Komórki krwi różnicuje się na podstawie cytofluorometrii laserowej. W tym celu pożądane komórki są barwione fluorescencyjnymi przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko antygenom CD. Próbka krwi po potraktowaniu znakowanymi przeciwciałami jest przepuszczana przez cienką rurkę, przez którą przepuszczana jest wiązka laserowa, która wzbudza luminescencję fluorochromu. Intensywność fluorescencji koreluje z gęstością antygenów na powierzchni komórki i można ją określić ilościowo za pomocą fotopowielacza. Otrzymane wyniki są przekształcane na histogram.

Cytometria przepływowa służy do określenia statusu immunologicznego (zawartość głównych populacji limfocytów, zawartość cytokin wewnątrzkomórkowych i zewnątrzkomórkowych, aktywność funkcjonalna komórek NK, aktywność fagocytozy itp.).

W postaci zmętnienia, zwanego osadem. Powstaje przez zmieszanie antygenów i przeciwciał w równoważnych ilościach; nadmiar jednego z nich obniża poziom tworzenia kompleksu immunologicznego. Reakcja precypitacji jest umieszczana w probówkach (reakcja precypitacji pierścieniowej), w żelach, pożywkach itp. Szeroko stosowane są odmiany reakcji precypitacji w półpłynnym żelu agarowym lub agarozowym: podwójna immunodyfuzja Ouchterlony'ego, immunodyfuzja promieniowa, immunoelektroforeza itp. .
Reakcja strącania pierścienia. Reakcja jest przeprowadzana w wąskich wytrącających probówkach: rozpuszczalny antygen nakłada się na surowicę immunologiczną. Przy optymalnym stosunku antygenu i przeciwciał na granicy tych dwóch roztworów tworzy się nieprzezroczysty pierścień precypitacyjny (ryc. 7.50). Jeśli w reakcji jako antygeny stosuje się gotowane i przefiltrowane ekstrakty tkankowe, to taka reakcja nazywana jest reakcją termoprecypitacji (reakcja Ascoli, w której wykrywa się hapten wąglika).

Ryż. 7.50.

Podwójna reakcja immunodyfuzji Ouchterlony'ego.

Aby zainicjować reakcję, roztopiony żel agarowy wlewa się cienką warstwą na szklaną płytkę, a po zestaleniu wycina się w nim otwory. Antygeny i surowice odpornościowe są umieszczane oddzielnie w zagłębieniach żelu, które dyfundują do siebie. W miejscu spotkania w równoważnych proporcjach tworzą osad w postaci białego pasma (ryc. 7.51). W systemach wieloskładnikowych pomiędzy dołkami pojawia się kilka linii osadu z antygenami i przeciwciałami; w identycznych antygenach linie precypitatu łączą się, w nieidentycznych antygenach przecinają się.

Ryż. 7.51

Serum odpornościowe ze stopionym żelem agarowym równomiernie wylewa się na szkło. Po zestaleniu się w żelu wykonuje się dołki, w których umieszcza się antygen (Ag) w różnych rozcieńczeniach. Antygen, dyfundując do żelu, tworzy wokół studzienek pierścieniowe strefy precypitacji z przeciwciałami. Średnica pierścienia strącającego jest proporcjonalna do stężenia antygenu (ryc. 7.52). Reakcja służy do oznaczania w surowicy krwi immunoglobulin różnych klas, składników układu dopełniacza itp.

Ryż. 7.52.

Połączenie elektroforezy i immunoprecypitacji: mieszanina antygenów jest wprowadzana do studzienek żelu i rozdzielana w żelu przez elektroforezę, następnie surowica immunologiczna jest wprowadzana do rowka żelu równolegle do stref elektroforezy. Przeciwciała surowicy odpornościowej dyfundują do żelu i tworzą linię precypitacji w miejscu „spotkania” z antygenem (ryc. 7.53).

Ryż. 7.53.

Reakcja flokulacji (według Ramona) (od łac. kłacz- płatki wełny) - pojawienie się opalescencji lub łuszczącej się masy (immunoprecypitacja) w probówce podczas reakcji toksyna-antytoksyna lub anatoksyna-antytoksyna (ryc. 7.54). Służy do określania aktywności antytoksycznej surowicy lub toksoidu.

Ryż. 7.54.

Szczepy czynnika wywołującego błonicę - C. diphtheriae mogą być toksygenne (wytwarzają egzotoksynę) i nietoksygenne. Powstawanie egzotoksyny zależy od obecności w bakteriach profaga niosącego gen toksowy kodujący powstawanie egzotoksyny. W przypadku choroby wszystkie izolaty badane są pod kątem toksygenności – wytwarzania egzotoksyny błoniczej w reakcji strącania w agarze (ryc. 7.55).

Ryż. 7,55