Falošne negatívny test – nepriamy Coombsov test. Coombsov test: priamy a nepriamy

– antiglobulínový test zameraný na identifikáciu v Rh-negatívnej krvi neúplných antierytrocytových protilátok proti Rh faktoru – špecifickému proteínu, ktorý sa nachádza na povrchu erytrocytov Rh-pozitívnej krvi. Sú dva typy tento test: priamy – dôkaz protilátok na povrchu červených krviniek, nepriamy – dôkaz protilátok v krvnom sére. Priame testovanie sa vykonáva pri diagnostike a monitorovaní liečby krvných ochorení: hemolytická anémia, hemolytická choroba novorodencov a iných. Nepriamy test sa vykonáva na posúdenie kompatibility krvi darcu a príjemcu počas transfúzie, ako aj na zistenie prítomnosti a rizika Rh konfliktu pri plánovaní a riadení tehotenstva. Materiál pre Coombsov test je odkysličená krvŠtúdia sa uskutočňuje metódami založenými na aglutinačnej reakcii. Normálne dávajú oba testy negatívny výsledok. Analýza je dokončená do jedného dňa. Celkovo sa v Moskve našlo 87 adries, kde bolo možné vykonať túto analýzu.

– antiglobulínový test zameraný na identifikáciu v Rh-negatívnej krvi neúplných antierytrocytových protilátok proti Rh faktoru – špecifickému proteínu, ktorý sa nachádza na povrchu erytrocytov Rh-pozitívnej krvi. Existujú dva typy tohto testu: priamy - detekcia protilátok na povrchu červených krviniek, nepriamy - detekcia protilátok v krvnom sére. Priame testovanie sa vykonáva pri diagnostike a monitorovaní liečby krvných ochorení: hemolytická anémia, hemolytická choroba novorodencov a iné. Nepriamy test sa vykonáva na posúdenie kompatibility krvi darcu a príjemcu počas transfúzie, ako aj na zistenie prítomnosti a rizika Rh konfliktu pri plánovaní a riadení tehotenstva. Materiál pre Coombsov test je venózna krv, štúdia sa uskutočňuje metódami založenými na aglutinačnej reakcii. Zvyčajne oba testy dávajú negatívny výsledok. Analýza je dokončená do jedného dňa.

Coombsov test - klinická štúdia Rh-negatívna krv, zameraná na detekciu protilátok proti Rh faktoru. Test sa používa na identifikáciu rizika vzniku Rh konfliktu a hemolytických reakcií. U každého človeka obsahuje povrch červených krviniek určitý súbor antigénov alebo aglutinogénov – zlúčenín rôzneho charakteru, podľa prítomnosti alebo neprítomnosti ktorej krvnej skupiny a Rh faktora sa posudzuje. Existuje mnoho typov antigénov, vrátane lekárska prax najväčší praktický význam majú aglutinogény A a B, ktoré určujú krvnú skupinu, a aglutinogén D, ktorý určuje Rh faktor. O pozitívny Rh faktor Antigény D sa detegujú na vonkajšej membráne erytrocytov, ale nie, ak sú negatívne.

Coombsov test, nazývaný aj antiglobulínový test, je zameraný na zistenie neúplných antierytrocytových protilátok proti systému Rh faktora v krvi. Protilátky proti Rh faktoru - špecifické imunoglobulíny, ktoré vznikajú v Rh-negatívnej krvi pri vstupe erytrocytov s aglutinogénmi D. Môže k tomu dôjsť pri zmiešaní krvi plodu a tehotnej ženy, pri krvných transfúziách vykonávaných bez predchádzajúcej krvnej skupiny. Coombsov test existuje v dvoch verziách – priamej a nepriamej. Pri vykonávaní priameho Coombsovho testu sa zisťujú protilátky pripojené k povrchu červených krviniek. Štúdia sa používa na určenie príčiny hemolytickej reakcie. Nepriamy Coombsov test je zameraný na detekciu protilátok proti erytrocytom v krvnej plazme. Je potrebné zistiť kompatibilitu krvi medzi darcom a príjemcom alebo matkou a plodom a pomáha predchádzať rozvoju Rh konfliktu a následnej hemolýze červených krviniek.

Krv pre obe verzie Coombsovho testu sa odoberá zo žily. Analýza sa uskutočňuje aglutináciou s použitím antiglobulínového séra. Výsledky štúdie sa využívajú v hematológii na identifikáciu príčin hemolytických reakcií, v chirurgii a resuscitácii pri vykonávaní krvných transfúzií, v pôrodníctve a gynekológii pri sledovaní tehotenstiev u žien s Rh negatívnou krvou.

Indikácie

Pri hemolytických reakciách (deštrukcia červených krviniek) sa predpisuje priamy Coombsov test, ktorý zisťuje protilátky naviazané na povrchu červených krviniek. rôzneho pôvodu. Štúdia je indikovaná pri primárnej autoimunitnej hemolytickej anémii, posttransfúznej hemolytickej anémii, hemolytickej chorobe novorodenca, hemolýze erytrocytov spôsobenej autoimunitnými, nádorovými alebo infekčnými ochoreniami, ako aj odbery lieky napríklad chinidín, metyldopa, prokaínamid. Na zabránenie vzniku Rh konfliktu sa používa nepriamy Coombsov test, ktorý určuje protilátky v krvnej plazme. Je indikovaný pacientom pri príprave na transfúziu krvi, ako aj tehotným ženám s negatívny Rh faktor za predpokladu, že budúci otec dieťa má pozitívny Rh faktor.

Na stanovenie Rh kompatibility sa Coombsov test nepredpisuje pacientom s Rh-pozitívnou krvou. V týchto prípadoch sú už na povrchu červených krviniek antigény, tvorbu protilátok nemôže vyprovokovať krvná transfúzia ani vstup krvi plodu do krvného obehu tehotnej ženy. Štúdia tiež nie je indikovaná pre tehotné ženy, ak majú obaja rodičia negatívny Rh faktor – dedičnú recesívnu vlastnosť. Dieťa v takýchto pároch vždy má Rh negatívna krv imunologický konflikt s matkou je nemožný. O hemolytické patológie Antiglobulínový test sa nepoužíva na sledovanie úspešnosti liečby, pretože výsledky neodrážajú aktivitu procesu deštrukcie červených krviniek.

Obmedzením Coombsovho testu je zložitosť výskumného postupu – získať spoľahlivé výsledky je potrebné dodržiavať teplotné a časové podmienky, pravidlá na prípravu činidiel a biomateriálov. Medzi výhody Coombsovho testu patrí jeho vysoká citlivosť. Pri hemolytickej anémii zostávajú výsledky tohto testu pozitívne, aj keď sú hladiny hemoglobínu, bilirubínu a retikulocytov normalizované.

Príprava na analýzu a zber materiálu

Materiál použitý na vykonanie Coombsovho testu je venózna krv. Špeciálne požiadavky Nie je čas na odber krvi a prípravu pacienta. Ako pri každej štúdii sa odporúča urobiť si prestávku po jedle aspoň 4 hodiny a prestať fajčiť na posledných 30 minút. fyzická aktivita, vyhnúť sa emocionálny stres. Tiež sa oplatí vopred prediskutovať s lekárom potrebu prestať užívať lieky – niektoré lieky môžu skresliť výsledky Coombsovho testu. Krv sa odoberá pomocou injekčnej striekačky z ulnárna žila, menej často zo žily na zadná strana kefy V priebehu niekoľkých hodín je materiál doručený do laboratória.

Pri vykonávaní priameho Coombsovho testu sa do krvného séra pacienta pridá antiglobulínové sérum. Po určitom čase sa zmes vyšetruje na prítomnosť aglutinátov – tie sa tvoria, ak sú na červených krvinkách protilátky. Ak je výsledok pozitívny, určí sa aglutinačný titer. Nepriamy Coombsov test pozostáva z viac etapy. Po prvé, protilátky prítomné v sére sa počas inkubácie fixujú na injikované červené krvinky. Potom sa do vzorky pridá antiglobulínové sérum, po určitom čase sa stanoví prítomnosť a titer aglutinátov. Doba analýzy je 1 deň.

Normálne výsledky

Za normálnych okolností je výsledok priameho Coombsovho testu negatívny (-). To znamená, že v krvi nie sú žiadne protilátky spojené s červenými krvinkami a nemôžu spôsobiť hemolýzu. Normálny výsledok Nepriamy Coombsov test je tiež negatívny (-), to znamená, že v krvnej plazme nie sú žiadne protilátky proti Rh faktoru. Pri príprave na transfúziu krvi pre príjemcu to znamená kompatibilitu s krvou darcu, pri sledovaní tehotenstva to znamená absenciu Rh senzibilizácie matky, nízke riziko vzniku imunologického konfliktu. Fyziologické faktory, ako sú stravovacie návyky resp fyzická aktivita, nemôže ovplyvniť výsledok testu. Preto, ak je výsledok pozitívny, je potrebná konzultácia s lekárom.

Diagnostická hodnota analýzy

Pozitívny výsledok Coombsovho testu je vyjadrený kvalitatívne, od (+) do (++++), alebo kvantitatívne, titrami od 1:16 do 1:256. Stanovenie koncentrácie protilátok na červených krvinkách a v krvnom sére sa vykonáva v oboch typoch vzoriek. Ak je priamy Coombsov test pozitívny, na vonkajšej membráne červených krviniek sa zistia protilátky, ktoré vedú k zničeniu týchto krviniek. Príčinou môže byť transfúzia krvi bez predchádzajúcej typizácie – potransfúzna hemolytická reakcia, ako aj erytroblastóza novorodenca, hemolytická reakcia v dôsledku užívania liekov, primárna alebo sekundárna autoimunitná hemolytická anémia. Sekundárnu deštrukciu červených krviniek môže spôsobiť systémový lupus erythematosus, Evansov syndróm, Waldenströmova makroglobulinémia, paroxyzmálna studená hemoglobinúria, chronická lymfocytová leukémia, lymfóm, infekčná mononukleóza, syfilis, mykoplazmatická pneumónia.

Pozitívny výsledok nepriameho Coombsovho testu naznačuje prítomnosť protilátok proti Rh faktoru v plazme. V praxi to znamená, že došlo k Rh senzibilizácii a existuje možnosť rozvoja Rh konfliktu po infúzii darcovskej krvi počas tehotenstva. Aby sa predišlo komplikáciám v tehotenstve, ženy s pozitívnym výsledkom Coombsovho testu sú zaradené do špeciálneho registra.

Liečba abnormalít

Coombsov test sa týka izoserologických štúdií. Jeho výsledky umožňujú identifikovať hemolytickú reakciu, ako aj určiť kompatibilitu krvi darcu a príjemcu, matky a plodu, aby sa zabránilo rozvoju Rh konfliktu. Ak je výsledok testu pozitívny, potom musíte požiadať o radu svojho ošetrujúceho lekára - pôrodníka-gynekológa, hematológa, chirurga.

Protilátky, nachádzajúce sa na povrchu erytrocytov, môžu byť buď v statickom alebo voľnom stave v krvná plazma. V závislosti od stavu protilátok sa uskutočňuje priama alebo nepriama Coombsova reakcia. Ak existuje dôvod domnievať sa, že protilátky sú fixované na povrchu červených krviniek, vykoná sa priamy Coombsov test. V tomto prípade test prebieha v jednej etape – sčítaní antiglobulínové sérum. Ak sú na povrchu červených krviniek prítomné neúplné protilátky, aglutináciačervené krvinky

Nepriama reakcia

Nepriama Coombsova reakcia prebieha v 2 stupňoch. Najprv musíte umelo implementovať senzibilizáciačervené krvinky Za týmto účelom sa inkubujú červené krvinky a testované krvné sérum, čo spôsobí fixáciu protilátok na povrchu červených krviniek. Potom sa uskutoční druhá fáza testu Coombs - pridanie antiglobulínového séra.

Zrážacia reakcia - RP (z lat. praecipilo zrazenina) je tvorba a precipitácia komplexu rozpustného molekulového antigénu s protilátkami vo forme zákalu tzv. zrazenina. Vzniká zmiešaním antigénov a protilátok v ekvivalentných množstvách, nadbytok jedného z nich znižuje úroveň tvorby imunitného komplexu. Precipitačná reakcia sa uskutočňuje v skúmavkách (krúžková precipitačná reakcia), v géloch, živných médiách atď. Odrody precipitačnej reakcie v polotekutom agare alebo agarózovom géli, dvojitá imunodifúzia tzv. Ouchterlony, radiapová imunodifúzia, imunoepektroforéza atď.

Reakcia zrážania kruhu. Reakcia sa uskutočňuje v úzkych precipitačných skúmavkách: na imunitné sérum sa navrství rozpustný antigén. Pri optimálnom pomere antigénu a protilátok sa na hranici týchto dvoch roztokov vytvorí nepriehľadná vrstva. precipitačný kruh. Ak sa pri reakcii ako antigény použijú uvarené a prefiltrované tkanivové extrakty, potom sa táto reakcia nazýva prvá termoprecipitačná reakcia (reakcia, pri ktorej sa deteguje antraxový haptén).
Ouchterlonyho dvojitá imunodifúzna reakcia. Na nastavenie reakcie roztopte agarový gél tenká vrstva vyleje sa na sklenenú dosku a po vytvrdnutí sa do nej vyrežú otvory. Antigény a imunitné séra sa umiestnia oddelene do jamiek gélu, ktoré difundujú k sebe. V mieste stretnutia v rovnakých pomeroch tvoria zrazeninu vo forme bieleho pruhu. Vo viaczložkových systémoch sa medzi jamkami s antigénmi a protilátkami objaví niekoľko línií precipitátu; v identických AG sa precipitátové línie spájajú; v neidentických AG sa pretínajú.
Radiálna imunodifúzna reakcia. Imunitné sérum s roztaveným agarovým gélom sa rovnomerne naleje na pohár. Po stuhnutí v géli sa urobia jamky, do ktorých sa vloží antigén v rôznych riedeniach. Antigén difundujúci do gélu vytvára kruhové precipitačné zóny okolo jamiek s protilátkami. Priemer precipitačného prstenca je úmerný koncentrácii antigénu. Reakcia sa používa na stanovenie imunoglobulínov rôznych tried, zložiek komplementového systému atď. v krvnom sére.
Imunoelektroforéza- kombinácia metódy elektroforézy a imunoprecipitácie: zmes antigénov sa zavedie do jamiek gélu a v géli sa rozdelí elektroforézou, potom sa do drážky rovnobežne so zónami elektroforézy pridá imunosérum, ktorého protilátky difundujú do gél a tvoria precipitačné línie v mieste „stretnutia“ s antigénom.
Flokulačná reakcia(podľa Ramona) (z lat. f1oecus - vlnené vločky) - objavenie sa opalescencie alebo flokulentnej hmoty (imunoprecipitácia) v skúmavke počas reakcie toxín - antitoxín alebo toxoid - antitoxín. Používa sa na stanovenie aktivity antitoxického séra alebo toxoidu.

HLA typizácia- štúdium ľudského hlavného histokompatibilného komplexu - HLA komplexu. Táto formácia zahŕňa oblasť génov na chromozóme 6, ktoré kódujú HLA antigény zapojené do rôznych imunitných reakcií.

Úlohy pre HLA typizácia môžu byť veľmi odlišné - biologická identifikácia (typ HLA sa dedí spolu s rodičovskými génmi), určenie predispozície k rôzne choroby, výber darcov na transplantáciu orgánov – ide o porovnanie výsledkov HLA typizácie tkanív darcu a príjemcu. Pomocou typizácie HLA sa zisťuje, nakoľko sú si manželia podobní alebo odlišní z hľadiska histokompatibilných antigénov, aby bolo možné diagnostikovať prípady neplodnosti.

HLA typizácia naznačuje Analýza polymorfizmu HLA a uskutočňuje sa dvoma metódami - sérologickou a molekulárno-genetickou. Klasická sérologická metóda typizácie HLA je založená na mikrolymfocytotoxickom teste a molekulárna metóda využíva PCR (polymerázová reťazová reakcia).

sérologické HLA typizácia uskutočnené na izolovaných populáciách buniek. Antigény hlavného histokompatibilného komplexu nesú hlavne lymfocyty. Preto sa ako hlavné nosiče antigénov triedy I používa suspenzia T lymfocytov a na stanovenie antigénov HLA triedy II suspenzia B lymfocytov. Na izoláciu požadovaných bunkových populácií z plnej krvi sa používa buď centrifugácia alebo imunomagnetická separácia. Predpokladá sa, že prvá metóda môže viesť k falošne pozitívnym údajom, pretože to vedie k smrti niektorých buniek. Druhá metóda sa považuje za špecifickejšiu – viac ako 95 % buniek zostáva životaschopných.

Ale základ pre vykonanie lymfocytotoxického testu HLA typizácia je špecifické sérum obsahujúce protilátky proti rôznym alelickým variantom antigénov HLA triedy I a II. Sérologický test môže určiť typ HLA tým, že skúma, ktoré séra reagujú s lymfocytmi a ktoré nie.

Ak dôjde k reakcii medzi bunkami a sérom, výsledkom je vytvorenie komplexu antigén-protilátka na povrchu bunky. Po pridaní roztoku obsahujúceho komplement nastáva bunková lýza a smrť. Sérologický test typizácie HLA sa hodnotí pomocou fluorescenčnej mikroskopie na vyhodnotenie pozitívnych (červená fluorescencia) a negatívnych (zelená fluorescencia) reakcií alebo mikroskopie s fázovým kontrastom na vyhodnotenie jadrového farbenia mŕtve bunky. Výsledok typizácie HLA je odvodený s prihliadnutím na špecifickosť zreagovaných sér a skrížene reagujúcich skupín antigénov a intenzitu cytotoxickej reakcie.

Nevýhody sérologického HLA typizácia sú prítomnosť skrížených reakcií, slabá afinita protilátok alebo nízka expresia HLA antigénov, neprítomnosť proteínových produktov v rade HLA génov.

Modernejšie, molekulárne metódy HLA typizácia používajú už štandardizované syntetické vzorky, ktoré nereagujú s antigénmi na povrchu leukocytov, ale s DNA a priamo indikujú, ktoré antigény sa vo vzorke nachádzajú. Molekulárne metódy nevyžadujú živé biele krvinky, študovať sa dá akákoľvek ľudská bunka a na prácu stačí pár mikrolitrov krvi, prípadne sa môžete obmedziť na zoškrabovanie z ústnej sliznice.

Molekulárna genetika HLA typizácia využíva metódu PCR, ktorej prvým krokom je získanie čistej genómovej DNA (z plnej krvi, suspenzie leukocytov, tkanív).

Vzorka DNA sa potom skopíruje – amplifikuje in vitro pomocou primerov (krátka jednovláknová DNA) špecifických pre konkrétny lokus HLA. Konce každého páru primérov musia byť striktne komplementárne k jedinečnej sekvencii zodpovedajúcej špecifickej alele, inak nedôjde k amplifikácii.

Po PCR sa pri opakovanom kopírovaní ukáže veľké množstvo fragmenty DNA, ktoré možno hodnotiť vizuálne. Na tento účel sa reakčné zmesi podrobia elektrolýze alebo hybridizácii a pomocou programu alebo tabuľky sa určí, či došlo k špecifickej amplifikácii. Výsledok typizácie HLA je prezentovaný vo forme komplexnej správy na génovej a alelickej úrovni. Vzhľadom na štandardizáciu použitých vzoriek molekulárne HLA typizácia presnejšie sérologické. Okrem toho poskytuje viac informácií (viac nových alel DNA) a ďalšie vysoký stupeň jeho detailovanie, keďže umožňuje identifikovať nielen antigény, ale aj samotné alely, ktoré určujú, ktorý antigén sa na bunke nachádza.

Reakcia imunitnej lýzy. Reakcia je založená na schopnosti špecifických protilátok vytvárať imunitné komplexy s bunkami, vrátane erytrocytov a baktérií, čo vedie k aktivácii komplementového systému po klasickej dráhe a lýze buniek. Z reakcií imunitnej lýzy sa najčastejšie využíva reakcia hemolýza a zriedkavo sa využíva reakcia bakteriolýzy (hlavne pri diferenciácii cholery a cholery podobných vibriónov).

Reakcia hemolýzy. Pod vplyvom reakcie s protilátkami v prítomnosti komplementu sa zakalená suspenzia červených krviniek zmení na jasne červenú číra tekutina- „laková krv“ v dôsledku uvoľňovania hemoglobínu. Pri nastavovaní diagnostickej reakcie fixácie komplementu (FFR) sa hemolytická reakcia používa ako indikátor: na testovanie prítomnosti alebo neprítomnosti (fixácie) voľného komplementu.

Lokálna hemolytická reakcia v géli(Erneova reakcia) je jedným z variantov hemolytickej reakcie. Umožňuje určiť počet buniek tvoriacich protilátky. Počet buniek vylučujúcich protilátky - hemolyzíny - je určený počtom hemolytických plakov, ktoré sa objavujú v agarovom géli obsahujúcom erytrocyty, suspenziu buniek skúmaného lymfoidného tkaniva a komplementu.

Imunofluorescenčná metóda

(RIF, imunofluorescenčná reakcia) je metóda na detekciu špecifických Ag (Abs) pomocou Abs (Ags) konjugovaných s fluorochrómom. Má vysokú citlivosť a špecifickosť. Používa sa na expresnú diagnostiku infekcií. chorôb (identifikácia patogénu vo výskumnom materiáli), ako aj na stanovenie Ab a povrchových receptorov a markerov leukocytov (imunofenotypizácia) a iných buniek. Priama I. m. pozostáva zo spracovania časti tkaniva alebo náteru z patologického materiálu alebo mikrobiálnej kôry obsahujúcej špecifické Ab konjugované s fluorochrómom; prípravok sa premyje, aby sa zbavil nenaviazaných Abs a skúmal sa pod fluorescenčným mikroskopom. V pozitívnych prípadoch sa po obvode objektu objaví žiariace svetlo. imunitný komplex. Kontrola je potrebná na vylúčenie nešpecifickej luminiscencie. O nepriamy. ich. v prvom štádiu sa tkanivový rez alebo náter ošetrí nefluorescenčným špecifickým činidlom, v druhom - luminiscenčným činidlom proti -globulínom zvieraťa, ktoré sa použilo v prvom štádiu. V pozitívnom prípade sa vytvorí svetelný komplex pozostávajúci z Ar, At k nemu a At proti At (sendvičová metóda). Okrem fluorescenčného mikroskopu sa pri fenotypizácii buniek berie do úvahy RIF. laserový triedič buniek .

Prietoková cytometria- metóda optického merania parametrov bunky, jej organel a procesov v nej prebiehajúcich.

Táto technika zahŕňa detekciu rozptylu svetla z laserového lúča pri prechode bunky v prúde kvapaliny a stupeň rozptylu svetla umožňuje získať predstavu o veľkosti a štruktúre bunky. Okrem toho analýza zohľadňuje úroveň fluorescencie chemických zlúčenín, ktoré sú súčasťou bunky (autofluorescencia) alebo pridané do vzorky pred prietokovou cytometriou.

Bunková suspenzia, vopred označená fluorescenčnými monoklonálnymi protilátkami alebo fluorescenčnými farbivami, vstupuje do prúdu tekutiny prechádzajúceho cez prietokovú kyvetu. Podmienky sa vyberajú tak, že sa bunky zoraďujú jedna za druhou kvôli tzv. hydrodynamické zaostrovanie prúdu v prúde. V momente, keď bunka prekročí laserový lúč, detektory zaznamenajú:

rozptyl svetla v malých uhloch (od 1° do 10°) ( túto charakteristiku používané na určenie veľkosti buniek).

rozptyl svetla pod uhlom 90° (umožňuje posúdiť pomer jadro/cytoplazma, ako aj heterogenitu a zrnitosť buniek).

intenzita fluorescencie cez niekoľko fluorescenčných kanálov (od 2 do 18-20) - umožňuje určiť zloženie subpopulácie bunkovej suspenzie atď.

Naneste 1 veľkú kvapku séra O(I), A(II), B(III) na platničku alebo podložné sklíčko pomocou pipiet (rôzne!). Po zaznamenaní času použite čistú sklenenú tyčinku alebo čistý roh podložného sklíčka na spojenie kvapiek séra s kvapkami krvi. Stanovenie trvá 5 minút, pretrepte platňu, potom pridajte 1 kvapku fyziologického roztoku do každej zmesi kvapiek a vyhodnoťte výsledky. Je lepšie, ak sa sérum dodáva v 2 rôznych sériách. Výsledky krvných skupín sa musia zhodovať v oboch šaržiach séra.

Vyhodnotenie výsledkov izohemaglutinácie:

izohemaglutinácia. Ak je reakcia pozitívna, v zmesi sa objavia drobné červené zrnká priľnavých červených krviniek. Zrná sa spájajú do väčších zŕn a tie do vločiek. Sérum je takmer odfarbené;

ak je reakcia negatívna, zmes zostane rovnomerne sfarbená počas 5 minút ružová farba a nenašli sa žiadne zrná;

Pri práci s 3 sérami skupín O(I), A(II), B(III) sú možné 4 kombinácie reakcií:

1. ak všetky 3 séra vykázali negatívnu reakciu, to znamená, že zmes je jednotne sfarbená do ružova - toto je krvná skupina O(I);

   ak iba sérum skupiny A(II) malo negatívnu reakciu a séra O(I) a B(III) dali pozitívnu reakciu, to znamená, že sa objavili zrná - toto je krvná skupina A(II);

   sérum skupiny B(II) vykázalo negatívnu reakciu a séra skupiny O(I) a A(II) vykázali pozitívnu reakciu - toto je krvná skupina B(III).

všetky 3 séra poskytli pozitívne reakcie - testovaná krv bola skupina AB(IV). V tomto prípade sa štúdia uskutočňuje so sérom skupiny AB(IV).

Poznámka! Kvapky testovanej krvi by mali byť 5-10 krát menšie ako kvapky séra.

Izohemaglutinačné chyby.

Neschopnosť vykonať aglutináciu tam, kde by mala byť, a prítomnosť aglutinácie tam, kde by nemala byť. Môže to byť spôsobené slabým titrom séra a zlou aglutináciou červených krviniek.

Prítomnosť aglutinácie tam, kde by nemala byť- Ide o pseudoaglutináciu, keď hromady červených krviniek tvoria „stĺpce mincí“. Potrasenie tanierom alebo pridanie fyziologického roztoku ich ničí.

Panaglutinácia, keď sérum zlepí všetky červené krvinky, vrátane krviniek vlastnej krvnej skupiny. Do 5. minúty príznaky aglutinácie zmiznú.

Existuje aj takzvaná studená panaglutinácia, kedy sa červené krvinky zlepia kvôli nízkej teplote vzduchu (pod 15 °C) v miestnosti.

Vo všetkých týchto prípadoch sa uskutočňuje buď opakovaná reakcia, alebo s použitím štandardných červených krviniek.

Stanovenie Rh krvi

Na stanovenie stavu Rh, t. j. na zistenie prítomnosti alebo neprítomnosti antigénov systému Rh v krvi ľudí, sa používajú štandardné anti-Rh séra (reagenty), ktoré sa líšia špecifickosťou, t. j. obsahujú protilátky proti rôznym antigénom tohto systému. Na stanovenie Rh 0 (D) antigénu sa najčastejšie používa anti-Rhesus sérum s prídavkom 10% roztoku želatíny, alebo sa používa štandardné anti-Rhesus činidlo vopred pripravené s 33% roztokom polyglucínu. Na získanie presnejších výsledkov výskumu, ako aj na identifikáciu antigénov iných sérologických systémov sa používa Coombsov test (je tiež veľmi citlivý pri určovaní kompatibility transfúzovanej krvi). Na výskum sa používa natívna krv alebo krv pripravená s nejakým konzervačným prostriedkom. V tomto prípade by sa krv mala umyť z konzervačnej látky desaťnásobným objemom izotonického roztoku chloridu sodného. Pri určovaní stavu Rh- Rh 0 (D) mali by sa použiť dve vzorky séra alebo anti-Rhesus činidla z dvoch rôznych sérií a súčasne štandardné červené krvinky získané z krvi Rh-pozitívnych (Rh +) a Rh-negatívnych (Rh -) na kontrolu by sa mali využívať jednotlivci. Pri určovaní iných izoantigénov by sa podľa toho mali použiť kontrolné červené krvinky, ktoré obsahujú alebo chýba antigén, proti ktorému sú protilátky v štandardnom sére namierené.

Parciálne tepelné aglutiníny sú najbežnejším typom protilátok, ktoré môžu spôsobiť rozvoj autoimunitnej hemolytickej anémie. Tieto protilátky patria k IgG, zriedkavo k IgM, IgA.

COOMBSOV TEST

Coombsov test: úvod. Coombsov test je laboratórna diagnostická metóda založená na hemaglutinačnej reakcii.

Hlavnou metódou diagnostiky autoimunitnej hemolytickej anémie je Coombsov test. Je založená na schopnosti protilátok špecifických pre imunoglobulíny (najmä IgG) alebo zložky komplementu (najmä S3) aglutinovať erytrocyty potiahnuté IgG alebo S3.

Väzba IgG a C3b na erytrocyty sa pozoruje pri autoimunitnej hemolytickej anémii a liekmi vyvolanej imunitnej hemolytickej anémii. Priamy Coombsov test. Priamy Coombsov test sa používa na detekciu protilátok alebo zložiek komplementu fixovaných na povrchu červených krviniek. Vykonáva sa nasledovne:

Na získanie protilátok proti ľudským imunoglobulínom (antiglobulínové sérum) alebo komplementu (antikomplementárne sérum) sa zviera imunizuje ľudským sérom, imunoglobulínmi alebo ľudským komplementom. Sérum získané zo zvieraťa sa čistí od protilátok proti iným proteínom.

Červené krvinky pacienta sa premyjú fyziologickým roztokom, aby sa úplne odstránilo sérum, ktoré neutralizuje protilátky proti imunoglobulínom a komplementu a môže spôsobiť falošne negatívny výsledok.

Ak sú protilátky alebo zložky komplementu fixované na povrchu červených krviniek, pridanie antiglobulínu alebo antikomplementového séra spôsobí aglutináciu červených krviniek.

Priamy Coombsov test sa používa v nasledujúcich prípadoch:

Autoimunitná hemolýza.

Hemolytická choroba novorodencov.

Imunitná hemolytická anémia vyvolaná liekmi.

Hemolytické transfúzne reakcie. Nepriamy Coombsov test. Nepriamy Coombsov test zisťuje protilátky proti červeným krvinkám v sére. Na tento účel sa sérum pacienta inkubuje s červenými krvinkami darcu skupiny 0 a potom sa vykoná priamy Coombsov test.

Nepriamy Coombsov test sa používa v nasledujúcich prípadoch:

Stanovenie individuálnej kompatibility krvi darcu a príjemcu.

Detekcia aloprotilátok vrátane protilátok, ktoré spôsobujú hemolytické transfúzne reakcie.

Stanovenie povrchových antigénov erytrocytov v lekárska genetika a súdne lekárstvo.

Potvrdenie identických dvojčiat počas transplantácie kostnej drene.

Na vykonanie biologického testu sa krv začne čo najrýchlejšie podávať transfúziou (najlepšie prúdom). Po transfúzii 25 ml krvi sa hadička systému upne svorkou. Potom nasleduje pauza na 3 minúty, počas ktorej sa monitoruje stav príjemcu. Na vykonanie biologického testu sa trikrát vstrekne 25 ml krvi. Na konci testu (po transfúzii prvých 75 ml krvi v zlomkových dávkach 25 ml v intervaloch 3 minút) sa systém nastaví na požadovaná rýchlosť transfúzia. Pri transfúzii viac ako jednej fľaše krvi pacientovi je potrebné vytiahnuť ihlu zo žily. V tomto prípade sa ihla vyberie zo skúmavky liekovky, v ktorej krv vytiekla, a vloží sa do ďalšej liekovky. Rúrka systému (guma alebo plast) je v tomto momente upnutá svorkou. Ak je počas transfúzie krvi nevyhnutné podať príjemcovi intravenózne akýkoľvek iný liek, urobí sa to prepichnutím gumovej hadičky systému. Prepichnutie plastovej trubice je neprijateľné, pretože neopadáva. Po každej transfúzii krvi musí byť pacient sledovaný, aby sa identifikoval a okamžite vylúčil možné komplikácie, počítajúc do toho alergické reakcie. 2 hodiny po ukončení transfúzie krvi sa má zmerať telesná teplota. Ak sa zvýši, meranie sa musí opakovať každú hodinu počas nasledujúcich 4 hodín. Rovnako dôležité je sledovanie močenia a zloženia moču, čo umožňuje zistiť prítomnosť toxickej potransfúznej reakcie. Vznik oligúrie a anúrie po transfúzii krvi, prítomnosť krviniek a bielkovín v moči sú priamym znakom rozvoja posttransfúznej hemolýzy.

Coombsov test– test na detekciu protilátok naviazaných na povrch alebo rozpustených v plazme. Používa sa na detekciu imunizácie a protilátok proti červeným krvinkám. Druhý titul antiglobulínový test. Môže byť priamy alebo nepriamy.

O priamy antiglobulínový test detekuje protilátky fixované na povrchu červených krviniek. Vykonáva sa pri podozrení na iné autoimunitné ochorenia po užití liekov (metyldopa, penicilín, chinín) atď.

Červené krvinky boli senzibilizované in vivo – protilátky sú na nich už pevne naviazané a pridanie antiglobulínového séra (anti-IgG) spôsobuje zlepenie senzibilizovaných buniek, čo je viditeľné voľným okom.

Nepriamy Coombsov test zisťuje antierytrocytové protilátky v krvnej plazme, vykonáva sa pred transfúziou krvi a počas nej.

Antierytrocytové protilátky sú typom autoprotilátok, t.j. protilátky proti vlastným tkanivám. Autoprotilátka vzniká pri patologickej reaktivite imunitný systém pri niektorých liekoch napr vysoké dávky penicilín.

Červené krvinky na svojom povrchu obsahujú rôzne chemické štruktúry(glykolipidy, sacharidy, glykoproteíny a proteíny), v medicíne nazývané antigény. Osoba zdedí od svojich rodičov špecifickú mapu antigénov na každej červenej krvinke.

Antigény sa spoja do skupín a následne sa krv rozdelí do niekoľkých skupín – podľa systému AB0, Rh, Kell, Lewis, Kidd, Duffy. Najznámejšie a najvýznamnejšie v práci lekára sú AB0 a Rh faktor (Rh).

Systém AB0

Stav Rh osoby je určený prítomnosťou týchto antigénov. Zvlášť dôležitým antigénom erytrocytov je antigén D. Ak je prítomný, potom hovoria o Rh pozitívna krv RhD, a ak tam nie je - oh Rh negatívny Rhd.

Ak sa zodpovedajúca protilátka naviaže na antigény erytrocytov, erytrocyt sa zničí - hemolýza.

Indikácie

Hlavná indikácia pre priamyantiglobulínový test- podozrenie na hemolytickú anémiu. Najčastejšie sa vykonáva pri primárnej autoimunitnej hemolytickej anémii, hemolýze pri reumatických, nádorových, infekčné choroby hemolýza vyvolaná liekmi.

Ak sa anémia objaví niekoľko dní alebo mesiacov po transfúzii krvi alebo počas nej dlhotrvajúca žltačka U novorodenca sa vykonáva aj priamy Coombsov test.

Nepriamevykoná sa antiglobulínový test pred transfúziou krvi a počas tehotenstva Rh-negatívnej ženy.

Autoimunitná hemolytická anémia

Autoimunitná hemolytická anémia (primárna)– klasické autoimunitné ochorenie s neznámymi príčinami. Interakcia v rámci imunitného systému je narušená, čo vedie k vnímaniu vlastných červených krviniek ako cudzích. V lymfatických uzlinách sa syntetizujú protilátky triedy IgG (reagujú pri t 37 °C) a/alebo IgM (pri t 40 °C), ktoré po pripojení na povrch erytrocytu spúšťajú množstvo enzýmov (tzv. komplementový systém) a „perforujú“ stenu erytrocytu, čo vedie k jeho deštrukcii – hemolýze.

Prvé príznaky sú spôsobené deštrukciou červených krviniek a poklesom hemoglobínu. Medzi nimi:

• únava, všeobecná slabosť, Podráždenosť
• dyspnoe
• bolesť brucha a hrudníka, nevoľnosť
• tmavá farba moču
• bolesť chrbta
• ikterické sfarbenie kože a slizníc
• zníženie počtu červených krviniek a

Priamy pozitívny výsledok Coombsove testy 100% potvrdzuje diagnózu autoimunitnej hemolytickej anémie, dokazuje jej autoimunitný pôvod. Negatívny výsledok zároveň neumožňuje odstrániť diagnózu.

Sekundárna hemolytická anémia

Sekundárna autoimunitná hemolytická anémia a pozitívny Coombsov test sa môžu vyskytnúť pri nasledujúcich ochoreniach:

• Evansov syndróm
• zápal pľúc

Pozitívny antiglobulínový test na tieto ochorenia je jedným zo symptómov a nie kritériom diagnózy.

Hemolytická choroba novorodenca

Príčina hemolytická choroba novorodencov - inkompatibilita krvnej skupiny matky a plodu, vo väčšine prípadov podľa Rh systému, v jednotlivých prípadoch - podľa systému AB0, kazuisticky - podľa iných antigénov.

Rh konflikt sa rozvinie, ak plod Rh-negatívnej ženy zdedí Rh-pozitívnu krv od otca.

Choroba sa u novorodenca vyvíja iba vtedy, ak matka už vytvorila protilátky proti zodpovedajúcim antigénom, čo sa stane po predchádzajúce tehotenstvá, potraty, transfúzie nekompatibilná krv. Najčastejším dôvodom na spustenie syntézy protilátok proti antigénom membrány erytrocytov je pôrod (feto-materské krvácanie). Prvý pôrod vo všeobecnosti prebieha bez komplikácií, no ďalšie sú v prvých dňoch po pôrode spojené s hemolytickým ochorením novorodenca.

Príznaky hemolytickej choroby novorodenca:

• žltosť kože
• a sliznice
• zväčšená pečeň a slezina
• problémy s dýchaním
• opuch celého tela
• excitácia a postupná depresia centrálneho nervového systému

Anémia po transfúzii krvi

Nepriamy Coombsov test vykonaná pred transfúziou krvi na posúdenie kompatibility, a priamy Coombsov test – po ňom pri podozrení na potransfúznu hemolýzu, t.j. v prítomnosti príznakov, ako je horúčka, slzenie (čítajte nižšie). Účelom analýzy je identifikovať protilátky proti transfúznym červeným krvinkám, ktoré sa naviazali na červené krvinky príjemcu a sú príčinou posttransfúznej hemolýzy, ako aj predčasného odstránenia darcovských červených krviniek z krvného obehu. príjemca (ten, kto dostal krv).

Symptómy:

• zvýšenie telesnej teploty
• kožná vyrážka
• bolesť chrbta
• červená
• nevoľnosť
• závraty

Dekódovanie

Je potrebné pripomenúť, že základné pravidlá na dešifrovanie priamych a nepriamych antiglobulínových testov sú rovnaké. Rozdiel je len v umiestnení protilátok – v krvi alebo na červenej krvinke.

• Ak priamy Coombsov test je negatívny– to znamená, že protilátka „nesedí“ na červených krvinkách a je potrebné ďalej hľadať príčinu symptómov a vykonať nepriamy Coombsov test
• Ak pozitívny výsledok Coombsov test zistený po transfúzii krvi, infekciách, liekoch - pozitivita trvá až 3 mesiace (životnosť červených krviniek 120 dní - 3 mesiace)
• pozitívny výsledok antiglobulínového testu s autoimunitné ochorenie trvá mesiace a dokonca roky

Norm

• priamy Coombsov test - negatívny
• nepriamy Coombsov test - negatívny

Kvalitatívne pozitívny výsledok sa meria v počte plusov od jedného do štyroch (+, ++, +++, ++++) a kvantitatívne v digitálnej forme - 1:16, 1:256 atď.

Áno. Váš lekár by mal určite vedieť, že ste dostali krvnú transfúziu, pretože to teraz ovplyvňuje správnu interpretáciu výsledkov testov. Pri príjme cudzej (hoci mnohokrát testovanej) krvi vždy existuje možnosť, že si vaše telo vytvorí protilátky proti transfúznej krvi. Práve tieto protilátky zabezpečia zlý vplyv o zdravotnom stave. Pri následných transfúziách krvi musí lekár vedieť, že ste už transfúziu dostali, čo znamená, že bol čas na syntézu protilátok. Pre tehotné ženy sú tieto informácie ešte relevantnejšie.

3. Ak dôjde k nesúladu Rh faktora medzi matkou a dieťaťom, budú choré všetky deti?

Závisí od toho, či je dieťa Rh pozitívne alebo negatívne (RhD). Nositelia krvných skupín I, II, III a IV môžu byť Rh pozitívni alebo negatívni. V situácii, keď je matka Rh negatívna a dieťa je Rh pozitívne, protilátky sa vytvoria už pri prvom otehotnení, ale až po prvom pôrode (resp. ukončení gravidity) dôjde k priamemu kontaktu krvi matky s. dieťa. Hemolytický účinok protilátok sa zrealizuje až počas druhej a ďalší pôrod, čo povedie k hemolytickému ochoreniu novorodenca.

Každá žena s negatívnym Rh faktorom by mala byť počas tehotenstva a po pôrode starostlivo vyšetrená preventívna liečba aby sa zabránilo vzniku protilátok a ďalším komplikáciám.

4. Je počas tehotenstva potrebné poznať krvnú skupinu môjho manžela pred vykonaním Coombsovho testu?

Počas tehotenstva musíte nielen vedieť, ale aj skontrolovať krvnú skupinu biologického otca dieťaťa.

Údaje

• prvýkrát navrhnutý v Cambridge v roku 1945
• prah citlivosti – aspoň 300 fixných molekúl protilátky na jednej červenej krvinke
• počet protilátok spúšťajúcich hemolýzu - individuálne pre každú osobu (od 16-30 do 300)
• dynamika iných laboratórnych indikátorov hemolytickej anémie (hemoglobín, bilirubín, retikulocyty) sa môže normalizovať a Coombsov test zostane na rovnakej úrovni

Coombsov test bol naposledy upravený: 16. marca 2018 Mária Bodyanová

Normálne v krvi nie sú žiadne protilátky proti červeným krvinkám.

Priamy Coombsov test je antiglobulínový test (aglutinácia v géli, ktorý umožňuje detekciu kompletných divalentných protilátok), ktorý deteguje protilátky triedy IgG a C3 zložku komplementu na povrchu červených krviniek. Protilátky detegované priamym Coombsovým testom majú zvyčajne širokú špecificitu, ktorá nie je spojená s dobre etablovaným antigénom. Pozitívny priamy Coombsov test jasne naznačuje, že pacient má hemolytickú anémiu, hoci nie všetci pacienti s pozitívnym priamym antiglobulínovým testom trpia týmto ochorením. Približne u 10 % pacientov sa protilátky alebo zložky komplementu na membráne červených krviniek nedajú určiť priamym Coombsovým testom (test je negatívny), no napriek tomu trpia autoimunitnou hemolytickou anémiou. Na objasnenie špecifickosti protilátok v takýchto prípadoch sa používajú testy s ich elúciou. Priamy Coombsov test, pozitívny len na komplement, sa zvyčajne vzťahuje na studené protilátky typu IgM. V tomto prípade protilátky IgM nie sú prítomné na červených krvinkách, keď bazálnej teploty telá. Avšak vzhľadom na skutočnosť, že protilátky IgM aktívne fixujú komplement a komplement zostáva na červených krvinkách, pri tejto forme autoimunitnej hemolytickej anémie (ochorenie studených aggutinínov) bude Coombsov test pozitívny iba na komplement.

Priamy Coombsov test je pozitívny na autoimunitnú hemolytickú anémiu spôsobenú teplými protilátkami, autoimunitnú liekmi indukovanú anémiu (pri užívaní metyldopy má pozitívnu reakciu až 20 % pacientov), ​​liekovo-adsorpčný typ hemolytickej anémie, imunokomplexový typ hemolytickej anémia (test je pozitívny len na C3), pri autoimunitnej hemolytickej anémii spôsobenej protilátkami proti chladu - ochorenie chladových aglutinínov (test je pozitívny len na C3). Pri paroxyzmálnej studenej hemoglobinúrii je priamy Coombsov test negatívny.

Nepriamy Coombsov test - nepriamy antiglobulínový test (zisťuje neúplné protilátky) umožňuje identifikovať atypické protilátky v krvi vrátane aloprotilátok proti cudzím antigénom erytrocytov. Svoj názov (nepriamy) dostal vďaka tomu, že sa vyskytuje v 2 štádiách. Krvné sérum pacienta s nekompletnými protilátkami spočiatku interaguje s pridaným korpuskulárnym Ag diagnosticum bez viditeľných prejavov. V druhom štádiu pridané antiglobulínové sérum interaguje s neúplnými protilátkami adsorbovanými na antigénoch, pričom sa objaví viditeľná zrazenina. Transfúzia homologických (alogénnych) červených krviniek alebo tehotenstvo sú najviac bežné dôvody tvorbu týchto anti-erytrocytových protilátok. Kombinácia pozitívneho nepriameho Coombsovho testu s negatívnym priamym testom neposkytuje nič na diagnostiku autoimunitnej hemolytickej anémie. Pozitívny nepriamy Coombsov test spôsobuje určité ťažkosti pri výbere krvi na transfúziu a pri vykonávaní krížového testu na kompatibilitu s konzervovanou krvou, ale nemá žiadnu inú diagnostickú hodnotu.