Uzročnik difterije (Corynebacterium diphtheriae). Corynebacterium diphtheriae (difterija korinebakterija)
Uzročnik difterije pripada rodu Corynebacterium (od latinskog coryna - klub, diphthera - film). Bakterije na krajevima imaju batinasta zadebljanja. Ovaj rod uključuje bacile difterije patogene za ljude i nepatogene vrste - bacile pseudodifterije i difteroide, koji se nalaze na sluznicama i koži.
Uzročnike difterije Corynebacterium diphtheriae otkrio je T. Klebs (1883.) i izolirao ih god. čisti oblik F. Leffler (1884).
Morfologija. Uzročnici difterije su blago zakrivljeni, tanki štapići, veličine 3-6 × 0,3-0,5 mikrona, sa zadebljanjima na krajevima. Ova zadebljanja sadrže zrnca volutina (Babesch-Ernst zrna). Bakterije difterije su nepokretne i nemaju spore niti kapsule. Gram pozitivan. Dobro se boje osnovnim anilinskim bojama, dok su zrna volutina intenzivnije obojena. Za bojanje se obično koristi alkalno metilen plavo ili kristalno ljubičasto. Značajka Corynebacteria diphtheria je njihov polimorfizam; u jednoj kulturi postoje šipke različitih oblika i veličina: zakrivljene, ravne, duge, kratke, debele, ponekad kokobakterije. Lokalizacija bakterija u razmazima je karakteristična - obično se nalaze u paru pod oštrim ili tupim kutom, u obliku raširenih prstiju i sl. Položaj u razmazima i prisutnost volutinskih zrna je diferencijalno dijagnostički znak pri mikroskopskom pregledu. Nepatogeni predstavnici roda Corynebacteria - bacili pseudodifterije i difteriode često su raspoređeni u obliku palisade, mogu bez zrna volutina ili mogu biti na jednom kraju (vidi sliku 4).
Uzgoj. Corynebacterium diphtheria su fakultativni anaerobi. Rastu na temperaturi od 35-37° C, pH 7,4-7,8. Ne razmnožavaju se normalno hranjive podloge. Uzgajaju se na medijima koji sadrže krv ili serum.
Krajem 19. stoljeća francuski znanstvenik E. Roux predložio je korištenje koaguliranog goveđeg ili konjskog seruma za uzgoj bakterija difterije, a F. Leffler preporučio je dodavanje bujona (25%) i 1% glukoze. Na ovim podlogama korinebakterije rastu brzo, unutar 14-18 sati formiraju konveksne kolonije krem boje koje se ne spajaju (rast na kosom podlozi podsjeća na šagrensku kožu). Međutim, na tim je podlogama nemoguće razlikovati bacile difterije od bacila pseudodifterije.
Trenutačno su glavne podloge za uzgoj Claubergova podloga (sadrži krvni serum i kalijev telurit), Buninova podloga kinozola, Tinsdalova podloga itd. Na temelju kulturnih i enzimskih svojstava korinebakterija, difterija se dijeli na tri biovarija: gravis, mitis ), intermedius . Biovar gravis obično se nalazi u R obliku. Na Claubergovoj podlozi bakterije ovog biovara rastu u obliku velikih kolonija 2-3 mm, sivkasto-crne boje (jer reduciraju telurit u telur) i imaju nazubljene rubove, što im daje izgled rozete. Kada petljom dodirnete koloniju, čini se da se mrvi. U bujonu bakterije ovog biovara stvaraju mrvljivi film i zrnasti sediment.
Corynebacterium biovar mitis raste na Claubergovoj podlozi u obliku malih, glatkih kolonija (oblika slova S) crne boje. U bujonu daju jednoliku zamućenost.
Corynebacteria biovar intermedius (intermedini) su intermedijarni. Na Claubergovoj podlozi bakterije ovog biovara često rastu u obliku sjajnih, malih, crnih kolonija (ovaj biovar je rijedak).
Enzimska svojstva. Sva tri biovara bakterija difterije posjeduju enzim cistinazu, koji razgrađuje cistin i proizvodi sumporovodik. Ova svojstva koriste se za razlikovanje uzročnika difterije od nepatogenih predstavnika ovog roda (tablica 49).
Bilješka. + pozitivna reakcija (kvari se); - negativna reakcija (ne cijepa se).
Patogeni sva tri biovara razgrađuju glukozu i maltozu u kiselinu. C. gravis razgrađuje škrob. Ovo svojstvo ga razlikuje od druga dva biovara. Corynebacterium diphtheria reducira nitrate u nitrite, ne stvara indol i ne razgrađuje ureu.
Corynebacterium diphtheria proizvodi neuraminidazu, hijaluronidazu i druge patogene enzime.
Stvaranje toksina. Virulentni sojevi uzročnika difterije proizvode egzotoksin. Kemijski, to je termolabilan protein koji se sastoji od dvije frakcije. Frakcija B fiksira toksin na tjelesna tkiva osjetljiva na njega. Frakcija A je odgovorna za toksični učinak. Jačina kultura toksina difterije može se odrediti "in vivo" kod zamoraca osjetljivih na toksin. Dim egzotoksin difterije je minimalna letalna doza, to je minimalna količina otrova koja ubije zamorca od 250 g 4. dana.
Prisutnost egzotoksina može se otkriti i "in vitro" - na čvrstom hranjivom mediju. Ova metoda ima široku primjenu u praksi. Egzotoksin difterije je nestabilan. Brzo se raspada pod utjecajem temperature, svjetlosti i atmosferskog kisika. Nakon dodavanja formalina (0,3-0,4%) toksinu i držanja na temperaturi od 37-38 °C nekoliko tjedana, on se pretvara u toksoid, koji gubi svoju toksičnost, ali zadržava antigenska svojstva toksina. Toksini koje proizvode različiti sojevi se međusobno ne razlikuju i mogu se neutralizirati difterijskim antitoksinom *.
* (Sada je utvrđeno da svi biovari korinebakterija mogu biti toksigeni i netoksigeni.)
Antigenska struktura. Bakterije difterije imaju površinski toplinski labilan proteinski antigen i polisaharidni O-antigen specifičan za tip. Osim toga, među korinebakterijama razlikuje se 19 produkata faga, koji se uzimaju u obzir pri identificiranju kultura. Fagovari se koriste za identifikaciju izvora bolesti.
Otpornost na čimbenike okoliša. Uzročnici difterije su relativno stabilni. Temperatura od 60°C ubija ih za 10-15 minuta, 100°C ih ubija za minutu. U filmu mogu izdržati zagrijavanje do 90 ° C. Na valjanoj sirutki na sobnoj temperaturi traju do 2 mjeseca, na dječjim igračkama - nekoliko dana. Korinebakterije dobro podnose niske temperature. Uzročnici difterije prilično su otporni na sušenje. Dezinficijensi (3% otopina fenola, 1% otopina sublimata, 10% otopina vodikovog peroksida) ubijaju ove bakterije u roku od nekoliko minuta.
Osjetljivost životinja. U prirodni uvjetiživotinje ne obolijevaju od difterije. Od pokusnih životinja najosjetljiviji su zamorci i kunići. S intradermalnom ili potkožnom infekcijom razvijaju sliku toksične infekcije s stvaranjem upale, edema i nekroze na mjestu ubrizgavanja. Krvarenja se opažaju u nadbubrežnim žlijezdama.
Izvori bolesti. Bolesnici i nosioci bakterija.
Putevi prijenosa. Kapljice u zraku, kontakt u kućanstvu (preko posuđa, igračaka, knjiga, ručnika itd.).
Bolest kod ljudi: 1) difterija ždrijela; 2) nosna difterija.
Rjeđe je difterija dušnika, bronha, očiju, ušiju, rodnice i difterija oštećene kože.
Patogeneza. Ulazna vrata su sluznice dišnog trakta i oštećena koža. Kada dospiju na sluznicu, uzročnici difterije se razmnožavaju na mjestu prodora i uzrokuju nekrozu tkiva. Formira se film koji je usko povezan s donjim tkivima. Na površini sluznice pojavljuju se prljavosive ili žućkaste naslage koje se sastoje od razorenog epitela, fibrina, leukocita i corynebacterium diphtheria. Prilikom uklanjanja filma vatom ili lopaticom, površina sluznice može krvariti.
Tijekom proliferacije Corynebacterium diphtheria dolazi do nakupljanja egzotoksina u nekrotičnim područjima, što može dovesti do oticanja sluznice i tkiva. Sa sluznice se otok može proširiti na grkljan, bronhe i uzrokovati asfiksiju. Toksin koji cirkulira u krvi selektivno utječe na srčani mišić, nadbubrežne žlijezde i stanice živčanog tkiva.
Difterija je toksična infekcija. Težina procesa ovisi o stupnju toksigenosti soja i obrambenim sposobnostima organizma.
Imunitet. Imunitet je uzrokovan antitoksičnim i antibakterijskim imunitetom. dojenčad ne obolijevaju jer imaju pasivni imunitet prenijet od majke.
Prisutnost antitoksične imunosti prosuđuje se Schickovom reakcijom. Za postavljanje reakcije 1 / 40 Dlm ( smrtonosna doza Toksin zamorca), koji se nalazi u 0,2 ml izotonične otopine natrijeva klorida, ubrizgava se intradermalno u podlakticu. Ako u krvi nema antitoksina, nakon 24-48 sati na mjestu uboda javlja se crvenilo i otok (promjera do 2 cm). Ako je antitoksin prisutan, nema otoka niti crvenila (antitoksin prisutan u krvi neutralizira ubrizgani toksin).
Prenesena bolest ostavlja imunitet. Međutim, u 6-7% slučajeva opažaju se rekurentne bolesti.
Prevencija. Rana dijagnoza. Izolacija. Dezinfekcija. Identifikacija nositelja toksigenog bacila difterije.
Specifična prevencija provodi se uvođenjem toksoida. U SSSR-u provode obavezno cijepljenje djeca s DTP cjepivom je složeno cjepivo koje uključuje difteriju i toksoid tetanusa i suspenzija mrtvih štapića hripavca. Djeca se cijepe od 5-6 mjeseci s naknadnim revakcinacijom. Za ponovno cijepljenje primjenjuje se cjepivo bez pertusisnih štapića.
Specifičan tretman. Koristi se antitoksični serum protiv difterije. Dozu i učestalost određuje liječnik, a također se primjenjuju antimikrobni lijekovi.
Kontrolna pitanja
1. Kakva je morfologija Corynebacterium diphtheria i koji biovari postoje?
2. Na kojim podlogama se uzgajaju bakterije difterije i kakav je obrazac rasta?
3. Odnos prema kojem ugljikohidratu omogućuje razlikovanje biovara gravis od drugih biovara difterije?
4. Koji je put prijenosa i gdje je uzročnik difterije najčešće lokaliziran u bolesnika?
5. Koje su specifične prevencije i specifičnog liječenja difterije?
Mikrobiološki pregled
Svrha studije: izolacija patogena za dijagnozu. Identifikacija kliconoša difterije prema epidemiološkim indikacijama. Detekcija egzotoksina u izoliranoj kulturi.
Materijal za istraživanje
1. Iscjedak iz sluznice ždrijela.
2. Iscjedak iz nosne sluznice.
3. Iscjedak iz sluznice oka.
4. Gnoj iz uha.
5. Iscjedak iz sluznice rodnice.
6. Iscjedak rane.
Materijal za istraživanje ovisi o lokalizaciji procesa.
Za svaku lokalizaciju procesa obavezno pregledajte sluznicu ždrijela i nosa. Materijal se uzima štapićem od vate, za što se koristi metalna žica, po mogućnosti aluminijska, na čiji se jedan kraj čvrsto namota vata, zatim se štapić ugradi u pluteni čep, stavi u epruvetu i sterilizira u Pasteur peći na temperaturi od 160°C 1 tampon na sat vremena ili u autoklavu na temperaturi od 112°C.
Bilješke. 1. Materijal se uzima na prazan želudac ili najranije 2 sata nakon jela i ne ranije od 4 dana nakon liječenja antibioticima ili drugim antibakterijskim sredstvima. 2. Ako se materijal uzima iz grla i nosa, tada se epruvete s oba brisa obilježe i povežu. Kulture se rade zasebno, a materijal iz svakog brisa se ispituje kao samostalan rad. 3 Materijal prikupljen suhim tupferom treba inokulirati najkasnije 2-3 sata nakon uzimanja. Ako je potrebno transportirati prikupljeni materijal, bris se prethodno navlaži 5% otopinom glicerina u izotoničnoj otopini natrijevog klorida.
Osnovne metode istraživanja
1. Mikrobiološki.
2. Bakterioskopski.
3. Biološki.
Napredak studije
Drugi dan studija
Čaše se izvade iz termostata i pregledaju. Rast bakterija na Claubergovom mediju može biti usporen zbog prisutnosti inhibitora u mediju. U tom slučaju, šalice se stavljaju u termostat još 24 sata.
Treći dan studija
Čašice se izvade iz termostata i pregledaju pomoću povećala ili stereoskopskog mikroskopa. Ako postoje sumnjive kolonije, dio njih se pod kontrolom stereoskopskog mikroskopa izolira na agaru s 25% seruma i na koloni s Pisa medijem za određivanje enzima cistinaze. Test na toksigenost uzima se iz drugog dijela kolonija.
Tijekom mikroskopskog pregleda kolonija uzetih iz Claubergove podloge, korinebakterije difterije gube svoju specifičnost: nema zrnatosti, mijenja se veličina, a lokalizacija ostaje ista. Kada se inokuliraju na podloge sa serumom, vraća se morfološka specifičnost uzročnika difterije.
Kod identifikacije uzročnika difterije obavezna je pretraga na prisutnost enzima cistinaze i određivanje toksigenosti. Ako rezultat ovih pokusa, provedenih s dijelom kolonija iz Claubergove podloge, nije dovoljno jasan ili je negativan, pokus se ponavlja s izoliranom čistom kulturom.
Test cistinaze. Kultura koja se proučava sije se ubrizgavanjem u središte stupca Pisa medija. Ako je reakcija pozitivna, nakon 18-24 sata, tijekom injekcije se opaža zacrnjenje, a oko crne šipke formira se tamni oblak; crnjenje nastaje kao rezultat činjenice da enzim cistinaza razgrađuje cistin koji je dio Pisa medija, a oslobođeni sumpor reagira s olovnim acetatom - nastaje crni olovni sulfit. Difteroidi i bacili pseudodifterije ne sadrže enzim cistinazu, stoga, kada rastu na Pisu mediju, boja medija se ne mijenja.
Određivanje egzotoksina. Provodi se metodom difuznog taloženja u gelu. Metoda se temelji na interakciji toksina s antitoksinom. U onim područjima agara gdje ove komponente međusobno djeluju, formira se talog u obliku zaobljenih linija.
Metoda određivanja: rastopljeni i na 50°C ohlađeni Marten agar, pH 7,8, ulije se u Petrijeve zdjelice (Martin agar proizvodi bolji egzotoksin). Količina agara u posudi ne smije biti veća od 12-15 ml kako bi se održala prozirnost - u debelom sloju teško se vide linije taloženja. Nakon stvrdnjavanja agara nanesite traku sterilnog filter papira navlaženu antitoksičnim serumom protiv difterije.
Ispitna kultura inokulirana je "pločicama". Sjetva se vrši pomoću petlje. Promjer pločica je 0,8-1,0 cm, udaljenost pločica od ruba papirnatih traka je 0,5-0,7 cm, pločice poznatog toksigenog soja inokuliraju se između dvije pločice testne kulture. Ispitna kultura smatra se toksigenom ako su linije taloženja jasne i spajaju se s linijama taloženja kontrolnog (toksogenog) soja. Ako se linije taloženja sijeku s linijama kontrolnog soja ili ih nema, izolirana kultura se smatra netoksogenom (slika 50).
Priprema traka papira. Od filtar papira se izrežu trake veličine 1,5 x 8 cm, nekoliko komada zamota u papir i sterilizira u autoklavu na temperaturi od 120°C 30 minuta. Prije izvođenja pokusa sterilnom pincetom izvadite jednu traku, stavite je u sterilnu Petrijevu zdjelicu i navlažite antitoksičnim serumom protiv difterije. Serum se prvo razrijedi tako da 1 ml sadrži 500 AE (antitoksičnih jedinica). Papir se navlaži s 0,25 ml seruma (125 AU) i postavi na površinu medija. Zatim se usjevi obavljaju na gore navedeni način. Svi usjevi se stavljaju u termostat. Rezultati se bilježe nakon 18-24 i 48 sati.
Četvrti dan istraživanja
Usjevi se uklanjaju iz termostata i rezultati se uzimaju u obzir. Razmazi se izrađuju iz kulture uzgojene na podlozi sa serumom i boje se Loefflerovim plavetnilom.
Prisutnost u razmazima štapića karakterističnih za njihovu morfologiju, crnog štapića s oblakom u Pisuovom mediju i linija taloženja u agaru omogućuje nam da damo preliminarni odgovor: "Detektirana je Corynebacterium diphtheria." Istraživanje se nastavlja. Ako u agaru nema linija taloženja ili je njegova bistrina nedovoljna, test toksigenosti mora se ponoviti s izoliranom čistom kulturom.
Za konačnu identifikaciju izolirane kulture i određivanje biovara uzročnika provodi se inokulacija na glukozu, saharozu, škrob i bujon s ureom (za otkrivanje enzima ureaze). Sjetva na podloge se obavlja na uobičajeni način.
Test na ureazu. Izolirana kultura se sije u bujon s ureom i indikatorom (krezol crveno) i stavlja u termostat. Nakon samo 30-40 minuta, rezultat se može uzeti u obzir: kod inokulacije pravih uzročnika difterije, boja medija se ne mijenja, budući da ne sadrže ureazu. Bacili pseudodifterije razgrađuju ureu i mijenjaju indikator – medij postaje grimiznocrven.
Peti dan istraživanja
Rezultati se bilježe (Tablica 50).
Kontrolna pitanja
1. Koji materijal se ispituje za identifikaciju uzročnika difterije?
2. Kako se uzima materijal za testiranje na difteriju iz grla i nosa?
3. Što treba učiniti s brisom ako je potrebno transportirati prikupljeni materijal?
4. Koji se uređaj koristi za proučavanje kolonija na Claubergovoj podlozi?
5. Koja se istraživanja provode za konačnu identifikaciju izolirane kulture?
6. Koje metode se koriste za određivanje toksigenosti Corynebacterium diphtheria?
1. Uzmite žicu i vatu od učitelja i pripremite 10 tampona, ugradite ih u pluteni čep, stavite u epruvetu i sterilizirajte.
Pažnja! Prije sterilizacije provjerite je li tampon dovoljno čvrsto namotan.
2. Uzmite sterilne briseve od učitelja i međusobno uzmite materijal iz grla i nosa (s različitim brisevima).
3. Studija iz tablice. 49 svojstva uzročnika difterije i srodnih korinebakterija.
4. Ispitivanje toksičnosti. Učinite ploče u petlju bez kulture.
5. Skicirajte napredak studije te pozitivne i negativne rezultate testa toksigenosti.
Kulturni mediji
Telur Claubergov medij: prva smjesa - 1,5 mjesec unaprijed priprema se mješavina od 20 ml janjeće ili konjske krvi i 10 ml glicerina. Na dan pripreme medija pripremaju se dvije druge smjese; druga smjesa - 50 ml MPA pH 7,5 se otopi i ohladi na temperaturu od 50 ° C, nakon čega se doda 2,5 ml prve smjese; treća smjesa - pomiješati 17 ml ovčje krvi i 33 ml destilirane vode (smjesa se priprema sterilno), zagrijana u vodenoj kupelji na temperaturu od 50°C. Spojiti drugu i treću smjesu, dodati 4 ml 1% otopine kalijevog telurita K 2 TeO 3, brzo sve promiješati i uliti u šalice. Medij je proziran i boje crnog vina.
Srijeda Pisa. U 90 ml rastaljenog 2% MPA (pH 7,6) dodajte 2 ml otopine cistina (1% otopina cistina u 0,1 N otopini natrijevog hidroksida), dobro promiješajte i dodajte isti volumen od 0,1 N. otopina sumporne kiseline. Medij se sterilizira 30 minuta na temperaturi od 112°C. Otopljenom i na 50°C ohlađenom mediju doda se 1 ml 10% otopine olovnog acetata, dva puta sterilizira uz strujanje vodenom parom, promiješa i doda se 9 ml normalan konjski serum. Medij se sterilno ulije u male epruvete od 2 ml. Sjetva se obavlja injekcijskim putem.
Srijeda Bunin. Suhi kinosolni medij se doda u 100 ml hladna voda(pH 7,6-7,8), miješati i zagrijavati na laganoj vatri dok se agar ne rastopi (prema uputama na etiketi). Zatim se medij kuha 2-3 minute do stvaranja pjene, nakon čega se medij ohladi na 50 °C i doda 5-10 ml sterilne defibrinirane krvi. Medij se promiješa i izlije u Petrijeve zdjelice. Pripremljeni medij može se čuvati 3-4 dana na temperaturi od 4-10°.
Tinsdal srijeda. U 100 ml 2% hranjivog agara, otopljenog i ohlađenog na 50 °C, dodajte: 1) 12 ml 1% otopine cistina na 0,1 N. otopina sumporne kiseline; 2) 12 ml 1% otopine natrijevog hidroksida; 3) 1,8 ml 2% otopine kalijevog telurita; 4) 1,8 ml 2,5% otopine natrijevog hiposulfita, 20 ml normalnog konjskog ili goveđeg seruma. Nakon dodavanja svakog sastojka, medij se temeljito promiješa. Čašice s podlogom čuvaju se 3-4 dana na 10°C.
Pitanje 2. Corynebacterium diphtheriae (rod Corynebacterium)
C. diphtheriae - štapićaste bakterije; uzrokuju difteriju (grčki diphtheria - koža, film) - akutna infekcija karakterizirana fibrinoznom upalom u ždrijelu, grkljanu, rjeđe u drugim organima i simptomima intoksikacije.
Morfološka i kulturalna svojstva.
Corinebacterium diphteriae su tanke, blago zakrivljene ili ravne gram-pozitivne štapiće raspoređene pod kutom jedna prema drugoj u obliku rimskih petica. Na krajevima su zadebljani zbog prisutnosti zrna valuta na jednom ili oba pola ćelije. Zrnca valute sastoje se od polifosfata; oni percipiraju anilinske boje intenzivnije od citoplazme stanice i lako se otkrivaju kada se boje prema Neisseru u obliku plavo-crnih granula, dok su tijela bakterija obojena žuto-zeleno. Bojanje po Gramu ne otkriva zrnca valute.
Uzimanje razmaza iz čiste kulture. Neisserova mrlja Bris iz čiste kulture.
Loefflerovo alkalno plavo bojenje
Bacil difterije nema rezistenciju na kiseline, nepokretan je, ne stvara spore i ima mikrokapsulu u čijem je sastavu kord faktor. Stanična stijenka sadrži galaktozu, manozu, arabinozu, kao i veliki broj lipida, uključujući kiselo nestabilne mikolne kiseline.
Uzročnik difterije je fakultativni anaerob, heterotrof, raste na 37 o C na složenim hranjivim podlogama: koagulirani krvni serum, krvni telurit agar.
Na elektivnim podlogama nakon 8-14 sati formira točkaste, konveksne žućkasto-krem kolonije s glatkom ili blago granuliranom površinom. Kolonije se ne spajaju i imaju izgled šagrene kože.
Na teluritnim podlogama uzročnik difterije nakon 24-48 sati stvara crne ili crnosive kolonije kao rezultat redukcije telurita u metalni telur.
Uzročnik difterije ima visoku enzimsku aktivnost. Diferencijalno dijagnostičke značajke C. diphteriae su:
nedostatak sposobnosti fermentacije saharoze i razgradnje uree,
sposobnost proizvodnje enzima cistinaze.
Uzročnik difterije nije ujednačen u kulturalnim i biokemijskim svojstvima. Sukladno preporukama Regionalnog ureda Svjetske zdravstvene organizacije za Europu, vrsta C. diphteriae podijeljena je u 4 biovara: gravis, mitis, intermedius, belfanti.
Na teluritnoj podlozi biovar gravis stvara suhe, mat, velike, plosnate, sivkasto-crne kolonije, uzdignute u središtu. Periferija kolonije je svijetla s radijalnim prugama i neravnim rubom. Takve kolonije nalikuju cvijetu tratinčice. Biovar mitis stvara male, glatke, sjajne, crne, konveksne kolonije s glatkim rubom, okružene zonom hemolize. Biovari intermedius i belfanti zapravo pripadaju biovaru mitis, jer ne razgrađuju škrob, a to svojstvo je najstabilnije kod C. diphteriae.
Antigenska struktura. C. diphteriae ima O-antigen (frakcije lipida i polisaharida smještene duboko u staničnoj stijenci) i K-antigen (površinski toplinski labilni protein). O antigen je interspecies. Na temelju antigena K razlikuje se oko 58 serovara.
Faktori patogenosti. Glavni faktori patogenosti C. diphteriae su površinske strukture, enzime i toksine.
Površinske strukture (pili, komponente mikrokapsule: cord faktor, K-antigen, mikolne kiseline) imaju proteinsku i lipidnu prirodu, potiču prianjanje mikroba na mjesto ulazna kapija, sprječavaju fagocitozu bakterija, imaju toksični učinak na stanice makroorganizma, uništavaju mitohondrije.
Enzimi patogenosti: neuraminidaza, hijaluronidaza, hemolizin, dermonekrotoksin. Neuraminidaza odvaja N-acetilneuraminsku kiselinu od sluzi i glikoproteina na površini stanice, lijaza razgrađuje ga na piruvat i N-acetilmanozamin, i piruvat potiče rast bakterija. Kao rezultat djelovanja hijaluronidaza povećava se propusnost krvnih žila i oslobađanje plazme izvan njihovih granica, što dovodi do oticanja okolnih tkiva. Dermonekrotoksin uzrokuje nekrozu stanica na mjestu lokalizacije patogena. Fibrinogen plazme koji se oslobađa izvan krvnih žila dolazi u kontakt s trombokinazom nekrotičnih stanica tijela i pretvara se u fibrin, što je bit difterijske upale. Unutar filma difterije, C. diphteriae nalazi zaštitu od efektora imunološkog sustava i antibiotika, razmnožavajući se i stvarajući velike količine glavni čimbenik patogenosti jehistotoksin difterije.
Histotoksin difterije ima blokirajući učinak na sintezu proteina u organima koji su najintenzivnije opskrbljeni krvlju: kardiovaskularni sustav, miokard, živčani sustav, bubrezi i nadbubrežne žlijezde.
Epidemiologija. U prirodnim uvjetima od difterije obolijevaju samo ljudi koji nemaju otpornost na patogene i antitoksični imunitet. Bolest je široko rasprostranjena. Najveći broj oboljelih zabilježen je u drugoj polovici rujna, listopadu i studenom. Najosjetljivija su djeca predškolske i osnovnoškolske dobi. Među odraslima u grupu povećan rizik uključuju radnike u ugostiteljstvu i trgovini, školama, predškolskim ustanovama i zdravstvenim ustanovama.
C. diphteriae otporna je na čimbenike okoliša: u kapljicama sline na posuđu ili igračkama, na ručkama vrata mogu postojati do 15 dana, na predmetima iz okoliša 5,5 mjeseci, a mogu se razmnožavati u mlijeku. Kada se kuha, C. diphteriae umire u roku od 1 minute, u 10% otopini vodikovog peroksida - nakon 3 minute, u 5% otopini karbolne kiseline i 50-60% alkohola - nakon 1 minute.
Histotoksin difterije vrlo je nestabilan i brzo se uništava izlaganjem svjetlosti, zagrijavanjem i oksidacijom.
Patogeneza.
Izvor infekcije su:
1.nosioci toksigenih sojeva - posebno su opasni oni nosioci koji nemaju kliničke manifestacije bolesti, budući da imaju antitoksični imunitet.
2.bolesnici: Među bolesnicima najveći značaj imaju oni s lokalizacijom procesa u gornjim dišnim putovima. Bolesnik je epidemiološki opasan tijekom cijelog razdoblja bolesti, čak i tijekom oporavka oslobađa toksigene sojeve u okoliš.
Glavni mehanizam infekcije je aerosol. Putevi prijenosa:
vodeća uloga pripada kapljicama u zraku,
ponekad se mogu javiti putevi prijenosa putem zračne prašine, kontaktom u kućanstvu, a također i putem prehrane (preko mlijeka).
Ulazna kapija infekcije opslužuju sluznicu orofarinksa ( krajnici i okolna tkiva), nosa, grkljana, dušnika, kao i sluznice očiju i genitalija, oštećene kože, površine rane ili opekline, nezacijeljene pupčane rane.
Najčešće difterija grla ( 90-95%). Period inkubacije traje od 2 do 10 dana. Po patogenezi difterija spada u toksinemijske infekcije kada mikrob ostaje na ulazu infekcije, i sve kliničke manifestacije povezane su s djelovanjem egzotoksina.
Početno stanje infektivni proces je prianjanje mikroba na ulaznim vratima. Tu se razmnožavajući, mikrob izlučuje g istotoksin, koji ima lokalni učinak na stanice tkiva, a također ulazi u krv, što dovodi do toksinemije.
U području ulaznih vrata razvija se upalna reakcija, koja je popraćena nekrozom epitelnih stanica i edemom, stvara se bijela prevlaka sivkaste ili žućkaste nijanse koja sadrži veliki broj mikroba koji proizvode toksin.
Karakterističan simptom difterije je fibrinozni film:
Ako se stvara sluznica jednoslojni epitel(grkljan, dušnik, bronhi), javlja se lobarna upala, ovdje se film nalazi površno i lako se odvaja od ispod ležećih tkiva.
Ako se stvara sluznica slojeviti epitel(orofarinks, epiglotis, glasnice), javlja se difterična upala kada su sve stanice čvrsto povezane jedna s drugom i s osnovnom vezivnotkivnom bazom. U tom slučaju, fibrinozni film je čvrsto spojen s tkivima ispod i ne može se ukloniti tamponom. Kada to pokušate učiniti, sluznica krvari.
Imunitet. Nakon bolesti stvara se postojana i intenzivna humoralna antitoksična imunost. Trajanje imuniteta nakon cijepljenja je 3-5 godina.
Mikrobiološka dijagnostika.
Materijal za istraživanje je fibrinozni film, sluz iz grla ili nosa.
Prikupljanje materijala mora se provesti unutar 3-4 sata (najkasnije 12 sati) od trenutka kontakta s pacijentom. Za prikupljanje materijala koriste se suhi pamučni štapići, ako će se sjetva obaviti unutar 2-3 sata, prilikom transporta materijala brisevi se navlaže 5% otopinom glicerina.
Dijagnostičke metode:
Glavna dijagnostička metoda je bakteriološki. Bakteriološki laboratorij mora u roku od 48 sati dati odgovor o prisutnosti ili odsutnosti C. diphteriae u pretragama.
Materijal se inokulira na hranjivu podlogu. Odabiru se sumnjive kolonije i identificira se izolirana kultura:
Na temelju prisutnosti cistinaze (Pizou test): ispitna kultura se inokulira u stupac hranjivog agara s cistinom. Usjevi se inkubiraju 24 sata na 37 o C. C. diphteriae uzrokuje crnjenje medija uzduž injekcije kao posljedicu stvaranja olovnog sulfida.
Na prisutnost ureaze (Sachsov test): pripremiti alkoholnu otopinu uree i otopinu indikatora - fenol crvenog, koje se prije upotrebe pomiješaju u omjeru 1:9 i uliju u aglutinacijske epruvete. Bakterije koje se proučavaju uvode se u omči i trljaju se duž zida posude. U pozitivnom slučaju, nakon 20-30 minuta inkubacije na 37 o C, medij postaje crven kao rezultat razgradnje uree pomoću ureaze.
Sposobnost C. diphteriae da proizvodi toksin (određeno reakcijom taloženja u agaru). Da biste to učinili, traka filter papira impregnirana antitoksičnim serumom protiv difterije koji sadrži 5000 AE/ml stavi se u Petrijevu zdjelicu s hranjivim agarom koji sadrži 15-20% konjskog seruma, 0,3% maltoze i 0,03% cistina. Čašica se suši na 37 0 C 30 minuta i ispitni sojevi se inokuliraju s plakovima na udaljenosti od 0,6-0,8 cm od ruba papira. Usjevi se inkubiraju 24 sata na 37 0 C. U pozitivnom slučaju, na spoju toksina s antitoksinom u mediju, stvara se talog u obliku bijelih linija - “antena”.
Za određivanje toksigenosti uzročnika difterije može se koristiti biološki test. Zamorcu se intradermalno ili supkutano ubrizgava ispitna kultura. Toksigene kulture ubijaju životinje unutar 3-5 dana, obdukcijom se otkrivaju hiperemične nadbubrežne žlijezde, a kod intradermalne infekcije nekroza kože.
Za bakterioskopski pregled(kao nezavisna dijagnostička metoda rijetko se koristi zbog polimorfizma uzročnika, ali se može izvesti na zahtjev liječnika) Iz materijala se pripremaju razmazi na nekoliko stakala, jedan razmaz se boji po Gramu, drugi po Neisseru, treći se tretira fluorokromom - korifosfinom za fluorescentnu mikroskopiju.
O prisutnosti antitoksičnog imuniteta prosuđuje se Schickova reakcija - reakcija neutralizacije toksina antitoksinom. 1/40 DLM toksina difterije ubrizgava se u kožu podlaktice. Crvenilo i oteklina na mjestu ubrizgavanja ukazuje na odsutnost antitoksina u krvi. Negativna reakcija Chica ukazuje na prisutnost antitoksina.
Za ubrzanu detekciju toksina difterije, kako u bakterijskim kulturama tako iu krvnom serumu, koristi se: RNGA s eritrocitnim dijagnostikumom antitijela, RIA i ELISA. Koriste se molekularno genetičke metode istraživanja PCR.
Pripravci za specifično liječenje difterije.
Za neutralizaciju histotoksina difterije koristi se specifični koncentrirani konjski serum protiv difterije, koji se dobiva hiperimunizacijom konja antitoksinom protiv difterije.
Kod kliničke sumnje na difteriju odmah se započinje specifično liječenje serumom protiv difterije. Potrebno je odabrati optimalan način primjene seruma, budući da antitoksin može neutralizirati samo onaj toksin koji nije vezan za tkiva. Kako bi se spriječio razvoj anafilaktičkog šoka, serum se primjenjuje frakcijski prema A.M. Bezredke. Ne savjetuje se primjena seruma kasnije od 3. dana bolesti.
Je dizajnirao humani imunoglobulin protiv difterije za intravenoznu primjenu. Njegova uporaba uzrokuje manje nuspojava.
Za suzbijanje proliferacije C. diphteriae na ulaznim vratima moraju se propisati antibiotici. Lijekovi izbora su penicilin ili eritromicin, ili drugi β-laktami i makrolidi.
Pripravci za specifičnu prevenciju difterije.
Za stvaranje umjetne aktivne antitoksične imunosti koriste se toksoid difterije. Pročišćeni i koncentrirani lijek dio je povezanih cjepiva:
1. adsorbirano cjepivo protiv hripavca, difterije i tetanusa (DTP cjepivo),
2. adsorbirani toksoid difterije-tetanusa (ADS-toksoid),
3. adsorbirani toksoid difterije-tetanusa sa smanjenim sadržajem antigena (ADS-M),
4. adsorbirani toksoid difterije sa smanjenim sadržajem antigena (AD-M).
U djece se prema kalendaru cijepljenja stvara osnovni imunitet. Samo 95% procijepljenosti stanovništva jamči učinkovitost cijepljenja.
Mikrobiološki pregled koji omogućuje identifikaciju uzročnika difterije (C. diphtheriae) u proučavanom biomaterijalu.
Sinonimi ruski
Kultura na Loefflerov bacil, kultura na BL, kultura na bacil difterije.
engleski sinonimi
Kultura Corynebacterium diphtheriae, kultura difterije.
Način istraživanja
Mikrobiološka metoda.
Koji se biomaterijal može koristiti za istraživanje?
Bris grla i nosa.
Koji je pravi način za istraživanje?
Nije potrebna priprema.
Opće informacije o studiju
Corynebacterium diphtheriae (Lefflerov bacil) su gram-pozitivne bakterije iz roda Corynebacterium koje su uzročnici difterije i sposobne su stvarati toksin difterije. Bolest se prenosi kapljicama u zraku, izvor infekcije su bolesni ljudi ili nositelji bakterija.
Period inkubacije u prosjeku traje 2-5 dana. Javlja se fibrinozna upala sluznice orofarinksa i respiratornog trakta sa stvaranjem pseudomembrana i simptomima opće intoksikacije.
Na toksični oblik Difterija također može utjecati na srce i živčani sustav. U nekim slučajevima moguće je asimptomatsko nositeljstvo.
Dijagnoza difterije temelji se na kliničkim podacima, za potvrdu se provodi difterijska kultura.
Za što se koristi istraživanje?
- Za potvrdu dijagnoze difterije.
- Za diferencijalna dijagnoza bolesti koje se javljaju sa sličnim simptomima, kao što su tonzilitis različitog podrijetla, peritonzilarni apsces, infektivna mononukleoza, akutni laringotraheitis, epiglotitis, bronhijalna astma.
- Za procjenu učinkovitosti tekuće antibakterijske terapije.
Kada je studija zakazana?
- Ako se sumnja na difteriju.
- Kada se zna da je bolesnik bio u kontaktu s oboljelima od difterije.
- Nakon antibakterijska terapija– ne manje od 2 tjedna nakon završetka uzimanja antibiotika.
- U nekim slučajevima prije hospitalizacije u bolnici (u profilaktičke svrhe).
Što znače rezultati?
Referentne vrijednosti: nema rasta.
Identifikacija uzročnika difterije potvrđuje dijagnozu difterije ili, ako nema simptoma bolesti, ukazuje na nositeljstvo bakterije. Na negativan rezultat kulture u bolesnika sa sumnjom na difteriju, dijagnoza se može potvrditi kada kontakt osobe Nalaz kulture je pozitivan, odnosno izoliran je uzročnik difterije.
Razlozi za pozitivan rezultat
- Difterija ili asimptomatsko nositeljstvo C. diphtheriae.
Razlozi negativnog rezultata
- Nema difterije. Izuzetak su slučajevi kada je u vrijeme ispitivanja provedeno liječenje antibioticima.
Što može utjecati na rezultat?
Prethodna antibakterijska terapija.
Važne bilješke
Dijagnoza difterije postavlja se na temelju kliničke slike bolesti, pa liječenje treba započeti prije nego što se dobije laboratorijska potvrda bolesti. Ako je rezultat kulture pozitivan, potrebno je ispitati izolirani soj C. diphtheriae na toksigenost.
- Kultura flore s određivanjem osjetljivosti na antibiotike
Tko naručuje studiju?
Specijalist za zarazne bolesti, terapeut, liječnik opće prakse, pedijatar, ORL.
Književnost
- Macgregor R.R. Corynebacterium diphtheriae. U: Načela i praksa infektivne bolesti / G.L. Mandell, Bennett JE, Dolin R (ur.); 6. izd. – Churchill Livingstone, Philadelphia, PA 2005. – 2701 str.
- Efstratiou A. Laboratorijske smjernice za dijagnoza infekcija uzrokovanih Corynebacterium diphtheriae i C. ulceran / A. Efstratiou, R.C. Georg // Zarazne bolesti i javno zdravlje. – 1999. – God. 2, br. 4. – Str. 250–257.
- Suvremeni pristupi laboratorijskoj dijagnostici difterije / A. Efstratiou // J. Infect. Dis. – 2000. – God. 181 (Dodatak 1). – Str. S138–S145.
Sadržaj članka
Corynebacterium diphtheria
Prvi opisao E. Klebs 1983., a izolirao F. Leffler 1984.Morfologija i fiziologija
Corynebacterium diphtheria ima oblik karakterističan za cijeli rod. Nalaze se pod kutom jedan prema drugom u obliku rimskih petica. Volutinova zrnca identificiraju se bojanjem octenoplavim po Neisserovoj metodi, kojom se boje samo inkluzije bez utjecaja na citoplazmu. Bacil difterije je okružen mikrokapsulom i ima pili. C. diphtheriae je zahtjevna kada je u pitanju hranjivi supstrat. Trebaju mnogo aminokiselina, ugljikohidrata, mineralne soli. Obično se uzgajaju na serumu zgrušane krvi i krvnom agaru s kalij teluritom. Na potonjem mediju nastaju kolonije dva tipa: gravis - tamnosive boje i mitis - crne boje, koje se međusobno razlikuju po biokemijskim svojstvima.Antigeni
C. diphtheriae sadrži K-antigen u mikrokapsuli, što im omogućuje diferencijaciju u serovare i skupinski specifični polisaharidni antigen stanične stijenke, koji daje unakrsne serološke reakcije s mikobakterijama i nokardijom. Patogenost i patogeneza. Čimbenici virulencije bakterija difterije su pili i mikrokapsule, pomoću kojih se pričvršćuju na epitelne stanice tonzila, rjeđe grkljana, dušnika, nosne šupljine, spojnice oka i vulve. Zatim dolazi do kolonizacije epitelnih stanica, što je popraćeno pojavom upalni proces. Toksičnost je povezana s izlučivanjem histotoksina koji se sastoji od dvije podjedinice: toksičnog polipeptida i transportnog polipeptida odgovornog za dostavu toksične komponente do ciljnih stanica. Stvaranje prvog kontroliraju bakterijski geni, drugoga geni faga koji je lizogenizirao bakterijsku stanicu. To ukazuje da samo lizogene stanice C. diphtheriae mogu lučiti histotoksin.Fiksacija histotoksina se događa na receptorima membrana mišićnih stanica srca, srčanog parenhima, bubrega, nadbubrežnih žlijezda i živčanih ganglija. U tom slučaju, sinteza proteina na ribosomima je blokirana, što u konačnici dovodi do smrti stanice. Kod difterije, u pravilu, nema bakterijemije i septikemije zbog lokalizacije C. diphtheriae u stanicama grkljana, gdje se razvija fibrinozno-nekrotična upala sa stvaranjem filmova, limfadenitisom i edemom, što može dovesti do asfiksije. Osim difterije grkljana, C. diphtheriae uzrokuje difteriju površina rana i genitalija. Difteriji slične korinebakterije su: C. xerosis uzrokuje kronični konjunktivitis, C. ulcerans - blage oblike bolesti sličnih difteriji, C. pyogenes i C. haemolyticum - ulcerozni nekrotični faringitis, tonzilitis, gingivostomatitis. C. pseudodyphtheriae stalni je stanovnik kože i sluznica.Imunitet
Intenzitet postinfektivne imunosti kod difterije je zbog visoka razina antitoksina u krvnom serumu. Antibakterijska protutijela nastala tijekom difterije - aglutinini, precipitini i drugi - nemaju zaštitna svojstva. O prisutnosti ili odsutnosti antitoksične imunosti prosuđuje se Schickova reakcija - neutralizacija toksina antitoksinom. Kada se toksin difterije V40 DLM ubrizga u kožu podlaktice, pojavljuje se crvenilo i otok u nedostatku antitoksina u krvi. U prisutnosti antitoksina Schickova reakcija je negativna.Ekologija i epidemiologija
Stanište za C. diphtheriae su ljudi, u čijim su grlima lokalizirani. Difterija uglavnom pogađa djecu. Međutim, tijekom proteklih 30 godina, difterija je sazrela. U odraslih je difterija teška i može biti smrtonosna. U okoliš Bakterije difterije ostaju održive nekoliko dana jer podnose isušivanje. Infekcija se javlja kapljicama u zraku i to rjeđe putem kontakta.Difterija
Difterija - akutna, uglavnom u djece zarazna bolest, što se očituje karakterističnom fibrinoznom upalom na mjestu lokalizacije patogena i teškom intoksikacijom tijela egzotoksinom difterije. Njegov uzročnik je Corynebacterium diphtheriae, koja pripada rodu Corynebacterium. Prije ovog roda postoji još oko 20 vrsta bakterija koje su patogene za ljude, životinje i biljke. Od njih je najveća važnost za praktična medicina imaju sljedeće: 1. S. ulcerans - može izazvati faringitis, kožne lezije, otkriva se i kod zdravih ljudi, u mliječnim proizvodima i posudama za njihov transport, neki sojevi su toksigeni.2. S. jeikeium (ranije Corynebacterium JK) - izaziva upalu plua, endokarditis, peritonitis, inficira rane i kou.3. C. cistitidis (ranije corynebacterium skupina D2) - inicira stvaranje kamenaca u mokraćni put i upala pluća.4. S. minutissimum - izaziva eritrasmu, plune apscese, endokarditis.5. S. haemolyticum - moe izazvati tonzilitis, celulitis, apscese mozga, osteomijelitis, kronini dermatitis.6. C. xerosis - prije se smatrao uzročnikom kseroze (kroničnog konjunktivitisa), sada je klasificiran kao saprofit.7. C. pseudodiphtheriticum je saprofit koji živi na sluznici ljudskog nazofarinksa.Prikupljanje i dostava materijala u laboratorij
Materijal za istraživanje je film s krajnika, lukova, nepca, uvule, sluzi iz ždrijela i nosa, rjeđe iscjedak iz oka, uha, rane, vagine, zahvaćenog područja kože. Na zahtjev epidemiologa ispituju se ispiranje s igračaka i drugih predmeta, neki prehrambeni proizvodi(mlijeko, sladoled). Materijal se uzima prije početka etiotropnog liječenja natašte ili 2 sata nakon jela.Za uzimanje materijala koriste se tamponi, suhi ili prethodno navlaženi 5% otopinom glicerina, stavljaju se u epruvetu i steriliziraju s to. Testni materijal uzima se iz orofarinksa i nosa s dva odvojena tupfera, nastojeći ga rotirajućim pokretima uzeti na granici zdravog i oboljelog područja, bez dodirivanja brisa sluznice obraza, zuba i jezika, što je pritisnuti lopaticom. Tijekom laringoskopije, film ili sluz uzimaju se izravno iz grkljana. Filmovi i sluz iz usta i nosa moraju se uzeti u svim slučajevima, čak i kod difterije rijetkih lokalizacija (koža, rana, oko, uho, vulva).Ako je potrebno učiniti početnu bakterioskopiju na zahtjev liječnika, materijal se uzima posebnim (dodatnim) obriskom ili se dio snimljenog uzorka šalje filmom pažljivo izmrvljenim između dva stakalca.Nakon uzimanja materijala brisevi se stavljaju u iste epruvete na koje se upisuje broj, datum i upisuje se vrijeme prikupljanja i ime liječnika. Moraju se dostaviti u laboratorij najkasnije 3 sata nakon uzimanja materijala. Ako shema uzorkovanja uključuje uzimanje uz bolesnikov krevet, tada se epruvete i posude s kulturama odmah šalju u laboratorij ili inkubiraju na 37 ° C i isporučuju nakon 20-23 sata, po hladnom vremenu u vrećicama s grijačima.Bakterioskopski pregled
Bakterioskopski pregled materijala od bolesnika provodi se samo na zahtjev liječnika i samo radi prepoznavanja nekrotizirajuće angine Simanovsky-Plaut-Vincent (identifikacija vretenastih štapića i Vincentovih spiroheta, koje ne rastu konvencionalnim uzgojem). metode).Dugi niz godina mikroskopski pregled a identifikacija volutinskih zrnaca, obojenih prema metodama Lefflera i Neissera, bila je osnova za laboratorijsku dijagnozu difterije i otkrivanje bakterijskog nositeljstva. Sada, zbog varijabilnosti bakterija difterije pod utjecajem antibiotika, ne preporučuje se primarno mikroskopiranje ispitivanog materijala, već se radi utvrđivanja atipičnih kolonija na krvno-teluritnim podlogama i kod provjere čistoće izoliranih kultura provodi bakterioskopski pregled. Brisevi se boje po Gramu, Leffleru i Neisseru. Možete ih obojiti metil acetat ljubičastom, toluidin plavom ili bentiazolskom i tiazinskom bojom.Bacili difterije u razmazima su smješteni pod kutom, u obliku latiničnih slova V, X, Y, ili formiraju grozdove koji podsjećaju na hrpu razbacanih šibica. Volutinova zrna nalaze se, u pravilu, na polovima mikrobnih stanica. Bakterije pseudodifterije i difteroidi nalaze se paralelno (u obliku "ogradice") i, naravno, nemaju volutinska zrna. Babesch-Ernst zrnca mogu se detektirati pomoću fluorescentne mikroskopije kada se razmazi boje korifosfinom. Zrna dobivaju narančasto-crvenu boju na pozadini žuto-zelenih tijela bakterijskih stanica.Bakteriološka istraživanja
Klinički materijal se inokulira na krvni agar i krvni telurit agar (ili Clauberg II medij), izlije u Petrijeve zdjelice. Kultura na krvni agar neophodna je za otkrivanje druge mikroflore. Osim toga, neki sojevi Cdiphtheriae osjetljivi su na djelovanje kalijevog telurita, pa njihov rast na teluritnim podlogama može biti inhibiran. Kako bi se otkrilo nositeljstvo bakterije difterije, kulture se rade samo na krvnom teluritnom agaru, budući da inokulum može sadržavati malu količinu bacila difterije, čiji će rast na neselektivnim podlogama biti potisnut od strane druge mikroflore. U tom slučaju dopuštena je i uporaba prijenosnog medija.Krvni telurin agar
U 100 ml 2% hranjivog agara, pH 7,6, otopljenog i ohlađenog na 50 °C, dodajte 10-15 ml defibrinirane krvi i 2 ml 2% otopine kalijevog telurita. Smjesa se dobro promiješa i izlije u sterilne Petrijeve zdjelice u sloju debljine 3-4 mm.Claubergova srijeda II
U 100 ml 3% hranjivog agara pH 7,6, otopljenog i ohlađenog na 50 °C, dodajte 3 ml 2% otopine kalijevog telurita, 10 ml mješavine glicerola i 50 ml hemolizirane krvi. Glicerinska smjesa se priprema dodavanjem 20 ml sterilnog glicerina u 40 ml defibrinirane krvi. Smjesa se može čuvati u hladnjaku 4 mjeseca. Za pripremu hemolizirane („lakirane”) krvi dodajte 16 ml defibrinirane krvi u 34 ml sterilne destilirane vode.Transportni polutekući medij
U 100 ml Hottingerove digestije ili mesnopeptonske juhe dodajte 1 g bilo kojeg komercijalnog agara, namjestite pH na 7,6, sterilizirajte u autoklavu na 112 °C 30 minuta, aseptično dodajte 10 ml seruma i 1 ml 2% kalijevog telurita. . Medij se ulije u epruvete od 5 ml. Ako je moguće, koristi se i složeniji transportni medij Emes (AMIES), modificiran po Stewartu.Cijepljenje od jednog bolesnika vrši se na jednoj pločici, a koristi se jedna polovica medija za inokulaciju iz orofarinksa (tonzile, lukovi, uvula), a zatim se koristi jedna polovica medija za inokulaciju iz orofarinksa (tonzile, lukovi, uvula). a drugi za cijepljenje drugim brisom iz nosa. Ako postoji materijal za proučavanje s kože, očiju, ušiju i drugih lokalizacija, dodajte još jednu šalicu. Ne možete sijati materijal od nekoliko pacijenata na jednu ploču. Prije inokulacije podloge se zagrijavaju u termostatu 15-20 minuta.Prilikom inokulacije ispitivani materijal utrljati tupferom najprije u odvojeni dio krvnog agara površine 2x1 cm, zatim na sličan način na krvni telurit agar. (ili medij Clauberg II), dok se štapić stalno okreće kako bi se inokulirao sav materijal iz njega. Zatim se istim tupferom preostale površine podloge (pola šalice) inokuliraju prugama. Ovom tehnikom postavljanja na ploču proizvode se izolirane kolonije (čista kultura), koje se koriste izravno s pločice za određivanje toksigenosti i kasniju identifikaciju. Inokulirane posude ili epruvete s transportnim medijem inkubiraju se u termostatu na 37 ° C 20-24 sata.Drugi dan se stereoskopskim mikroskopom ispituje priroda kolonija. Ako nema rasta na obje podloge, materijal se ponovno uzorkuje.Odaberu se zdjelice s tipičnim i sumnjivim kolonijama na C.diphtheriae za daljnju identifikaciju kulture svim testovima. Sumnjive kolonije nije potrebno mikroskopirati.Kolonije bacila difterije na krvnom agaru su bjelkaste odn. žućkaste boje, neproziran, okrugao, blago konveksan, promjera 1-2 mm. Obično imaju uljastu konzistenciju, iako neke mogu formirati lomljive, tvrde R-kolonije. Na mediju krvnog telurita, KonomiC. siva boja , konveksan, s glatkim rubom, viskozan. Nakon 48 sati poprimaju tamno sivu ili crnu boju s metalnim odsjajem, jednakih ili blago nazubljenih rubova, glatke ili s radijalno prugastom površinom (R-forma), viskozne ili lomljive na dodir petljom. 48-satne kolonije na teluritnim podlogama i Neke enzimske karakteristike uzročnika difterije razlikuju četiri kulturološke i biokemijske varijante (biovare) - gravis, mitis, belfanti, intermedius Biovar gravis obično stvara sive ili crne mat suhe kolonije, lomljive, ravne, glatka, promjera 1,5-2 mm, radijalno prugasta na površini, vrlo je toksična, ne uzrokuje hemolizu, razgrađuje škrob i glikogen.Biovari mitis i belfanti rastu u obliku sivih ili crnih, okruglih glatkih konveksnih kolonija s glatkih rubova, promjera 1-1,5 mm, ove opcije su manje toksične, uzrokuju hemolizu, ali ne razgrađuju škrob i glikogen Biovar intermedius stvara male, sive, prozirne kolonije promjera 0,5-1 mm, s ravnim, glatkim površinski, slabo je toksičan, ne razgrađuje škrob i glikogen.Ako nema tipičnog rasta, pripremaju se razmazi iz drugih, sumnjivih kolonija. Ako se u njima nađu spore bacili, koki, gljivice itd., studije na difteriju se prekidaju i daju negativan odgovor. Međutim, važno je zapamtiti da se bakterije difterije koje su stvorile atipične kolonije na podlogama s inhibitorima rasta (kalijev telurit) mogu skratiti, podebljati, ali zadržati polimorfizam i karakterističan položaj.Kad tipične kolonije narastu, odmah se počinje proučavati njihova toksigenost i identifikacija. Toksigena svojstva ispituju se u najmanje 2 izolirane kolonije sijanjem jedne polovice svake kolonije na podlogu za određivanje toksigenosti i nespaljene petljom na podlozi Pisa, a druge polovice na kosi serumski agar kako bi se izolirala čista kultura i čuvala do kraj laboratorijske dijagnostike. Ako toksigene i netoksogene varijante C. diphtheriae rastu istovremeno na pločici, potrebno je ispitati toksigena svojstva oko 20 kolonija u slučaju višestrukog rasta sumnjivih kolonija, sijati materijal od 5-6 kolonija u jednu ploču. Kada naraste samo jedna kolonija, inokulira se na medij za određivanje toksigenosti i, kalcinirajući petlju, u epruvetu s Pisu medijem. Ako je korišten transportni medij, viseći medij se pretvara u gust krvno-teluritni medij. treći dan, kada se u agar gelu pojave specifične precipitacijske linije i pozitivan test na cistinazu, izolirana kultura se utvrđuje kao toksigena C. difterije. Ako nakon 24 sata nema linija oborine, posude se inkubiraju još jedan dan. U slučaju negativnog Pisa testa kultura se identificira kao vrsta korinebakterije Čista kultura na kosom agaru sirutke sije se na ugljikovodične podloge s glukozom, saharozom, topivim škrobom te se uzimaju uzorci za dokazivanje ureaze, pirazinamidaze i nitrat-reduktaza.Četvrti dan bilježe se rezultati svih kultura i daje obrazloženi izvještaj.bakteriološki zaključak o izoliranoj kulturi Koriste se sljedeće metode za identifikaciju korinebakterija.Određivanje toksigenosti in vitro
Temelji se na interakciji toksina s antitoksinom u agar gelu. Na mjestima optimalnog kvantitativni omjer Toksin i antitoksin talože se u debljini agara u obliku tankih delikatnih bijelih linija (“strelice”, “antene”). Ovaj test se u mnogim zemljama u inozemstvu naziva Elek test. Test toksigenosti obično se provodi s čistim kulturama. Također se može utvrditi kulturama kontaminiranim stranom mikroflorom, što ubrzava laboratorijsku dijagnostiku difterije na dan. Ali ako je test negativan, ponavlja se s izoliranom čistom kulturom.Za izvođenje ovog testa mikrobiološka industrija proizvodi poseban suhi standardni medij za određivanje toksigenosti mikroba difterije (DTDM) i standardne papirnate diskove, natopljene antitoksičnim anti- difterijskog seruma i osuše.Na površinu svježe pripremljene podloge DTDM s antitoksinom stavljaju se papirnati diskovi (ne više od četiri po čašici). Na udaljenosti od 0,5 cm od diska oko njega se sije kultura u obliku „pločica" promjera 7-8 mm, izmjenjujući se „pločice" proučavane kulture i kontrolnog soja. Rezultati se uzimaju u obzir nakon 18-24 i 48 godina. Kriterij specifičnosti precipitata je spajanje precipitacijskih linija proučavane kulture s linijama toksigenog soja. U tom se slučaju izolirana kultura smatra toksigenom.U nedostatku standardnih papirnatih diskova mogu se koristiti trake filter papira natopljene antitoksinom protiv difterije. izrađuju se izravno u laboratoriju. Papirnate trake izrezane na zadane veličine i sterilizirane u autoklavu na 121°C 30 minuta se navlaže s 0,25 ml pročišćenog difterijskog antitoksina, koji sadrži 500 IU po ml. U tom slučaju na čašicu s odgovarajućom podlogom nanesite traku papira navlaženu antitoksinom i osušite tako da čašicu otvorite 15-20 minuta u termostatu i okrenete je naopako. Nakon toga se na obje strane traka inokuliraju kulture „plakova" naizmjenično testni i kontrolni sojevi. Za određivanje toksigenosti uzročnika difterije možete koristiti i druge medije (AGV, otvoreni agar, itd.), recepti za koje su navedeni u “Uputama za bakteriološku dijagnostiku difterije”, Kijev (1999). Dugo godina se toksigenost bakterija difterije određivala supkutanom ili intradermalnom injekcijom kulture u dva zamorca, od kojih je jedan je dan ranije ubrizgano 100-1000 IU antitoksičnog seruma protiv difterije. Sada ova metoda bakteriološki laboratoriji praktički se gotovo nikad ne koristi zbog visoke cijene i značajnog kašnjenja odgovora.B U zadnje vrijeme razvio vrlo osjetljivu i vrlo specifičnu metodu za određivanje gena toksina difterije polimerizacijom lančana reakcija. Temelji se na određivanju regije DNA C. diphtheriae gdje je lokaliziran gen toksina difterije pomoću specifičnih početnica. Metoda ima prednosti u odnosu na tradicionalno određivanje toksigenosti: visoka osjetljivost, brzi rezultati (4-6 sati) i ne zahtijeva izolaciju čiste kulture. Ali zahtijeva posebnu opremu, skupe reagense i odgovarajuće prostorije, pa se stoga može provesti samo u specijaliziranom laboratoriju. Svi ne-toksogeni sojevi bakterija difterije izolirani od pacijenata i nositelja bakterija moraju se poslati u Ukrajinski centar za državni sanitarni i epidemiološki nadzor (gdje postoji takav laboratorij) za konačno određivanje toksigenih svojstava C. diphtheriae.Određivanje cistinaze (Pizou test)
C. diphtheriae, C. ulcerans izlučuju enzim cistinazu, bakterije pseudodifterije i drugi difteroidi ga proizvode.Izolirana kultura se inokulira u podlogu sa cistinom, izlije u koloni u uske epruvete. Cistinaza-pozitivne bakterije razgrađuju cistin uz oslobađanje sumporovodika, koji s olovnim acetatom uključenim u medij stvara olovni sulfat, zbog čega medij postaje tamno smeđi. S. diphtheriae ne samo da uzrokuje tamnjenje okoline nakon tijeka ubrizgavanja, već također stvara "oblak" oko nje tamno smeđa na udaljenosti od 1 cm od površine. Rezultati se uzimaju u obzir nakon 20-24 sata inkubacije u termostatu.Određivanje ureaze (Sachse test)
Bakterije difterije ne proizvode ovaj enzim. Samo nekoliko drugih vrsta korinebakterija daje pozitivan test na ureazu. Za izvođenje testa, izolirana kultura se sije u bujon s ureom. Ureaza razgrađuje ureu, mijenja pH okoliša, popraćeno njegovim crvenilom. Ako se enzim ne oslobodi, boja juhe se ne mijenja.Određivanje pirazinamidaze
Određivanje pirazinamidaze provodi se hidrolizom pirazinamida u pirazinsku kiselinu i amonij. Za to se u sterilnu epruvetu u kojoj je pripremljena gusta suspenzija izolirane kulture ulije 0,25 ml sterilne destilirane vode, zatim se doda jedna dijagnostička tableta Rosko 598-21. Inkubirati 4 sata na 37°C, nakon čega se doda jedna kap svježe pripremljenog 5%-tnog Vodena otopina amonijev željezni sulfat. U prisutnosti enzima, suspenzija postaje crvena ili narančasta. Patogene korinebakterije ne izlučuju pirazinamidazu i stoga ne mijenjaju boju suspenzije.Saharolitički enzimi
Saharolitički enzimi određuju se sijanjem kompletne petlje izolirane kulture u svaku epruvetu skraćene šarolike Hissove serije (glukoza, saharoza, topljivi škrob). Rezultati se uzimaju u obzir nakon 24 sata inkubacije u termostatu. Razgradnja škroba može se odgoditi do 48 sati.Određivanje nitrat reduktaze
Određivanje nitrat reduktaze dodatni je test za identifikaciju C. belfanti i C. ulcerans, koje ne proizvode ovaj enzim. Ispitna kultura se inokulira u epruvetu s bujonom u koji se doda 0,1% KN03 i inkubira u termostatu 24 sata. Obavezna kontrola neinokuliranom podlogom. U slučaju prisutnosti nitrat reduktaze, kada se dodaju 3 kapi Kasatkinova reagensa u inokulirani bujon, pojavljuje se crvena boja. Medij u kontrolnoj epruveti ne mijenja boju.Za identifikaciju korinebakterija nedavno se koriste papirnati indikatorski diskovi s glukozom, saharozom, ureom i škrobom iz seta “B” za identifikaciju enterobakterija (tvrtka ImBio, Nižnji Novgorod). U 4 epruvete priprema se gusta suspenzija ispitne kulture iu svaku od njih se uroni disk s odgovarajućim ugljikohidratom ili drugim reagensom. Nakon inkubacije u termostatu, oslobađanje ureaze se bilježi nakon 40-120 minuta, a saharolitička aktivnost se određuje nakon 5-24 sata. U prisutnosti ureaze bijeli disk s ureom postaje ružičasto grimizan, a u nedostatku ostaje bijel. Diskovi s glukozom i saharozom, uz prisustvo odgovarajućih enzima, mijenjaju boju iz crvene u žutu nakon 5-6 sati. Pri određivanju amilaze u epruvetu s odgovarajućim supstratom dodaje se indikatorska pločica s jodom. Ako enzima nema, pojavljuje se tamnoplava boja, ako ga ima, boja otopine ostaje nepromijenjena.Specifična prevencija i liječenje
Vakcinalna prevencija difterije provodi se primjenom toksoida difterije dobivenog tretiranjem toksina difterije formaldehidom. Kod nas se za cijepljenje koristi DPT - adsorbirano cjepivo protiv hripavca-difterije-tetanusa. Antitoksični serum koristi za specifična terapija, i antibiotici - za sanitaciju nositelja bakterija. Antibiotici uključuju penicilin, vankomicin, eritromicin itd.Corynebacterium diphtheriae otkrivena je i izolirana u čistoj kulturi prije 100 godina. Njegov konačni etiološki značaj u nastanku difterije potvrđen je nekoliko godina kasnije, kada je dobiven specifičan toksin koji je uzrokovao uginuće životinja s pojavama sličnim onima uočenim kod oboljelih od difterije. Corynebacterium diphtheriae pripada rodu Corynebacterium, skupini corynephroma bakterija. Corynebacterium diphtheriae su ravni ili blago zakrivljeni štapići s proširenim ili šiljastim krajevima. Podjela na prijelom i rascjep daje karakterističan raspored u obliku rimskog broja V ili raširenih prstiju, ali se u potezima često nalaze pojedinačno smješteni štapići. Njihove velike nakupine, koje se javljaju u razmazima pripremljenim od sluzi grla, nosa i iscjetka iz rane, imaju karakter poput pusta. Prosječna duljina njihovih šipki je 1-8 mikrona, širina - 0,3 / 0,8 mikrona. Nepomični su i ne stvaraju spore niti kapsule. Corynebacterium diphtheriae je fakultativni anaerob. Bacili difterije su otporni na sušenje. Na temperaturi od 60 °C u čistim kulturama uništavaju se unutar 45-60 minuta. U patološkim produktima, tj. uz prisutnost proteinske zaštite, oni mogu ostati održivi sat vremena na temperaturi od 90 °C. Niske temperature ne djeluju štetno na bacile difterije. U dezinfekcijska sredstva U normalnim koncentracijama brzo umiru.
Potrebno je istaknuti izuzetno veliki polimorfizam bacila difterije, koji se očituje u promjeni njihove debljine i oblika (nabubreni, bočasti, segmentirani, nitasti, razgranati).U terminalnim zadebljanjima, a ponekad i u središnjem dijelu, nakon 12 sati dolazi do izbijanja difterijskog bacila. rasta kulture, Babesh zrna se nalaze s posebnim bojama.Ernst, koji su nakupine volutina. Postoje dokazi da je volutin dugolančani anorganski polifosfat. M.A. Peshkov sugerira njihovu metafosfatnu prirodu. A. A. Imshanetsky smatra da je volutin nusprodukt metaboličkih procesa. Poznato je da je fosfor neophodan za formiranje zrna. Postoje i pretpostavke o potrebi mangana i cinka za ovaj proces.
Volutinska zrna se nalaze u jednodnevnim kulturama, a tada opada broj bakterija uz prisustvo zrna.Citoplazma sadrži i nukleotid, intracitoplazmatske membrane – lizosome, vakuole.
Bakterije se boje svim anilinskim bojama. Kada se boje metodom po Gramu, oni su pozitivni. Za bojenje zrna volutina koristi se Neisserova metoda. Kada se boje ovom metodom, zrna volutina, koja imaju veliki afinitet prema metilenskom modrilu, trajno su obojena Plava boja, a iz tijela bakterije, dodatnim bojanjem krizoidinom ili bismarckbraunom, istiskuje se metilensko modrilo.
Uzročnik difterije je heterotrof, odnosno pripada skupini bakterija koje za svoj rast zahtijevaju organska tvar. Podloge koje se koriste za uzgoj moraju sadržavati aminokiseline kao izvor ugljika i dušika - alanin, cistin, metionin, valin i dr. U tom smislu elektivne podloge za uzgoj su one koje sadrže životinjske bjelančevine: krv, serum, ascitična tekućina. Na temelju toga nastala je klasična Lefflerova okolina, a zatim Claubergova, Tyndallova i akumulacijska okolina.
Na Lefflerovoj podlozi kolonije bacila difterije imaju sjajnu, vlažnu površinu, glatke rubove i žućkastu boju. Nakon nekoliko dana rasta pojavljuju se radijalne pruge kolonija i slabo izražene koncentrične linije. Promjer kolonija doseže 4 mm. Prvi znaci rasta pojavljuju se nakon 6 sati u termostatu na 36-38 °C. Rast je jasno vidljiv 18 sati nakon sjetve. Optimalna vrijednost pH za rast bacila difterije je 7,6. Corynebacterium diphtheria često je teško razlikovati od drugih vrsta corynebacterium. Za određivanje vrste koristi se kompleks kulturnih i biokemijskih karakteristika.
Vrsta Corynebacterium diphtheria također je heterogena; dijeli se na 3 kulturološka i biokemijska tipa gravis, mitis, intermedins, na dvije varijante - toksigene i netoksogene, niz seroloških tipova i fagotipova.
Trenutno na većini teritorija cirkuliraju dva kulturno-biokemijska tipa - gravis i mitis. Intermedinski tip, koji se nekada dosta razlikovao, u novije vrijeme se rijetko nalazi. Najjasnije razlikovanje tipova može se napraviti prema obliku kolonija kada se kultura uzgaja na krvnom agaru s dodatkom telurita. Kolonije tipa gravis nakon 48-72 sata dosegnu promjer od 1-2 mm, imaju valovite rubove, radijalne pruge i ravno središte. Njihov se izgled obično uspoređuje s cvijetom tratinčice. Kolonije su mat zbog sposobnosti bakterije da reducira telurit, koji se potom spaja s nastalim sumporovodikom, sivo-crne boje. Kada rastu u bujonu, kulture tipa gravis stvaraju mrvljivi film na površini. Kada se siju na Hiss mediju uz dodatak sirutke, razgrađuju polisaharide - škrob, dekstrin, glikogen uz stvaranje kiseline.
Kulture tipa mitis na teluritnom krvnom agaru rastu kao okrugle, blago konveksne, glatkih rubova, mat crne kolonije. Kada se uzgajaju u bujonu, proizvode jednoliku mutnoću i talog. Ne razgrađuju škrob, dekstrin i glikogen.
U razmazima su štapići tipa gravis često kratki, a tipa mitis su tanji i duži.
Usporedna elektronska mikroskopska studija bacila difterije različitih biokemijskih tipova pokazala je prisutnost troslojne strukture kod gravis i mitis tipova. stanična membrana. Ljuska tipa intermedin je dvoslojna i gotovo 3 puta deblja. Između citoplazme i membrane nalaze se prostori ispunjeni zrncima, što može biti povezano s egzotoksinom. Vidljive su kose pruge bakterija koje stvaraju razdjelne stijenke između stanica kćeri. Kromosomski aparat, kod tipova gravis i mitis, predstavljen je običnim zrncima s vakuolama, a kod tipa intermedins raspoređen je po cijeloj citoplazmi. Elektronski mikroskop otkriva višeslojnu membranu, čija prisutnost objašnjava zašto su bacili difterije ponekad gram-negativni.
Kolonije bakterija difterije postoje u S-, R- i SR-oblicima, pri čemu se potonji smatra srednjim. N. Morton vjeruje da su kolonije S-formi karakteristične za tip mitis, a SR-forme - za tip gravis. Osim ovih glavnih oblika, postoje mukoidne kolonije - M-forme, patuljaste kolonije - D-forme i gonidijalne kolonije - L-forme. Sve se to smatra oblicima disocijativne varijabilnosti.
Bakterije difterije moraju se razlikovati od difteroida i bacila pseudodifterije.
Velik broj studija posvećen je varijabilnosti bacila difterije. Mogućnost pojave atipične forme u laboratorijskim uvjetima potvrđena je epidemiološkim studijama.
Biokemijska, morfološka, fizikalno-kemijska varijabilnost bakterija difterije, prepoznata od strane velikog broja istraživača, u nekim slučajevima komplicira bakteriološku dijagnostiku i prisiljava na sveobuhvatno proučavanje kultura.
Sve kulture izolirane pod različitim epidemiološkim uvjetima podijelili smo u 8 skupina; uključili su sve moguće morfološke varijante nama zanimljivih predstavnika korinebakterija:
1. skupina - kratke šipke, duge oko 2 mikrona, bez zrna;
2. skupina - kratke šipke, duge oko 2 mikrona, ali povremeno sa zrncima;
3. skupina - šipke srednje veličine, duge 3-6 mikrona, široke 0,3-0,8 mikrona, bez karakteristične granularnosti;
4. skupina - šipke srednje veličine, duge 3-7 mikrona, široke 0,3-0,8 mikrona, blago zakrivljene, povremeno sa zrncima;
5. skupina - šipke srednje veličine, duge 3-6 mikrona, široke 0,3-0,8 mikrona, blago zakrivljene, zrnate;
6. skupina - duge šipke, duge 6-8 mikrona, široke 0,3-0,6 mikrona, blago zakrivljene, povremeno sa zrncima;
7. skupina - duge šipke, duge 6-8 mikrona, široke 0,3-0,8 mikrona, obično zakrivljene, bez zrna;
Grupa 8 - kratki, grubi štapići, dugi oko 2 mikrona, široki oko 1 mikrona, bez zrnaca.
Položaj štapića nije uzet u obzir pri raspoređivanju u skupine, ali obično je karakterističan raspored odgovarao morfologiji.
U 1., 2., 3. i 8. skupini, koje su morfološki odgovarale Hoffmannovim štapićima, raspored je bio grupni, paralelan ili u obliku pojedinačnih jedinki, u 4., 5. i 6. skupini, koje su uglavnom morfološki odgovarale pravoj difteriji. bakterije, štapići smješteni pod kutom ili u obliku pojedinačnih jedinki. U skupini 7 šipke su češće bile nasumično raspoređene, ispreplićući se jedna s drugom. U 8. skupini štapići su bili smješteni u obliku pojedinačnih jedinki.
Od 428 proučavanih kultura, 111 je prema ukupnosti svojih karakteristika trebalo svrstati u pravu difteriju, 209 su bile kulture Hoffmannova bacila, a 108 je činilo skupinu atipičnih kultura. U kulturama bliskim difteriji, atipičnost se očitovala u smanjenju biokemijske aktivnosti, ponekad u razgradnji uree; u kulturama koje su morfološki bliske Hoffmannovim štapićima, zadržavaju pozitivan cisteinski test i sposobnost razgradnje jednog od šećera.
Od 111 kultura difterije, 81 kultura (73%) bila je morfološki tipična, 28 kultura (27%) imalo je morfologiju Hoffmannovih štapića. Od 111 kultura difterije bilo je 20 kultura tipa gravis, a od njih je samo 9 svrstano u 1. i 2. morfološku skupinu.
Kulture koje su na temelju kombinacije karakteristika klasificirane kao kulture Hoffmannova bacila imale su morfologiju tipičnih kultura difterije u 20% slučajeva.
25% ispitivanih sojeva klasificirano je kao atipične kulture, njihova morfologija odgovara i bacilu difterije i bacilu Hoffmanna.
Dakle, biokemijski i morfološka svojstva kulture ne podudaraju se uvijek, a biokemijska atipičnost, kao i morfološka, češće se uočava u kulturama izoliranim tijekom razdoblja smanjene učestalosti, a time i smanjenja razine nositeljstva.
Potrebno je primijetiti opće smanjenje biokemijske aktivnosti usjeva u posljednjih 10-15 godina. Pokazatelj toga je usporena fermentacija šećera, koja se ponekad događa 5-6. dana, kao i različita biokemijska aktivnost kolonija iste kulture.
Biokemijska identifikacija čistih kultura izoliranih u različitim epidemiološkim uvjetima pokazuje da se, iako se morfologija i biokemijska svojstva često ne podudaraju, opći princip raspodjele kultura, utvrđen prema morfološkim podacima, ne mijenja. Kako pri raspodjeli usjeva prema morfološkim i biokemijskim podacima, tako i pri njihovoj potpunoj identifikaciji s uključivanjem serološke reakcije princip distribucije ostaje isti: atipične kulture su češće u razdobljima prosperiteta epidemije, Hoffmannov bacil se češće detektira u razdobljima problema s epidemijom i sije se dulje od prave difterije.
Proučavanje toksigenih svojstava izoliranih kultura na čvrstim hranjivim podlogama pokazalo je da čak iu razdoblju procvata epidemije postoji dovoljan broj nositelja toksigenih bacila difterije. Treba napomenuti da se toksigena svojstva ne mogu uvijek otkriti čak ni u kulturama izoliranim od pacijenata. To ukazuje na potrebu poboljšanja primijenjenih metoda za određivanje toksigenosti usjeva.
Rezultati reakcije aglutinacije atipičnih kultura izoliranih u različitim epidemiološkim uvjetima pokazali su prisutnost istih obrazaca seroloških svojstava koje smo uočili proučavajući morfologiju i biokemiju kultura. Atipičnost kultura izoliranih u prosperitetnom području, prema serološkim podacima, bila je dublja nego u nepovoljnijim područjima. Dakle, u prosperitetnom području, 26% atipičnih kultura dalo je pozitivnu reakciju aglutinacije, u nepovoljnim područjima - 19%.
Jedno od glavnih svojstava bacila difterije je sposobnost stvaranja toksina. Toksinogeneza Corynebacterium diphtheria određena je genom sadržanim u profagu, stoga glavno sredstvo agresije - stvaranje toksina - nije povezano s bakterijskim kromosomom.
Toksin difterije je protein molekulske mase 6200 daltona. Jačina toksina utvrđuje se izvođenjem intradermalnih testova na prisutnost nekrotičnih učinaka i učinak na osjetljive životinje ( smrtonosni učinak). Snaga toksina mjeri se pomoću minimalne letalne doze, a to je najmanja količina toksina koja može uzrokovati smrt zamorca težine 250 g 4-5 dana kada se daje intraperitonealno. Toksin ima antigenska svojstva koja su sačuvana kada se tretira formaldehidom, koji uklanja njegova toksična svojstva. To je omogućilo njegovu upotrebu za pripremu profilaktičkog lijeka.
Molekula toksina sastoji se od dva fragmenta, od kojih je jedan termostabilan i ima enzimsku aktivnost, a drugi je termolabilan i ima zaštitnu funkciju. Dokazana je intracelularna sinteza toksina s njegovim oslobađanjem kroz tubule stanične stijenke. Sinteza toksina događa se kada se mikrob uzgaja u tekućem mediju - mesno-peptonskoj juhi s dodatkom glukoze, maltoze i faktora rasta pri pH 7,8-8,0.
Prema novijim podacima, toksin difterije je proizvod virusnog podrijetla. Kao potvrdu, I. V. Chistyakova iznosi sposobnost netoksogenih korinebakterija da se transformiraju u toksigene pod utjecajem faga. Mogućnost pretvaranja netoksogenih kultura u toksigene potvrđena je u pokusima na jednostaničnim kulturama. Opisani fenomen naziva se lizogena konverzija. Korištenjem umjerenih virusa dobivenih iz toksigenih sojeva gravisa, bilo je moguće pretvoriti netoksogenu varijantu Corynebacterium diphtheria gravis u toksigenu.
E.V. Bakulina, M.D. Krylova sugerirali su da žarišna konverzija može biti važna u procesu epidemije. U tom smislu započelo je istraživanje njezine uloge u stvaranju toksigenih sojeva Corynebacterium diphtheria u prirodi. Mogućnost pretvorbe toksigenosti pokazala se ne samo u sustavima fag-bakterija, već iu prirodni uvjeti. Ali među lokalnim kulturama ovaj proces, prema brojnim istraživačima, nije uobičajen. Razlozi tome vjerojatno su nedostatak proizvođača umjerenih faga, osjetljivost lokalnih sojeva na fage je drugačija od referentnih sojeva, pa stoga ne mogu biti primatelji konvertirajućih faga poznatog spektra djelovanja.
Samo u dijelu mikrobne populacije bilo je moguće pretvoriti toksigena svojstva bacila difterije pod utjecajem stafilokoknih i streptokoknih faga. U novijim radovima pitanje konverzije faga u epidemijskom procesu dobiva još suzdržaniju ocjenu. Smatra se da tox+ korinefagi ne igraju ulogu u epidemijskom procesu difterije. nezavisna uloga. Nositelji netoksogenih bacila mogu se zaraziti tox+ fagom samo zajedno s toksigenim sojem, a stafilokokni fagi nisu sposobni pretvoriti netoksogene korinebakterije. Da bi se izvršila pretvorba u smjeru toksigenosti u ljudskom tijelu, očito je neophodan bliski kontakt između nosača koji ima pretvarajući fag i nosača koji izlučuje soj koji je lizosenzitivan na taj fag. Osim sposobnosti stvaranja toksina, bakterija difterije ima faktore patogenosti kao što su hijaluronidaza, neuraminidaza, deoksiribonukleaza, katalaza, esteraza i peroksidaza. Studija izvanstaničnih metaboličkih produkata nije pokazala razlike između toksigenih i netoksogenih korinebakterija difterije.
Trenutno se za intraspecifičnu tipizaciju Corynebacterium diphtheria, uz gore opisanu biokemijsku metodu, mogu koristiti serološke i fagne metode.
Prisutnost seroloških tipova posljedica je za tip specifičnih, toplinski stabilnih, površinskih i toplinski labilnih antigena.
Postoji niz shema serološke tipizacije. U našoj zemlji koristimo shemu koju su predložili V. S. Suslova i M. V. Pelevina, ali ona ne može osigurati klasifikaciju svih netoksogenih sojeva. Broj seroloških tipova raste. I. Ewing je utvrdio prisutnost 4 serološka tipa - A, B, C i D; D. Robinson i A. Peeney 5 tipova - I, II, III, IV i V. L. P. Delyagina identificirala je još 2 serološka tipa. Smatra se da je broj seroloških tipova znatno veći, uglavnom zbog mitis tipa. Iz nekoliko dostupnih literaturnih podataka o obrascima u izolaciji jednog ili drugog serotipa kada razne forme infektivni proces i drugačije epidemiološke prilike nisu utvrđene. Uz podatke o različitoj agresivnosti usjeva koji pripadaju različitim serološkim tipovima, postoje izvješća koja odbijaju povezanost serološkog tipa s patogenošću usjeva.
Karakteristično je da se u različitim područjima javljaju različiti serološki tipovi. Serološka tipizacija može se koristiti za epidemiološku analizu.
U uvjetima sporadičnog morbiditeta, ograničenog broja kliconoša, kada je potraga za izvorom infekcije znatno otežana, važna je metoda fagotipizacije, koja omogućuje podjelu korinebakterija na serološke i kulturalne varijante. Označavanje se može provesti prema svojstvima faga izoliranih iz kulture i prema osjetljivosti kulture na određene bakteriofage. Najraširenija shema je ona koju su predložili R. Saragea i A. Maximesco. Omogućuje označavanje toksigenih i netoksogenih sojeva svih kulturnih varijanti. Uz pomoć 22 tipična faga, kulture se mogu podijeliti u 3 skupine, u kojima je kombinirana 21 varijanta faga: 1. skupina - toksigeni i netoksigeni sojevi tipa mitis (varijante faga I, la, II, III); 2. - toksigeni i netoksogeni sojevi tipa intermedins i netoksogeni gravis (varijante faga IV, V, VI, VII); 13 varijanti faga (od VIII do XIX) uključeno je u 3. skupinu, koja je objedinila gravis toksigene sojeve.
Shema je testirana na velikom broju sojeva izoliranih u Rumunjskoj i dobivenih iz muzeja u 14 zemalja. Fagotipizacija je bila pozitivna u 62% sojeva, a osobito su uspješno obilježeni sojevi tipa gravis. Među potonjima, pripadnost jednoj od varijanti faga utvrđena je u 93%. Specifične reakcije s tipičnim fagima u toksigenim sojevima tipa gravis prema shemi ovih autora temelje se na infekciji sojeva različitim virusima.
U našoj zemlji istraživanja u području fagotipizacije provela je M. D. Krylova. Autor je razvio shemu označavanja faga temeljenu na principu koji su predložili Williams i Rippon za tipizaciju stafilokoka koji koagulira plazmu: varijanta faga je označena imenom tipa faga koji ju je lizirao u testnom razrjeđenju. Fagi i varijante faga u shemi M.D. Krylove označeni su slovima latinične abecede: velika slova - fagi koji daju konfluentnu i polukonfluentnu lizu, mala slova - lizu u obliku plakova. Na temelju toga razvijena je modificirana shema fagotipizacije za netoksicne korinebakterije varijante gravis i shema fagotipizacije za toksigene korinebakterije varijante gravis.
