Лабораторна діагностика гельмінтозів. Метод виділення чистої культури лейшманій, отриманих шляхом зіскрібку патологічних тканин

Прості методи

Макроскопічний метод. При огляді фекалій можна виявити гельмінтів, їх головки, членики, уривки стробіли, що виділяються самостійно або після дегельмінтизації. Цей метод особливо рекомендується для виявлення ентеробіозу, теніозу та теніарингоспу.

Невеликі порції калу перемішують з водою в плоскій ванні або в чашці Петрі і, переглядаючи при хорошому освітленніна темному тлі, при необхідності користуючись лупою, витягують гельмінтів і всі підозрілі утворення білого кольору пінцетом чи піпеткою. Зібране переносять в іншу чашку з водою або предметне скло в краплю розведеного гліцерину або ізотонічного розчину хлориду натрію для подальшого вивчення.

При методі відстоювання всю досліджувану порцію фекалій слід розмішати з водою у скляному циліндрі, потім обережно злити верхній шарводи. Так повторюють кілька разів. Коли рідина стане прозорою, її зливають, а осад переглядають невеликими порціями у скляній ванній або чашці Петрі, як було зазначено вище.

Мікроскопічні методи – основний спосіб дослідження фекалій для виявлення яєць або личинок гельмінтів. Різні методи дослідження описані нижче. З метою підвищення достовірності обстеження аналізи можуть бути повторені кілька разів щодня або з проміжком 1-3 дні.

Метод нативного мазка. Нативний мазок - найбільш поширений та технічно доступний методдослідження фекалій. У нативному мазку можна виявити яйця та личинки гельмінтів усіх видів. Однак при невеликій кількості яєць у випорожненнях їх не завжди вдається знайти. Тому дослідження калу лише з допомогою нативного мазка перестав бути повноцінним і має доповнюватися методами збагачення. Ефективність дослідження нативного мазка помітно підвищується при перегляді чотирьох препаратів, приготованих з проби калу на двох предметних стеклах без покриття покривним склом, що дозволяє досліджувати загалом приблизно таку ж кількість калу, як і за методом Като (див. нижче).

Невелика кількість (завбільшки з сірникову головку) розмішаного калу тонко розмазують дерев'яною паличкою на поверхні предметного скла в краплі 50% розчину гліцерину. Зазвичай на одному склі готують два мазки. Мазок переглядають під малим збільшенням мікроскопа (про 8, бл. 7). У сумнівних випадках його накривають покривним склом та досліджують під великим збільшенням (про. 40).

Для приготування великого нативного мазка 200-300 мг калу (розміром з велику горошину) розтирають на склі розміром 6х9 см у 15-20 краплях 50% водного розчину гліцерину. Переглядають під бінокулярним стереоскопічним мікроскопом (про. 4, прибл. 12,5 або про. 2, прибл. 17) у світлі без покривного скла. У сумнівних випадках можна переводити об'єктив на збільшення. У таких мазках добре видно пофарбовані великі яйця гельмінтів, дещо гірше – прозорі яйця карликового ціп'яка. Для виявлення дрібних яєць цей метод непридатний. Разом з тим, великий обсяг досліджуваного матеріалу і велике поле зору при високій глибині різкості забезпечують значну ефективність зазначеної модифікації в порівнянні зі звичайним нативним мазком.

Товстий мазок з целофаном (метод Като) ефективніший, ніж вивчення нативного мазка, але також потребує поєднання з методами збагачення. Виявляються яйця всіх видів гельмінтів, проте з метою виявлення яєць карликового ціп'яка (яйця прозорі) або опісторха (дрібні яйця) лаборант повинен бути особливо уважним, щоб їх не пропустити (рис.21).

Метод заснований на виявленні яєць гельмінтів у товстому мазку калу, просвітленому гліцерином та підфарбованому малахітовим зеленим. Попередньо гідрофільний целофан нарізають пластинками розміром 20 х 40 мм і занурюють у суміш Като (6 мл 3% водного розчину малахітового зеленого, 500 мл гліцерину, 500 мл 6% розчину фенолу). 3-5 мл суміші вистачає на 100 пластинок, які готові до використання через добу і можуть зберігатися в цій же суміші добре закритому посуді при кімнатній температурі протягом 6 міс. За відсутності малахітового зеленого (рекомендується зменшення стомлюваності очей лаборанта) і фенолу (дезинфікуючий засіб) можна користуватися лише 50%-м водним розчином гліцерину, ефективність дослідження не знижується.

Мал. 20. Методика приготування товстого мазка калу з целофаном за Като

100 мг випорожнень наносять на предметне скло, покривають обробленою, як зазначено вище, пластинкою целофану і придавлюють гумовою пробкою так, щоб випорожнення не розтікалися з-під целофану. Мікроскопіювання при малому або великому збільшенні мікроскопа проводять не пізніше, ніж через 1 годину (у спеку - 30-40 хв) після приготування мазка. Причиною непрозорості препарату можуть бути товстий шар фекалій, погана обробка платівки у суміші Като, недостатній термін витримки препарату під целофаном. Тривале просвітлення гліцерином та надмірне висихання препарату також ускладнюють виявлення яєць.

Метод закручування за С.С. Шульман. Метод запропонований для виявлення в калі личинок гельмінтів, насамперед стронгілоїду. Досліджують тільки свіжовиділені фекалії, 2-3 г яких переносять у скляну банку, розмішують скляною паличкою круговими рухами з 3-5-кратною кількістю фізіологічного розчину, не торкаючись стінок судини. Яйця та личинки гельмінтів скупчуються в центрі. Після закінчення перемішування краплю на кінці палички швидко переносять на предметне скло, закривають покривним склом і досліджують під мікроскопом.

Методи збагачення. Методи збагачення засновані на різниці питомої ваги яєць і сольового розчину, що дозволяє виявити їх невелику кількість. Якщо питома вага яєць більша за питому вагу рідини, то яйця концентруються в осаді, який досліджують під мікроскопом. Цей метод седиментації (осадження) застосовують для яєць трематод. При більшій питомій вазі розчину яйця спливають поверхню рідини, і тоді досліджують плівку. Це методи флотації (випливання), вони найбільш ефективні для виявлення яєць анкілостомід, волосоголовця і карликового ціп'яка.

Методи флотації. Метод Фюлеборна заснований на випливанні яєць гельмінтів у насиченому розчині хлориду натрію, що має високу відносну щільність (1,2), що дає можливість виявлення яєць при невеликій їх кількості. Метод ефективніший, ніж вивчення нативного мазка, хоч і складніше. Достоїнствами методу є дешевизна та доступність. Рекомендується поєднувати вивчення нативного мазка та методу Фюллеборна.

Насичений розчин готують, розчиняючи 400 г натрію хлориду в 1 л води при кип'ятінні. Відносна густина розчину 1,18-1,22. Розчин зберігають у закритій пляшці. Для проведення аналізу в банку об'ємом 30-50 мл поміщають 2-3 г випорожнень і при помішуванні паличкою доливають майже догори насичений розчин натрію хлориду. Смужкою паперу швидко видаляють великі частки, що спливли. Через 45-60 хв. відстоювання дротяною петлею знімають поверхневу плівку і переносять її на предметне скло до краплі 50% водного розчину гліцерину. Замість зняття плівки петлею можна долити розчин у банку доверху, накрити предметним склом, до поверхні якого пристають яйця, що спливли. Готують декілька препаратів. Додатково переглядають 2-4 препарати з осаду, набираючи його очною піпеткою на 2 предметні стекла. Крім поверхневої плівки, необхідно обов'язково дослідити також і осад, оскільки трематод яйця, теніїд, незапліднені яйця аскарид не спливають в даному розчині. Яйця ряду гельмінтів спливають у солоному розчині не відразу. Так, якщо максимальне число яєць карликового ціп'яка спливає через 15-20 хв, то аскарид - через 1,5-2 год, волосоголовець - через 2-3 год.

Таким чином, до переваг цього методу відноситься його дешевизна та доступність, до недоліків - необхідність перегляду препаратів на поверхневій плівці та осаді, а також тривалість відстоювання.

Метод Е. В. Калантарян також є методом збагачення, але ефективніший і простіше, ніж метод Фюллеборна. Застосовується насичений розчин натрію нітрату з відносною щільністю 1,38. Тому яйця більшості гельмінтів виринають і виявляються в поверхневій плівці, дослідження осаду не потрібно.

Для приготування насиченого розчину нітрату натрію 1 кг солі нітрату натрію (натрієвої селітри) розчиняють у 1 л води та кип'ятять до повного розчинення та утворення на поверхні плівки. Без фільтрування переливають у суху сулію. За відсутності нітрату натрію його можна замінити на нітрат амонію (аміачна селітра), розчиняючи 1,7 кг на 1 л води. Відносна щільність одержаного розчину 1,3, що дещо знижує ефективність порівняно з розчином нітрату натрію.

Переваги методу: швидко спливають і виявляються у поверхневій плівці яйця більшості гельмінтів, що унеможливлює дослідження осаду. Недоліками методу є дефіцит нітрату натрію, а також те, що трематод яйця, онкосфери тенід не спливають і залишаються в осаді. Необхідно враховувати, що при тривалому (більше 1 -2 години) витримуванні фекалій у розчині яйця деяких гельмінтів починають набухати та осідають, зникаючи з поверхневої плівки.

Методи седиментації

Метод П. П. Горячова ґрунтується на принципі осадження яєць. Мазок у разі виходить світлий, без грубої домішки, що полегшує виявлення дрібних яєць трематод (описторха та інших.). Питома вага яєць опісторха висока, тому вони не спливають у сольових розчинах.

У циліндр діаметром 2-3 см наливають 70-100 мл насиченого розчину натрію хлориду. Окремо ретельно розмішують 0,5 г випорожнень в 20-25 мл води і обережно фільтрують через вирву з двома шарами марлі в циліндр на сольовий розчин, уникаючи перемішування (так, щоб утворилося два чітко розмежовані шари). Через 2-3 години верхній шар з калом відсмоктують піпеткою, а сольовий розчин залишають стояти на 12-20 годин або центрифугують. Осад піпеткою переносять на предметне скло, покривають покривним склом та мікроскопують.

Метод Горячова було запропоновано виявлення яєць описторха і виявився ефективніше, ніж дослідження нативного мазка і метод Фюллеборна. В даний час для діагностики опісторхозу (клоноргоспу) рекомендують методи Като і Калантарян, як досить ефективні та технічно простіші.

Метод Красильникова. Під дією поверхнево-активних речовин, що входять до складу миючих засобів (детергентів), яйця гельмінтів звільняються від випорожнень і концентруються в осаді.

Попередньо готують 1% розчин прального порошку «Лотос». Для цього 10 г порошку розчиняють у 1 л водопровідної води. За відсутності Лотоса можна використовувати й інші пральні порошкиАле кожного з них потрібно брати стільки, скільки розчиниться без утворення осаду в 1 л водопровідної води. У скляну посудину ємністю 30-50 мл наливають 20-30 мл розчину детергенту, туди поміщають невелику порцію випорожнень і добре перемішують. Співвідношення випорожнень та розчину має бути приблизно 1:20. Випорожнення повинні бути в розчині не менше доби. За цей час на дні утворюється осад із 2-3 шарів. Нижній шар складається з грубих важких частинок, в середньому шарі збираються яйця гельмінтів, верхній шар являє собою білувато-сірі пластівці. Потім піпеткою набирають 2-3 краплі рідини із середнього шару та переносять на предметне скло. На одному склі готують 2 препарати, накривають покривним склом та мікроскопують.

Метод Красильникова дозволяє виявити яйця всіх видів гельмінтів, що виділяються з випорожненнями.

Ефір-формаліновий метод седиментації та хімікоседиментаційний метод при високої ефективностідуже трудомісткі, особливо при масових обстеженнях, у зв'язку з цим доцільніше використовувати ефіроцтовий метод. Він дозволяє після додаткової обробки осаду хімреактивами отримати у ньому практично лише яйця гельмінтів, що полегшує виявлення дрібних яєць трематод. Цей метод виявився універсальним, що виявляє яйця всіх кишкових гельмінтів, цисти найпростіших, він також може використовуватися для кількісної оцінки інтенсивності інвазії.

У центрифужні градуйовані пробірки наливають 7 мл 10% розчину оцтової кислотита додають 1 г фекалій до позначки 8 мл. Фекалій і ретельно перемішують паличкою до утворення однорідної суміші, а потім проціджують через два шари марлі в іншу центрифужну пробірку (щоб у новій пробірці процідженого розчину знову було 8 мл, якщо менше, то додатково можна обполоснути 10% розчином оцтової кислоти лійку з бинтом які проціджували розчин фекалій). У цю пробірку додають 2 мл ефіру (до 10 мл), закривають пробкою і енергійно струшують протягом 30 сек. Суміш центрифугують при 3000 об/хв протягом 1 хвилини (2 хвилини при 1500 об/хв). Шар коагулянту (у вигляді пробки у верхній частині пробірки) паличкою відокремлюють від стінок пробірки і разом із надосадовою рідиною обережно зливають. Осад (як правило, невеликий, безбарвний) наносять на предметне скло піпеткою, накривають покривним склом і мікроскопують.

Поділяються найпростіші на 4 класи:

При інцистуванні мікроорганізм набуває округлої форми і покривається захисною оболонкою. У формі найпростіші цисти стають малосприйнятливими до несприятливих факторів середовища.

Дослідження можуть піддаватися:

Зверніть увагу:різновидів діагностики дуже багато, ми розглянемо ті види, які найпоширеніші у клінічній лабораторній практиці.

Приватні види діагностики

У кожному конкретному випадку перед лаборантом ставиться завдання знаходження певного збудника, іноді принагідно з основним виявляються й інші.

Налічується 6 видів цього мікроорганізму, здатного до проживання в кишечнику людини. Клінічне значення має лише дизентерійна амеба, що зустрічається у вегетативної формі та у вигляді цист.

Додатково застосовуються імунологічні методи:

непрямої імунофлюоресценції;
непрямої аглютинації (РНА);
радіальної імунодифузії.

Зверніть увагу: серологічні методималоінформативні та застосовуються лише як доповнення до основних у сумнівних випадках.

Діагностика війкових (інфузорій)

Патогенна форма мікроорганізмів цього – балантидій. Це мікроб, що викликає балантидіаз – хвороба, що супроводжується виразковим процесом товстого кишківника. Збудник виявляється у нативному мазку у вигляді вегетативної форми та цисти. Матеріал для мазка (кал і слиз) забирається при ректороманоскопічному дослідженні та висівається на спеціальні середовища.

Діагностика джгутиконосців (лейшманій, лямблій, тріпанос, тріхомонад)

Для людини становлять небезпеку лейшманії, трипаносоми, лямблії, трихомонади.

Лейшманія– мікроби, викликають лейшманіоз, досліджуються у мазках крові, матеріалах кісткового мозку, зіскрібків зі шкірних інфільтратів. У деяких випадках при діагностиці лейшманій застосовується посів на живильні середовища.

Трипаносоми- Збудники сонної хвороби (американський/африканський трипаносомоз, або хвороба Шагаса).

Африканський варіант визначають у початковому періоді щодо периферичної крові. Патологічні мікроби при прогресуванні хвороби знаходяться у матеріалі пункцій лімфовузлів, у запущених стадіях – у спинномозковій рідині.

Для діагностики трипанос при підозрі на хворобу Шагаса досліджуваний матеріал обстежується під мікроскопом при малому збільшенні. При цьому мазки та товсту краплю попередньо фарбують.

Трихомонади(кишкова, ротова,) виявляються при мікроскопії матеріалів, взятих із уражених слизових оболонок.

Виявлення споровиків (малярійного плазмодія, збудника кокцидозу та ін.)

Найбільш поширений та небезпечний для людини вид – малярійний плазмодій, що має 4 основні різновиди збудника: збудник триденної малярії, чотириденної малярії, тропічної малярії та малярії овалі.

Статевий розвиток плазмодія (спорогонія) проходить у комарах Анофелес. Безстатеве (тканинна та еритроцитарна шизогонія) – у печінковій тканині та еритроцитах людини. Ці особливості життєвого циклуобов'язково враховуються при діагностиці малярійного плазмодія.

Так, у щойно хворого у крові можна виявити статеві клітини циклу спорогонії. А ось на висоті малярійних нападів у крові у великій кількості з'являються шизонти.

Більше того, у різні фази малярійної лихоманки проявляються різні форми плазмодія:

у період ознобу кров наповнюється мерозоїтами, різновидом шизонтів;
на висоті температури в еритроцитах накопичуються кільцеподібні трофозоїти;
зниження температури характеризується переважанням амебоподібних трофозоїтів;
У періоди нормального стану кров містить дорослі форми шизонтів.

Дослідження збудника малярії (малярійного плазмодія) проводиться в мазку та в товстій краплі.

Зверніть увагу:діагностика малярії при дослідженні мазків та товстих крапель крові іноді буває помилковою. Тромбоцити крові в деяких випадках можуть бути помилково зараховані до малярійного збудника. Також іноді симулюють плазмодії фрагменти лейкоцитів та інших клітин.

Основні методи дослідження найпростіших

Стисло ознайомимося з найпоширенішими методами дослідження на наявність найпростіших.

Діагностика найпростіших методом нативного мазка та мазка, пофарбованого розчином Люголя (у калі)

Препарат готується з емульсії калу в ізотонічному розчині. На предметне скло наносяться дві краплі хлору натрію і поруч розчин Люголя. В обидва склади дерев'яною паличкою додають матеріал, що досліджується, і після накриття склом переглядають у різних дозволах мікроскопа.

За певними ознаками реєструють знайдених найпростіших. Для точності готують 2-3 препарати з одного матеріалу. У сумнівних випадках аналіз повторюють кілька разів протягом 2-3 тижнів.

Методом можна виявити вегетативні та цистні форми:

лямблій;
балантидій;
дизентерійної амеби.

Разом з патогенними формами визначаються і найпростіші непатогенні. Також у здорових носіїв знаходяться просвітні та цистні форми.

Важливо:дослідження, щоб уникнути неточностей і помилок, слід проводити неодноразово.

Результат діагностики найпростіших методом нативного та забарвленого мазка повинен містити опис форми збудника (просвітна, циста, тканинна).

Вимоги до дослідження:

забраний на аналіз матеріал (рідкий кал) досліджується пізніше 30 хвилин після дефекації;
оформлений кал необхідно діагностувати протягом 2 годин після дефекації;
у матеріалі не повинно бути домішок (дезінфікуючих засобів, води, сечі);
для роботи з матеріалом використовують тільки дерев'яні палички, скляні не придатні через зісковзування слизу;
палички після використання необхідно негайно спалювати.

Метод консервації (дослідження калу) при діагностиці найпростіших

Дослідження проводиться шляхом фіксації найпростіших із консервантом. Відмінність цього від попереднього у цьому, що консерванти дозволяють зберегти препарат протягом тривалого періоду.

Використовувані консерванти:

Барроу. Містить інгредієнти, що консервують: 0,7 мл хлориду натрію, 5 мл формаліну, 12,5 мл 96% спирту, 2 г фенолу і 100 мл дистильованої води. Фарбувальний склад: 0,01% розчин тіонін (азура).
Розчин Сафарлієва. склад: 1,65 г сульфату цинку, 10 мл формаліну, 2,5 г кристалічного фенолу, 5 мл оцтової кислоти, 0,2 г метиленового синього, 100 мл води. Цей консервант використовується у випадках, коли матеріал повинен зберігатись більше місяця.

Консервантом наповнюються порожні флакони, у яких переносять матеріал, у пропорціях 3:1, потім за необхідності додають барвник. Оцінка результатів проводиться у разі дослідження 2-3-х препаратів.

Метод формалін-ефірного збагачення (аналіз на наявність найпростіших у калі)

Цей спосіб діагностики дозволяє відокремити та сконцентрувати цисти найпростіших. Для аналізу потрібні такі інгредієнти: формалін (10 мл), 0,85 г ізотонічного розчину, дистильована вода, сірчаний ефір, розчин Люголю.

Суміш біоматеріалу з перерахованими рідинами змішують та центрифугують. Отриманий на дні пробірки осад забарвлюють розчином Люголя і досліджують на наявність цист і вегетативних форм.

Метод знаходження лейшманій (мазок кісткового мозку)

Для діагностики лейшманіозу використовуються реактиви: суміш Нікіфорова (сірчаний ефір та етиловий спирт), фосфатний буфер, Азур-еозин по Романівському.

Речовину кісткового мозку дуже обережно поміщають на предметне скло після спеціальної підготовки. Використовується мікроскоп із імерсійною системою.

У гострий період хвороби в пунктаті виявляється велика кількість лейшманії.

Зверніть увагу:іноді кров'яні клітиниможуть нагадувати оброблені лейшманії, тому дуже важливо лаборанту бути уважним та мати достатній досвід для самостійного дослідження.

Метод виявлення лейшманій у мазку зі шкірного інфільтрату

Необхідні реактиви аналогічні до попереднього аналізу.

Досліджуваний матеріал отримують з наявного горбка або виразкового вмісту. Зішкріб при підозрі на лейшманіоз робиться дуже акуратно скальпелем, без крові. Потім готується препарат на склі. Для точності одержуваних результатів одночасно оглядають кілька препаратів.

За наявності захворювання серед присутніх у досліджуваному матеріалі макрофагів, фібробластів, лімфоїдних клітин визначаються лейшманії.

Метод виділення чистої культури лейшманій, отриманих шляхом зіскрібку патологічних тканин

При цьому способі діагностики найпростіших зіскрібок тканин поміщають у спеціальну живильне середовище, в якій відбувається активне розмноження лейшманій

Перед забором зіскрібка шкіру ретельно обробляють спиртом, потім робиться надріз горбка, з дна якого витягується вміст і поміщається в пробірку з середовищем. Матеріал забирається кілька разів, після чого він поміщається у різні пробірки. Потім термостат при температурі 22-24 градуси відбувається культивування. Результати оцінюють під мікроскопом. Цей метод застосовується, коли інші, більш дешеві та швидкі способи діагностики найпростіших неефективні.

Побачити, як на практиці розшифровуються аналізи на наявність найпростіших крапель крові, ви зможете, подивившись відео-огляд:

Лотін Олександр, медичний оглядач

Методи гельмінтологічних дослідженьділяться на прямі та непрямі. Прямі методи: виявлення самих гельмінтів, їх фрагментів, яєць, личинок у фекаліях, сечі, дуоденальному секреті, мокротинні, носовому та вагінальному слизу, вмісті піднігтьових просторів, біопсованих шматочках тканини. Непрямі методи: виявлення вторинних змін, що виникають в організмі людини в результаті життєдіяльності паразита, серологічних реакцій, загальним дослідженнямкрові, сечі. Найбільш поширеними методами дослідження фекалій є гельмінтоовоскопічні та протозооскопічні. При діагностиці не можна якимось одним методом виявити яйця або личинки всіх видів гельмінтів, що мешкають у травної системилюдини. Так, при використанні методу флотації поверхневу плівку не спливають (через високу питому вагу) яйця трематод, у деяких випадках незапліднені яйця аскарид. У калі дуже рідко можна виявити яйця гостриків, онкосфери теніїд, які виявляються спеціальними методами досліджень: зішкріб з періанальних складок для гостриків і теніїд, методи осадження для трематод (яйця опісторха та ін.). Тому для цілеспрямованого обстеження хворого на гельмінтози лікар у напрямку має вказати, на які гельмінти слід звернути основну увагу (діагноз), що дозволить лаборанту вибрати відповідну методику виявлення даного виду гельмінта. Фекалії, взяті з різних місцьвипорожнення в кількості не менше 50 грамів (чайна ложка) в чистий скляний посуд, повинні бути відправлені в лабораторію не пізніше ніж через добу після дефекації та досліджені в день надходження. У разі необхідності збереження калу до наступного дняйого поміщають у холодне місце (0-4°С) або заливають одним із консервантів. Перед дослідженням кал перемішують паличкою, щоб яйця гельмінтів виявилися рівномірно розподіленими в загальній масі. При виявленні у препараті яєць будь-якого гельмінта перегляд не припиняють, тому що. може бути подвійна чи потрійна інвазія. Контроль за ефективністю лікування гельмінтозів здійснюється шляхом дослідження фекалій на яйця гельмінтів через 2-3 тижні або через 2-3 місяці після лікування, залежно від виявленого гельмінту. Макроскопічні методи служать виявлення в калі цілих статевозрілих гельмінтів чи його фрагментів неозброєним оком чи з допомогою ручної лупи. Часто на поверхні калу після дефекації можна бачити активно гострих гостриків; виділяються з фекаліями аскариди; іноді люди самі помічають відходження гельмінтів. У хворих на дифілоботріоз можуть виділятися уривки стробіли лентеца (у вигляді "локшини"), а у інвазованих тенідами (свинячий або бичачий ціп'як) з калом часто відходять членики гельмінтів (у вигляді "білих обсічок") або вони активно виповзають з анального отвору. Макроскопічний метод є основним для диференціальної діагностики теніїдозу та теніарингоспу (у поєднанні з опитуванням). Зі спеціальних макроскопічних методів застосовується метод послідовного промивання фекалій. Фекалії розмішуються у воді для отримання рівномірної суспензії, після чого при хорошому освітленні їх ретельно переглядають окремими невеликими порціями у чорних фотографічних кюветах або на темному тлі у чашках Петрі. Пінцетом або препарувальною голкою витягують усі підозрілі білі частинки, великі утворення, підозрілі на фрагменти гельмінтів, і розглядають їх під лупою між двома предметними шибками. Дрібних гельмінтів чи голівки цестод розглядають під лупою у краплі гліцерину чи під мікроскопом. При використанні цього методу для діагностики члеників свинячого, бичачого ціп'яків, широкого лентеця відмиті членики поміщають між двома стеклами і, переглядаючи світ під лупою або малим збільшенням мікроскопа, визначають видову приналежність до будови матки (у зрілого членика свинячого ціп'якавід центрального стовбура відходять 8-12 бічних відгалужень, а у бичачого ціп'яка 18-32, частіше 28-32, у широкого лентеца членики більше завширшки і матка в центрі у вигляді "розетки"). Якщо матку погано видно, її попередньо можна потримати деякий час у 50% розчині гліцерину, після чого навіть запустілі стовбури матки проглядаються добре. При визначенні цих цестод за будовою головок, що відійшли, їх з шийкою обережно кладуть у краплю гліцерину між предметними стеклами (або покривають покривним склом) і, не передавлюючи, розглядають під мікроскопом при малому збільшенні.

Мікроскопічні методи поділяються на прості, складні та спеціальні.

До простих належать методи нативного мазка, нативний мазок розчином Люголя, методи товстого мазка під целофаном по Като, закручування (по Шульману) та періанального зіскрібка.

Складні методи є більш ефективними та засновані на концентрації яєць у препаратах. Вони включають попередню обробку фекалій рідкими реактивами, в результаті чого яйця гельмінтів або випадають в осад, або спливають на поверхню рідини.

До складним методамналежать методи збагачення:

а) флотаційні (коли питома вага яєць менша за питому вагу сольового розчину і яйця спливають у поверхневу плівку);

б) седиментаційні (коли подовжня вага яєць більша за питому вагу сольових розчинів і яйця осідають в осад).

Спеціальними методами виявлення яєць та личинок гельмінтів, цист та вегетативних форм найпростіших є методи зішкрібання, флотації, седиментації, ларвоскопії, протозооскопії, дослідження жовчі та методи фарбування мазків калу, мокротиння та ін.

Відбір проб та їх консервування

Для дослідження беруть фекалії з різних місць порціями в кількості 50 г і в чистому скляному або пластмасовому посуді із щільною кришкою направляють до лабораторії. Дослідженню піддаються свіжі фекалії (не більше добової давності), а в деяких випадках (при дослідженні стронгілоїдозу) відразу після дефекації. Запропоновано низку консервантів фекалій, що містять яйця гельмінтів: 4-10% розчин формаліну, який для запобігання розвитку яєць анкілостомід необхідно підігріти до t° 50-60°; суміш 0,2% водного розчину азотнокислого натрію (1900 мл), розчину Люголя (5 г йоду, 10 г йодистого калію, 250 мл води), формаліну (300 мл) і гліцерину (25 мл), в якому яйця гельмінтів зберігаються 6-8 міс.; суміш гліцерину (5 мл), формаліну (5 мл) та води (100 мл); розчини 1-1,5% детергентів "Лотос", "Екстра", "Барф", "Тайд" і т. д. (у ваговому співвідношенні фекалій і розчину детергенту 1: 5); суміш мертіолату 1: 1000 (200 мл), формаліну (25 мл), гліцерину (5 мл), дистильованої води (250 мл) з додаванням 0,6 мл розчину Люголя (з розрахунку 1 г фекалій на 10 мл суміші).

Для діагностики гельмінтозів застосовуються макро- та мікрогельмінтоскопічні методи дослідження фекалій.

Макрогельмінтоскопічні дослідження

Метод відстоювання

Добову порцію фекалій ретельно перемішують з 5-10-кратною кількістю води, зливають у високі скляні циліндри (банки, відра) та залишають до повного осадження зважених частинок. Верхній каламутний шар обережно зливають і доливають чисту воду догори (повторюють кілька разів, поки вода над осадом стане прозорою). Зливаючи верхній шар, переносять осад у кювету або чашку Петрі і переглядають його (на темному тлі) під лупою або неозброєним оком.

Метод відсіювання

Перемішані з водою фекалії поміщають на верхнє сито приладу, що складається з системи сит з отворами спадного діаметра, прилад з'єднують з водопровідною мережею і, відкривши водопровідний кран, промивають, а рідину, що витікає, відводять в каналізацію. Великі гельмінти залишаються верхньому ситі, а дрібніші затримуються на нижніх. Сита перевертають і, змивши вміст темні кювети, переглядають неозброєним оком або під лупою.

Мікрогельмінтоскопічні дослідження

Проводять з метою виявлення яєць (гельмінтоовоскопічні методи – цветн. рис. 1) або личинок гельмінтів (гельмінтоларвоскопічні методи).

Гельмінтоовоскопічні методи

Якісні методи без збагачення

Нативний мазок. Невелика кількість фекалій розтирають на склі в краплі 50% розчину гліцерину або кип'яченої води. Великі частинки обережно видаляють, суміш покривають покривним склом і досліджують під мікроскопом (переглядають два мазки). Зручніше і простіше готувати довгі мазки між двома предметними стеклами. Нативний мазок застосовують лише на додаток до методів збагачення, тому що він недостатньо ефективний, особливо при слабких інвазіях.

Товстий мазок з целофаном по Като(К. Kato, 1954) є дуже ефективним методомдослідження. Шматочки гідрофільного целофану (розміром 4x2 см) замочують на 24 години у суміші гліцерину (50 мл), 6% розчину фенолу (500 мл) та 3% водного розчину (6 мл) зеленої малахітової (остання не обов'язкова). Ок. 100 мг фекалій розмазують на предметному склі і, покривши шматочком вологого целофану, притискають гумовою пробкою № 5. Препарат досліджують через 30-60 хв., коли він злегка підсохне і просвітиться, внаслідок чого яйця гельмінтів легко виявити під малим.

Якісні методи зі збагаченням (методи спливання та осадження)

Перші засновані на застосуванні насичених розчинів різних хім. речовин, у яких яйця спливають завдяки різниці частки.

Метод Кофоїда-Барбера(Ch.А. Kofoid, М. A. Barber) у модифікації Фюллеборна (F. Fulleborn, 1920). Ок. 5 г фекалій у високій та вузькій баночці (об'ємом 100 мл) розмішують дерев'яною паличкою у 100 мл насиченого розчину кухонної солі, Зад. вага якого 1,18 (400 г солі розчиняють при кип'ятінні в 1 л води). Великі частинки, що спливли на поверхню, швидко видаляють паличкою або шматочком паперу. Після відстоювання суміші протягом 45-90 хв. дротяної петлі (діам. 0,8-1 см) знімають всю поверхневу плівку, переносять її на предметне скло. При дослідженні на яйця анкілостомід суміш відстоюють 10-15 хв. Можна знімати плівку безпосередньо предметним склом, яким покривають баночку так, щоб воно стикалося з рідиною (насичений розчин солі доливають до країв баночки). Після відстоювання предметне скло знімають, швидко перевертають і досліджують під мікроскопом (без покривного скла) плівку, що пристала до нього, з яйцями гельмінтів. Цей метод добре виявляє яйця всіх нематод та карликового ціп'яка. Тяжкі яйця трематод; більшості цестод та незапліднених аскарид спливають погано, тому досліджують і осад. Для цього після зняття плівки рідину зі баночки швидко зливають і з осаду петлею або піпеткою беруть кілька крапель, переносять їх на предметне скло, додають гліцерину для просвітлення і досліджують під мікроскопом.

Метод Є. В. Калантарян(1938) є ефективнішою модифікацією методу Фюллеборна. У ньому розчин кухонної солі замінено насиченим розчином азотнокислого натрію, уд. вага якого 1,39 (один об'єм азотнокислого натрію розчиняють у рівному обсязі води при кип'ятінні), плівку знімають через 20-30 хв.

Застосовуються також методи Фауста (Е. С. Faust, 1939), Брудастова із співавт. (1970) та ін.

Для осадження яєць гельмінтів використовують хім. речовини, що розчиняють жири та білки фекалій.

Метод Телеманна (W. Telemann, 1908) у модифікації Міягави (Y. Miyagawa, 1913). Ок. 5 г фекалій розтирають у ступці або баночці, додавши по 5 мл етилового ефіру і 50% розчину соляної кислоти; суміш проціджують через дротяне або волосяне сито в пробірку та центрифугують. У пробірці утворюється 3 шари: вгорі - ефір з розчиненим жиром, нижче - соляна кислота з розчиненими білковими речовинами, в осаді - нерозчинні частини фекалій та яйця гельмінтів. Верхні шари зливають, а осад додають воду і центрифугують. Декілька крапель осаду переносять на предметне скло і досліджують під мікроскопом. Цим методом можна виявити яйця всіх видів гельмінтів, але іноді деформуються.

Метод Рітчі (L. S. Kitchie, 1948).Для розчинення жирів та білків використовують формалін та ефір.

Для осадження яєць гельмінтів можна використовувати різні детергенти. За кордоном набув поширення метод фільтрації у спеціальних апаратах Белла, який застосовується для досліджень не тільки фекалій, а й сечі, крові тощо.

Існує ряд методів, що поєднують принципи флотації та осадження яєць. До них належать методи Лейна (С. A. Lane), Ріваса (D. Rivas), Горкіна, Дарлінга (S. Т. Darling). Один із таких флотаційно-седиментаційних методів, а також метод послідовних зливів запропонований Н. В. Демидовим (1963, 1965) для дослідження на фасціоліз і дикроцеліоз.

Кількісні методи

Метод Столла(N. R. Stoll, 1926). У градуйовану широку пробірку або колбочку (з двома мітками: 56 і 60 мл) наливають до першої мітки децинормальний розчин їдкого натру, додають фекалії до тих пір, поки рівень рідини не досягне другої мітки, ретельно перемішують скляною паличкою і, помістивши 10 стек дрібних камінців, закривають пробкою і струшують протягом 1 хв. Швидко, щоб завись не відстояла, набирають градуйованою піпеткою 0,075 мл суміші (0,005 г фекалій), переносять на предметне скло з нанесеною на ньому сіткою, покривають покривним склом і підраховують під мікроскопом гельмінтів яйця в препараті; помноживши отримане число на 200 одержують кількість яєць в 1 г фекалій. Для більш точного результату підраховують яйця у двох або більше препаратах та беруть середній показник. Метод Столла нечутливий при слабких інвазіях. Тому рекомендують підраховувати кількість яєць у препаратах, приготовлених різними методамифлотації чи осадження, за умови постійного використання рівної навішування фекалій та посуду одного обсягу. Використовують також товстий мазок по Като.

Метод Бівера(Р. С. Beaver, 1950). Готують стандартний мазок, густоту якого визначають за допомогою електрофотометра, а потім підраховують в ньому всі яйця гельмінтів.

Гельмінтоларвоскопічні методи

Метод Берманна(G. Baermann, 1917). 5-10 г свіжовиділених фекалій поміщають на металевій сітці у скляну лійку, на вузькому кінці якої надята гумова трубка з затискачем. Щоб уникнути забруднення осаду, частинками калу рекомендується підкладати (на сітку) папір або додавати у фекалії тваринне вугілля або кукурудзяне борошно. Вирву наповнюють теплою водою (t° 45-50°) до зіткнення з фекаліями. В силу термотропності личинки активно переміщуються в теплу водуі поступово накопичуються в нижній частині вирви, над затискачем. Через 3-4 години затиск відкривають, рідину спускають в 1-2 пробірки, центрифугують протягом 2-3 хв., Верхній шар зливають, а осад досліджують на склі під мікроскопом.

Метод виявлення мірацидіїв шистосом. Фекалії промивають у темряві при t° 8-10°, осад витримують 45 хв. на яскравому світлі при t° 28°, потім переливають темну колбу з трубочкою збоку. Мірацидії концентруються у прозорій бічній трубці, звідки їх можна вибрати.

Для виявлення личинок анкілостом застосовують також методи Фюллеборна та ін.

Методи дослідження інших виділень, а також тканин та органів

Ок. 100 мл сечі, що досліджується, відстоюють 30 хв. в циліндрі і, видаливши верхній шар, зливають 10-15 мл осаду в пробірку, центрифугують при 1500 про хв протягом 1-2 хв; осад досліджують. Бажано збирати всю добову порцію сечі.

Сечостатевий шистосоматоз діагностують шляхом виявлення мірацидіїв. Порцію свіжої сечі центрифугують протягом 5 хв., осад переливають в пофарбовану в чорний колір колбу, до верхньої частини якої припаяна прозора скляна трубочка. Додають воду у співвідношенні 1:5, 1: 10 і ставлять на 2 години термостат при t° 25-30°. Вийшли з яєць мірацидії видно через прозору трубочку неозброєним оком у вигляді точок, що швидко рухаються. При хрон, формі шистосоматозу у хворих до кінця сечовипускання виділяється кров, але яйця в сечі знаходять рідко, тому рекомендується вдаватися до біопсії сечового міхура.

Дослідження мокротиння.У мокротинні можуть бути яйця парагонімусів, шистосом, томінксів, личинки мігруючих нематод, фрагменти ехінококового міхура. Всю доставлену порцію мокротиння ретельно переглядають неозброєним оком або під лупою, вибирають і досліджують усі видимі уривки тканин, скупчення іржавого кольору тощо; потім переглядають усю порцію мазками. Гнійне мокротиннязаливають рівною кількістю 0,5% розчину їдкого лугу, центрифугують та досліджують осад.

При деяких гельмінтозах у харкотинні спостерігаються характерні зміни. При парагонімозі, напр., в мокротинні можна виявити скупчення яєць у вигляді жовтих грудочок, а також велика кількість слизу, лейкоцити, еритроцити, альвеолярні клітини, спіралі Куршманна, еластичні волокна, кристали Шарко-Лейдена. Виявлено також характерні ромбоподібні кристали із загостреними кінцями. Наявність великої кількостіеозинофіли дозволяє диференціювати парагонімоз від туберкульозу.

Дослідження вмісту абсцесів та пунктатів. У гнійних виділенняхабсцесів, а також у пухлинах і кістах, видалених при оперативному втручанні, можна виявити гельмінтів, їх фрагменти, личинки та яйця (ехінокок, альвеокок, спарганум, цистицерк, дирофілярія, аскариди, токсокара, парагонімус та ін). Техніка дослідження проста; у деяких випадках із тканин пухлини готують гістологічні зрізи. Гнійне вміст можна обробити методом Телеманна; прозору рідину досліджують так само, як і дуоденальний вміст, додаючи сірчаний ефір. Ехінококову рідину центрифугують і досліджують осад на наявність сколексів та гачків; препарати забарвлюють карболфуксином за Цилем-Нельсеном.

Дослідження крові.У крові виявляють мікрофілярій та личинок мігруючих нематод. Краплю крові беруть із пальця чи з мочки вуха і досліджують у свіжому вигляді чи готують із неї препарати.

Крапля поміщають на предметне скло з нанесеним квадратом з вазеліну і злегка притискають покривним склом. Під мікроскопом видно мікрофілярії, що рухаються між клітинами крові. Кров можна поміщати між двома шарами клейкої целюлозної стрічки; мікрофілярії зберігають рухливість протягом 6 год.; у повністю висохлому препараті їх можна розрізнити під мікроскопом протягом 30 днів. Ідентифікувати види мікрофілярій можна лише у пофарбованих мазках чи товстих краплях. Приготовлені препарати висушують, гемолізують і забарвлюють по Романовському - Гімзі, Райту, Цилю-Нельсену, Лейшману, Папаніколау (див. метод Райта забарвлення, Романовського-Гімзи метод, Циля-Нельсена метод). Виявивши мікрофілярій у краплі крові, пофарбованої по Романівському-Гімзі, препарат додатково фарбують гематоксиліном Хансена; через 15-60 хв. промивають 2 хв. у проточній воді. Перефарбований препарат диференціюють у 0,2% розчині соляної кислоти; чохлик мікрофілярій забарвлюється в блідо-фіолетовий колір, а ядерна субстанція тіла - у темно-фіолетовий.

При слабких інвазіях необхідно досліджувати 2-10 лід крові з антикоагулянтом (напр., з 5% розчином лимоннокислого натрію) одним із наступних методів.

Метод Кнотта (J. Knott, 1939), модифікований Маркеллом та Фоге (Е. К. Markell, М. Voge, 1965). 2 мл крові перемішують у центрифужній пробірці з 10 справ 1% оцтової к-ти, центрифугують протягом 2 хв. при 1500 об/хв; поверхневий шарзливають, осад розподіляють на кількох предметних стеклах і досліджують під мікроскопом. Препарати можна фарбувати за Романівським-Гімзою або іншими методами.

Метод фільтрації Белла (D. R. Bell, 1967). В апараті, що складається з лійки з нержавіючої сталі з прямокутним отвором і мембранних фільтрів тієї ж форми, розміром 19 х 42 мм, з величиною пор від 0,8 до 5 мкм, фільтрують у пробірки кров, гемолізовану в суміші з 1 мл детергенту типу і 9 мл фізіол, розчину (для прискорення фільтрації апарат з'єднаний із вакуумним насосом). Фільтр фіксують у киплячій дистильованій воді і фарбують по Романівському-Гімзі або гарячим гематоксиліном Ерліха. Забарвлений фільтр висушують в ексікаторі або в ізопропіловому спирті (послідовно в 3 чашках), просвітлюють на склі іммерсійним маслом та досліджують під покривним склом. Забарвлені препарати зберігаються кілька тижнів. Метод Белла найефективніший для кількісного обліку мікрофілярій у крові.

Застосовується також метод із полівідоном Голдсміду.

Дослідження шкіри.У шкірі можна виявити мікрофілярій онхо-церків та личинок гельмінтів тварин, що викликають шкірну форму larva migrans(Див.). Зрізи шкіри або матеріал, отриманий скарифікацією, беруть у ділянці стегна, ікри, сідниці або на рівні дельтоподібного м'яза. Конусоподібний шматочок епідермісу піднімають ентомологічною шпилькою та, зрізавши бритвою, досліджують на склі в краплі фізіол, розчину. При негативному результатісвіжий препарат повторно переглядають через 10 хв; личинки зазвичай локалізуються з обох боків препарату. Отриманий матеріал можна витримувати у 2 мл фізіол, розчину протягом 1-2 год. та дослідити осад. Рекомендують брати у хворого 5 зрізів шкіри.

Можна готувати препарати з крові та тканинної рідини, що виділилися після сильного стиску зрізів. Краплі фарбують за Майєром, Романовським-Гімзе або гематоксиліном Делафільда.

Стандартний метод кількісного обліку інвазії. Біопсована ділянка шкіри діам. 3-5 мм і вагою не менше 1-4 мг зважити, розрізати на дрібні шматочки та підрахувати личинки під мікроскопом у фізіол. розчин на предметному склі; 1-4 личинки в полі зору позначають знаком +, 5-9 личинок - знаком ++, 10-19 - знаком +++, 20 і більше - знаком ++++. Кількісний облік зручніше проводити на фарбованих препаратах.

Дослідження на трихінельоз, цистицеркоз та шистосоматозу

Виявлення личинок трихінел

Компресійний метод.Шматок двоголовий або литкового м'яза(поблизу сухожилля), взятої хірургічним шляхом з дотриманням асептики, розщеплюють препаровальними голками на окремі тонкі волоконця, здавлюють їх між двома предметними склом у краплі гліцерину так, щоб препарат був тонким і прозорим. Під мікроскопом із затемненим полем зору добре видно личинки трихінел. Ефективне дослідження кількох шматочків м'язів у компресоріумах, що використовуються у вет.-сан. практиці, особливо у спеціальних трихінелоскопах.

Метод перетравлення Бечмена(G. W. Bachman, 1928). 1 а подрібнених м'язів заливають 60 мл штучного шлункового соку (0,5 г пепсину; 0,7 мл концентрованої соляної кислоти; 100 мл води) і витримують 18 год. у термостаті при t° 37°; верхній шар рідини зливають, до осаду додають теплої води (t 37-45 °) і виливають в апарат Берманна. Через годину жид-, кістку спускають у пробірку, центрифугують і досліджують осад. Якщо личинки укладені в звапнілі капсули, їх попередньо декальцинують в розчині соляної, азотної, або сірчаної кислоти.

Біопроба. Шматочки досліджуваних м'язів згодовують білим мишам чи щурам. Через 2-3 дні можна виявити статевозрілих трихінелл у дуоденальному вмісті, а через 2-3 тижні - личинок у м'язах діафрагми та язика.

Гістологічні зрізи.Шматочки м'язів фіксують у рідині Буена, Ценкера або ін; звичайним способомготують зрізи на мікротомі та забарвлюють їх гематоксиліном Делафільда.

Виявлення цистицерків

Шматок екстирпованого м'яза, сполучної тканини та ін. оглядають неозброєним оком, обережно виділяють цистицерк - білуватий напівпрозорий пляшечку розміром 1-2 см, роздавлюють його між двома предметними склом у краплі гліцерину і досліджують під мікроскопом. Для визначення життєздатності виділених із тканин цистицерків їх витримують у 50% розчині жовчі на фізіол. розчин у термостаті при t° 37°; через 10-60 хв. головка життєздатного цистицерка вивертається назовні. Обвапнених цистицерків попередньо декальцинують 4% розчином азотної к-ти протягом години.

Виявлення яєць шистосом

При хрон, формах шистосоматозів, коли освіта гранульом перешкоджає виходу яєць з тканин у просвіт кишечника або в сечовивідні шляхи, застосовують біопсію слизової оболонки прямої кишки, яку виробляють спеціальною ложкою за допомогою ректоскопа, вибираючи ділянку з видимим ураженням. Біопсований шматочок роздавлюють між двома предметними склом і досліджують під мікроскопом. При негативному результаті шматочки просвітлюють у 4% розчині їдкого лугу і готують гістол. зрізи. Біопсію слизової оболонки худої кишки виробляють перорально та отриманий матеріал досліджують комперсійним методом або готують із нього гістол, зрізи. У ряді випадків сечостатевого шистосоматозу діагноз може бути поставлений тільки на підставі ендовезикальної біопсії. При гепатолієнальній формі шистосоматозу виробляють пункційну біопсію печінки; з отриманого матеріалу готують гістол, зрізи та досліджують їх під люмінесцентним мікроскопом. Люмінесцентний мікроскоп з темним полем використання та для дослідження тканин печінки на яйця шистосом. При ураженні шистосомами жіночих статевих шляхів виділення збирають за допомогою вагінального дзеркала або беруть гострою ложечкою шматочки слизової оболонки шийки матки; одержаний матеріал досліджують під мікроскопом на склі в краплі фізіол, розчину.

Дослідження на ентеробіоз та теніїдози

Періанальний зіскрібок (рекомендується брати ввечері, через 1 - 1,5 години після того, як пацієнт ліг спати, або вранці до туалету). Сірником, зрізаним навскіс і змоченим у краплі рідини (фізіол, розчин, кип'ячена вода або 2% розчин двовуглекислої соди), нанесеною на предметне скло, обережно роблю? зіскрібок зі слизової оболонки ануса і складок навколо нього (від центру назовні). Зібрану на кінці сірника слиз зчищають краєм покривного скла у краплю рідини на предметному склі та, покривши цим же покривним склом, досліджують. При масових обстеженнях, коли зіскрібки беруть у дитячих чи інших установах, використаний сірник поміщають у краплю рідини на предметному склі, після підсихання краплі покривають іншим предметним склом і доставляють у лабораторію, загорнувши в папір та закріпивши гумкою. Для дослідження ректального слизу користуються спеціальним приладом – трубочкою Шахматова або Ціманна, за допомогою яких беруть слиз із прямої кишки та досліджують мазки під мікроскопом.

Метод із ватним тампоном. Пацієнтам додому видають пробірку з ватним тампоном на скляній чи дерев'яній паличці; вранці пацієнт протирає періанальні складки тампоном, змоченим кип'яченою водоюі поміщає його в пробірку з невеликою кількістю води. У лабораторії тампони прополіскують у тій же пробірці з новою порцією води та осад досліджують після центрифугування.

Целофановий метод Холла (М. С. Hall, 1937). Квадратний шматочок целофану зміцнюють гумкою на скляній паличці. Зіскрібок роблять сухим целофаном і поміщають його в пробірку. У лабораторії целофан злегка зрушують із палички і, зрізавши його кінчик ножицями, розправляють на предметному склі; змочивши децинормальним розчином їдкого натру, покривають покривним склом та досліджують під мікроскопом.

Метод із целюлозною стрічкою Грема (С. F. Graham, 1941). Смужку целюлозної стрічки притискають клейкою стороною до періанальних складок обстежуваного, потім тією ж стороною до предметного скла і досліджують без покривного скла; можна додавати краплю толуєну. В. В. Каледін (1972) для цих цілей запропонував застосовувати целулоїдні диски, вирізані з відмитої рентгенівської плівки та змочені гліцерином; диски досліджують на предметному склі у краплі силікатного клею. Методом із целюлозною стрічкою можна дослідити також білизну дітей.

Піднігтьовий зіскрібок. Краї нігтя, нігтьове ложе, піднігтьові простори змочують 0,5-1% розчином їдкого лугу та протирають вологими ватними тампончиками. Тампони поміщають у центрифужні пробірки з цим розчином, центрифугують і досліджують осад.

Методи дослідження об'єктів довкілляна яйця та личинки гельмінтів (санітарно-гельмінтологічні дослідження)

Дослідження проводять з метою визначення ступеня забрудненості яйцями та личинками гельмінтів об'єктів. зовнішнього середовища. Отримані дані використовують із оцінки сан. стану установ та підприємств та ефективності заходів, що проводяться по боротьбі з гельмінтозами.

При вивченні ступеня забрудненості різних об'єктів навколишнього середовища яйцями та личинками гельмінтів та оцінки їхньої ролі в епідеміології гельмінтозів важливо встановити не тільки кількість знайдених яєць, а й їхню життєздатність та інвазійність, які визначають: а) на вигляд, під мікроскопом; б) фарбуванням різними барвниками, у тому числі люмінесцентними; як правило, живі яйця та личинки не фарбуються; в) культивуванням в оптимальних умовах до інвазійної стадії; г) зараження лабораторних тварин (біопробу).

Дослідження води та каналізаційних стоків. Для одного дослідження використовують 10-25 л води (річок, морів, ставків, купальних басейнів, водопроводу) та 1-2-5 л каналізаційних стоків.

Метод 3. Г. Василькової (1941). Воду або каналізаційні стоки фільтрують через мембранні ультрафільтри в апараті Гольдмана, що складається зі скляної або металевої вирви з фільтрами, з'єднаної за допомогою кільця-насадки з колбою Бунзена. Для прискорення процесу фільтрації до апарата підключають вакуумний насос. Після фільтрації мембранні фільтри переглядають під мікроскопом, просвітлюючи їх 50% розчином гліцерину; осад, що скупчився, зчищають і переглядають окремо у вигляді мазків. Застосовуються фільтрувальні апарати та інших конструкцій.

Метод Г. Ш. Гуджабідзе та Г. А. Юдіна (1963) для дослідження каналізаційної рідини. 1 л рідини відстоюють 2 години в циліндрі Лисенка; одержаний осад (5-9 мл) обробляють, як при дослідженні ґрунту (див. нижче).

Метод М. А. Романенка (1967). До 1л стічної рідини, поміщеної в скляний циліндр ємністю 1200-1500 мл, додають 0,4-0,6 г сірчанокислого алюмінію або хлорного заліза (з метою коагулювання, що прискорює процес осадження зважених частинок) і через 40 хв. суміш центрифугують 3 хв. при 1000 об/хв; верхній шар зливають, а для розчинення пластівців додають 1-2 мл 3% розчину соляної кислоти, потім 150 мл насиченого розчину азотнокислого натрію. Опад досліджують, як ґрунт.

Дослідження ґрунту

Забрудненість ґрунту яйцями гельмінтів визначають з метою виявлення вогнищ гельмінтозів та оцінки ефективності роботи з їхнього оздоровлення.

Метод 3. Г. Василькової та В. А. Гефтер (1948). 12,5 г ґрунту змішують у пробірках (об'ємом 100 мл) з нержавіючої сталі або латуні з 20 мл 5% розчину їдкого лугу, додавши 10 скляних бусинок або дрібних камінців. Пробірки закривають гумовими пробками та струшують протягом 20 хв. в апараті для струшування або вручну. Вийнявши пробки, пробірки центрифугують 3-5 хв., Зливають поверхневу рідину, до осаду додають 60-80 мл насиченого розчину азотнокислого натрію і, ретельно перемішавши, знову центрифугують 3-5 хв. У цю поверхневу плівку зі спливлими яйцями знімають, торкаючись поверхні суміші складною петлею (5-6 петель, з'єднаних на загальному стрижні), і переносять у стаканчик з водою; перемішують з тим самим розчином, центрифугують; всю процедуру повторюють щонайменше 3 раз. Вміст стаканчика, куди переносять плівку, розбавляють водою та фільтрують через мембранні фільтри, які досліджують під мікроскопом у краплі гліцерину.

Метод 3. Г. Василькової та В. А. Гефтер у модифікації А. А. Намітокова (1961) відрізняється від основного методу тим, що замість дослідження препаратів плівки використовують половину вмісту пробірки (щоразу додаючи нову порцію насиченого розчину азотнокислого натрію), фільтрують та досліджують фільтри.

Н. А. Романенко (1968) рекомендує досліджувати на яйця гельмінтів проби ґрунту та осаду стічних вод за допомогою апарату, запропонованого Г. Ш. Гуджабідзе. 50 г ґрунту ретельно перемішують протягом 1 хв. в 150 мл води в центрифужних пробірках (ємністю 250 мл) спеціальними лопатями, що наводяться в дію електромотором. Суміш центрифугують 3 хв. при 1000 об/хв, зливають воду і, додавши 150 мл насиченого розчину азотнокислого натрію, перемішують і знову центрифугують 3 хв. Пробірки з пробами встановлюють штатив, доливають розчин азотнокислого натрію до утворення опуклого меніска, покривають предметними склом (10 х 6 см) і відстоюють 10-15 хв., потім скла знімають і досліджують; процедуру повторюють щонайменше 4 раз.

Дослідження на личинки гельмінтів методом Берманна (1917). 200-400 г ґрунту поміщають у шматочку марлі на металеву сітку (з діам, отворів 1-2 мм), надіту на широку частину скляної лійки, укріпленої в штативі. На вузький кінець вирви натягнута гумова трубка із затискачем. Вирву наповнюють теплою (t° 50°) водою так, щоб нижня частина сітки з ґрунтом стикалася з водою. Через термотропність личинки активно виповзають у теплу воду і, осідаючи, накопичуються в нижній частині гумової трубки над затискачем. Через 3-4 години з вирви випускають у пробірку 50 мл вмісту, центрифугують та досліджують осад.

Дослідження овочів, фруктів та ягід

Досліджують переважно овочі, ягоди та фрукти, які вживаються в їжу без термічної обробки. Метод 3. Г. Василькової (1948). По 5-10 штук овочів або фруктів (бл. 0,5 кг) або 100-200 г зелені (салат, зелена цибуля) заливають на кілька годин водою в широкогорлих скляних банках з притертими пробками і струшують 10-20 хв. в апараті для струшування або вручну. Воду зливають, досліджувані об'єкти прополіскують чистою водоюі всю воду, що змиває, фільтрують в апараті Гольдмана; фільтри досліджують, просвітлюючи гліцерином. Можна фарбувати фільтри 25% розчином Люголя в гліцерині; при цьому яйця гельмінтів забарвлюються в коричневий колірта їх легко розпізнати серед крохмальних зерен, пофарбованих у синій колір. Великий осад обробляють, як ґрунт.

Дослідження змивів з предметів побуту та з рук. Пензликом для клею (або ватним тампоном, обгорнутим шматочком капронової тканини), змоченою в 2% розчині двовуглекислої соди, багаторазово проводять по обстежуваному предмету або рукам, після чого обполіскують в тому ж розчині, налитому в пробірку. У лабораторії пензлики та тампони прополіскують чистою водою; всі змивні води центрифугують та досліджують осад.

Метод Ст А. Гефтер (1960). Пил з м'якого інвентарю ефективніше збирати за допомогою пилососа, підключеного до вирви, яка складається з 2 роз'ємних частин: на поверхню нижньої частини, покритої металевою або пластмасовою сіткою, поміщають мембранний фільтр і зміцнюють його, надівши верхню частинуворонки. Зібрану вирву приєднують до шлангу пилососа гумовою трубкою. Пил із предмета збирають протягом 3 хв., після чого фільтр виймають та замінюють новим. У лабораторії фільтри переглядають під мікроскопом, просвітлюючи їх гліцерином. Якщо шар пилу на фільтрі великий, його зішкрібають і переглядають у вигляді мазків або обробляють, як ґрунт.

Імунологічні методи діагностики

Можливість використання імунолу. методів для діагностики гельмінтозів обумовлена здатністю гельмінтів продукувати активні антигени, що впливають на імунокомпетентні клітини господаря та стимулюють продукцію антитіл. Найбільш ефективні імунодіагностичні методи при кишкових гельмінтозах, коли секрети та екскрети гельмінтів, що мають антигенну активність, потрапляють безпосередньо в кров господаря. Імунол, реакції використовують для діагностики аскаридозу, трихінельозу, філяріатозів, шистосоматозів, ехінококозу та альвеококкозу, цистицеркозу, парагонімозу, симптомокомплексу larva migrans- (токсокароз, ангіостронгілез) та ін. лементу, флюоресціюючих антитіл ) та внутрішньошкірні алергічні проби. Антигени готують з личинок і статевозрілих гельмінтів, використовуючи сольові екстракти гомогенатів свіжозаморожених або ліофілізованих тканин, а також різні біологічно активні рідини (рідина з ехінококових пухирів, порожнинну рідину аскарид та ін.). У зв'язку з тим, що гельмінти мають дуже складну антигенну структуру і в їх антигенній мозаїці є компоненти та окремі детермінанти, що перехресно реагують з іншими видами гельмінтів, бактеріями, антигенами господаря, розробляються методи очищення їх від неспецифічних компонентів. Фракціонування проводять різними методами: гель-фільтрацією в колонках з сефадексами, іонообмінною хроматографією на ДЕАЕ-сефадексі, обробкою кислотами та ін. Фракційні антигени мають зазвичай більш високу специфічність, ніж цілісні екстракти, активність їх приблизно однакова. Імунодіагностичні методи знаходять усі більше застосування. Реакції використовують не тільки для найбільш повного та раннього виявлення хворих, але й для дослідження вогнищ та вивчення епідеміології гельмінтозів.

Серологічні реакції.Реакцію мікропреципітації на живих личинках застосовують для діагностики нематодозів – преімагінальної фази аскаридозу, анкілостомідозів, трихінельозу. Реакція стає позитивною через 5-10 днів після зараження (аскаридозом, анкілостомідозами) і зберігається протягом 90-100 днів. Антигеном є живі личинки нематод, виділені з тканин експериментально заражених лабораторних тварин. Виділених личинок ретельно відмивають від білків господаря стерильним фізіол, розчином та дистильованою водою та по 10-15 прим. поміщають за допомогою пастерівської піпетки на стерильне предметне скло з ямочкою. Наносять 2-3 краплі випробуваної сироватки, накривають стерильним покривним склом, укладають у вологу камеру (чашка Петрі, вистелена зволоженим фільтрувальним папером) і витримують 24-48 год. у термостаті при t° 37°. При позитивній реакції під малим збільшенням мікроскопа видно навколо ротового та анального отворівличинок сірувато-білі, злегка опалесцентні маси преципітатів кулястої або зигзагоподібної форми. Ефективність реакції досягає 85-95%.

Реакція кільцепреципітації розроблена В. П. Пашук (1957) для діагностики трихінельозу. Реакція стає позитивною на 2-3-му тижні хвороби. Ефективність її досягає 80-90%. Антигеном служить екстракт порошку з висушених при t 35 личинок, виділених з м'язів заражених тварин. У пробірки діам. 0,5 см наливають по 0,1 мл кожного розведення антигену і обережно нашаровують на нього (або опускають на дно) однакову кількість випробуваної сироватки так, щоб рідини не змішувалися. Пробірки витримують 30 хв. у термостаті при t° 37°, а потім 30-60 хв. за кімнатної температури. При позитивній реакції на межі зіткнення антигену та сироватки з'являється білувате ніжне кільце, що легко розпадається при струшуванні.

Реакція преципітації в гелі по Оухтерлоню (О. Ouchterlony, 1949) у мікромодифікації А. І. Гусєва та В. С. Цвєткова запропонована І. А. Гіновкером, Є. А. Забозлаєвою, А. В. Дороніним (1970) для діагностики ранньої фази опісторхозу. За попередніми даними, її ефективність становить 87%. Антигеном служить екстракт гомогенату свіжозаморожених статевозрілих опісторхісів, виділених з печінки кішок.

Реакція непрямої гемаглютинації (див.) з діагностикумом - суспензією формалінізованих та танізованих еритроцитів барана, сенсибілізованих ехінококовою рідиною, - розроблена

Л. Н. Степанковської (1972) для діагностики ехінококозу та альвеококозу.

РНГА з діагностикумом з формалінізованих еритроцитів барана, сенсибілізованих екстрактом гомогенату свіжозаморожених цистицерків свинячого ціп'яка, запропонована Л. М. Коноваловою (1973) для діагностики цистицеркозу мозку; вона ефективна у 85% випадків.

РНГА з аскаридним діагностикумом запропонована для діагностики преімагінальної фази аскаридозу.

Реакція зв'язування комплементу (див.) ставиться за звичайною методикою і використовується для діагностики трихінельозу та цистицеркозу.

Метод люмінесцентних антитіл (непрямий метод). Цей метод з знежиреним сухим гомогенатом цистицерків свинячого ціп'яка як антиген, фіксованим на предметному склі, розроблений JI. М. Коновалової (1973) для діагностики цистицеркозу людини. Та ж реакція з гістолом, зрізами личинок трихінел як антиген розроблена для діагностики трихінеллезу.

E. С. Лейкіна, В. А. Гефтер.

При виявленні яєць гельмінтів на різних об'єктах навколишнього середовища (ґрунт, вода, овочі та ін.) завжди необхідно визначати їх життєздатність на вигляд, фарбуванням вітальними фарбами, культивуванням в оптимальних умовах і постановкою біологічної проби, тобто.

Згодовуванням лабораторним тваринам.

Визначення життєздатності яєць або личинок гельмінтів на вигляд. Яйця гельмінтів мікроскопують спочатку при малому, потім за великому збільшенні. У деформованих і мертвих яєць гельмінтів оболонка розірвана або прогнута всередину, мутна плазма, розпушена. У сегментованих яєць кулі дроблення (бластомери) нерівного розміру, неправильної форми, часто зрушені одного полюсу. Іноді зустрічаються аномальні яйця, які, маючи зовнішні потворності, розвиваються нормально. У живих личинок аскарид дрібна зернистість є лише у середній частині тіла, у міру їх загибелі зернистість поширюється у всьому тілі, з'являються великі блискучі гіалінові вакуолі - звані перлинні нитки.

Для визначення життєздатності зрілих яєць аскарид, волосоголовців, гостриків слід викликати активні рухи личинок легким підігрівом препарату (до температури не вище 37 °С). Життєздатність личинок аскарид та волосоголовців зручніше спостерігати після їх виділення із шкаралупи яйця натисканням на покривне скло препарату препарувальною голкою або пінцетом.

У інвазійних личинок аскарид часто помічається чехлик, що відшарувався на головному кінці, а в личинок власоголовів, що закінчили розвиток в яйці, на цьому місці при великому збільшенні виявляється стилет. У загиблих личинок гельмінтів незалежно від місця їхнього перебування (в яйці або поза ним) помічають розпад тіла. При цьому внутрішня структураличинки стає глибчастою або зернистою, а тіло каламутним і непрозорим. У тілі виявляються вакуолі, але в кутикулі - розриви.

Життєздатність онкосфер теніїд (бичачого, свинячого ціп'яків та ін.) визначають за рухом зародків при впливі на них травних ферментів. Яйця поміщають на годинникове скло зі шлунковим соком собаки або штучним соком дуоденальним. склад останнього: панкреатину 0,5 г, натрію бікарбонату 0,09 г, дистильованої води 5 мл. Годинникове скло з яйцями ставлять у термостат при 36-38 “З на 4 год. При цьому живі зародки звільняються від оболонок. Оболонки живих онкосфер також розчиняються в підкисленому пепсині та в лужному розчинітрипсину через 6-8 годин у термостаті при 38 °С.

Якщо помістити яйця тенію в 1% розчин натрію сульфіду, або 20% розчин натрію гіпохлориду, або ж в 1% розчин хлорної води при 36-38 ° С, зрілі та живі зародки звільняються від оболонок і не змінюються протягом 1 доби. Незрілі і мертві онкосфери зморщуються або набухають і різко збільшуються, а потім «розчиняються» протягом 10 хв - 2 год. 38 °С.

Життєздатність сколексів ехінококів визначають при слабкому нагріванні. Для цього відмиті у воді сколекси або виводкові капсули поміщають у краплю води на предметне скло з ямочкою, покривають покривним склом і досліджують під мікроскопом з нагрівальним столиком при температурі 38-39 °С. Якщо немає нагрівального столика, препарат підігрівають за допомогою будь-якого джерела тепла. При цьому життєздатні сколекс активно рухаються, скорочуючи або розслаблюючи присоски, подовжуючи і коротшаючи хоботок. Якщо помістити сколекси в 0,5-1% водний розчинфіліцилену при кімнатній температурі, то всі життєздатні сколекси швидко вивернуться і загинуть. Нежиттєздатні сколекси у своїй не вивертаються.

Життєздатність адолескаріїв фасціол, зібраних на рослинах та інших об'єктах водойм, перевіряють дослідженням їх на предметному склі у фізіологічному розчині під мікроскопом із нагрівальним столиком. При підігріванні личинки трематоди, що у цисті, починають рухатися.

Життєздатність яєць карликового ціп'яка визначають за розташуванням гачків на зародку.

У живих яйцях карликового ціп'яка відбуваються мляві маятникоподібні рухи протоплазми і майже непомітні розсування та зрушення загострених кінців латеральної пари гаків в сторони від середньої пари.

Скорочення протоплазми зародка та зародкових гачків допомагають зародку звільнитися спочатку від оболонок онкосфери, а потім від зовнішньої оболонки яйця.

У живому яйці медіанна пара і бічні пари гаків розташовані паралельно, в деяких яйцях леза бічних пар зближені і розташовані по відношенню до середньої пари гачків під кутом менше 45 °.

Зародок, що гине, конвульсивно скорочується і мляво розсовує гаки. У загиблому зародку рух гаків припиняється, і вони розташовуються безладно, іноді ж латеральні по відношенню до сусідньої пари гаки бувають розсунуті під прямим, тупим або гострим кутом.

Іноді спостерігаються зморщування зародка, утворення зернистості. Більш точний метод, заснований на появі онкосферних рухів при різкій зміні температур: від 5-10 до 38-40 °С.

Визначення життєздатності незрілих нематод слід вивчати у вологій камері (чашках Петрі), поміщаючи яйця аскарид у 3% розчин формаліну, приготований на ізотонічному розчині натрію хлориду при температурі 24-30 ° С, яйця волосоголов у 3 % розчин соляної кислотипри температурі 30-35 ° С, яйця гостриків в ізотонічний розчин хлориду натрію при температурі 37 “С. Чашки Петрі слід відкривати 1-3 рази на тиждень для кращої аерації та знову зволожувати фільтрувальний папір чистою водою.

Спостереження за розвитком яєць гельмінтів ведуть не менше 2 разів на тиждень. Відсутність ознак розвитку протягом 2-3 місяців свідчить про їх нежиттєздатність. Ознаками розвитку яєць гельмінтів є спочатку стадії дроблення, розподіл вмісту яйця на окремі бластомери. Протягом першої доби розвивається до 16 бластомірів, які переходять у другу стадію – морулу тощо.

Яйця анкілостомід культивують у скляному циліндрі (висотою 50 см та діаметром 7 см), закритому пробкою. Суміш із рівних обсягів стерильного піску, деревного вугілляі випорожнень з яйцями анкілостомід, розведену водою до напіврідкої консистенції, обережно наливають на дно циліндра за допомогою скляної трубки. Протягом 1-2-добового відстоювання в темряві при температурі 25-30 ° С з яєць вилуплюються рабдитоподібні личинки, а через 5-7 діб вони стають вже філярієподібними: личинки виповзають вгору по стінках циліндра, де видно навіть неозброєним оком. Природно розвиваються у воді яйця трематод, наприклад опісторхів, дифілоботріїд, фасціол та ін, поміщають на годинникове скло, чашку Петрі або в іншу посудину, наливають невеликий шар звичайної води. При культивуванні яєць фасціол слід врахувати, що вони швидше розвиваються в темряві, при цьому в живих яйцях при температурі 22-24 ° С через 9-12 діб формується мірацидій. При мікроскопуванні яєць, що розвиваються, трематод добре помітні рухи мірацидію. Мірацидій фасціоли з оболонок яйця виходить лише на світлі. При культивуванні воду змінюють через 2-3 добу.

Личинки анкілостомід і стронгілоїд культивують на агарі в чашці Петрі з тваринним вугіллям. Після перебування в термостаті при температурі 26-30 ° С протягом 5-6 діб личинки розповзаються по агару, залишаючи за собою доріжку з бактерій (метод Фюллеборна).

Метод Harada та Mori (1955). У пробірки, вміщені в штатив, додають 7 мл дистильованої води. Дерев'яною паличкою беруть 0,5 г випорожнень і роблять мазок на фільтрувальному папері (15X150 мм) в 5 см від лівого краю (цю операцію проводять на аркуші паперу, щоб захистити поверхню лабораторного столу). Потім смужку з мазком вставляють пробірку так, щоб вільний від мазка лівий кінець досягав дна пробірки. Верхній кінець накривають шматком целофану і щільно охоплюють резинкою. На пробірці пишуть номер та прізвище обстежуваного. У такому стані пробірки зберігають протягом 8-10 діб за температури 28 °С. Для вивчення культури знімають та видаляють целофанову покришку та витягують пінцетом смужку фільтрувального паперу. При цьому слід виявляти обережність, оскільки невелика кількість інвазійних личинок може пересуватися до верхнього кінця фільтрувального паперу або стінки пробірки і проникати під поверхню целофану.

Пробірки поміщають у гарячу водяну баню при температурі 50 °С на 15 хв, після чого їх струшують і швидко переливають в 15-мілілітрову пробірку для осадження личинок. Після центрифугування надосадову рідину видаляють, а осад переносять на предметне скло, покривним покривним склом і мікроскопують під малим збільшенням.

Для диференціального діагнозу філярієподібних личинок необхідно користуватися даними, наведеними в табл. 13.

Методи фарбування яєць та личинок гельмінтів. Мертві тканини здебільшого сприймають фарби швидше, ніж живі. Ці особливості використовують у гельмінтології для визначення життєздатності яєць та личинок гельмінтів. Однак у окремих випадках деякі фарби краще сприймаються живими тканинами, ніж мертвими.

Таблиця 13 Диференційна діагностикафілярнеподібних личинок A.duodenale, N.americanus, Strongyloides stercoralis, Trichostrongylus spp.

Для диференціального розпізнавання живих та мертвих яєць та личинок застосовують такі фарби та способи.

Для фарбування живих та мертвих тканин використовують лейкобазу метиленового синього. Жива клітина або тканина редукують метиленовий синій в безбарвну лейкобазу, мертва тканина не має такої здатності, тому набуває забарвлення.

Для фарбування яєць аскарид можна використовувати метиленовий синій у розчині молочної кислоти з їдким лугом (метиленового синього 0,05 г, їдкого натру 0,5 г, молочної кислоти 15 мл). Живі яйця забарвлення не сприймають, зародки мертвих яєць забарвлюються у синій колір.

Метод фарбування не застосовується для незрілих яєць аскарид і волосоголовців; пігментована оболонка фарбується, і тому не видно, чи забарвилася зародкова клітина всередині яйця.

Фарбування личинок аскарид основним розчином фарби діаманткрезилового синього концентрації 1:10 ТОВ здійснюють наступним чином: на предметне скло наносять краплю рідини з яйцями аскарид та краплю основного розчину фарби. Препарат накривають покривним склом, яке щільно притискають до предметного при легкому постукуванні препарувальною голкою. Під мікроскопом спостерігають кількість личинок, що вийшли, і ступінь їх офарблюваності, після чого цей же препарат переглядають повторно через 2-3 год. Живими вважаються тільки недеформовані личинки, що не забарвилися протягом 2 год.

Вказується можливість фарбування препаратів розчином йоду щодо життєздатності яєць аскаридий птахів. Як барвник у цьому випадку використовують 5% спиртовий розчин йоду. При його нанесенні на препарат зародки мертвих яєць аскаридій протягом 1-3 секунд забарвлюються в оранжевий колір. Мертві яйця опісторха та онкосфери бичачого ціп'яка забарвлюються розчином толуїдинового синього (1:1000), а мертві онкосфери бичачого ціп'яка - розчином діаманткрезилового синього (1:10 000). При цьому набувають кольору зародка та оболонки як мертвих, так і живих яєць. Тому після фарбування яйця та онкосфери відмивають у чистій водіі додатково забарвлюють сафраніном (у розведенні 1:10 000 10% розчину спирту). Спирт видаляє фарбу з оболонок, а сафранін надає їм червоного кольору. В результаті живі яйця забарвлюються у червоний колір, зародок у мертвих – у синій, а оболонка залишається червоною. Мертві зародки онкосфер бичачого ціп'яка швидко, протягом декількох хвилин, забарвлюються в яскраво-червоний або рожевий колір сафраніном або в синій колір діаманткрезиловим синім у розведенні 1:4000 або індигокарміном у розведенні 1:1000-1:2000.

Живі зародки не змінюються під впливом цих фарб навіть через 2-7 год.

Для визначення життєздатності яєць карликового ціп'яка рекомендується використовувати наступні фарби: 1) діаманткрезиловий синій (1:8000) - через 1 год у мертвих яєць особливо яскраво забарвлюється онкосфера, яка різко виділяється на блідому або безбарвному тлі решти яйця; 2) сафранін: у розведенні 1:8000 при дії протягом 2 год та 1:5000 – протягом 3-5 год; 3) 50% розчин пирогалловой кислоти в розведенні 1:2 - при дії протягом 1 год при температурі 29-30 “З (що нижча температура, то триваліший процес фарбування).

Живі плероцеркоїди широкого лентеца дуже добре фарбуються водним розчином (1:1000) нейтральрот протягом 5-20 хв. Для отримання стійкого рожевого забарвлення, що не зникає протягом 5 діб і не впливає на рухливість плероцеркоїдів, зазвичай достатньо 10 хв. Ступінь забарвлення контролюють шляхом перегляду личинок у чистому ізотонічному розчині хлориду натрію, для чого плероцеркоїдів періодично вилучають з фарби. Доцільно застосовувати метиленовий синій для фарбування мертвих плероцеркоїдів.

Р.Э.Чобанов та інших. (1986) запропонували методику визначення життєздатності яєць і личинок гельмінтів з використанням барвником пігменту «рубрин», одержуваного при культивуванні цвілевого гриба Peniciliium rubrum. Для цього використовують 3% водний розчин барвника.

Процес забарвлення яєць і личинок завершується через 1,5 год. Нежиттєздатні яйця гостриків, бичачого і карликового ціп'яків, анкілостомід, трихостронгілід набувають інтенсивного рожевого кольору, личинки анкілостомід і трихостронгілід - червоний. Менш яскраве забарвлення спостерігається у яєць аскарид та волосоголовців, оскільки, виділяючись з кишечника, вони вже мають темно-коричневий колір: Життєздатні яйця та личинки не забарвлюються.

Фізико-хімічні методи стимуляції виходу мирувдії з яєць трематод. Методи розроблені С.М.Герман та С.А.Беером (1984) для визначення життєздатності яєць опісторхів та дикроцеліумів шляхом впливу реакційного середовища на яйця. Якщо вони живі, відбувається виходження мирацидію. Методи засновані на фізикохімічній активації залози вилуплення мірацидію та стимуляції рухової активностіличинки. Стимуляція досягається впливом на яйця трематоди спеціального реакційного середовища у поєднанні з послідовними прийомами – створенням перепаду температур, підсушуванням суспензії яєць, впливом слабкого струму рідини в досліджуваній краплі, які сприяють масовому виходу мироцидів із яєць.

Визначення життєздатності яєць опісторха за методом Герман, Беера. Завис яєць у воді (водопровідній, що відстояла) попередньо охолоджують до 10-12 °С. Усі наступні операції здійснюють за кімнатної температури (18-22 °С). У центрифужну пробірку вносять одну краплю (приблизно 0,05 мл) суспензії, що містить 100-400 яєць. Пробірки ставлять до штатива на 5-10 хв, щоб осадити яйця. Потім вузькою смужкоюфільтрувального паперу обережно відсмоктують надлишок води до повного видалення. У пробірку додають 2 краплі середовища, струшують, вміст переносять піпеткою на предметне скло і залишають на 5-10 хв, злегка похитуючи (або поміщають під фен) для створення слабких струмів рідини в досліджуваній краплі суспензії. Ця операція, що імітує перистальтику кишківника молюска, дозволяє активізувати вихід мірацидіїв. Після цього до суспензії додають ще 2 краплі середовища і потім мікроскопують препарат за допомогою звичайного світлового мікроскопа (Х200). За цей час у яєць із життєздатним мирацидієм має відкритися кришечка, при цьому личинка активно виходить у середу. Завдяки наявності в ній етанолу мірацидій через 3-5 хв знерухомлюється, а потім фарбується барвником, що знаходиться в середовищі. У результаті легко виявляють та підраховують мірацидії.

Приготування реакційного середовища. Середовище готують на 0,05 М трис-HCi буфері в оптимальних режимах pH 8,0-9,5. У буфер додають етанол до 10-13 % і барвник (сафранін, метиленовий синій та інші, що працюють у межах pH) до слабкого фарбуваннярідини (наприклад, для сафраніну його кінцева концентрація становитиме 1:50 000). Можна використовувати інший буфер, що працює в лужних межах pH, наприклад 0,05 М фосфатний (pH 8,5). Отже, середовище містить 96% етанол – 12 частин; барвник (матковий розчин) – 1-10 частин; 0,05 М тріс-НС! буфер (pH 8,5-9,5) – до 100 частин. Приклад середовища: 12 частин 96% етанолу, 1 частина насиченого розчину сафраніну, решта до 100 частин - 0,05 М буфер трис-HCl, pH 9,5.

Визначення життєздатності яєць дикроцеліуму методом Герман, Беера, Стратана. Краплю суспензії, що містить 100-150 яєць трематоди, поміщають у центрифужну пробірку на 1-2 хв для осадження яєць. Потім обережно підсушують рідину за допомогою смужки фільтрувального паперу. Додають пастерівською піпеткою 1-2 краплі реакційного середовища та інкубують на водяній бані при 28-30 °С 2-3 хв. Склад середовища: 6 частин бутанолу, 94 частини 0,4% розчину хлориду натрію або 0,3% розчину калію хлориду в дистильованій воді. Яйця в середовищі переносять піпеткою на предметне скло і залишають на 1,5-2 години при кімнатній температурі (18-22 °С), при цьому кожні 25-30 хв (у міру підсихання) додають по 1-2 краплі (0,05 мл) розчину бутанолу в дистильованій воді. Після цього препарат мікроскопують при 100-200-кратному збільшенні. Життєздатність визначають за кількістю яєць, що розкрилися, з вийшли мирацидиями. Бутанол проникає через пори оболонки яєць, досягає мірацидіїв та активізує їх. Інкубація при зазначеній температурі посилює цей процес. Бутанол в концентрації 3-7% згубний для мирицидію, що вийшов з яйця. Перенесення суспензії яєць з пробірки на предметне скло дозволяє на момент виходу мірацидію (через 30-40 хв) знизити концентрацію бутанолу за рахунок випаровування до безпечного рівня (1,5-0,5 %). Наявність в середовищі хлориду натрію в концентрації 0,1-0,5% (або хлориду калію в концентрації 0,05-0,4%) зумовлює активність мироцидію, що вийшов. На відміну від дрібних прозорих яєць опісторха яйця дикроцеліуму мають темнозабарвлену оболонку, у них добре помітна кришечка, відкрита після виходу мірацидію. Тому життєздатність яєць дикроцеліуму зручніше оцінювати шляхом підрахунку яєць, що розкрилися, а не фарбування і підрахунку мірацидіїв.

Люмінесцентний метод дослідження яєць та личинок гельмінтів.

Вперше в гельмінтологічній практиці методи люмінесцентної мікроскопії були застосовані в 1955 році. При цьому повідомлялося, що люмінесцентна мікроскопія дає можливість диференціювати живі та мертві об'єкти без пошкодження яйця. Для флюоресценції використовувалися не УФ-промені, а синьо-фіолетова частина видимого світла, зі звичайним мікроскопом та предметним склом; до освітлювача «ОІ-18» застосовувався спеціальний набіркольорові фільтри.

Було встановлено, що живі та мертві яйця аскарид, гостриків, карликових ціп'яків, бичачого ціп'яка, широкого лентеця та інших гельмінтів люмінескують неоднаково. Це явище спостерігається як при первинній люмінесценції без застосування барвників, так і при фарбуванні флюорохромами (акридиновий помаранчевий, корифосфін, примулін, ауролін, сульфат берлерину, трипафлавін, риванол, акрихін та ін.).

Незабарвлені живі несегментовані яйця аскарид світяться яскраво-зеленим світлом із жовтуватим відтінком; у мертвих яєць оболонка випромінює зелене світлозначно яскравіше, ніж темно-зелена зародкова; у яєць аскарид з личинкою проявляється лише оболонка, а в мертвих і оболонка, і личинка яскраво-жовтого кольору.

Непігментовані та несегментовані живі яйця гостриків та карликових ціп'яків випромінюють зеленувато-жовте світло; у мертвих яєць інтенсивно люмінескує оболонка на тлі темно-зеленої зародкової маси. При вторинній люмінесценції (при фарбуванні акридиновим помаранчевим у розведенні 1:10 ТОВ та 1:50 ТОВ від 30 хв до 2 год) оболонка живих та мертвих нематод, трематод та цестод люмінескує неоднаково.

Шкаралупа живих і мертвих Ascaris lumbricoides, Toxocara leonina, Enterobius vermicularis, Hymenolepis nana, H.fraterna, H. diminuta, T.saginatus, D.latum забарвлюється в оранжево-червоний колір. Зародки живих Asc. lumbricoides, T.leonina, H.diminuta, D.latum та онкосфери бичачого ціп'яка люмінескують тьмяним темно-зеленим або сіро-зеленим кольором. Мертві зародки цих яєць гельмінтів випромінюють «гаряче» оранжево-червоне світло. Живі личинки гостриків і токсокар (звільнені від шкаралупи яйця) випромінюють тьмяне сіро-зелене світло, при їх загибелі колір змінюється від головного кінця в світло-зелений, потім жовтий, помаранчевий і, нарешті, яскраво-оранжевий.

При фарбуванні флюорохромами - корифосфілом, примуліном - у мертвих яєць аскарид і волосоголовців спостерігається свічення від лілово-жовтого до мідно-червоного кольору. Життєздатні яйця не люмінескують, а забарвлюються у темно-зелений колір. Живі яйця трематод Paragonimus westermani і Clonorchis sinensis не люмінескують після фарбування акридиновим помаранчевим, а від мертвих яєць виходить жовтувато-зелене світло.

Метод люмінесценції може бути застосований і визначення життєздатності личинок гельмінтів. Так, флюорохромовані розчином акридинового помаранчевого (1:2000) личинки стронгілятів, рабдитат світяться: живі – зеленим (з відтінком), мертві – яскраво-оранжевим світлом. Живі личинки трихінелл не світяться або дають слабке світіння при 10-хвилинній обробці розчинами ізотіоціанату флюоресцеїну, аураміну та ін. Флюорохромовані мертві личинки (в концентрації 1:5000) дають яскраве свічення.

Живі мірацидії, що вийшли з оболонки, випромінюють тьмяне блакитне світло з ледь помітним світло-жовтим віночком вій, але через 10-15 хв після загибелі проявляються яскравим світлом, що горить, світло-зеленим, а потім оранжево-червоним світлом.

КАТЕГОРІЇ

Скринінг

УЗД кінцівок

Види УЗД

УЗД черевної порожнини

УЗД грудної клітки

ПОПУЛЯРНІ СТАТТІ

	Як знайти учасника вів на прізвище у військовому архіві
	Переможна дорога червоної армії
	Зміни, які вносяться до актів уряду Російської Федерації з питань перевезення великовагових вантажів автомобільними шляхами Російської Федерації
	Форма Російської армії. І. Іллюхін. Уніформа наполеонівської армії. Піхотні головні убори Форма офіцера російської армії 1812
	Журнал реєстрації електроенергії в снт

2023 «kingad.ru» - УЗД дослідження органів людини