Svojstva bakteriofaga i njihova primjena u medicini. Praktična primjena faga u medicini

CM. ZAKHARENKO, dr. sc., izv. prof. Vojni medicinske akademije ih. CM. Kirov, Sankt Peterburg

Bakteriofagi su jedinstveni mikroorganizmi na temelju kojih je stvorena skupina terapeutskih i profilaktičkih lijekova s ​​posebnim svojstvima i karakteristikama. Temeljni prirodni fiziološki mehanizmi interakcije između faga i bakterija omogućuju predviđanje beskrajne raznolikosti samih bakteriofaga i moguće načine njihove primjene. Kako se zbirke bakteriofaga budu širile, nedvojbeno će se pojaviti novi ciljni patogeni, a proširit će se i raspon bolesti za koje se fagi mogu koristiti kao monoterapija i kao dio složenih režima liječenja.

Da, koristiti polivalentni piobakteriofag Sextaphage u liječenju inficirane nekroze gušterače (Državna medicinska akademija u Permu nazvana po akademiku E.A. Wagneru) omogućio je bržu obnovu osnovnih parametara homeostaze i funkcije organa i sustava u bolesnika. Došlo je i do značajnog smanjenja broja postoperativne komplikacije I smrtni slučajevi: u skupini bolesnika koji su primali standardnu ​​terapiju smrtnost je bila 100%, dok je u skupini koja je primala BF bila 16,6%.

Zbog neškodljivosti i reaktogenosti BF lijekova, njihova primjena u pedijatrijska praksa, uključujući i novorođenčad. Zanimljivo je iskustvo regionalne dječje škole Nižnji Novgorod klinička bolnica, gdje su u razdoblju komplikacije epidemiološke situacije, uz uobičajene protuepidemijske mjere, korišteni BF - Intesti-bakteriofag i BF Pseucfomonas aeruginosa. Smanjenje incidencije nozokomijalnih infekcija pseudomonasne etiologije 11 puta pokazalo je visoku učinkovitost primjene BF. Lijekovi BF mogu se propisati za liječenje disbioze i poremećaja probavni sustav, te spriječiti kolonizaciju sluznice gastrointestinalnog trakta oportunističke bakterije. Višekomponentni BF pripravci idealni su za trenutačno ublažavanje prvih znakova gastrointestinalnih tegoba.

Danas je poduzeće zacrtalo niz prioritetnih područja za razvoj i proizvodnju terapeutskih i profilaktičkih bakteriofaga, koji su u korelaciji s novonastalim svjetskim trendovima. Stvaraju se i uvode novi lijekovi: BF su razvijeni protiv seracija i enterobakterija, u tijeku je rad na stvaranju fagnog lijeka protiv Helicobacter pylori.

Samo jedan proizvođač ovih lijekova je NPO Microgen, navodi se u izvješću zamjenika načelnika Odjela za znanost i inovativni razvoj Alla Lobastova, proizvodi više od 2 milijuna pakiranja godišnje. Nažalost, ideje mnogih liječnika o bakteriofazima daleko su od objektivnih. Malo ljudi zna da bakteriofagi aktivni protiv istog patogena mogu pripadati različitim porodicama, imati različite životne cikluse itd. Na primjer, bakteriofagi P. aeruginosa pripadaju porodicama Myoviridae, Podoviridae, Siphoviridae i imaju litički životni ciklus ili umjeren. Različiti sojevi istog patogena mogu imati različitu osjetljivost na bakteriofage. Većina stručnjaka zna (čuo je, netko ga je koristio) za postojanje tekućine i tableta oblik doziranja terapijski i profilaktički lijekovi bakteriofaga. Međutim, njihov je raspon znatno širi, što se može smatrati apsolutnom prednošću, posebice u kombinaciji s različitim načinima primjene (oralna primjena, klizme, aplikacije, ispiranje rana i sluznica, primjena u šupljine rane i dr.). DO očite prednosti bakteriofagima se tradicionalno pripisuje specifičan učinak na prilično ograničenu populaciju bakterija, vremenski ograničeno postojanje (dok ne nestane ciljna populacija mikroorganizama), nepostojanje nuspojave kao otrovne i alergijske reakcije, disbiotičke reakcije, itd. Ovi se lijekovi mogu koristiti u različitim oblicima dobne skupine i tijekom trudnoće. Bakteriofagi sami po sebi nisu značajni alergeni. Slučajevi netolerancije na lijekove bakteriofaga uglavnom su povezani s reakcijom na komponente hranjivog medija. Svi veliki proizvođači ove skupine lijekova teže maksimalnoj kvaliteti korištenih komponenti, što smanjuje vjerojatnost takvih reakcija. U kontekstu sve veće otpornosti na antibiotike, neki autori predlažu da se bakteriofagi smatraju najboljom alternativom antibioticima. Terapeutski i profilaktički lijekovi bakteriofaga su koktel posebno odabranih kombinacija (kompleks poliklonalnih visoko virulentnih bakterijskih virusa, posebno odabranih protiv najčešćih skupina patogena bakterijske infekcije) na temelju kolekcija faga proizvođača. Podružnice FSUE NPO Microgen u Ufi, Permu i Nižnji Novgorod – modernih centara proizvodnju takvih lijekova. Mogućnost izrade po mjeri patogeni mikroorganizmi terapijski i profilaktički lijekovi bakteriofaga još je jedna važna prednost ove skupine lijekova. Sve veća otpornost bakterija na antimikrobne lijekove i česta polietiologija suvremenih zaraznih bolesti zahtijevaju kombiniranu antibiotsku terapiju (dva, tri, a ponekad i više antibiotika). antimikrobna sredstva). Za odabir učinkovita shema antibiotske terapije, osim stvarne osjetljivosti bakterija na lijek, potrebno je voditi računa o dovoljnoj veliki brojčimbenici. Terapija fagom također ima određene prednosti u tom pogledu. S jedne strane, uporaba kombinacije bakteriofaga nije popraćena njihovom međusobnom interakcijom i ne dovodi do promjena u obrascima njihove uporabe. Unutar postojećeg skupa terapijskih bakteriofaga postoji niz dobro dokazanih kombinacija - koliprotejski bakteriofag, polivalentni piobakteriofag, intestibakteriofag. S druge strane, bakterije nemaju zajedničke mehanizme rezistencije na antibiotike i fage, stoga se mogu koristiti i kada je uzročnik otporan na jedan od lijekova, kao iu kombinaciji “antibiotik + bakteriofag”. Ova kombinacija je posebno učinkovita za uništavanje mikrobnih biofilmova. Eksperiment to uvjerljivo pokazuje kombinirana uporaba antagonisti željeza i bakteriofag mogu poremetiti stvaranje biofilma Klebsiella pneumoniae. Istodobno dolazi do značajnog smanjenja veličine mikrobne populacije i smanjenja broja "mladih" stanica. Još jedan važna značajka Djelovanje bakteriofaga je takav fenomen kao indukcija apoptoze. Neki sojevi E. coli imaju gene koji uzrokuju smrt stanice nakon unošenja bakteriofaga T4 u nju. Dakle, kao odgovor na ekspresiju kasnih gena faga T4, lit gen (kodira proteazu koja uništava faktor elongacije EF-Tu, neophodan za sintezu proteina), blokira sintezu svih staničnih proteina. Gen prrC kodira nukleazu koja cijepa lizinsku tRNA. Nukleazu aktivira produkt gena stp faga T4. U stanicama zaraženim fagom T4, rex geni (koji pripadaju genomu faga i eksprimirani su u lizogenim stanicama) uzrokuju stvaranje ionskih kanala, što dovodi do gubitka vitalnih iona u stanicama i posljedično do smrti. Sam fag T4 može spriječiti smrt stanice zatvarajući kanale svojim proteinima, produktima gena rII. Ako bakterije razviju otpornost na antibiotik, potrebno je tražiti nove mogućnosti za modificiranje aktivne molekule ili fundamentalno nove tvari. Nažalost, za posljednjih godina Tempo uvođenja novih antibiotika znatno je usporen. Situacija s bakteriofazima je bitno drugačija. Zbirke velikih proizvođača uključuju desetke gotovih sojeva bakteriofaga i stalno se nadopunjuju novim aktivnim fagima. Zahvaljujući stalnom praćenju osjetljivosti izoliranih patogena na bakteriofage, proizvođači prilagođavaju sastave faga koji se isporučuju u regije. Zahvaljujući prilagođenim bakteriofazima, moguće je eliminirati izbijanje bolničkih infekcija uzrokovanih sojevima rezistentnim na antibiotike.

Na oralno bakteriofagi brzo dolaze do mjesta infekcije: kada ih pacijenti s gnojno-upalnim bolestima uzimaju oralno, u roku od sat vremena fagi ulaze u krv, nakon 1-1,5 sati otkrivaju se iz bronhopulmonalnog eksudata i s površine opeklinskih rana, nakon 2 sata - iz urina, a također i iz cerebrospinalne tekućine pacijenata s traumatskim ozljedama mozga.

Dakle, bakteriofagi su jedinstveni mikroorganizmi, na temelju kojih je stvorena skupina terapeutskih i profilaktičkih lijekova s ​​posebnim svojstvima i karakteristikama. Temeljni prirodni fiziološki mehanizmi interakcije između faga i bakterija omogućuju predviđanje beskonačne raznolikosti samih bakteriofaga i mogućih načina njihove upotrebe. Kako se zbirke bakteriofaga budu širile, nedvojbeno će se pojaviti novi ciljni patogeni, a proširit će se i raspon bolesti za koje se fagi mogu koristiti kao monoterapija i kao dio složenih režima liječenja. Suvremeni pogled na buduću sudbinu terapije fagima trebao bi se temeljiti kako na visokoj specifičnosti njihovog djelovanja tako i na potrebi da se strogo pridržavaju svih pravila terapije fagima. Kontrastiranje bakteriofaga s bilo kojim sredstvom etiotropne terapije je pogrešno.

Po prvi put je postavljena pretpostavka da su bakteriofagi virusi. D. Errel. Kasnije su otkriveni gljivični virusi itd. koji su postali poznati kao fagi.

Morfologija faga.

Dimenzije - 20 - 200nm. Većina faga ima oblik punoglavca. Najsloženiji fagi sastoje se od višestruke glave, u kojoj se nalazi nukleinska kiselina, vrata i nastavaka. Na kraju procesa nalazi se bazalna ploča, iz koje se protežu niti i zubi. Ove niti i zubi služe za pričvršćivanje faga na bakterijsku membranu. Kod najsloženije organiziranih faga distalni dio procesa sadrži enzim – lizozim. Ovaj enzim potiče otapanje bakterijske membrane tijekom prodiranja faga NK u citoplazmu. Kod mnogih faga, proces je okružen ovojnicom, koja se kod nekih faga može skupiti.

Postoji 5 morfoloških skupina

1. Bakteriofagi s dugim procesom i kontraktilnom ovojnicom
2. Fagi s dugim procesom, ali bez kontraktilne ovojnice
3. Fagi kratkih grana
4. Fagi s procesnim analogom
5. Nitasti fagi

Kemijski sastav.

Fagi se sastoje od nukleinske kiseline i proteina. Većina njih sadrži dvolančanu DNA, zatvorenu u krug. Neki fagi sadrže jedan lanac DNA ili RNA.

Fagna ljuska - kapsida, sastoji se od uređenih proteinskih podjedinica – kapsomera.

Kod najsloženije organiziranih faga distalni dio procesa sadrži enzim – lizozim. Ovaj enzim potiče otapanje bakterijske membrane tijekom prodiranja faga NK u citoplazmu.

Fagi dobro podnose smrzavanje, zagrijavanje na 70 i sušenje. Osjetljivo na kiseline, UV zračenje i ključanje. Fagi inficiraju strogo definirane bakterije interakcijom sa specifičnim staničnim receptorima.

Prema specifičnosti interakcije -

Polifagi - u interakciji s nekoliko srodnih vrsta bakterija

Monofagi – fagi specifični za određenu vrstu – stupaju u interakciju s jednom vrstom bakterija

Tipski fagi – komuniciraju s pojedinačnim varijantama bakterija unutar vrste.

Na temelju djelovanja tipičnih faga vrste se mogu podijeliti na serija faga. Interakcija faga s bakterijama može se dogoditi kroz produktivni, aproduktivni i integrativni tip.

Produktivni tip- formira se potomstvo faga, a stanica se lizira

S aproduktivnim- stanica nastavlja postojati, proces interakcije je prekinut u početnoj fazi

Integrativni tip- genom faga se integrira u bakterijski kromosom i koegzistira s njim.

Ovisno o vrsti interakcije razlikuju se virulentni i umjereni fagi.

Virulentan komuniciraju s bakterijama na produktivan način. Prvo, apsorpcija faga na bakterijskoj membrani događa se zbog interakcije specifičnih receptora. Dolazi do prodora ili prodora virusne nukleinske kiseline u citoplazmu bakterija. Pod utjecajem lizozima nastaje mala rupica u bakterijskoj ovojnici, omotač faga se steže i ubrizgava se NK. Ljuska faga izvan bakterije. Zatim dolazi do sinteze ranih proteina. Oni osiguravaju sintezu strukturnih proteina faga, replikaciju nukleinske kiseline faga i potiskivanje aktivnosti bakterijskih kromosoma.

Nakon toga dolazi do sinteze strukturne komponente fagi i replikacija nukleinskih kiselina. Od tih elemenata sastavlja se nova generacija čestica faga. Sklop se naziva morfogeneza, nove čestice, kojih u jednoj bakteriji može nastati 10-100. Slijedi liza bakterije i otpuštanje nove generacije faga u vanjski okoliš.

Umjereni bakteriofagi međusobno djeluju bilo na produktivan ili integrativan način. Proizvodni ciklus se odvija na sličan način. Integrativnom interakcijom DNA umjerenog faga se nakon ulaska u citoplazmu integrira u kromosom na određenom području, a tijekom stanične diobe replicira se sinkrono s bakterijskom DNA te se te strukture prenose na stanice kćeri. Takva ugrađena DNK faga - prophage, a bakterija koja sadrži profage naziva se lizogena, a fenomen je lizogenija.

Spontano, ili pod utjecajem niza vanjskih čimbenika, profage se mogu izrezati iz kromosoma, tj. prijeći u slobodno stanje, pokazati svojstva virulentnog faga, što će dovesti do stvaranja nove generacije bakterijskih tijela - indukcija profaga.

Lizogeneza bakterija je u osnovi fagne (lizogene) pretvorbe. To se shvaća kao promjena karakteristika ili svojstava lizogenih bakterija u usporedbi s nelizogenim bakterijama iste vrste. Zadržavamo pravo na promjene različita svojstva- morfološki, antigenski itd.

Umjereni fagi mogu biti neispravni - ne mogu formirati fagno potomstvo koje nije unutra prirodni uvjeti i u indukciji.

Virion je punopravna virusna čestica koja se sastoji od NK i proteinske ljuske

Praktična primjena faga -

1. Primjena u dijagnostici. U odnosu na niz bakterijskih vrsta, monofagi se koriste u reakciji fagolizabilnosti kao jedan od kriterija za identifikaciju bakterijske kulture; tipični fagi se koriste za fagotipizaciju i intraspecifičnu diferencijaciju bakterija. Provodi se u epidemiološke svrhe, kako bi se utvrdio izvor infekcije i načini njezina uklanjanja
2. Za liječenje i prevenciju niza bakterijskih infekcija - trbušni tip, stafilokokne i streptokokne infekcije (tablete otporne na kiseline)
3. Umjereni bakteriofagi se koriste u genetski inženjering kao vektor sposoban za uvođenje genetskog materijala u živu stanicu.

Genetika bakterija

Bakterijski genom sastoji se od genetskih elemenata sposobnih za samoreprodukciju - replikoni. Replikoni su bakterijski kromosomi i plazmidi. Bakterijski kromosom tvori nukleoid, zatvoreni prsten koji nije povezan s proteinima i nosi haploidni skup gena.

Plazmid je također zatvoreni prsten molekule DNA, ali mnogo manje veličine od kromosoma. Prisutnost plazmida u citoplazmi bakterija nije neophodna, ali oni daju prednost u okoliš. Veliki plazmidi se reduciraju s kromosomom i njihov broj u stanici je mali. A broj malih plazmida može doseći nekoliko desetaka. Neki plazmidi su sposobni reverzibilno integrirati u bakterijski kromosom u određenoj regiji i funkcionirati kao pojedinačni replikon. Takvi plazmidi nazivaju se integrativni. Neki plazmidi mogu se prenijeti s jedne bakterije na drugu izravnim kontaktom – konjugirani plazmidi. Sadrže gene odgovorne za stvaranje F-pilova, koji čine konjugacijski most za prijenos genetskog materijala.

Glavne vrste plazmida su

F - integrativni kongativni plazmid. Spolni faktor određuje sposobnost bakterija da budu donori tijekom konjugacije

R - plazmidi. Otporan. Sadrži gene koji određuju sintezu faktora koji uništavaju antibakterijski lijekovi. Bakterije koje posjeduju takve plazmide nisu osjetljive na mnoge lijekove. Stoga se formiraju čimbenici otporni na lijekove.

Plazmidni toks - determinirajući čimbenici patogenosti -

Ent – plazmidi – sadrži gen za proizvodnju enterotoksina.

Hly - uništavaju crvene krvne stanice.

Mobilni genetski elementi. To uključuje umetanje - elementi za umetanje. Općeprihvaćena oznaka je Is. To su dijelovi DNK koji se mogu kretati i unutar replikona i između njih. Sadrže samo gene potrebne za vlastito kretanje.

Transpozoni- veće strukture koje imaju ista svojstva kao Is, ali osim toga sadrže strukturne gene koji određuju sintezu biološke tvari, kao što su toksini. Mobilni genetski elementi mogu uzrokovati inaktivaciju gena, oštećenje genetskog materijala, fuziju replikona i širenje gena kroz bakterijsku populaciju.

Varijabilnost kod bakterija.

Sve vrste varijabilnosti podijeljene su u 2 skupine - nenasljedne (fenotipske, modifikacijske) i nasljedne (genotipske).

Izmjene- fenotipske nenasljedne promjene osobina ili svojstava. Modifikacije ne utječu na genotip i stoga se ne nasljeđuju. One su adaptivne reakcije na promjene u određenim uvjetima vanjsko okruženje. U pravilu se gube u prvoj generaciji, nakon što faktor prestane djelovati.

Genotipska varijabilnost utječe na genotip organizma, pa se stoga može prenijeti na potomke. Genotipska varijabilnost dijeli se na mutacije i rekombinacije.

Mutacije- trajne, nasljedne promjene karakteristika ili svojstava organizma. Osnova mutacija je kvalitativna ili kvantitativna promjena slijeda nukleotida u molekuli DNA. Mutacije mogu promijeniti gotovo svako svojstvo.

Po podrijetlu mutacije su spontane i inducirane.

Spontane mutacije javlja se u prirodnim uvjetima postojanja organizma, i induciran nastaju kao posljedica usmjerenog djelovanja mutagenog faktora. Na temelju prirode promjena u primarnoj strukturi DNA kod bakterija razlikuju se genske ili točkaste mutacije i kromosomske aberacije.

Genske mutacije javljaju unutar jednog gena i minimalno uključuju jedan nukleotid. Ova vrsta mutacije može biti rezultat zamjene jednog nukleotida drugim, gubitka nukleotida ili umetanja dodatnog.

Kromosomski- može utjecati na nekoliko kromosoma.

Može doći do delecije - gubitka dijela kromosoma ili duplikacije - udvostručavanja dijela kromosoma. Rotiranje dijela kromosoma za 180 stupnjeva je inverzija.

Svaka mutacija nastaje pod utjecajem određenog mutagenog faktora. Po svojoj prirodi mutageni su fizikalni, kemijski i biološki. Ionizirana radiacija, X-zrake, UV zrake. Kemijski mutageni uključuju analoge dušičnih baza, samu nitritastu kiselinu, pa čak i neke lijekovi, citostatici. Biološki - neki virusi i transfazoni

Rekombinacija- izmjena dijelova kromosoma

Transdukcija - prijenos genetskog materijala pomoću bakteriofaga

Reparacija genetskog materijala - obnavljanje štete nastale mutacijama.

Postoji nekoliko vrsta reparacije

1. Fotoreaktivacija - ovaj proces osigurava poseban enzim koji se aktivira u prisutnosti vidljivog svjetla. Ovaj enzim kreće se duž DNK lanca i popravlja oštećenja. Kombinira timere koji nastaju pod djelovanjem UV zraka. Značajniji su rezultati tamne reparacije. Ne ovisi o svjetlu i osigurava ga nekoliko enzima - prvo nukleaze izrezuju oštećeni dio lanca DNK, zatim DNK polimeraza sintetizira mrlju na matrici komplementarnog lanca koja je sačuvana, a ligaze ušivaju mrlju u oštećeno područje .

Reparacije podliježu genske mutacije, ali kromosomske najčešće ne

1. Genetska rekombinacija kod bakterija. Karakterizira ih prodiranje genetskog materijala iz bakterije donora u bakteriju primatelja uz stvaranje genoma kćeri koji sadrži gene obiju izvornih jedinki.

Ugradnja fragmenta DNK donora u primatelja događa se crossing overom

Tri vrste prijenosa -

1. Transformacija- proces u kojem se prenosi fragment izolirane donorske DNA. Ovisi o sposobnosti primatelja i stanju DNK donora. Kompetencija- sposobnost apsorpcije DNA. Ovisi o prisutnosti posebnih proteina u staničnoj membrani primatelja i nastaje tijekom određenih razdoblja bakterijskog rasta. Donatorska DNK mora biti dvolančana i ne baš velika. Donor DNA prodire kroz bakterijsku membranu, i jedan od lanaca se uništava, drugi se integrira u primateljevu DNA.
2. Transdukcija- provodi se uz pomoć bakteriofaga. Opća transdukcija i specifična transdukcija.

Općenito - nastaje uz sudjelovanje faktora virulencije. Tijekom sastavljanja čestica faga, glava faga može greškom uključivati ​​ne DNK faga, već dio bakterijskog kromosoma. Takvi fagi su defektni fagi.

Specifično- provode ga umjereni fagi. Prilikom rezanja, rezanja se strogo provode duž granice. Oni se grade između određenih gena i prenose ih.

1. Konjugacija- prijenos genetskog materijala s bakterije davatelja na primatelja, pri njihovom izravnom kontaktu. Neophodan uvjet- prisutnost kongativnog plazmida u stanici donora. Tijekom konjugacije nastaje konjugacijski most zahvaljujući pilima, preko kojih se genetski materijal prenosi od donora do bolesnika.

Genska dijagnostika

Skup metoda koje omogućuju identifikaciju genoma mikroorganizma ili njegovog fragmenta u materijalu koji se proučava. Prva je predložena metoda NC hibridizacije. Na temelju korištenja načela komplementarnosti. Ova metoda omogućuje otkrivanje prisutnosti markerskih fragmenata DNA patogena u genetskom materijalu pomoću molekularnih sondi. Molekularne sonde su kratki lanci DNA komplementarni regiji markera. Sondi se dodaje fluorescentna oznaka, radioaktivni izotop, enzim. Materijal koji se proučava podvrgava se posebnoj obradi koja mu omogućuje uništavanje mikroorganizama, oslobađanje DNK i njegovu podjelu na jednolančane fragmente. Nakon toga materijal je fiksiran. Tada se detektira aktivnost oznake. Ova metoda nije vrlo osjetljiva. Uzročnik je moguće identificirati samo ako je njegova količina dovoljno velika. 10 do 4 mikroorganizma. Tehnički je prilično složen i zahtijeva veliki broj sondi. Rašireno u praksi ga nije našao. Bio je razvijen nova metoda - polimeraza lančana reakcija- PCR.

Ova se metoda temelji na sposobnosti replikacije DNA i virusne RNA, tj. do samoreprodukcije. Bit pacijenta je ponavljano kopiranje - in vitro amplifikacija fragmenta DNA, koji je marker za dati mikroorganizam. Budući da se proces odvija na dovoljno visoke temperature 70-90, metoda je postala moguća nakon izolacije termostabilne DNA polimeraze iz termofilnih bakterija. Mehanizam umnožavanja je takav da kopiranje lanaca DNA ne počinje ni na jednom mjestu, već samo na određenim početnim blokovima za čiju se izradu koriste tzv. Primeri su polinukleotidne sekvence komplementarne terminalnim sekvencama kopiranog fragmenta željene DNA, a početnice ne samo da započinju pojačavanje, već ga i ograničavaju. Sada postoji nekoliko PCR opcija, koje karakteriziraju 3 faze -

1. Denaturacija DNA (podjela na 1 lanac fragmenata)
2. Pričvršćivanje temeljnog premaza.
3. Komplementarno dodavanje DNA lanaca dvostrukim lancima

Ovaj ciklus traje 1,5-2 minute. Kao rezultat toga, broj molekula DNA udvostručuje se 20-40 puta. Rezultat je 10 na 8. potenciju kopija. Nakon amplifikacije provodi se elektroforeza i izolira se u obliku pruga. Provodi se u posebnom uređaju koji se naziva pojačalo.

Prednosti PCR-a

1. Daje izravne indikacije prisutnosti patogena u ispitnom materijalu, bez izolacije čiste kulture.
2. Vrlo visoka osjetljivost. Teoretski, može se otkriti 1.
3. Materijal za istraživanje može se odmah dezinficirati nakon prikupljanja.
4. 100% specifičnost
5. Brzi rezultati. Potpuna analiza- 4-5 sati. Ekspresna metoda.

Široko se koristi za dijagnosticiranje zaraznih bolesti, čiji su uzročnici organizmi koji se ne mogu kultivirati ili se teško kultiviraju. Klamidija, mikoplazma, mnogi virusi - hepatitis, herpes. Za određivanje su razvijeni ispitni sustavi antraks, tuberkuloza.

Analiza ograničenja- uz pomoć enzima molekula DNA se dijeli na određene sekvence Nukleoidi i fragmenti analiziraju se na temelju sastava. Na taj način možete pronaći jedinstvena područja.

Biotehnologija i genetski inženjering

Biotehnologija je znanost koja, na temelju proučavanja vitalnih procesa živih organizama, koristi te bioprocese, kao i same biološke objekte, za industrijsku proizvodnju proizvoda potrebnih čovjeku, za reprodukciju bioefekta koji se ne očituju u neprirodnim Uvjeti. Kao biološki objekti najčešće se koriste jednostanični mikroorganizmi, kao i stanice životinja i biljaka. Stanice se razmnožavaju vrlo brzo, što omogućuje povećanje biomase proizvođača u kratkom vremenu. Trenutno je biosinteza složenih tvari, poput proteina, antibiotika, ekonomičnija i tehnološki pristupačnija od drugih vrsta sirovina.

Biotehnologija koristi same stanice kao izvor ciljanog produkta, kao i velike molekule koje stanica sintetizira, enzime, toksine, antitijela te primarne i sekundarne metabolite – aminokiseline, vitamine, hormone. Tehnologija dobivanja proizvoda mikrobne i stanične sinteze svodi se na nekoliko tipičnih faza - odabir ili stvaranje proizvodnog stožera. Odabir optimalne hranjive podloge, uzgoj. Izolacija ciljnog produkta, njegovo pročišćavanje, standardizacija, davanje oblika lijeka. Genetski inženjering se svodi na stvaranje ciljnih proizvoda potrebnih čovjeku. Rezultirajući ciljni gen spojen je s vektorom, a vektor može biti plazmid, i umetnut je u stanicu primatelja. Primatelj - bakterija - coli, kvasac. Ciljni produkti sintetizirani rekombinantima se izoliraju, pročišćavaju i koriste u praksi.

Inzulin i ljudski interferon. Eritropoetin, hormon rasta, monoklonska antitijela. Cjepivo protiv hepatitisa B.

Bakteriofagi ili fagi (od drugog grčkog φᾰγω “proždiram”) su virusi koji selektivno inficiraju bakterijske stanice. Najčešće se bakteriofagi razmnožavaju unutar bakterija i uzrokuju njihovu lizu. Tipično, bakteriofag se sastoji od proteinske ovojnice i genetskog materijala jednolančane ili dvolančane nukleinske kiseline (DNK ili, rjeđe, RNK). Ukupan broj bakteriofaga u prirodi približno je jednak ukupnom broju bakterija (1030 – 1032 čestice). Bakteriofagi aktivno sudjeluju u kruženju kemikalija i energije te imaju značajan utjecaj na razvoj mikroba i bakterija Struktura tipičnog miovirusa bakteriofaga.

Struktura bakteriofaga 1 - glava, 2 - rep, 3 - nukleinska kiselina, 4 - kapsida, 5 - "ovratnik", 6 - proteinska ovojnica repa, 7 - repna fibrila, 8 - bodlje, 9 - bazalna ploča

Bakteriofagi se razlikuju po kemijska struktura, vrsta nukleinske kiseline, morfologija i priroda interakcije s bakterijama. Za veličinu bakterijski virusi stotine i tisuće puta manji od mikrobnih stanica. Tipična fagna čestica (virion) sastoji se od glave i repa. Dužina repa je obično 2-4 puta veća od promjera glave. Glava sadrži genetski materijal – jednolančanu ili dvolančanu RNA ili DNA s enzimom transkriptazom u neaktivnom stanju, okruženu proteinskom ili lipoproteinskom ovojnicom – kapsidom, koja pohranjuje genom izvan stanice. Nukleinska kiselina i kapsida zajedno čine nukleokapsid. Bakteriofagi mogu imati ikosaedralnu kapsidu sastavljenu od više kopija jednog ili dva specifična proteina. Tipično, uglovi su napravljeni od pentamera proteina, a nosač svake strane je napravljen od heksamera istog ili sličnog proteina. Štoviše, fagi mogu biti sferičnog, limunolikog ili pleomorfnog oblika. Rep ili privjesak je proteinska cijev - nastavak proteinske ljuske glave; u dnu repa nalazi se ATPaza koja regenerira energiju za ubrizgavanje genetskog materijala. Postoje i bakteriofagi s kratkim procesom, bez procesa i filamentni.

Taksonomija bakteriofaga Veliki broj izoliranih i proučavanih bakteriofaga uvjetuje potrebu njihove sistematizacije. To radi Međunarodni odbor za taksonomiju virusa (ICTV). Trenutno, prema Međunarodna klasifikacija i nomenklaturi virusa, bakteriofagi se dijele ovisno o vrsti nukleinske kiseline i morfologiji. Na ovaj trenutak Razlikuje se devetnaest obitelji. Od njih samo dvije sadrže RNA, a samo pet obitelji ima ovojnicu. Od obitelji DNA virusa samo dvije obitelji imaju jednolančane genome. Devet obitelji koje sadrže DNK imaju cirkularni DNK genom, dok ostalih devet ima linearni DNK. Devet obitelji specifično je samo za bakterije, preostalih devet je specifično samo za arheje, a (Tectiviridae) inficira i bakterije i arheje

Interakcija bakteriofaga s bakterijskom stanicom Na temelju prirode interakcije bakteriofaga s bakterijskom stanicom razlikuju se virulentni i umjereni fagi. Broj virulentnih faga može se povećati samo kroz litički ciklus. Proces interakcije između virulentnog bakteriofaga i stanice sastoji se od nekoliko faza: adsorpcija bakteriofaga na stanicu, prodiranje u stanicu, biosinteza komponenti faga i njihovo sklapanje te oslobađanje bakteriofaga iz stanice. U početku se bakteriofagi vežu za fag-specifične receptore na površini bakterijske stanice. Rep faga uz pomoć enzima koji se nalaze na njegovom kraju (uglavnom lizozima) lokalno otapa staničnu membranu, kontrahira se i DNA sadržana u glavi ubrizgava se u stanicu, dok proteinska ljuska bakteriofaga ostaje izvana. Ubrizgana DNA uzrokuje potpuno restrukturiranje metabolizma stanice: prestaje sinteza bakterijske DNA, RNA i proteina. DNK bakteriofaga počinje se prepisivati ​​pomoću vlastitog enzima transkriptaze, koji se aktivira nakon ulaska u bakterijsku stanicu. Najprije se sintetiziraju rani, a zatim kasni. RNA koje ulaze u ribosome stanice domaćina, gdje se sintetiziraju rani (DNA polimeraze, nukleaze) i kasni (proteini kapsida i repa, enzimi lizozim, ATPaza i transkriptaza) proteini bakteriofaga. Replikacija DNA bakteriofaga odvija se prema polukonzervativnom mehanizmu i provodi se uz sudjelovanje vlastitih DNA polimeraza. Nakon sinteze kasnih proteina i završetka replikacije DNA, konačni proces- sazrijevanje čestica faga ili spajanje DNA faga s proteinom omotača i stvaranje zrelih infektivnih čestica faga

Životni ciklus Umjereni i virulentni bakteriofagi na početne faze interakcije s bakterijskom stanicom imaju isti ciklus. Adsorpcija bakteriofaga na fag-specifične stanične receptore. Injekcija nukleinske kiseline faga u stanicu domaćina. Koreplikacija faga i bakterijske nukleinske kiseline. Dijeljenje stanica. Nadalje, bakteriofag se može razviti prema dva modela: lizogenom ili litičkom putu. Umjereni bakteriofagi su nakon diobe u stanju profaze (lizogeni put). Virulentni bakteriofagi se razvijaju prema litičkom modelu: nukleinska kiselina faga usmjerava sintezu enzima faga, koristeći aparat za sintezu proteina bakterije. Fag na ovaj ili onaj način inaktivira DNA i RNA domaćina, a enzimi faga ga potpuno razgrađuju; RNA faga "podređuje" stanični aparat za sintezu proteina. Nukleinska kiselina faga replicira i usmjerava sintezu novih proteina ovojnice. Nove čestice faga nastaju kao rezultat spontanog samosastavljanja proteinske ovojnice (kapsida) oko nukleinske kiseline faga; Lizozim se sintetizira pod kontrolom RNA faga. Liza stanice: stanica puca pod utjecajem lizozima; oslobađa se oko 200-1000 novih faga; fagi inficiraju druge bakterije.

Primjena U medicini Jedno od područja upotrebe bakteriofaga je antibakterijska terapija, alternativa uzimanju antibiotika. Na primjer, koriste se bakteriofagi: streptokokni, stafilokokni, klebsielni, dizenterijski i polialentni, piobakteriofagi, coli, proteus i koliproteus i drugi. U Rusiji je registrirano i koristi se 13 medicinskih proizvoda na bazi faga. Trenutno se koriste za liječenje bakterijskih infekcija koje nisu osjetljive na tradicionalni tretman antibiotici, posebno u Republici Gruziji. Tipično, uporaba bakteriofaga je popraćena većim uspjehom od antibiotika tamo gdje su prisutni. biološke membrane, obložen polisaharidima, kroz koje antibiotici obično ne prodiru. Trenutno terapijska upotreba Bakteriofagi nisu dobili odobrenje na Zapadu, iako se fagi koriste za ubijanje bakterija koje uzrokuju trovanje hranom, poput listerije. Uz dugogodišnje iskustvo u iznosu od veliki grad I ruralna područja dokazana je neobično visoka terapijska i profilaktička učinkovitost dizenteričnog bakteriofaga (P. M. Lerner, 2010.). U Rusiji se već dugo rade terapeutski pripravci faga; oni su liječeni fagom čak i prije antibiotika. Posljednjih godina, fagi su naširoko korišteni nakon poplava u Krymsku i Khabarovsku za sprječavanje dizenterije.

U biologiji se bakteriofagi koriste u genetskom inženjeringu kao vektori koji prenose dijelove DNA; moguć je i prirodni prijenos gena između bakterija putem nekih faga (transdukcija). Vektori faga obično se stvaraju na temelju umjerenog bakteriofaga λ koji sadrži dvolančanu linearnu molekulu DNA. Lijevo i desna ramena faga imaju sve gene potrebne za litički ciklus (replikacija, reprodukcija). srednji dio Genom bakteriofaga λ (sadrži gene koji kontroliraju lizogeniju, odnosno njegovu integraciju u DNA bakterijske stanice) nije bitan za njegovu reprodukciju i sastoji se od približno 25 tisuća parova nukleotida. Ovaj dio se može zamijeniti stranim fragmentom DNK. Takvi modificirani fagi prolaze kroz litički ciklus, ali ne dolazi do lizogenije. Vektori bakteriofaga λ koriste se za kloniranje fragmenata DNA eukariota (odnosno većih gena) do 23 tisuće parova nukleotida (kb). Štoviše, fagi bez umetaka manji su od 38 kb. ili, naprotiv, s prevelikim umetcima - više od 52 kb. ne razvijaju niti inficiraju bakterije. Budući da je reprodukcija bakteriofaga moguća samo u živim stanicama, bakteriofagi se mogu koristiti za određivanje vitalnosti bakterija. Ovaj smjer ima velike izglede, budući da je jedan od glavnih problema u različitim biotehnološkim procesima određivanje održivosti korištenih usjeva. Metodom elektrooptičke analize staničnih suspenzija prikazana je mogućnost proučavanja faza interakcije faga i mikrobne stanice.

I u veterini za: prevenciju i liječenje bakterijske bolesti ptice i životinje; liječenje gnojno-upalnih bolesti sluznice očiju i usne šupljine; prevencija gnojno-upalnih komplikacija kod opeklina, rana, kirurških intervencija; u genetičkom inženjerstvu: za transdukciju - prirodni prijenos geni između bakterija; kao vektori koji prenose dijelove DNA; korištenjem faga moguće je projektirati ciljane promjene u genomu DNK domaćina; V Industrija hrane: gotovi proizvodi od mesa i peradi već se masovno prerađuju sredstvima koja sadrže fage; bakteriofagi se koriste u proizvodnji prehrambenih proizvoda od mesa, peradi, sira, biljnih proizvoda i dr.;

V poljoprivreda: prskanje fagnim pripravcima za zaštitu biljaka i usjeva od truleži i bakterijskih bolesti; za zaštitu stoke i peradi od infekcija i bakterijskih bolesti; Za ekološka sigurnost: antibakterijsko tretiranje sjemena i biljaka; čišćenje prostorija poduzeća za preradu hrane; dezinfekcija radnog prostora i opreme; prevencija bolničkih prostora; provođenje ekoloških aktivnosti

Dakle, danas su bakteriofagi vrlo popularni u životu ljudi i životinja. Poduzeća su zacrtala niz prioritetnih područja za razvoj i proizvodnju terapeutskih i profilaktičkih bakteriofaga, koja su u korelaciji s novonastalim svjetskim trendovima. Stvaraju se i uvode novi lijekovi za liječenje mnogih bolesti. Proučavanjem i primjenom bakteriofaga bave se bakteriolozi, virolozi, biokemičari, genetičari, biofizičari, molekularni biolozi, eksperimentalni onkolozi, stručnjaci za genetičko inženjerstvo i biotehnologiju.

FSBEI HPE "Mari State University"

Biološko-kemijski fakultet

Zavod za biokemiju i fiziologiju

Sažetak iz mikrobiologije i osnova virusologije

"Bakteriofagi"

Izvedena:

student III tečaj

grupa BPG-21

Chesnokova Elena

Provjereno:

Izv.prof.dr.sc.

Gazheeva T.P.

Yoshkar-Ola, 2011

Uvod 3

Bakteriofagi. Njihova uloga u biosferi 4

Građa bakteriofaga 6

Interakcija bakteriofaga s bakterijskim stanicama 7

Životni ciklus 9

Taksonomija bakteriofaga 10

Primjena 11

U medicini 11

U biologiji 11

U mikrobiološkoj industriji 12

Glavne faze razvoja i najjednostavnije metode za proučavanje bakteriofaga 13

Popis izvora informacija 17

Uvod

Engleski bakteriolog Frederick Twort 1 u članku iz 1915. godine opisuje zaraznu bolest stafilokoka, uzročnik infekcije prolazi kroz filtere i može se prenositi iz jedne kolonije u drugu.

Neovisno o Fredericku Twortu, francusko-kanadski mikrobiolog Felix D'Herelle izvijestio je o otkriću bakteriofaga 3. rujna 1917. godine. Uz to, poznato je da je ruski mikrobiolog Nikolaj Fedorovič Gamaleja 3 još 1898. godine prvi uočio pojavu lize bakterija (bacila antraksa) pod utjecajem transplantabilnog sredstva.

Felix D'Herelle također je sugerirao da su bakteriofagi korpuskularne prirode. Međutim, tek nakon izuma elektronskog mikroskopa bilo je moguće vidjeti i proučavati ultrastrukturu faga. Dugo su se ideje o morfologiji i glavnim značajkama faga temeljile na rezultatima proučavanja faga T-skupine - T1, T2, ..., T7, koji se razmnožavaju na E. coli (E. coli) soj B. Međutim, svake su se godine pojavljivali novi podaci o morfologiji i strukturi različitih faga, što je zahtijevalo njihovu morfološke klasifikacije.

Bakteriofagi. Njihova uloga u biosferi

Bakteriofagi (fagi) (od starogrčkog φᾰγω - “proždiram”) su virusi koji selektivno inficiraju bakterijske stanice. Najčešće se bakteriofagi razmnožavaju unutar bakterija i uzrokuju njihovu lizu 4 . Tipično, bakteriofag se sastoji od proteinske ovojnice i jednolančanog ili dvolančanog genetskog materijala nukleinske kiseline (DNA ili, rjeđe, RNA). Veličina čestica je približno 20 do 200 nm.

Struktura tipičnog miovirusa bakteriofaga (slika 1).

Bakteriofagi su najbrojnija, u biosferi najrasprostranjenija i, pretpostavlja se, evolucijski najstarija skupina virusa. Procijenjena veličina populacije faga je više od 1030 čestica faga.

U prirodnim uvjetima fagi se nalaze na mjestima gdje postoje bakterije osjetljive na njih. Što je određeni supstrat (tlo, ljudski i životinjski izlučevine, voda itd.) bogatiji mikroorganizmima, to je veći broj odgovarajućih faga koji se u njemu nalazi. Tako se u tlima nalaze fagi koji liziraju stanice svih vrsta zemljišnih mikroorganizama. Posebno su bogati fagima černozemi i tla na kojima su primijenjena organska gnojiva.

Bakteriofagi obavljaju važna uloga u kontroli broja mikrobnih populacija, u autolizi stanica koje stare, u prijenosu bakterijskih gena, djelujući kao vektorski "sustavi".

Doista, bakteriofagi su jedan od glavnih mobilnih genetskih elemenata. Transdukcijom unose nove gene u bakterijski genom. Procjenjuje se da se u 1 sekundi mogu zaraziti 1024 bakterije. To znači da se stalni prijenos genetskog materijala raspoređuje među bakterijama koje žive u sličnim uvjetima.

Visoka razina specijalizacije, dugoročno postojanje i sposobnost brzog razmnožavanja u prikladnom domaćinu pridonose njihovom očuvanju u dinamičkoj ravnoteži među širokim spektrom bakterijskih vrsta u bilo kojem prirodnom ekosustavu. Kada odgovarajući domaćin nije dostupan, mnogi fagi mogu ostati zarazni desetljećima osim ako ih ne unište ekstremne tvari ili uvjeti okoliša.

Pripravci faga koriste se za liječenje i prevenciju zaraznih bolesti, kao iu dijagnostici - za određivanje osjetljivosti na fage i fagotipizaciju u identifikaciji mikroorganizama. Djelovanje faga temelji se na njihovoj strogoj specifičnosti. Terapeutski i profilaktički učinak faga određen je litičkom aktivnošću samog faga, kao i imunizirajućim svojstvom komponenti (antigena) uništenih mikrobnih stanica koje se nalaze u fagolizatima, osobito u slučaju ponovljene uporabe. Pri dobivanju fagnih pripravaka koriste se dokazani proizvodni sojevi faga i sukladno tome tipične kulture mikroorganizama. Bakterijska kultura u tekućini hranjivi medij, koji je u logaritamskoj fazi reprodukcije, inficiran je uterinskom suspenzijom faga.

Fag-lizirana kultura (obično sljedeći dan) se filtrira kroz bakterijske filtere i otopina kinozola se dodaje filtratu koji sadrži fag kao konzervans.
Gotova droga fag je bistra tekućina žućkaste boje. Za duže skladištenje neki fagi dostupni su u suhom obliku (u tabletama). U liječenju i prevenciji crijevne infekcije fagi se koriste istovremeno s otopinom natrijevog bikarbonata, budući da kiseli sadržaj želuca uništava fag. Fag ne perzistira u organizmu dugo (5-7 dana), pa se preporučuje ponovna uporaba.

Proizvedeno u Sovjetskom Savezu sljedećih lijekova, koristi se za liječenje i prevenciju bolesti: tifusa, salmonele, dizenterije, kolifaga, stafilokoknog faga i streptokoka. Trenutno se fagi koriste za liječenje i prevenciju u kombinaciji s antibioticima. Ova aplikacija ima više učinkovito djelovanje za oblike bakterija otporne na antibiotike.

Dijagnostički bakteriofagi naširoko se koriste za identifikaciju bakterija izoliranih iz pacijenta ili iz zaraženih okolišnih objekata. Uz pomoć bakteriofaga, zbog njihove visoke specifičnosti, moguće je odrediti vrste bakterija te s većom točnošću pojedine vrste izoliranih bakterija. Trenutno je razvijena fagodijagnostika i fagotipizacija bakterija roda Salmonella, Vibrio i stafilokoka. Fagotipizacija pomaže u utvrđivanju izvora infekcije, proučavanju epidemioloških odnosa i razlikovanju sporadičnih slučajeva bolesti od epidemijskih.
Fagodijagnostika i fagotipizacija temelji se na principu kokultivacije izoliranog mikroorganizma s odgovarajućom vrstom ili tipom faga. Pozitivan rezultat Smatra se da postoji dobro definirana liza proučavane kulture s fagom vrste, a zatim s jednim od tipičnih faga.