Bacillus cereus ip 5832 kulturalna i morfološka svojstva. Bactisubtil
Bacillus cereus
Posebnosti bacila: predstavljeni su velikim ravnim štapićima koji se pozitivno boje po Gramu, sposobni su stvarati spore u aerobnim uvjetima, jedina patogena vrsta za ljude je Bacillus anthracis (bacil antraksa), neke oportunističke vrste također su sposobne uzrokujući trovanje hranom i bolničke infekcije. Bacili se izoliraju iz tla, slatke i morske vode, kao i iz biljaka. Mogu rasti na temperaturama od 5 do 75 °C, a njihov opstanak u ekstremnim uvjetima olakšava sporulacija. Bolničke lezije (pneumonija, septikemija, endokarditis, meningitis itd.) uzrokuju B. subtilis, B. cereus i B. megaterium (slika 4, vidi umetak u boji), B. alvei, B. laterosporus, B. pumilus, B thuringiensis i B. sphaericus. Lezije se bilježe relativno rijetko, a njihov razvoj kod ljudi je pospješen širokom rasprostranjenošću bakterija i velikom otpornošću njihovih spora na različite utjecaje.
Bacillus cereus je sveprisutan, gram-pozitivan, pokretni štapić koji stvara spore.
Sistematski položaj mikroorganizma.
|
Obitelj |
Fungi impcrfecti Eubacteriales Bacillaceae Bacil subtilis |
Uzrokuju kod ljudi želučane bolesti (proljev i sl.), septikemiju, endokarditis i oštećenje središnjeg živčanog sustava. Bolest je obično kratkotrajna i prolazi bez ikakvog liječenja, ali zabilježeni su i pojedinačni smrtni slučajevi. Otrovanje hranom Bacillus cereus nije prijavljeno zbog relativno malog broja slučajeva bolesti izazvanih njime (do 1% od ukupnog broja). Učestalost bolesti geografski varira. Tako u nekim zemljama oni čine manje od 1% svih trovanja hranom, dok u drugima više od 30%. Bacillus cereus relativno se često izdvaja iz proizvoda, što ovu vrstu bakterije čini značajnim indikatorskim testnim organizmom za prehrambenu industriju. Hrana s najvećim rizikom od kontaminacije su meso i mliječni proizvodi, povrće, juhe, začini i, posebno, dječja hrana. Gotovo svi sojevi Bacillus cereus proizvode toksine. Gotovo 95% izolata Bacillus cereus proizvodi citotoksične enterotoksine. Od toga, nehemolitički enterotoksin (NHE) proizvodi više od 90% sojeva, a hemolizin BL (HBL) proizvodi oko 55% proučavanih sojeva. Vjeruje se da HBL i NHE nastaju u crijevima bolesnika nakon konzumacije hrane kontaminirane vegetativnim stanicama ili sporama Bacillus cereus. Uz ova dva toksina, neki sojevi Bacillus cereus proizvode toplinski stabilni emetički enterotoksin (ETE). Vjeruje se da se ETE enterotoksin inicijalno nakuplja u hrani, najčešće u škrobnim namirnicama poput riže i tjestenine. Iz tih razloga, praćenje sadržaja enterotoksina u ovim proizvodima korištenjem pouzdanih metoda ubrzanog testiranja postaje sve važnije.
Patogenost, proširenost bolesti
|
Bacillus cereus - Dekstroza kazein-peptonski agar |
Bacillus cereus je oportunistički mikroorganizam koji uzrokuje sporadična trovanja hranom kod ljudi. Bacillus cereus je sveprisutan u prirodi. Etiološku ulogu Bacillus cereus u trovanju hranom izvorno je proučavao i opisao Hauge 1950. godine. Izvorom trovanja hranom uzrokovanog Bacillus cereusom prvo se smatralo da su kulinarski proizvodi koji sadrže krumpirov škrob. Tada su opisana izbijanja sličnih otrovanja biljnim, mesnim, ribljim i drugim prehrambenim proizvodima. Bacillus cereus se najbrže razmnožava u usitnjenim proizvodima (mljeveno meso, kotleti, kobasice, kreme). U sirovinama nije dopušteno više od 100 stanica/g; nije dopuštena prisutnost Bacillus cereus u konzerviranoj hrani. U steriliziranim mesnim konzervama, prema utvrđenim tehnološkim uvjetima, nema stanica ove bakterije. Kada u konzerviranom proizvodu ostanu održive spore, uzročnik se može razmnožavati u uvjetima skladištenja konzervirane hrane na 20 o C. Istodobno se na površini proizvoda pojavljuje sivi premaz, mijenja se njegov miris i konzistencija. Bacillus cereus također može uzrokovati dijarealni sindrom kod životinja, ptica i insekata 6-18 sati nakon konzumacije kontaminirane hrane. To je prije svega zbog nekoliko vrsta toksina (NHE, HBL, bc-D-ENT) sadržanih u kontaminiranoj hrani, a potom i zbog proliferacije bakterija u crijevima. Ovaj kompleks toksina Bacillus cereus uzrokuje citotoksični učinak i izlučivanje tekućine u crijevima. Kada se biološki test provodi na miševima, životinje doživljavaju nekrozu kože na mjestu ubrizgavanja i naknadnu smrt.
Trenutno se u medicinskoj praksi široko koriste službeno registrirani biološki lijekovi koji se temelje na oslabljenim sojevima normalne crijevne mikroflore.
1. Pripreme kao što je baktisubtil. Pripravci koji sadrže čistu kulturu soja Bacillus IP 5832 s vegetativnim sporama u količini od najmanje 1 milijarde Normaliziraju fiziološku ravnotežu crijevne mikroflore. Spore bakterija sadržane u pripravcima otporne su na djelovanje želučanog soka i u crijevima klijaju u vegetativne oblike. Vegetativni oblici bakterija proizvode enzime koji razgrađuju ugljikohidrate, masti i bjelančevine, što rezultira stvaranjem kiselog okoliša koji sprječava procese truljenja. Lijekovi potiču normalnu sintezu vitamina B i P u crijevima. Dostupan u kapsulama.
2. Pripravci tipa flonivin BS sadrže čistu kulturu bacila soja 1P5832 (109) s vegetativnim sporama. Sojevi Bacillus IP5832 genetski su imuni na sve vrste sulfonamida, nistatin i većinu antibiotika širokog spektra. Dostupan u kapsulama.
3. Preparati tipa biosporin sadrže Bacillus subtilis, Bacillus lichineformis. Dostupan u kapsulama.
4. Pripravci tipa bifidumbakterina su mikrobna masa živih bifidobakterija liofilizirana u mediju za uzgoj. Oni su najvažniji ljudski simbionti, dominiraju zdravom crijevnom mikroflorom djece i odraslih. Jedna doza sadrži najmanje 108 živih bifidobakterija. Dostupan u tabletama, kapsulama, vrećicama i bočicama.
Trenutno se proučava učinkovitost tekućih bifidobakterija. Istraživanja ruskih znanstvenika dokazala su da učinkovitost ovih lijekova protiv disbakterioze premašuje učinkovitost suhih bifidobakterija. Istodobno, terapijski učinak tijekom terapije tekućim bifidobakterijama razvio se nakon 1-2 mjeseca, dok je primjena suhih bifidobakterija dovela do poboljšanja kliničkih i laboratorijskih simptoma tek nakon 3-6 mjeseci. To je zbog činjenice da tekući biološki proizvodi, prvo, sadrže veći broj mikrobnih tijela (1011-1015 u 1 ml volumena u odnosu na 108 u suhim pripravcima), drugo, ne sadrže stranu mikrofloru i, treće, vitalnost mikroorganizama tekućih pripravaka pokazala se znatno većom. To jest, žive bifidobakterije u potpunosti zadržavaju svoja fiziološka svojstva, zbog čega imaju terapeutski učinak u kratkim vremenskim razdobljima. Na bazi živih bifidobakterija stvoreni su i pripravci kao što su bifiliz dry i bifiform. Sastav lijekova kao što je bifiliz uključuje lizozim, zbog čega ima protuupalno djelovanje, osim toga, potiče metaboličke procese i eritropoezu. Inače, u pogledu farmakoloških svojstava i indikacija za uporabu, ti su lijekovi slični lijekovima tipa bifidumbakterina.
5. Preparati poput lifepack probiotika - sadrže Bifidobacterium bifidum (5x107 mikrobnih tijela u 1 kapsuli).
6. Pripravci tipa Bificol su suhi kompleksni dvokomponentni biološki pripravci od žive bakterijske anaerobne i aerobne mikroflore crijeva čovjeka, sojeva bifidobakterija (Bifidobacterium bifidum I) i Escherichia coli (Escherichia coli M-17). Oni su liofilizirana kultura zajednički uzgojenih bakterija navedenih sojeva. 1 doza lijeka sadrži najmanje 107 živih bifidobakterija i najmanje 107 Escherichia coli M-17. Dostupno u bocama.
7. Pripravci poput kolibakterina su liofilizat živih bakterija antagonistički aktivnog soja Escherichia coli M-17, imaju antagonističko djelovanje protiv širokog spektra patogenih i uvjetno patogenih mikroorganizama, čime se normalizira fiziološka ravnoteža crijevne mikroflore. Dostupan u ampulama i tabletama.
8. Pripravci tipa Lactobacterin su liofilizat živih laktobacila. Laktobacili su dio normalne mikroflore. Kisela sredina koju stvaraju laktobacili pospješuje razvoj bifidne flore i druge normalne mikroflore u crijevima, budući da je optimalna za te bakterije, te na taj način održava i regulira fiziološku ravnotežu crijevne mikroflore. Dostupan u ampulama, tabletama i čepićima.
9. Pripravci poput acipola su mješavina živih laktobacila acidofila i zagrijanih kefirnih zrnaca. Lijekovi imaju visoku biokemijsku kiselotvornu i antagonističku aktivnost. Zagrijana kefirna zrnca su imunomodulator koji potiče obrambene snage organizma. Dostupan u bočicama i tabletama.
10. Pripravci tipa acilact su liofilizat živih acidofilnih laktobacila. Dostupno u bocama.
11. Tipalinex pripravci su jedan od najuravnoteženijih eubiotika, koji sadrži žive liofilizirane bakterije: Lactobacillus acidophilus, Bifidumbakterium infantis v.liberorum, Streptococcus faecium. Ove bakterije su predstavnici normalne crijevne mikroflore i otporne su na antibiotike i kemoterapijske agense. Bakterije mliječne kiseline, proizvodeći organske kiseline (mliječnu, octenu, propilensku), stvaraju kiselu sredinu u crijevima nepovoljnu za razvoj patogenih i uvjetno patogenih mikroorganizama. Kao rezultat toga, normalizira se fiziološka ravnoteža crijevne mikroflore. Osim toga, bakterije mliječne kiseline stabiliziraju membrane crijevnih epitelnih stanica, sudjeluju u preradi monosaharida i reguliraju ravnotežu elektrolita u crijevima. Osim eubiotskog učinka, kombinacija mikroorganizama uključenih u lijek također pruža baktericidne i antidiarrhealne učinke. Dostupan u kapsulama.
12. Pripravci tipa Nutrolin B sadrže sporogene laktobacile i vitamine B, B2, B6, PP. Dostupan u obliku kapsula, tableta i sirupa.
13. Pripravci tipa Travis sadrže Lactobacillus Acidophilus, Lactobacillus Bulgaricus, Bacillus Bifidum, Streptococcus thermophilus. Dostupan u kapsulama.
14. Pripravci tipa hilak su pripravak u obliku kapi za oralnu primjenu, koji sadrži sterilni koncentrat produkata metabolizma tvari za stvaranje mliječne kiseline s produktima metabolizma gram-pozitivnih i gram-negativnih simbionta crijevne mikroflore, kao i aminokiseline, kratkolančane hlapljive masne kiseline, biosintetička mliječna kiselina, mliječno-slani pufer, laktoza. Lijekovi pomažu u održavanju kiselosti u crijevima unutar fiziološke norme, što dovodi do normalizacije saprofitne crijevne flore i stvara nepovoljne uvjete za život patogenih mikroorganizama. Pod utjecajem lijekova normalizira se prirodna sinteza vitamina B i K. Kratkolančane hlapljive masne kiseline sadržane u lijekovima osiguravaju obnovu oštećene crijevne mikroflore kod zaraznih bolesti gastrointestinalnog trakta, povećavaju regenerativnu sposobnost stanice pokrovnog tkiva stijenke crijeva, te uspostavljaju narušenu ravnotežu vode i elektrolita u lumenu crijeva .
15. Pripravci tipa Enterol sadrže liofilizirani Saccharomyces boulardii (medicinski kvasac). Djeluju antimikrobno, antagonisti su patogenih i uvjetno patogenih mikroorganizama: klostridije, stafilokoka, kandide, lamblije. Povećajte lokalnu imunološku obranu kao rezultat povećanja imunoglobulina. Djeluju antitoksično i poboljšavaju trofiku crijevne sluznice. Dostupan u obliku praha u vrećicama i kapsulama.
Sadržaj teme "Uzročnik antraksa. Kliničke manifestacije infekcije antraksom. Bacillus cereus.":Bacillus cereus. Morfologija bacillus cereus. Kulturna svojstva bacillus cereus. Klinika trovanja bacillus cereus. Principi mikrobiološke dijagnostike bacillus cereus. Identifikacija bacillus cereus.
Bacillus cereus- saprofitna bakterija tla, široko rasprostranjena u prirodi. Bakterije često kontaminiraju prehrambene proizvode, uzrokujući trovanje hranom. Fenomeni intoksikacije su posredovani enterotoksinom. Tvore ga bakterije koje rastu iz spora koje su otporne na određene uvjete termičke obrade prehrambenih proizvoda (obično povrća). Bakterije proizvode toksine samo in vivo, tijekom klijanja spora. Posljednjih godina bilježe se i bolničke infekcije sporadično uzrokovane bakterijom B. cereus - bakterijemija, endokarditis i meningitis u osoba s protetskim organima, kateterima, u bolesnika s hemodinamskim poremećajima, kao i u onih koji su dulje vrijeme primali citostatike i imunosupresive. Dugo vrijeme. Oštećenja su teška i često fatalna.
Morfologija i svojstva kulture bacillus cereus
Morfološki Bacillus cereus nalikuje bacilu antraksa; glavne razlike su pokretljivost i hemolitička aktivnost. U razmazima su bakterije raspoređene u obliku ograde. Temperaturni optimum za rast je 30 °C; optimalni pH 7-9,5. Na agaru, patogen stvara "raširene" kolonije s neravnim rubovima; na CA, kolonije su okružene širokom zonom hemolize (vidi umetnutu sliku 4). S vremenom kolonije poprimaju karakterističan voštani izgled [od lat. sada, vosak, svijeća]. U tekućim medijima stvaraju delikatan film na površini, bijeli pahuljasti sediment i zamućenje juhe. Bakterije pokazuju visoku proteolitičku aktivnost i ukapljuju želatinu za 1-4 dana; svi sojevi proizvode lecitinazu i acetoin. Oni stvaraju kiselinu u mediju koji sadrži glukozu i maltozu.
Kliničke manifestacije trovanja bacilom cereusom
Bacillus cereus uzrokuje dvije vrste trovanja hranom (gastroenteritis).
Otrovanje bakterijom Bacillus cereus prvi tip karakterizira skraćeno razdoblje inkubacije (oko 4-5 sati); Karakteriziran iscrpljujućim proljevom i povraćanjem. Bolest se razvija kada se jede hrana kontaminirana velikim brojem mikroorganizama.
Otrovanje bakterijom Bacillus cereus Druga vrsta trovanja ima duže razdoblje inkubacije (oko 17 sati). Bolesnici se žale na grčevite bolove u trbuhu i proljev. Ovaj skup simptoma često se pogrešno smatra trovanjem hranom uzrokovanim klostridijom.
Principi mikrobiološke dijagnostike bacillus cereus
Dijagnostički znak bacillus cereus uzeti u obzir otkrivanje u sumnjivim prehrambenim proizvodima više od 10 5 bakterija u 1 g/ml proizvoda ili 10 2 -10 3 bakterija u 1 g/ml izmeta i povraćane vode ili vode za pranje. Glavne razlike između B. cereus i B. anthracis su hemolitička aktivnost, pokretljivost, otpornost na penicilin, brzo ukapljivanje želatine i nepatogenost za bijele miševe.
Izum se odnosi na područje medicine, točnije na mikrobiologiju, i može se koristiti u bakteriološkim laboratorijima za detekciju antagonističke aktivnosti soja Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893). Koinkubacija se provodi u fiziološkoj otopini izoliranog soja Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) u čistoj kulturi i izolirane čiste kulture oportunističkog patogenog mikroorganizma (OPM) iz fecesa bolesnika. Dobivena smjesa se sije pomoću Golda na hranjivi agar sa i bez penicilina u koncentraciji od 0,01 U/ml, te ako se utvrdi smanjenje količine UPM na podlozi s penicilinom u odnosu na količinu UPM na podlozi bez njega. , utvrđuje se prisutnost antagonističkog djelovanja soja Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) prema soju UPM, dok se eubiotik procjenjuje kao učinkovit protiv soja UPM izoliranog iz bolesnika tijekom testiranja na crijevnu disbiozu. Izum omogućuje suzbijanje soja Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) bez ugrožavanja klijavosti UPM test kultura. 3 stola
Izum se odnosi na područje medicine, točnije na mikrobiologiju, i može se koristiti u bakteriološkim laboratorijima za identifikaciju antagonističke aktivnosti soja Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) u svrhu pojedinačne procjene učinkovitosti eubiotika, glavne djelatne tvari čiji je princip soj Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893), u odnosu na oportunističke mikroorganizme izolirane iz pacijenta tijekom ispitivanja crijevne disbioze. Izum se također može koristiti u gastroenterologiji za individualni odabir eubiotika, čija je glavna djelatna tvar soj Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893), u liječenju crijevne disbioze.
Među lijekovima za korekciju promijenjene crijevne mikrobiocenoze značajno mjesto zauzimaju eubiotici namijenjeni suzbijanju patogenih i oportunističkih mikroorganizama. Najčešće su eubiotici predstavnici roda Bacillus koji nisu predstavnici normalne crijevne mikroflore, eliminiraju se ubrzo nakon ukidanja i snažni su antagonisti nesrodnih mikroorganizama zbog proizvodnje lizozima, proteolitičkih enzima i bakteriocina. Poznato je da bacili najučinkovitije suzbijaju patogene enterobakterije i neke oportunističke mikroorganizme koji naseljavaju crijevni biotop: S. aureus, Candida spp., E. coli, P. aeruginosa, K. pneumoniae i druge oportunističke enterobakterije.
Jedan od najčešće korištenih eubiotika u mnogim zemljama je lijek “Baktisubtil” (Francuska), čiji je glavni aktivni sastojak soj Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893). Poznat je i eubiotik “Flonivin” čija je glavna aktivna supstanca takođe Bacillus cereus soj IP 5832 (ATCC 14893), BS Proizvođač: Galenika, A.D., Srbija.
Industrijski sojevi roda Bacillus ne stvaraju biofilmove, budući da su njihova adhezivna svojstva za stanice crijevnog epitela slaba. Na temelju činjenice da se aktivnost soja Bacillus cereus javlja u lumenu crijeva i povezana je prvenstveno s visokom antagonističkom aktivnošću ovog soja, a ne s kompetitivnim odnosima za mjesta vezanja za sluznicu, učinkovitost eubiotika, čiji je glavni aktivni princip soj Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893), u odnosu na oportunističke mikroorganizme izolirane iz pacijenta tijekom dijagnoze crijevne disbioze, može se prosuditi po prisutnosti ili odsutnosti antagonističke aktivnosti soja Bacillus cereus IP. 5832 (ATCC 14893).
Bakteriocine ili tvari slične bakteriocinima proizvode bacili uglavnom izvanstanično i sposobni su se nakupljati u hranjivom mediju. Zahvaljujući tome, teoretski, antagonistička aktivnost bacila može se detektirati korištenjem različitih modifikacija metoda izravnog ili odgođenog antagonizma, koje se tradicionalno koriste samo za otkrivanje antagonizma probiotičkih lakto- i bifidobakterija: streak metoda, Frederickova metoda odgođenog antagonizma s posrednim ubijanjem soj proizvođač s kloroformom, dvoslojna agar metoda.
Za identifikaciju antagonističke aktivnosti soja Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893), koristili smo gore navedene metode.
Kako bi se procijenila antagonistička aktivnost bacila metodom izravnog antagonizma, suspenzija dnevne kulture B.cereus razvučena je po promjeru Petrijeve zdjelice hranjivim agarom u koncentraciji 1×10 9 prema standardu optičke zamućenosti GISC. nazvan po. L.A. Tarasevich. Kulture oportunističkih mikroorganizama izoliranih tijekom dijagnoze crijevne disbioze posijane su okomito. Inkubirana na 37°C 24 sata. Prisutnost antagonističke aktivnosti uzeta je u obzir prisutnošću zastoja u rastu u ispitivanim sojevima.
Pri procjeni antagonističke aktivnosti bacila metodom odgođenog antagonizma, test kulture oportunističkih mikroorganizama inokulirane su 24 i 48 sati nakon inokulacije bacila.
U razmatranim mogućnostima procjene antagonizma soja Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893), prema vlastitim podacima, soj nije pokazao antagonističko djelovanje prema test kulturama oportunističkih mikroorganizama (80 sojeva). Neki aktivno pokretni sojevi oportunističkih mikroorganizama (P. aeruginosa, E. coli) rasli su na površini bacilarnih kolonija.
Smatra se da metaboliti bacila imaju snažniji antagonistički učinak od živih kultura. Stoga smo također koristili metodu odgođenog antagonizma s intermedijarnim ubijanjem soja proizvođača kloroformom. Soj Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) inokuliran je u skrutnuti 1,5% hranjivi agar izliven u Petrijeve zdjelice i uzgajan 48 sati na 37°C. Nakon inkubacije, dobivena kultura je ubijena parama kloroforma, a suspenzija testne kulture oportunističkog mikroorganizma je slojevito nanesena. Da biste to učinili, pomiješajte 0,1 ml kulture u konačnoj koncentraciji od 10 8 stanica prema standardu optičke zamućenosti s 2,5-3 ml 0,7% polutekućeg agara otopljenog i ohlađenog na temperaturu od 46-48°C. Ako postoji sposobnost stvaranja bakteriocina, potrebno je promatrati zonu inhibicije rasta testnog soja oko kolonije soja Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893). Antagonistička aktivnost bacila nije otkrivena, jer Na površini medija s navodnim bakteriocinima uočen je rast testnih kultura UPM "travnjaka".
Slične smo podatke dobili korištenjem modificirane metode dvoslojnog agara s inokulacijom bacila s travnjakom, nakon čega je uslijedilo ubijanje i slojevitost UPM test kulture.
Najbliža u tehničkoj biti navedenoj metodi je metoda invertnog agara, koja je opisana za utvrđivanje antagonističke aktivnosti probiotika koji sadrže Bacillus subtilis i Escherichia coli protiv oportunističkih kvasaca. Da bi se to postiglo, sojevi Bacillus subtilis i Escherichia coli se posijaju na čvrstu hranjivu podlogu, nakon 2 dana agar se okrene i na njegovu poleđinu se posije prethodno titrirana doza sjemena kvasca. Inkubirajte 24 sata u aerobnim uvjetima na 37°C. Prisutnost antagonizma detektira se kvantitativno supresijom rasta kvasca u usporedbi sa sličnom inokulacijom bez probiotičkih sojeva.
Opisana je i testirana metoda obrnutog agara za procjenu protugljivičnih učinaka probiotika koji sadrže Bacillus subtilis i Escherichia coli. Ali antagonistički učinak na druge oportunističke mikroorganizme (ne na oportunističke kvasce) nije procijenjen. Osim toga, izvorna metoda uključuje odabir doze sjemena kvasca pri kojoj na agaru ne bi raslo više od 70 kolonija. To zahtijeva titraciju i dodatna istraživanja pri testiranju svakog soja. Ispitivanje ove metode pomoću soja proizvođača eubiotika Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) i 80 testnih kultura oportunističkih mikroorganizama izoliranih tijekom dijagnostike crijevne disbioze nije nam omogućilo identificiranje niti jednog slučaja antagonističke aktivnosti soja Bacillus cereus IP 5832 ( ATCC 14893).
Za procjenu antagonističkog djelovanja probiotika koji sadrže lakto i bifido, također su opisane metode kokultivacije u tekućem mediju s različitim neizravnim metodama procjene koje ne podrazumijevaju naknadno nasađivanje na čvrstu hranjivu podlogu za određivanje broja potisnutih UPM.
Prema tome, niti jedna od poznatih metoda za otkrivanje antagonističke aktivnosti probiotičkih lakto- i bifidobakterija, prema autorima, nije nam omogućila detekciju antagonističke aktivnosti soja Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) protiv oportunističkih mikroorganizama izoliranih iz pacijenta tijekom studija za crijevnu disbiozu.
U literaturi također nismo pronašli način za pojedinačnu procjenu učinkovitosti lijeka "Baktisubtil" ili drugih eubiotika, čiji je glavni aktivni princip Bacillus cereus soj IP 5832 (ATCC 14893), protiv oportunističkih mikroorganizama izoliranih iz određeni pacijent tijekom studije za disbakteriozu crijeva.
Cilj izuma je identificirati antagonističku aktivnost soja Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) protiv oportunističkih mikroorganizama izoliranih iz određenog pacijenta tijekom ispitivanja crijevne disbioze.
Tehnički rezultat izuma je suzbijanje eubiotskog soja Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) bez ugrožavanja klijavosti testnih kultura.
Tehnički rezultat se postiže izolacijom čiste kulture oportunističkih mikroorganizama iz fecesa subjekta, zatim izolacijom soja Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) u čistoj kulturi, nakon čega se soj Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) suparira. -inkubira se sa svakim od sojeva oportunističkih mikroorganizama u fiziološkoj otopini, nakon čega slijedi Gold nasađivanje na hranjivi agar s penicilinom u koncentraciji od 0,01 U/ml i bez njega, te pri utvrđivanju smanjenja broja oportunističkih mikroorganizama na podlozi s penicilina u odnosu na broj oportunističkih mikroorganizama mikroorganizama na podlozi bez penicilina utvrđuje se prisutnost antagonističkog djelovanja soja Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) prema soju oportunističkog mikroorganizma, dok se eubiotik ocjenjuje učinkovitim protiv soj oportunističkog mikroorganizma izoliranog iz danog pacijenta u ispitivanju crijevne disbioze.
Metoda se provodi na sljedeći način:
Standardnim metodama izdvaja se čista kultura oportunističkih mikroorganizama iz fecesa bolesnika i soj Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) u čistoj kulturi, koji je glavni aktivni sastojak eubiotika. Izolirali smo čistu kulturu soja Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) iz eubiotika “Baktisubtil”. 1 ml suspenzije test kulture oportunističkog mikroorganizma u fiziološkoj otopini u konačnoj koncentraciji od 10 9 stanica prema standardu optičkog zamućenja pomiješa se s 1 ml suspenzije Bacillus cereus u istoj koncentraciji. Smjesa je inkubirana 48 sati na 37°C. Zatim se sjetva provodi prema Goldu. Da bi se to postiglo, provodi se kvantitativno sijanje pomoću mjerne petlje promjera 3 mm i kapaciteta 2 μl na hranjivom agaru s penicilinom u koncentraciji od 0,01 U/ml za suzbijanje bacila i na mediju bez antibiotika za kontrolu rast obiju vrsta kultura. Kako bi se isključili drugi mogući čimbenici koji potiskuju rast UPM i bacila (nedostatak hranjive baze), paralelno se provodi kontrolna sjetva monokultura nakon inkubacije u sličnim uvjetima. Broj uzgojenih mikroorganizama izračunava se prema tablici 1 – Obračunska tablica za određivanje broja bakterija u 1 ml tekućine. Ako se iz fecesa bolesnika otkrije više od jednog UPM-a, opisani postupak provodi se sa svakim od UPM-a. Ako se na podlozi s penicilinom utvrdi smanjenje broja oportunističkih mikroorganizama u odnosu na kontrolno nasađivanje, utvrđuje se prisutnost antagonističkog djelovanja soja Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) prema soju oportunističkog mikroorganizma izoliranog iz pacijent tijekom studije za crijevnu disbiozu. Prisutnost ili odsutnost antagonističkog djelovanja soja Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) je kriterij procjene za određivanje učinkovitosti eubiotika, čija je glavna aktivna tvar soj Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893), protiv soja oportunistički mikroorganizam izoliran iz danog pacijenta tijekom ispitivanja crijevne disbioze. Uz prisutnost antagonističkog djelovanja soja Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893), eubiotik se procjenjuje učinkovitim protiv soja oportunističkog mikroorganizma koji je izoliran od ovog pacijenta tijekom testa na crijevnu disbiozu.
Bitne razlikovne karakteristike predložene metode su:
Izolirajte čistu kulturu oportunističkih mikroorganizama iz fecesa ispitanika;
Izolirana je čista kultura soja Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893), koja je glavni aktivni sastojak eubiotika;
Zatim se soj Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) koinkubira sa svakim od sojeva oportunističkih mikroorganizama u fiziološkoj otopini;
Naknadna sjetva smjese na hranjivu podlogu prema Goldu;
Sjetva se provodi na hranjivi agar sa i bez penicilina u koncentraciji od 0,01 U/ml;
Ako se utvrdi smanjenje broja oportunističkih mikroorganizama na podlozi s penicilinom u usporedbi s brojem oportunističkih mikroorganizama na podlozi bez penicilina, utvrđuje se prisutnost antagonističke aktivnosti soja Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) prema sojevima oportunističkih mikroorganizama. je određen;
U prisutnosti antagonističkog djelovanja soja Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) protiv sojeva oportunističkih mikroorganizama, eubiotik se procjenjuje kao učinkovit protiv soja oportunističkog mikroorganizma izoliranog iz danog pacijenta tijekom testiranja na crijevnu disbiozu.
Uzročno-posljedična veza između bitnih razlikovnih obilježja i postignutog rezultata:
Individualnost identifikacije antagonističke aktivnosti soja Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) protiv oportunističkih mikroorganizama, i, zauzvrat, individualnost procjene učinkovitosti eubiotika, čiji je glavni aktivni sastojak soj Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) protiv oportunističkih mikroorganizama mikroorganizmi izolirani iz pacijenta tijekom ispitivanja crijevne disbioze osiguravaju se izolacijom oportunističkih mikroorganizama u čistoj kulturi iz fecesa subjekta i izolacijom čiste kulture soja Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893), nakon čega slijedi zajednička inkubacija u fiziološkoj otopini i nasađivanje po Goldu na hranjivu podlogu.
Sjetva prema Goldu na hranjivu podlogu neophodna je za određivanje broja potisnutih UPM.
Hranjivi agar s penicilinom u koncentraciji od 0,01 U/ml omogućuje vam suzbijanje eubiotičkog soja Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893), bez ugrožavanja klijavosti testnih kultura, što omogućuje otkrivanje antagonističke aktivnosti B. cereus protiv oportunističkih mikroorganizama.
Kao testne kulture proučavali smo sojeve oportunističkih mikroorganizama izoliranih iz bolesnika s crijevnom disbiozom - po 20 izolata S. aureus, S. epidermidis, Klebsiella spp., E. coli s tipičnim svojstvima, E. coli s promijenjenom enzimskom aktivnošću, Enterobacter spp. ., Citrobacter spp., P. aeruginosa.
1 ml suspenzije UPM test kultura u fiziološkoj otopini u konačnoj koncentraciji od 10 9 stanica prema standardu optičke zamućenosti pomiješan je s 1 ml suspenzije Bacillus cereus soja IP 5832 (ATCC 14893), u istoj koncentraciji. Kako bi se izbjegla proliferacija bacila ili oportunističkih bakterija, uporaba bilo kojeg tekućeg medija za kulturu za zajedničku inkubaciju smatrala se neprikladnom. Smjesa je inkubirana 48 h na 37°C. Pretpostavlja se da je tijekom tog vremena UPM izumro pod utjecajem metabolita bacila. Kvantitativno sijanje je provedeno pomoću mjerne petlje promjera 3 mm i kapaciteta 2 μl prema Goldu. Posijane su na hranjivi agar s antibioticima za suzbijanje bacila i na podlogu bez antibiotika za kontrolu rasta obje vrste kultura. Kako bi se isključili drugi mogući čimbenici supresije rasta UPM-a i bacila (nedostatak hranjive baze), paralelno je nakon inkubacije u sličnim uvjetima provedena kontrolna sjetva monokultura. Broj uzgojenih mikroorganizama izračunat je prema tablici 1 - Obračunska tablica za određivanje broja bakterija u 1 ml tekućine 1.
Za suzbijanje rasta bacila na podlozi za sadnju prethodno je odabran selektivni dodatak - antibiotik u koncentraciji koja suzbija bacile, ali ne inhibira rast mikroorganizama, na temelju podataka o širokoj rezistenciji na penicilin i streptomicin među ispitivane oportunističke bakterije (osobito enterobakterije). Različite koncentracije antibiotika dodane su u hranjivi agar otopljen i ohlađen na 46-48°C. Pri ispitivanju medija streptomicinom lijek je dodan u koncentracijama od 1,0 U/ml, 0,5 U/ml, 0,25 U/ml medija. 25 kultura UPM i Bacillus cereus soja IP 5832 (ATCC 14893) inokulirano je u koncentraciji od 10 9 stanica/ml na podloge sa i bez antibiotika. Međutim, rast bacila nije potpuno suzbijen - od 10 9 do 10 4 stanica/ml pri maksimalnoj koncentraciji streptomicina od 1,0 U/ml medija. U isto vrijeme, UPM kulture (Klebsiella spp., Enterobacter spp., atipična E. coli, Citrobacter spp., S. aureus) izolirane tijekom dijagnoze disbioze bile su u različitom stupnju potisnute streptomicinom u 74 (96%) testa ( Tablica 2 - Izbor antibiotika za suzbijanje soja Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) i istovremenog rasta oportunističkih mikroorganizama).
Pri ispitivanju medija s penicilinom lijek je dodan u koncentracijama od 0,001 U/ml, 0,01 U/ml, 0,1 U/ml, 1,0 U/ml medija. Sjetva i bilježenje rezultata obavljeni su na sličan način. Oportunističke enterobakterije nisu bile potisnute čak ni maksimalnom koncentracijom penicilina od 1,0 U/ml medija. Uočeno je intenzivnije potiskivanje S. aureusa. Prihvatljiva razina klijanja oportunističkih bakterija, uključujući S. aureus, uz istovremenu potpunu supresiju soja Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) uočena je pri koncentraciji penicilina od 0,01 U/ml hranjive podloge (tablica 2 - Izbor antibiotika). za suzbijanje soja Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) i istodobnog rasta oportunističkih mikroorganizama).
U prisutnosti antagonističkog djelovanja soja Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) protiv oportunističkih mikroorganizama, eubiotik se procjenjuje kao učinkovit protiv soja oportunističkog mikroorganizma izoliranog iz danog pacijenta tijekom testiranja na crijevnu disbiozu.
Odabrali smo antagonističko djelovanje soja Bacillus cereus IP 5832 kao evaluacijski kriterij za pojedinačnu ocjenu učinkovitosti eubiotika, čija je glavna djelatna tvar soj Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893), u odnosu na soj oportunističkih mikroorganizama. izoliran od ovog pacijenta tijekom ispitivanja crijevne disbioze (ATCC 14893). To se objašnjava činjenicom da se aktivnost soja Bacillus cereus javlja u lumenu crijeva i povezana je prvenstveno s visokom antagonističkom aktivnošću ovog soja, a ne s kompetitivnim odnosima za mjesta vezanja na sluznicu.
Skup bitnih razlikovnih svojstava predložene metode je nov i omogućuje suzbijanje eubiotičkog soja Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) bez ugrožavanja klijavosti testnih kultura, što zauzvrat osigurava identifikaciju antagonističke aktivnosti eubiotski soj Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) u odnosu na oportunističke mikroorganizme izolirane tijekom ispitivanja crijevne disbioze kod bolesnika, koji se može koristiti za individualnu procjenu učinkovitosti eubiotika, čija je glavna djelatna tvar Bacillus cereus soj IP 5832 (ATCC 14893), u odnosu na oportunističke mikroorganizme izolirane iz bolesnika pri ispitivanju na crijevnu disbiozu.
Primjeri specifične implementacije:
Bakteriološkom pretragom stolice na crijevnu disbiozu (br. 247) utvrđena je Citrobacter freundii u količini od 5×10 6 CFU/g.
1 ml suspenzije čiste kulture Citrobacter freundii izolirane iz fecesa bolesnika u fiziološkoj otopini u konačnoj koncentraciji od 10 stanica prema standardu optičkog zamućenja pomiješano je s 1 ml suspenzije čiste kulture Bacillus cereus soj IP 5832 (ATCC 14893), izoliran iz eubiotika “Bactistatin”, u istoj koncentraciji. Smjesa je inkubirana 48 h na 37°C. Zatim je provedeno kvantitativno sijanje pomoću mjerne petlje promjera 3 mm i kapaciteta 2 μl u Goldu na hranjivi agar s penicilinom u koncentraciji od 0,01 U/ml za suzbijanje bacila i na medij bez antibiotika za kontrolu rasta obje vrste kultura. Broj uzgojenih mikroorganizama izračunat je prema Tablici 1 – Obračunska tablica za određivanje broja bakterija u 1 ml tekućine.
U kontrolnoj varijanti koncentracija Citrobacter freundii bila je 10 8 CFU/g, au pokusnoj varijanti 5 × 10 CFU/g. Otkriveno je antagonističko djelovanje soja Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) protiv soja Citrobacter freundii (br. 247). Utvrđeno je da je lijek "Baktisubtil" učinkovit protiv soja Citrobacter freundii izoliranog od pacijenta tijekom ispitivanja crijevne disbioze.
Bakteriološkom pretragom stolice na crijevnu disbiozu (br. 512) utvrđen je S. aureus u količini od 10 6 CFU/g.
1 ml suspenzije čiste kulture bakterije S aureus izolirane iz fecesa bolesnika u fiziološkoj otopini u konačnoj koncentraciji od 10 9 stanica/ml prema standardu optičke zamućenosti pomiješano je s 1 ml suspenzije čiste kulture bakterije Bacillus. cereus soj IP 5832 (ATCC 14893), izoliran iz eubiotika "Baktisubtil", u istoj koncentraciji. Smjesa je inkubirana 48 h na 37°C. Zatim je provedeno kvantitativno sijanje pomoću mjerne petlje promjera 3 mm i kapaciteta 2 μl u Goldu na hranjivi agar s penicilinom u koncentraciji od 0,01 U/ml za suzbijanje bacila i na medij bez antibiotika za kontrolu rasta obje vrste kultura. Broj uzgojenih mikroorganizama izračunat je prema Tablici 1 – Obračunska tablica za određivanje broja bakterija u 1 ml tekućine.
U kontrolnoj varijanti koncentracija S aureusa bila je 5×10 6 CFU/g, u pokusnoj varijanti - 10 6 CFU/g. Antagonistička aktivnost soja Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) protiv soja S aureus nije otkrivena (br. 512). Utvrđeno je da je lijek "Baktisubtil" neučinkovit protiv soja S aureus izoliranog od pacijenta tijekom testa na crijevnu disbiozu.
Bakteriološkom pretragom stolice na crijevnu disbiozu (br. 429) utvrđena je Klebsiella pneumoniae u količini od 10 4 CFU/g, Enterobacter agglomerans u količini od 10 6 CFU/g, Citrobacter freundii u količini od 10 6 CFU/g, Staphylococcus aureus u količini od 10 4 CFU/g. G.
1 ml suspenzije čiste kulture svakog od sojeva oportunističkih mikroorganizama izoliranih iz bolesnika, u fiziološkoj otopini u konačnoj koncentraciji od 10 9 stanica prema standardu optičke zamućenosti, pomiješano je s 1 ml suspenzije čista kultura soja Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893), izolirana iz eubiotika "Baktisubtil" u istoj koncentraciji. Tako su dobivene 4 smjese sojeva oportunističkih mikroorganizama i bacila. Smjese su inkubirane 48 h na 37°C. Zatim je provedeno kvantitativno sijanje pomoću mjerne petlje promjera 3 mm i kapaciteta 2 μl u Goldu na hranjivi agar s penicilinom u koncentraciji od 0,01 U/ml za suzbijanje bacila i na medij bez antibiotika za kontrolu rast svake od izoliranih kultura. Broj uzgojenih mikroorganizama izračunat je prema Tablici 1 – Obračunska tablica za određivanje broja bakterija u 1 ml tekućine.
U kontrolnoj varijanti koncentracija Klebsiella pneumoniae iznosila je 10 8 CFU/g, au pokusnoj varijanti 10 6 CFU/g. U kontrolnoj varijanti koncentracija Enterobacter agglomerans iznosila je 10 7 CFU/g, au pokusnoj varijanti 10 5 CFU/g. U kontrolnoj varijanti koncentracija Staphylococcus aureusa bila je 10 8 CFU/g, au pokusnoj varijanti 5×10 6 CFU/g. U kontrolnoj varijanti koncentracija Citrobacter freundii iznosila je 10 7 CFU/g, au pokusnoj varijanti 10 6 CFU/g.
Otkriveno je antagonističko djelovanje soja Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) protiv sojeva Klebsiella pneumoniae, Enterobacter agglomerans, Staphylococcus aureus, Citrobacter freundii. Utvrđeno je da je lijek "Baktisubtil" učinkovit protiv ovih sojeva izoliranih od danog pacijenta tijekom ispitivanja disbakterioze.
Bakteriološkom pretragom stolice na crijevnu disbiozu (br. 449) utvrđena je Enterobacter agglomerans u količini od 10 6 CFU/g, Klebsiella pneumoniae u količini od 5×10 4 CFU/g, Citrobacter freundii u količini od 10 6 CFU/g. g.
1 ml suspenzije čiste kulture svakog od izoliranih sojeva oportunističkih mikroorganizama u fiziološkoj otopini u konačnoj koncentraciji od 10 9 stanica prema standardu optičke zamućenosti pomiješano je s 1 ml suspenzije čiste kulture Bacillus cereus soj IP 5832 (ATCC 14893), izoliran iz eubiotika "Baktisubtil", u istoj koncentraciji. Tako su dobivene 3 smjese sojeva oportunističkih mikroorganizama i bacila. Smjese su inkubirane 48 h na 37°C. Zatim je izvršeno kvantitativno sijanje mjernom petljom promjera 3 mm i kapaciteta 2 μl u Goldu na hranjivi agar s penicilinom u koncentraciji od 0,01 U/ml za suzbijanje bacila i na medij bez antibiotika za kontrolu rast svake od izoliranih kultura. Broj uzgojenih mikroorganizama izračunat je prema Tablici 1 – Obračunska tablica za određivanje broja bakterija u 1 ml tekućine.
U kontrolnoj varijanti koncentracija Enterobacter agglomerans iznosila je 10 8 CFU/g, u pokusnoj varijanti 5×10 7 CFU/g. U kontrolnoj varijanti koncentracija Klebsiella pneumoniae bila je 10 7 CFU/g, au pokusnoj varijanti 5×10 6 CFU/g. U kontrolnoj varijanti koncentracija Citrobacter freundii bila je 10 7 CFU/g, u pokusnoj varijanti 5×10 5 CFU/g.
Otkrivena je antagonistička aktivnost soja Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) prema soju Citrobacter freundii, dok nije otkrivena antagonistička aktivnost soja Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) prema sojevima Enterobacter agglomerans i Klebsiella pneumoniae. Utvrđeno je da je lijek "Baktisubtil" učinkovit protiv soja Citrobacter freundii i neučinkovit protiv sojeva Enterobacter agglomerans i Klebsiella pneumoniae izoliranih od ovog pacijenta tijekom ispitivanja na disbakteriozu.
Bakteriološkom pretragom stolice na crijevnu disbiozu (br. 461) utvrđena je Klebsiella pneumoniae u količini od 10 6 CFU/g i Citrobacter freundii u količini od 10 6 CFU/g.
1 ml suspenzije čiste kulture svakog od izoliranih sojeva oportunističkih mikroorganizama u fiziološkoj otopini u konačnoj koncentraciji od 10 9 stanica prema standardu optičke zamućenosti pomiješano je s 1 ml suspenzije čiste kulture Bacillus cereus soj IP 5832 (ATCC 14893), izoliran iz eubiotika "Baktisubtil", u istoj koncentraciji. Tako smo dobili 2 smjese sojeva oportunističkih mikroorganizama i bacila. Smjese su inkubirane 48 h na 37°C. Zatim je provedeno kvantitativno sijanje pomoću mjerne petlje promjera 3 mm i kapaciteta 2 μl u Goldu na hranjivi agar s penicilinom u koncentraciji od 0,01 U/ml za suzbijanje bacila i na medij bez antibiotika za kontrolu rasta svih izoliranih kultura. Broj uzgojenih mikroorganizama izračunat je prema Tablici 1 – Obračunska tablica za određivanje broja bakterija u 1 ml tekućine.
U kontrolnoj varijanti koncentracija Klebsiella pneumoniae bila je 10 7 CFU/g, au pokusnoj varijanti 5×10 5 CFU/g. U kontrolnoj varijanti koncentracija Citrobacter freundii bila je 10 8 CFU/g, u pokusnoj varijanti 5×10 7 CFU/g.
Utvrđeno je antagonističko djelovanje soja Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) prema soju Klebsiella pneumoniae, a nije utvrđeno antagonističko djelovanje soja Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) prema soju Citrobacter freundii. Utvrđeno je da je lijek "Baktisubtil" učinkovit protiv soja Klebsiella pneumoniae i neučinkovit protiv soja Citrobacter freundii izoliranog od ovog pacijenta tijekom ispitivanja disbakterioze.
Korištenjem razvijene podloge s penicilinom u koncentraciji od 0,01 U/ml proučavan je antagonizam soja Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) i 96 UPM kultura izoliranih u značajnim količinama tijekom ispitivanja crijevne disbioze: Citrobacter spp. (16 sojeva), Klebsiella spp. (17), S. aureus (18), Enterobacter spp. (15), tipična E. coli (15), E. coli s atipičnim svojstvima (15). Antagonistička aktivnost eubiotika procijenjena je brojem sojeva ispitivanih mikroorganizama koje je suprimirao (u %) (Tablica 3 - Antagonizam soja Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) i oportunističkih mikroorganizama).
Istraživanja su pokazala da proučavani soj Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) suzbija 17,7% (17 izolata) testiranih UPM sojeva.
Međutim, smanjenje broja oportunističkih mikroorganizama bilo je beznačajno - za 0,5-2 lg. Pokazalo se da je 79,0% (81 izolat) testiranih sojeva otporno i čak sposobno za reprodukciju u prisutnosti eubiotika.
Inventivna metoda omogućuje suzbijanje eubiotičkog soja Bacillus cereus soj IP 5832 (ATCC 14893) bez ugrožavanja klijavosti testnih kultura, što zauzvrat osigurava identifikaciju antagonističke aktivnosti eubiotičkog soja Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) protiv soja oportunističkih mikroorganizama, izoliranog tijekom dijagnostike crijevne disbioze u bolesnika, koji se može koristiti za individualnu procjenu učinkovitosti eubiotika, čija je glavna djelatna tvar soj Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893), protiv oportunističkih mikroorganizama izoliranih od pacijenta tijekom ispitivanja crijevne disbioze.
| stol 1 | |||||||
| Obračunska tablica za određivanje broja bakterija u 1 ml tekućine | |||||||
| A | ja | II | III | Količina u 1 ml | |||
| 1-6 | - | - | <1000 | ||||
| 8-20 | - | - | - | 3000 | |||
| 20-30 | - | - | - | 5000 | |||
| 30-60 | - | - | - | 10000 | |||
| 70-80 | - | - | - | 50000 | |||
| 100-150 | 5-10 | - | - | 100000 | |||
| ne računajući | 20-30 | - | - | 500000 | |||
| -"- | 40-60 | - | - | 1 milijun | |||
| -"- | 100-150 | 10-20 | - | 5 milijuna | |||
| -"- | ne računajući | 30-40 | - | 10 milijuna | |||
| -"- | -"- | 60-80 | Pojedinačne kolonije | 100 milijuna | |||
| tablica 2 | |||||||
| Odabir antibiotika za suzbijanje soja Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) i istovremenog rasta oportunističkih mikroorganizama | |||||||
| Rast UMR pri danoj koncentraciji antibiotika, CFU/ml | Broj UPM sojeva uzgojenih pri određenoj koncentraciji antibiotika, abs (%) | ||||||
| Streptomicin, jedinice/ml medija | Penicilin, jedinica/ml medija | ||||||
| 1,0 | 0,5 | 0,25 | 1,0 | 0,01 | 0,01 | 0,001 | |
| 10 8 (identičan kontroli) | 1 (4) | 8 (32) | 10 (40) | 16 (64) | 19 (76) | 22 (88) | 23 (92) |
| 10 6 | 4 (16) | 2 (8) | 0 | 4 (16) | 3 (12) | 3 (12) | 2 (8) |
| 10 5 | 15 (60) | 12 (48) | 15 (60) | 5 (20) | 3 (12) | 0 | 0 |
| 10 4 | 3 (12) | 3(12) | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| <10 4 | 2 (8) | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Rast Bacillus cereus pri danoj koncentraciji antibiotika, CFU/ml | 10 4 | 10 4 | 10 4 | ots. | ots. | ots. | 10 4 |
| Tablica 3 | |||||
| Antagonizam soja Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) i oportunističkih mikroorganizama | |||||
| Testne kulture UPM | Broj sojeva | Osjetljivi sojevi abs (%) | Otporni sojevi abs (%)* | ||
| Smanjenje za 1 lg | Smanji za 2 lg | Totalno otporni sojevi | Od njih, oni su sposobni rasti u prisutnosti eubiotika** | ||
| Klebsiella spp. | 17 | 1 (5,9) | 0 | 16(94,1) | 1 (6.25) |
| Enterobacter spp. | 15 | 4 (26,7) | 1 (6,6) | 10 (66,7) | 1(10) |
| Citrobacter spp. | 16 | 5(31,3) | 0 | 11 (68,7) | 1 (9,1) |
| tipična E. coli | 15 | 1 (6,7) | 0 | 14 (93,3) | 0 |
| atipična E. coli | 15 | 2(13,3) | 0 | 13 (86,7) | 1 (7,7) |
| S. aureus | 20 | 3 (15,0) | 0 | 17 (85,0) | 6 (35,3) |
| * - broj UPM nije se promijenio u odnosu na kontrolu ili se nije promijenio za više od 0,5 lg ** - povećan broj UPM u odnosu na kontrolu |
Izvori informacija
1. Osipova I.G., Mikhailova R.A., Sorokulova I.B., Vasiljeva E.A., Gaiderov A.A. Spore probiotici // Journal of microbiology, virology and immunology. - 2003. - br. 3. - str.113-119.
2. Blinkova L.P., Semenova S.A., Butova L.G. i dr. Antagonistička aktivnost svježe izoliranih sojeva bakterija iz roda Bacillus // Journal of microbiology, virology and immunology. - 1994. - br. 5. - str.71-75.
3. Sojevi bakterija Bacillus subtilis i Bacillus licheniformis, koji se koriste kao komponente lijeka protiv virusnih i bakterijskih infekcija i lijeka na bazi ovih sojeva. / Patent RU 2142287, publik. 10.12.99. - Bik. N20.
4. Soj bakterije Bacillus subtilis sa širokim spektrom antagonističkog djelovanja. / Patent RU N2182172, publik. 05/10/02.
5. Gataullin A.G., Mikhailova N.A., Blinkova L.P., Romanenko E.E., Elkina S.I., Gaiderov A.A., Kalina N.G. Svojstva izoliranih sojeva Bacillus subtilis i njihov učinak na crijevnu mikrofloru pokusnih miševa // Journal of Microbiology, Virology and Immunology. - 2004. - br. 2. - str.91-94.
6. Davydov D.S., Mefed K.M., Osipova I.G., Vasiljeva E.A. Svjetska uporaba probiotika spora u zdravstvenoj praksi // Klinička prehrana. - 2007. - br. 1-2. - S.A36.
7. Sorokulova I.B. Utjecaj probiotika iz bacila na funkcionalnu aktivnost makrofaga // Antibiotici i kemoterapija. - 1998. - br. 2. - str.20-23.
8. Blinkova L.P. Bakteriocini: kriteriji, klasifikacija, svojstva, metode detekcije // Journal of Microbiology, Virology and Immunology. - 2003. - br. 3. - str.109-113.
9. Postnikova E.A., Efimov B.A., Volodin N.N., Kafarskaya L.I. Potraga za obećavajućim sojevima bifidobakterija i laktobacila za razvoj novih bioloških proizvoda // Journal of microbiology, epidemiology and immunology. - 2004. - Broj 2. Str.64-69.
10. Gratia A., Fredericq P. Deversite des souches antibiotiques de Escherichia coli et étendue varibile de leur champ d'action.Ibid: 1031-1033.
11. Fredericq P. Actions antibiotiques reciproques chez les Enterobacteriaceae. REV. Belge Pathol. Med. Exp.1948, 19 (Suppl. 4): 1-107.
12. Ermolenko E.I., Isakov V.A., Zhdan-Pushkina S.Kh., Tets V.V. Kvantitativna procjena antagonističke aktivnosti laktobacila // Journal of microbiology, virology and immunology. - 2004. - br. 5. - str.94-98.
13.Ushakova N.A., Chernukha B.A. Utjecaj temperaturnog šoka na biološku učinkovitost probiotika Bacillus subtilis 8130 // Klinička prehrana. - 2007. - br. 1-2. - S.A70.
14. Arzumanyan V.G., Mikhailova N.A., Gaiderov A.A., Basnakyan I.A., Osipova I.G. Kvantitativna metoda za procjenu odgođenog antagonizma probiotičkih kultura protiv oportunističkih kvasaca // Klinička laboratorijska dijagnostika. - 2005. - br. 5. str.53-54.
15. Metoda za određivanje antagonističkog djelovanja probiotika. / RU patent br. 2187801, publik. 20.08.2002.
16. Zykova N.A., Molokeeva N.V. Novi probiotički lijek "Trilact" // Klinička prehrana. - 2007. - br. 1-2. - S.A42.
17. Smjernice za korištenje jedinstvenih mikrobioloških (bakterioloških) metoda istraživanja u kliničkim dijagnostičkim laboratorijima: Dodatak 1 naredbi Ministarstva zdravstva SSSR-a br. 535. - 1986.
18. Sanford Jay P., Gilbert David N., Moeliering Robert C. Jr., Sande Merle A. Dvadeset deveto izdanje Sanfordovog vodiča za antimikrobnu terapiju, 1999.
ZAHTJEV
Metoda za individualnu procjenu učinkovitosti eubiotika, čija je glavna aktivna tvar soj Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893), protiv oportunističkih mikroorganizama izoliranih iz pacijenta tijekom ispitivanja crijevne disbioze, koja se sastoji u izolaciji oportunističkih mikroorganizama u čistoj kulture iz fecesa subjekta, zatim se SOJ Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) izolira u čistoj kulturi, nakon čega se soj Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) koinkubira sa svakim od sojeva oportunističkih mikroorganizama u fiziološkoj otopine, nakon čega slijedi sjetva prema Goldu na hranjivi agar sa i bez penicilina u koncentraciji od 0,01 U/ml, te ako se utvrdi smanjenje broja oportunističkih mikroorganizama na podlozi s penicilinom u odnosu na broj oportunističkih mikroorganizama na podloga bez penicilina utvrđuje se prisutnost antagonističkog djelovanja soja Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) prema soju oportunističkog mikroorganizma, pri čemu se eubiotik procjenjuje učinkovitim protiv soja oportunističkog mikroorganizma izoliranog iz danog bolesnika kada testiran na crijevnu disbiozu.
Kao rukopis
Gataullin Airat Gafuanovič
BIOLOŠKA SVOJSTVA SOJEVA BACILLUS SUBTILIS PERSPEKTIVNA ZA STVARANJE NOVIH PROBIOTIKA
disertacija za stupanj kandidata bioloških znanosti
Moskva - 2005
Rad je obavljen u Državnoj ustanovi Znanstveno-istraživački institut za cjepiva i serume nazvan. AI. Mečnikov RAMS, Moskva.
Znanstveni voditelji: doktor medicinskih znanosti,
Profesor Mikhailova N.A. Doktor bioloških znanosti Blinkova L.P.
Službeni protivnici: doktor medicinskih nauka,
Profesor Baturo A.P. Doktor medicinskih znanosti, profesor Likhoded V.G.
Vodeća organizacija: Savezna služba za nadzor zaštite prava potrošača i dobrobiti ljudi Nacionalno kontrolno tijelo Savezna državna znanstvena ustanova GosNII za standardizaciju i kontrolu medicinsko-bioloških pripravaka nazvana po. LA. Tarasevich
Obrana će se održati ¿3" i 2005. u 14 sati na sastanku disertacijskog vijeća D 001.035.01 u Državnom istraživačkom institutu za cjepiva i serume po imenu I.I. Mechnikov RAMS na adresi: 105064, Moskva, Maly Kazenny traka. , br. 5a.
Disertacija se može naći u knjižnici Državnog istraživačkog instituta za cjepiva i serume nazvanog po I.I. Mečnikov RAMS.
znanstveni tajnik
vijeće disertacije
Kandidat bioloških znanosti
OPĆI OPIS RADA
Relevantnost problema
U medicinskoj mikrobiologiji prikupljeni su podaci koji opravdavaju korištenje saprofitne mikroflore za korekciju disbiotičkih poremećaja, čiji mikroorganizmi tijekom svoje vitalne aktivnosti proizvode biološki aktivne tvari (BAS) koje suzbijaju rast patogenih mikroorganizama [Mikhailova N.A. i sur., 1993.; Mazankova L.N. et al, 1997; Osipova I.G. i sur., 2003].
Terapeutski i profilaktički lijekovi koji se temelje na živim nepatogenim mikrobima, koji prirodnom metodom davanja mogu pružiti blagotvorne učinke na fiziološke i biokemijske funkcije tijela domaćina optimizacijom njegovog mikrobiološkog statusa, klasificiraju se kao probiotici [Shenderov B.A. , 1997].
Za prevenciju i liječenje bolesti gastrointestinalnog trakta naširoko se koriste biološki proizvodi koji se temelje na živim mikrobnim kulturama bakterija koje stvaraju spore [Slabospitskaya A.T. i sur., 1990.; Nikitenko V.I., 1991.; Nikitenko L.I., Nikitenko V.I., 1992.; Smirnov V.V. i sur., 1995.; Shenderov B.A. i sur., 1997.; Pobery IA. i sur., 1998].
Rod Bacillus privlači pažnju istraživača od davnina. Podaci dobiveni u području mikrobiologije, biokemije, fiziologije i genetike bakterija ukazuju na prednosti Bacillusa kao proizvođača biološki aktivnih tvari: enzima, antibiotika, insekticida [Smirnov V.V. et al., 1982; Parshina S.N. et al, 1990; Harwood K., 1992.; Blinkova L.P. et al, 1994].
Raznolikost metaboličkih procesa, genetska i biokemijska varijabilnost, otpornost na litičke i probavne enzime poslužili su kao razlog za korištenje bacila u različitim područjima medicine. Američka Agencija za hranu i lijekove dodijelila je B. subtilis GRAS (općenito se smatra sigurnom) status, što je preduvjet za njihovu upotrebu u proizvodnji lijekova [Harwood K., 1992; Nikitenko L.I., 1992.; Kandybin N.V. i sur., 1995.; Ivanovski A.A., 1996, 1997; Boyko N.V. i sur., 1997.; Payne J. M., 1992.; Kubo K, 1994.; Tsuge K. i sur., 1995.; Rychen G. i sur., 1995., Donovan W.P. i sur., 1995].
Aktivnost mnogih predstavnika roda Bacillus izražena je i očituje se protiv širokog spektra patogenih i uvjetno patogenih mikroorganizama.Zahvaljujući sintezi raznih enzima i drugih tvari reguliraju i potiču probavu, djeluju antialergijsko i antitoksično. Korištenje bacila značajno povećava nespecifičnu otpornost makroorganizama.Osim toga, ovi mikroorganizmi su tehnološki napredne proizvodnje, stabilni tijekom skladištenja i, što je važno, ekološki prihvatljivi [Soroku Yu-va IB, 1996.]
Za biotehnologiju je najveći interes sublita vrste B. Za nju je napravljena baza podataka o molekularnoj genetici SubtiList u koju se unose svi podaci o genomu bakterija.
Bakterije B subtilis naširoko se koriste u tehnologiji proizvodnje brojnih bakterijskih i enzimskih pripravaka [Shablinskas AI, 1990, Gulko MA, 1994, Gastro GR, 1992, Dercova K et al, 1992, Kudrya VA, 1994, Lin S-C et al. , 1994, Cromwick AM et al, 1996, Buchell ME et al, 1997, Oh M K et al, 1995]
Na njihovoj osnovi stvoreni su pripravci - probiotici, karakterizirani širokim rasponom terapeutskih i profilaktičkih učinaka i sigurnošću za okoliš [Nakhabin IM, Perelygin VV, 1996].Spore probiotici učinkovito se koriste za liječenje gastrointestinalnih bolesti kod ljudi i domaćih životinja. [MPTopchiy, 1997, VGuida, 1978, Kharchenko, 1980, Nikitenko V I, 1992]
Najpoznatiji lijekovi trenutno su sljedeći lijekovi: bactisu btil, sporobacterin, biosporin, bactisporin, subalin, cereobiogen, enterogermin i drugi [Smirnov VV i dr. 1988, 1992, 1995, 1997, Nikitenko V I, 1989, 1991, 1992, Gracheva N M et al, 1996, Vinnik Yu Si et al, 1998, Sorokulova I B, 1996, 1997, St gard H, 1989, Maruta K, 1996, Su Li et al, 1996, Adami A et al, 1997]
Terapijska učinkovitost spornih probiotika osigurana je biološkim svojstvima sojeva korištenih za njihovu proizvodnju, a od presudnog je značaja spektar njihovog antagonističkog djelovanja na patogene i uvjetno patogene mikroorganizme koji su jedni od uzročnika abnormalnosti.
razvojem mikroekologije u različitim biotopima ljudskog i životinjskog tijela, a ne može se zanemariti ni sposobnost bacila da stvaraju različite biološki aktivne tvari, kao što su polipeptidni antibiotici, enzimi, bakteriocini i dr., kao ni njihova otpornost na antibiotike.
Cilj rada:
Proučiti biološka svojstva izoliranih sojeva B.subtilis i procijeniti mogućnost njihove uporabe za razvoj originalnog probiotika za spore
Ciljevi istraživanja:
Znanstvena novost.
Na temelju proučavanja morfoloških, fiziološko-biokemijskih, genetskih i drugih bioloških svojstava izoliranih sojeva odabran je soj bez plazmida B. subtilis 1719, koji pokazuje antagonizam prema oportunističkim i patogenim mikroorganizmima različitih taksonomskih skupina, ima nisku adhezivnost. aktivnost, te je otporan na gentamicin, polimiksin i eritromicin.
Eksperimentalno su potkrijepljeni pristupi stvaranju proizvodne tehnologije, uključujući proučavanje svojstava rasta soja B.subilhs 1719 na izvornim hranjivim podlogama, uvjeta za stabilizaciju njegove održivosti i antagonističke aktivnosti kao faza u dobivanju novog probiotičkog lijeka.
Podnesena je prijava izuma (br. 2005111301 od 19. travnja 2005.): “Bakterijski soj Bacillus subtllll.4 1719 je proizvođač antagonistički aktivne biomase protiv patogenih mikroorganizama, kao i proteolitičkih, amilolitičkih i lipolitičkih enzima.”
Praktični značaj.
Izolirani i identificirani soj B.SllbtlllS 1719 pohranjen je u Državnoj zbirci kultura GISC naz. LA. Tarasevicha pod brojem 277 i može se preporučiti za razvoj industrijske tehnologije za proizvodnju originalnog bioterapijskog probiotika.
1. Identificirana tri soja bakterijskih kultura po morfološkim, fiziološkim, biokemijskim i drugim svojstvima odgovaraju vrsti B. suhlllts. Ne sadrže plazmide, antagonistički su aktivni protiv oportunističkih i patogenih bakterija različitih taksonomskih skupina te imaju nisku ili srednju razinu adhezije.
2. Soj B.subtlhs 1719 ima probiotička svojstva, koja se očituju u eliminaciji oportunističkih i patogenih mikroorganizama uz uspostavljanje kvantitativnog i kvalitativnog sastava normalne mikroflore u eksperimentalnoj disbiozi, a ima i imunomodulatorni učinak na makroorganizam.
Provjera rada
Materijali prezentirani na konferenciji “Funkcionalna prehrana, sigurnost hrane i zdravlje ljudi u metropoli” (Moskva, 2003.); na natjecanju mladih znanstvenika Državnog istraživačkog instituta ustanova naz. I.I. Mečnikov (Moskva, 2004.); na društvo
VOEMP (Moskva, 2004.); na 8. međunarodnoj Putinovoj školi-konferenciji mladih znanstvenika “Biologija – znanost 21. stoljeća” (Puščino, 2004.); na 5. kongresu Znanstvenog društva gastroenterologa (Moskva 2005.).
Provjera disertacije održana je na znanstvenoj konferenciji mikrobiološkog odjela NIIWS-a nazvanog. I.I. Mechnikov RAMS (Moskva, svibanj 2005).
Opseg i struktura rada disertacije
Disertacija je objavljena na 131 stranici. Sastoji se od uvoda, pregleda literature (2 poglavlja), vlastitih rezultata (5 poglavlja), zaključka i zaključaka. Popis literature uključuje: 236 izvora (169 domaćih i 67 stranih). Rad sadrži 10 slika i 19 tablica.
Objekti istraživanja
Sojevi: Bacillus subtilis izoliran iz različitih izvora iz okoliša.
Kulture mikroorganizama izoliranih iz miševa s eksperimentalnom disbiozom.
Test - kulture za određivanje antagonističke aktivnosti, iz zbirke GISK-a nazvan. LA. Tarasevich
Hranjivi mediji:
Mesni peptonski agar (MPA), mesni peptonski bujon (MPB), modificirana Gauseova podloga br. 2, hranjivi agar s dodatkom 7% NaCl - za uzgoj kultura, 5% krvni agar za određivanje hemolitičkih svojstava, juha od jaja za ispitivanje aktivnosti lecitinaze , kazein i krumpirovi agari za određivanje enzimskih svojstava, AGV - za procjenu otpornosti na antibiotike.
Biokemijska svojstva bacila određena su na Omelyanskyjevom mediju s indikatorom bromotimol plavim i ugljikohidratima - glukozom, ksilozom, manitolom, laktozom, saharozom, maltozom, salicinom i eskulinom. Za kulture bez spora korišteni su Hiss mediji koji sadrže ugljikohidrate i mediji s aminokiselinama.
Iskorištenje citrata i propionata ispitano je na Coserovoj podlozi, a sposobnost redukcije nitrata ispitana je na bujonu s nitratima. Određivanje acetoina u mediju
(Voges-Proskauer reakcija) provedena je na Clarkovom mediju. Sposobnost proizvodnje sumporovodika proučavana je na Kliglerovom mediju; aktivnost katalaze detektirana je u reakciji s H2O2, sposobnost kultura da proizvode indol detektirana je u hranjivoj juhi s indikatorskim papirom; enzim ureaza – na Christensenovoj podlozi s ureom.
Osim toga, za proučavanje strukture mikroflore miševa koristili smo hladnu juhu sirutke i Hanksovu otopinu, diferencijalno dijagnostičke medije: Endo, CI-agar, Ploskireva, stafilokokni i enterokokni agar, 88-agar, Mac-Sopkay medij, cetrimid. agar, Blaurockova podloga, tioglikolatna srijeda, Wilson Blair srijeda i drugi.
Za procjenu svojstava rasta korišteni su sljedeći mediji:
Polusintetski medij s dodatkom krompir-glicerin hidrolizata [Mikhailova N.A. 1995].
Medij br. 5 (g/l): disupstituirani kalijev fosfat 3-voda - 0,3; disupstituirani amonijev sulfat - 2; natrijev citrat 5,5-vodeni - 2; bakar sulfat 5-voda - 0,005; cink sulfat 7-voda - 0,004; željezo (II) sulfat 7-voda - 0,0005; kalcijev klorid - 0,165; mangan (II) sulfat 5-voda - 0,05; magnezijev sulfat 7-voda - 0,3; suhi enzimski pepton za bakteriološke svrhe - 5.
Medij br. 9 (g/l): željezo (II) sulfat 7-voda - 0,01; magnezijev sulfat 7-voda - 0,1; kalcijev klorid - 0,08; suhi enzimski pepton za bakteriološke svrhe - 5,0; glukoza - 10,0, ekstrakt kvasca - 3.
Medij VK-2 (g/l): mangan klorid - 0,01; kalcijev klorid - 0,05; natrijev klorid - 5,0; natrijev fosfat disupstituirani 12-voda - 2,0; disupstituirani kalijev fosfat 3-voda - 2,0; glukoza - 10,0, suhi enzimski pepton za bakteriološke svrhe - 10,0.
SPAS-2 medij (g/l): kalijev fosfat disupstituirana 3-voda - 2,5; natrijev klorid - 5,0; škrob - 2,5; Modificirani hidrolizat soje - 10,0; suhi enzimski pepton za bakteriološke svrhe - 10,0.
Medij SPAS-4 (g/l): natrijev klorid - 5,0, Modificirani hidrolizat soje - 10,0; ekstrakt stočnog kvasca - 1,0; hidrolizat kazeinske kiseline - 5,0.
SPAS-6 medij (g/l), disupstituirani 3-vodeni kalijev fosfat - 2,5; natrijev klorid - 5,0, casamino kiseline 5,0; nemodificirani hidrolizat soje - 10,0, škrob - 2,5.
Metode istraživanja
Izolacija i identifikacija sojeva mikroorganizama provedena je nasađivanjem na diferencijalno dijagnostičke hranjive podloge u Petrijeve zdjelice ili epruvete. Kulture su stavljene u termostat na 37 ° C tijekom 18-24 sata. Nakon brojanja usjeva, pripremljeni su razmazi, obojeni po Gramu, mikroskopirani i odabrane su kulture bakterija koje stvaraju spore [Smirnov V.V., 1983., Murray P.R., 1999. ]
Proučavanje morfologije bakterijskih kolonija.
Za proučavanje morfologije kolonija u mikrobnoj populaciji, pripremljena su 10-struka razrjeđenja izvorne kulture u 0,9% fiziološkoj otopini i posijana na MPA medij [Smirnov V.V., 1983, Murray P.R., 1999].
Studija koncentracije biomase.
Koncentracija mikrobnih stanica u tekućini kulture određena je pomoću industrijskog standardnog uzorka zamućenosti GISC nazvanog po. LA. Tarasevich za 10 jedinica.
Određivanje osjetljivosti sojeva na antibiotike
Osjetljivost sojeva na antibiotike proučavana je metodom disk difuzije, korištenjem standardnih diskova impregniranih antibioticima u mediju AGV [Birger M.O., 1982; Reshedko G.K., 2003.; MUK 4.2.1980-04, 2004.]
Proučavana su fiziološka i biokemijska svojstva pomoću sposobnosti iskorištavanja različitih ugljikohidrata: glukoze, ksiloze, manitola, saharoze, maltoze i eskulina, laktoze i salicina; stvaranjem plina tijekom razgradnje glukoze; sposobnošću rasta na podlozi u prisutnosti 7% NaCl reducira nitrate, proizvodi indol, sumporovodik, sintetizira enzime: ureazu, proteazu, amilazu i lipazu. Procijenjena je i pokretljivost sojeva.
Toksičnost, toksičnost i virulencija izoliranih sojeva određena je na bijelim miševima bez rase težine 14-16 g, u skladu s preporučenim metodama [Smirnov V.V., 1983, Murray P.R., 1999].
Adhezivna aktivnost sojeva B. sub tills određena je metodom Brilis B. pri procjeni indeksa adhezije mikroorganizama (MAI), adhezija se smatrala niskom kada je MAI bio 1,00 - 2,49, srednjom kada je IAM bio 2,5 - 3,99, visokom kada je IAM > 4,0 [Brilis V I., 1982,1990]
Antagonistička aktivnost ispitana je metodom odgođenog antagonizma u odnosu na one dobivene iz zbirke GISC-a naz. L.A.Tarasevich test - sojevi koji se koriste u procjeni pokazatelja kvalitete probiotičkih pripravaka, [Boiko N.V., 1989; Blinkova L.P. 1994].
Citotoksični test za određivanje koncentracije TNF-a Koncentracija TNF-a određena je citotoksičnim učinkom mišjeg seruma na ciljne stanice linije L929.
Fagocitna aktivnost neutrofila proučavana je u citokemijskom testu za smanjenje nitroplavog tetrazolija (NBT test) s mišjim fagocitima i korištenjem luminol-ovisne kemiluminiscencije [Zinkin V.Yu., 2004.]
Razina citokina (IL-1P, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-I2, IFN-γ) u životinjskim serumima određena je pomoću enzimskog imunoeseja (ELISA) pomoću test sustava iz Biosource » (Belgija)
Eksperimentalna disbioza modelirana je na bijelim miševima tjelesne težine 14-16 g, kod kojih je provedena dekontaminacija normalne mikroflore antibiotikom doksiciklin hidroklorid (JSC Belmedpreparaty) ili selektivna dekontaminacija uvjetno patogene parijetalne mikroflore debelog crijeva fluorokinolonskim lijekom ciprofloksacinom (Tsifrana). , Reddy's Lab., Indija).
Studije luminalne i parijetalne mikroflore provedene su analizom fekalne tvari i dijelova debelog crijeva aseptički uzetih od miševa [Zudenkov A.E., 2001; Vorobyov A.A., 2001, 2003].
Za određivanje adhezivne aktivnosti enterocita korištena je modifikacija metode "rukavice" i izračunat je prosječni indeks adhezije (AIA) [Gorskaya N.M., 1994., Brilis V.I., 1982., 1990.]
Analiza plazmidne DNA provedena je standardnim postupkom dizajniranim za pročišćavanje plazmidne DNA pomoću alkalne lize [Osterman LD, 1981; Maniatis T. i sur., 1984].
Procjena svojstava rasta hranjivih medija tijekom uzgoja provedena je pomoću automatizirane radne stanice mikrobiologa i kemoterapeuta "Mikrob-Avtomat" na temelju tabletnog fotometra "Multiskan-Ascent" (Termo-Labsystems, Finska), opremljenog termostatom. i tresilica Statističke metode
Statistička obrada rezultata provedena je prema općeprihvaćenim metodama (Ashmarin I P, Vorobyov A.A., 1962.) Rezultati su smatrani pouzdanima na p.<0,05. Достоверность различий между средними значениями (X) экспериментальных данных оценивали по критерию Стьюдента
REZULTATI ISTRAŽIVANJA U ranoj fazi rada izolirano je 15 bakterijskih kultura. Utvrđeno je da samo 3 soja nemaju hemolitičku i lecitinaznu aktivnost (faktore patogenosti), pa su odabrana za daljnje istraživanje.
Mikroskopskim pregledom razmaza utvrđeno je da su sojevi gram-pozitivni, karakterizirani paracentralnim i središnjim položajem endospora.
Pri proučavanju kultura na agar modificiranom Gause mediju br. 2, tri varijante kolonija karakteristične za
Svi sojevi imali su morfološka i fiziološko-biokemijska svojstva tipična za predstavnike bakterija, bili su pokretni, rasli su na podlozi u prisutnosti 7% NaCl, a karakterizirani su skupom različitih enzima koji razgrađuju supstrate kao što su glukoza, saharoza. , maltoza, ksiloza, eskulin, želatina, škrob, kazein, smanjeni nitrati, ne stvara sumporovodik
Poznato je da kulture B subtilis imaju izražena antagonistička svojstva prema širokom spektru patogenih i uvjetno patogenih mikroorganizama. U našem radu ovo je svojstvo procijenjeno metodom odgođenog antagonizma, korištenjem sojeva testnih kultura iz zbirke GISC-a naz. LA. Tarasevich (Tablica 1).
Tablica 1. Antagonističko djelovanje sojeva Bacillus subtilis
Zone inhibicije rasta testnih sojeva (mm) _iX±m)___
Proučavani sojevi B.subtilis o g- yi g-fi f) C ^ aureus FDA 209R S aureus 29213 f, sch Tf GCh £ a o a 0 in s s 1 S I X. aureus "Filliov" a gch 1 G "s<3 о чО "о ГЧ Г4 О С (N 00 оо гц Гч| M1 "nJ
gospodin O<Л _ VI m IT) (N о п ГЧ гч +1 fl
br. 1719 N + g- G4 ž, +1 ž! +i u O VI O f o oo _ o o O № 1594 <Ч| CJ +1 +1 «-I С сч; п! O O O O o 00 stopa 00 o br. 1318 Ni g", +1" +1 o! s> !Nj eč fl +1 O fj +1 fi + m + i + o + G> f + o GČ + O CN GČ* +1 O + Gč GČ f. +1 (N Dobiveni podaci pokazuju da se razina antagonističke aktivnosti sojeva razlikuje ovisno o korištenom test soju. Sva tri soja imala su izraženu antagonističku aktivnost prema dvije vrste Shigella (Sflexncri 337 i s.sonnei 170), S.aureus FDA 209P, S. aureus "Nikiforov", P.mirabilis 24a, P.vulgans 177, C.albicans 690, E.coli 1882, P.aeruginosa 9022 i E.coh 212 (O157:H7), s najvišim stopama otkrivenim u soju B.subtilis 1719, koji je također pokazao antagonizam prema S.aureus 29213, S.aureus 25423. Posebno treba istaknuti da su proučavani sojevi pokazali dosta izražen antagonizam prema enteropatogenom soju E. coli 212 (0157:H7), koji je sposoban sintetizirati toksin sličan Shigi (citovertoksin), a maksimalnu aktivnost imao je soj B. subtilis br. (30 + 2,0) mm. 1719. Tri izvorna soja B subtilis proučavana su zbog njihove sposobnosti prianjanja, što je jedno od najvažnijih svojstava probiotičkih kultura (Tablica 2). Tablica 2. Adhezivna aktivnost sojeva Bacillus subtilis. Proučavani sojevi Adhezivna aktivnost Indeks adhezije mikroorganizama (MAI) (X±w) Razina adhezije B. subtilis 1719 1,53+0,08 Nisko B. subtilis 1594 2,84±0,47 Prosj B. subtilis 1318 3,08±0,33 Prosj Utvrđeno je da soj B.subtilis 1719 ima nisku, a sojevi B.subtilis 1594 i 1318 prosječnu adhezivnu aktivnost. Otpornost soja na antibiotike, kandidata za probiotičke lijekove, također je važno svojstvo koje određuje mogućnost njegove primjene u kombinaciji s antibakterijskim lijekovima. S tim u vezi, provedena je studija rezistencije sojeva B. subtilis na antibiotike na 14 antibiotika koji se najčešće koriste u klinici. Soj B.subtilis 1719 bio je rezistentan na gentamicin, polimiksin i eritromicin, dok su sojevi B.subtilis 1594 i B.subtilis 1318 bili rezistentni samo na gentamicin. Bilo je zanimljivo saznati je li rezistencija na antibiotike povezana s kromosomskom lokalizacijom genetske determinante ovog svojstva ili s prisutnošću plazma id. Analiza nositelja plazmida sojevima B. subtilis mogla bi pružiti informacije o prirodi rezistencije na antibiotike. U 0,9% agaroznom gelu, nakon elektroforeze, identificirana je frakcija koja odgovara veličini plazmidne DNA u određenom broju analiziranih uzoraka DNA (staze 2, 4 i 6) (slika 1). Međutim, uzorak distribucije ovih marki u agaroznom gelu razlikovat će se od onog kontrolne plazmidne DNA. Kako bi se konačno utvrdilo je li nastala DNA plazmid ili je riječ o kromosomskim fragmentima, izolirani materijal je tretiran sitno rezanim endonukleazama drugog tipa (restrikcijski enzim Pst I). Prilikom analize restrikcijskih produkata u agaroznom gelu (slika 1), izolirana je niskomolekularna frakcija DNA ekstrahiran iz proučavanih sojeva, raspao se bez stvaranja jasnih fragmenata, što je ukazivalo na odsutnost molekula plazmidne DNA u uzorcima Riža. 1. Podaci elektroforeze DNA pripravaka izoliranih iz sojeva Objašnjenje oznake Očigledno, identificirana otpornost na antibiotike odnosi se na prirodnu otpornost i vjerojatno je kontrolirana genima lokaliziranim na kromosomu U pokusima in vivo pokazalo se da je soj B subtilis 1719 netoksičan, netoksogen i avirulentan. Primjena antibiotika doksiciklin hidroklorida u dozi od 5 mg miševima (težine 14-16 g) omogućila je stvaranje modela disbioze u kojoj su crijeva životinja kontaminirana uvjetno patogenom i patogenom mikroflorom. Uvođenje kulture B subtilis 1719 u dozi od 0,5x10% 1,0x109 m/miš tijekom 7 dana pridonijelo je normalizaciji sastava i broja luminalnih i №1 №2 №3 №4 №5 №6 №7 №8 №9 № 10 №11 marker procesa nativna DNA soja B sullish 1719 cijepana DNA soja B sullish 1719 nativna DNA soja B sullish 1594 split DNA soja B sullish 1594 nativna DNA soja B sullish 1318 split DNA soja B sullish (8 1318 nativna DNA soja B 8 NHL 534 split DNA soj B 8db 534 nativni plazmid split plazmid pPETpB^et noćne mikroflore, kao i eliminaciju oportunističkih mikroorganizama (Tablica 3). Tablica 3. Mikroflora u miševa s eksperimentalnom disbiozom i nakon korekcije kulturom B. mutilum (Bs) 1719 u različitim dozama D Indikator Ig broj CFU/ml kod miševa (1g fecesa LII 11 1 cm crijeva) (X±t) Kontrola (intaktna) Nakon primjene Nakon tretmana s dozom Bs (stanice mikroba) doksiciklin 0,5x10" 1,0x109 Mikroorganizmi i a Parijetalni sloj crijeva i a o i Parijetalni sloj crijeva h i "X Parijetalni sloj crijeva I * s s = S c 5 H e e e & S « ! s g a 3 C E. coli: 7+0,42 7+0,7 7,3+0,64 6,5+1,4 710,7 6,5+0,48 811,4 5+0,43 1ac\ % 94 100 64 84 100 100 100 mj. lak, % b 0 36 16 * 0 0 0 0 hemoliza 0 0 0 0 0 0 0 0 1 R. vulgaris 0 0 710,26* 0 0 0 * 0 0 P. mirabilis * (1 0 6±0,42* 4,3Í,7* 0* * 0 0 0 S. freundii 610,42* 0 0 0 0 0 0 0 Enterococcus spp. 7±<).21 7+0.64 6±0,59 5.5Ю.84 7±0,42 5.5+0.84 710.48 510.47 S. epidermidis o 0 0 0 0 0 0 0 S. aureus 5±0,21 0 4±1,2* 4+0,21* * 0 0 * 0 "II Staphylococcus spp. 4+0,43* * 0 0 410,48* 0 0 0 « Candida spp. 6i0,64 0 4,5±0,21 6+0,92* * 0 * 0 1 0* 0 Lactobacillus spp. ¡9.510,42 7.610,43 1 5.510,4* 1 4+0,23* 910,44 7+0,34 1 910,21 7,5+0,84 1 Bifidobacterium spp. 2±0,1 2±0,1 1 2+0,1 2+0,1 1 2+0,1 2+0,1 2Yu.1 I 210,1 Clostridium spp. 5±0,22 3,1±0,21 1 510,21 4,5+0,24 1 5+0,59 1 4.510,73 1 5M.21 1 4,65+0,24 Napomena: *str<0,05 Slični rezultati dobiveni su i tijekom selektivne dekontaminacije uvjetno patogene parijetalne mikroflore debelog crijeva autbrednih miševa fluorokinolonskim lijekom ciprofloksacinom koji čuva broj bifidobakterija i laktobacila. Kultura B. subnhs 1719, primijenjen u sličnim dozama, dovelo je do značajnog) smanjenja broja stafilokoka (8,3 puta) u usporedbi s kontrolnom skupinom životinja koje nisu primale probiotičku kulturu.Primjena Citrana životinjama dovela je do oštre promjene u omjeru stafilokoki: bakterije, a uvođenje kulture \ 1719 promijenilo je taj omjer na razinu intaktnih miševa U sljedećoj fazi proučavali smo učinak kulture B ublin 1719 na adhezivnu sposobnost crijevnih epitekalnih stanica (enterocita) tijekom eksperimentalne disbioze izazvane primjenom antibiotika doksiciklin hidroklorida. Označavanje skupina miševa: Skupine miševa O Clean in na početku pokusa O Doksiciklin Š Doksiciklin bez izjednačavanja B Doksiciklin + B cYi 0,5 0 Doksiciklin h-BvcYi 1,0 □ Čisti + VbYk 0,5 ■ Očistite + V. eiYiL 0,5X109mk V diYiSi 1,0 x ] O"m k Riža. Slika 2. Prosječni indeks adhezije (AIA) test soja 8.xy1oek 25 na enterocite u modelu eksperimentalne disbioze i kada je korigiran kulturom B. subtilis 1719. Kada je disbioza korigirana kulturom B 8uNSh 1719 u različitim dozama, uočeno je smanjenje sposobnosti adhezije enterocita (slika 2). U nizu eksperimenata za proučavanje utjecaja soja B. 1719 sposobnost tih bacila da pouzdano promijeniti metaboličku aktivnost neutrofita prema NBT testu (Slika 3) Skupine životinja Riža. 3. Učinak kulture B SllbtlllS 1719 na aktivnost neutrofila (NST test) u eksperimentalnoj disbiozi Metodom luminol-ovisne kemiluminiscencije dobiveni su slični rezultati o funkcionalnoj aktivnosti neutrofila. Najveće povećanje njegove razine dogodilo se u razdoblju maksimalne manifestacije disbioze izazvane primjenom doksiciklina. Pod utjecajem K)LT)ra u subili 1719. dolazi do smanjenja proizvodnje IFNF-a Uvođenje kulture intaktnim životinjama nije utjecalo na razinu proizvodnje Doksiciklin Skupine miševa Riža. 4. Proučavanje utjecaja kulture B. nukleinske kiseline 1719 na razinu proizvodnje faktora nekroze tumora a (TNF-a) tijekom eksperimentalne disbioze Određivanje nakupljanja citokina (1L-1P, 1L-2, 1L-4, 1L-6, [L-10, 1H2, 1PL-y) dinamika krvnog seruma miševa nakon jedne injekcije kulture B^tsynHu 1719 otkrila je sljedeće uzorke. U prvih 12 sati nakon unošenja bakterijske kulture nije bilo promjena u razini citokina, osim Ib-1(5), dok se sadržaj ostalih ispitivanih citokina u odnosu na intaktne životinje značajno povećao tek nakon 24 sata. : I-1P (13,7 puta) i I-4 (14,6 puta), 1b-2 (5,2 puta), 1b-6 (7 puta), 1N0 (1,5 puta), 1N2 (5,2 puta), 1RI-y (9,7 puta). U proizvodnji probiotičkih pripravaka važan tehnološki pokazatelj je prinos biomase tijekom uzgoja mikroorganizama. Ovaj pokazatelj izravno ovisi o svojstvima rasta korištenih hranjivih medija. Nas Proučavane su glavne karakteristike procesa uzgoja Bisquid 1719 na sedam hranjivih podloga različitog sastava. Dobiveni podaci prikazani su u tablici 4. Podloga br. 5, SPAS-6 i krumpir-glicerinska podloga osigurali su rast soja s indeksom optičke gustoće (OP), jednako 0,24±0,01 (u=0,03 h"1), 0,22+0,01 (iKKOZZch1) odnosno 0,3+0,01 (u=0,025 h"1). Na medijima SPAS-2, SPAS-4, br. 9 maksimalna vrijednost OP bila je 0,42+0,03 (u=0,067 h"1), 0,38+0,02 (u=0,05h"") i 0,58+0,03 (u =0,037 h"1), odnosno na mediju VK-2 - 0,85±0,6 (u=0,068 h""). Vrijeme je da stignete maksimalna koncentracija biomase na tim medijima varirala je od 9±0,7 sati (SPAS-2) do 18±1,3 sata (KGG). Tablica 4. Akumulacija biomase sojeva B. nibiHn 1719 na podlogama različitog sastava tijekom uzgoja tijekom 20 sati (X±t) Medij Prosječno vrijeme ^-faze (h) Trajanje eksponencijalne faze (h) Vrijeme postizanja koncentracije biomase (h) Maksimalni prinos biomase (optička gustoća) Stopa rasta (i) br. 5 2 8+0,67 13±1,05 0,24+0,01 0,03 br.9 2 11 ±0,8 13+0,99 0,5810,03 0,037 KGG 2 2±0,12 18+1,3 0,3+0,01 0,025 SPAS-2 2 4+0,36 9±0,7 0,42+0,03 0,067 SPAS-4 2 4±0,34 11+1,1 0,38±0,02 0,05 SPAS-6 1,5 3+0,23 18+1,6 0,22±0,01 0,033 VK-2 1,5 8±0,72 14±1,0 0,85+0,6 0,068 Maksimalni prinos biomase (BY) utvrđen je na podlozi VK-2 pri brzini rasta, a najmanji na podlozi SPAS-6 pri brzini rasta Poznato je da se kao izvor ugljikohidrata u podlogama za uzgoj najčešće koriste glukoza, maltoza, saharoza i laktoza. U našim pokusima dobiven je visok prinos biomase na mediju VK-2 s dodatkom glukoze ili saharoze, OD pokazatelji su odgovarali Pri korištenju maltoze najveći OP zabilježen je na medij br. 9 0,695 ± 0,025 (u = 0,058 h"), međutim pokazalo se da je niži od vrijednosti dobivenih na mediju VK-2 uz uključivanje laktoze, saharoze i glukoze kao izvora ugljikohidrata. Utvrđeno je da sastav hranjivih podloga nije utjecao na antagonistička svojstva soja. U sljedećoj fazi procijenjeni su uvjeti stabilizacije vitalnosti i antagonističkih svojstava soja B. lumbago 1719 pri pohranjivanju u liofiliziranom i tekućem stanju na temperaturi od 5±3 °C (Tablica 5). U liofiliziranom stanju sa saharozno-žutim stabilizatorom, kultura Lybly 1719 zadržala je svoju održivost i antagonistička svojstva najmanje 4 godine (razdoblje promatranja). U tablici Na slici 5 također su prikazani rezultati proučavanja svojstava usjeva čuvanih 3 godine u tekućem stanju uz dodatak raznih stabilizatora. Tablica 5. Preživljavanje stanica soja B. mlinth 1719 pohranjenih u prisutnosti različitih stabilizatora Iz podataka u tablici 5 proizlazi da je optimalni tekući stabilizator 7% otopina NaCl, koja vam omogućuje da 2 godine održite održivost soja 1719. Da biste sačuvali svojstva kulture 1 godinu, također je moguće koristite destiliranu vodu i 10% otopinu glicerola Prilikom skladištenja u prisutnosti različitih stabilizatora, nije bilo statistički značajnih promjena u antagonističkim svojstvima soja B subtihs 1719 Usporedna analiza soja 1719 na antagonist i adheziv svojstva s komercijalnim probiotičkim pripravcima Sporobak- terin, Rusija (B subtihs 534), Cereobiogen, Kina (B cereus DM423), Subtil, Vijetnam (Biemis var vietnamí), Baktisubtil, Francuska (B cereus IP5832), Nutrolin, Indija (B toagulans) (Tablica 6), dopušteno dobiti sljedeće rezultate Najveća razina antagonističke aktivnosti B subi/lis 1719 očitovana je prema sojevima S flex neri 337 (30±3,0), S aureus “Nikiforov” (30+2,5), P uilgam 177 (30±2,0) P aeruginosa 9022 (27 ±1,5) i E coli 212 (0157 H7) (30±1,5) Nešto slabiji antagonizam otkriven je kod ovog soja s test kulturama Ecoh 1882 (26±1,2), Saw eus 25423 (21±1,5), S sonet 170 (20±1,5). 2,0), 5 aureusa "Phillipov" (20±1,5), Manje značajno usporavanje rasta otkriveno je za testne kulture Saurem FDA 209P (15±1,5), S aureus 29213 (15±3,0), P mirabilis 24a (12±1,2) Među proučavanim probiotičkim kulturama najbliži, ali inferioran soju 1719 po antagonističkoj aktivnosti bio je soj 534 "Indijski*" soj B koagulant pokazao se kao slab antagonist, inferioran u tom pogledu svim sojevima korištenim u eksperimentu Usporedba adhezivnih svojstava pokazala je da, općenito, sojevi komercijalnih pripravaka imaju prosječnu razinu prianjanja, dok se IAM kreće od 3,08 do 3,8, osim za "indijski" soj (IAM = 5,36 ± 0,56 za soj B subtllis 1719 ovaj Pokazatelj se pokazao najnižim (IAM = 1,53 ± 0,08) Tablica 6. Usporedne karakteristike antagonističkog djelovanja soja B. mlinth 1719 i kultura komercijalnih probiotičkih pripravaka u pokusu Zone inhibicije rasta testnih sojeva (mm) (X+t) Proučavani sojevi Bacillus o G-- vi Pi s, 3 s n yi s. o sch< с bu S ГЛ (Ч О сч 5 Vi S.aureus 25423 Л", aureus «Никифоров» S 0 5 <=; s 1 ÍÜ 5 1". пи rabil is 24а 0 г-- ¡с 1 о W4 о 3 о сч (Ч о ^ 5 § ^ сч ОС оо "с го ^ г» ■П" о сч Ñ V. subtihs br. 1719 G-(cm "+1 N o s +1 o GL ž +i t (Č +i n 1P (N +1 o f, u +i S SČ SČ +¡ tako u + Pó o, sch " +1 u sč u +i G-- (N +Í vo p o Sč" + o s. B.subtihs 534 Sporobacterin (Rusija) (-; SCh +1 CS o +1 o SCh O GL +1 O g +1 g o. +1 00 +i SCh (Ch B. cereus DM423 Cereobiogen (Kina) SP +i h- (N o o<4 О +1 о СЧ +1 <4 in +1 О о (Чг +1 о о о о о с +1 B. cereus var. vietnamí Subtil (Vijetnam) 1P + O o<4 + СЧ О о + (N о" +1 СЧ О, +i О о о + CI + о о О о о V. cereus IP 5832 Baktisubtil (Francuska) Š oo + in o O g- + o +1 (N in +i in o CN + g"- ■h- + t o + g" o o o o + g ■p +¡ o B. coagulans Nutrolin (Indija) s o O o + SCH "Í. O +1 p SCh o" -H (N O + o o o o o o Dakle, soj B. bubik 1719, koji smo izolirali, imao je kvalitativne prednosti u odnosu na druge testirane kulture komercijalnih pripravaka u pogledu proučavanih svojstava, što nam omogućuje da ga smatramo perspektivnim za upotrebu u razvoju novog probiotičkog pripravka. 1. Na temelju morfoloških i fiziološko-biokemijskih svojstava izolirani sojevi identificirani su kao B Raulym. U preparatima DNA sojeva B.mth/bx nisu pronađeni plazmidi, što očito ukazuje na kromosomsku kontrolu rezistencije na antibiotike. 2. Na modelu disbioze u bijelih miševa prikazana je probiotička aktivnost soja B. thylish 1719 koja se očituje u eliminaciji oportunističkih i patogenih mikroorganizama uz obnovu kvalitativnog i kvantitativnog sastava normalne mikroflore. 3. Optimalan medij za nakupljanje biomase tijekom uzgoja soja 1719 je BK-2 medij s dodatkom glukoze ili saharoze kao izvora ugljikohidrata. 4. Utvrđeno je da soj B. lialisia 1719 zadržava vitalnost i antagonističku aktivnost u liofiliziranom stanju sa saharozno-želatinskim stabilizatorom najmanje 4 godine (razdoblje promatranja), u tekućem obliku stabiliziranom 7% otopinom br. 01. - 2 godine i 1 godinu u prisustvu destilirane vode ili 10% otopine glicerina. 5. Antagonistički aktivan, nisko adhezivan, bez plazmida, netoksičan soj B. naylisha 1719, koji ima probiotičko i imunomodulatorno djelovanje, pohranjen je u Državnoj zbirci kultura GISC naz. LA. Tarasevich. 6. Soj V.zyysh 1719 (277) je zbog svojih bioloških svojstava i osnovnih tehnoloških karakteristika perspektivan za korištenje u razvoju novih probiotičkih pripravaka. 1 Gataullin A G, Gaiderov A A Mikhailova N A, Osipova I G, Romanen-ko E E Biološka svojstva sojeva BaaNi subtills različitog podrijetla Co “Aktualna pitanja razvoja cjepiva-seruma u 21. stoljeću” Perm 2003., str. 329-331. 2 Gataullin A G, Mikhaitova N A, Btinkova L P, Elkina S I, Gorobets OB, Gaiderov A A, Kalina NG Studija parijetalne mikroflore intestinalnog trakta miševa pomoću diferencijalne dijagnostičke podloge Zbirka "Razvoj i standardizacija mikrobioloških hranjivih podloga i testnih sustava" Makhachkala , 2003. str. 48 3 Gataullin A G, Btinkova L P, Mikhaitova N A, Elkina S I, Gaiderov A A, Kalina N G, Gorobets O B Promjene u sastavu parijetalne mikroflore tijekom eksperimentalne disbioze kao pokazatelj učinka terapeutskih lijekova na makroorganizam Anapi Mechniivsky Institute Kharyv, 2003. , br. 4-5, str. 123-124 4 Mikhailova N A, Blinkova L P, Elkina S I, Gataullin A G, Gorobets O B, Gaiderov A A, Kalina N G Disbioza kao sastavni pokazatelj nuspojava lijekova Poruka 1 Zbirka izvješća “Funkcionalna prehrana, sigurnost hrane i zdravlje ljudi u uvjetima metropole " M, 2003, str. 38-39 5 Mikhailova N A, Blinkova L P, Elkina S I, Gataullin A G, Gorobets O B, Gaiderov A A, Kalina N G Disbioza kao integralni pokazatelj nuspojava lijekova Poruka 2 Materijali II Moskovskog međunarodnog kongresa “Status biotehnologije i perspektive razvoja” Moskva, 2003., str. 162 6 Gataullin AG, Blinkova LP, Mikhailova NA, Elkina SI, Gaiderov A A, Kalina N G, Gorobets O B Promjena u sastavu parijetalne mikroflore kao pokazatelj učinkovitosti upotrebe lijekova u eksperimentalnoj disbiozi Analy Mechniyvsky Institute Kharyv, 2004. , broj 6, str 10-13 7 Gaiderov A A, Gataullin A G, Vasilyeva E A, Mikhailova N A, Osipova I G Studija učinka probiotičkih pripravaka na makrofagnu vezu nespecifičnog imuniteta Zbirka materijala međunarodne konferencije "Probiogici, prebiotici, sinbiotici i funkcionalna hrana. Trenutno stanje i perspektive ” M, 2004., str. 21-22 8 Blinkova L P, Mikhailova N A, Elkina S I, Gataullin A G, Kalina N G, Tokarskaya M M Utjecaj “Milife” i njegovih kombinacija sa spornim probiotikom na otpornost bijelih miševa tijekom eksperimentalnih infekcija Zbirka materijala međunarodne konferencije “Probiotici, Prebiotici” , sinbiotici i funkcionalna hrana Trenutno stanje i perspektive” M, 2004., str. 4041. 9 Blinkova L P, Mikhailova N A, Shmygaleva T P, Gataullin A G, Novikov V Yu, Shmygalev P A Adhezivna svojstva stanica i spora In subtilis Zbirka materijala Međunarodne konferencije “Probiotici, prebiotici, sinbiotici i funkcionalna hrana Trenutno stanje i perspektive " M, 2004., str. 41-42 10 Mikhailova N A, Godkov M A, Gataullin A G, Zinkin Yu V, Vetoshkin A I, Kharitonova A V, Gaiderov A A Imunomodulacijski utjecaj kulture B subtilis Zbirka materijala Međunarodne konferencije “Probiotici, prebiotici, sinbiotici i funkcionalna hrana Moderno stanje i izgledi” M , 2004., str. 204-205 11 Gataullin A G, Mikhailova N A, Blinkova L P, Romanenko E E, Elkina S I, Gaiderov A A, Kalina N G Svojstva izoliranih sojeva Bacillus subtilis i njihov učinak na crijevnu mikrofloru pokusnih životinja Zh mikrobiol, 2004, br. 2, od 91-94. 12 Gataullin AG, Zinkin YuV, Vetoshkin AI, Godkov MA, Gaiderov A A, Kharitonova A V Studija učinka lijeka B subtilis kod disbioze pomoću kemiluminiscentne analize Zbirka materijala međunarodne konferencije “8. međunarodna Putinova škola-konferencija mladih znanstvenika” Puščino, 2004, s 256 13 Blinkova L P, Mikhailova N A, Gorobets O B, Elkina S I, Gataullin A G Kalina N G, Gaiderov A A Eksperimentalna studija učinka biološki aktivnih lijekova na C albicans Advances in medical mycology, 2004, svezak III, str. 48-49 14 Gataullin A G, Mikhailova N A, Khvatov V B, Blinkova L P, Zinkin Yu V, Kharitonova A V Primjena kemiluminiscentne analize za procjenu anti- bakterijsko i antifungalno djelovanje lijeka B subtil je. Advances in medical mycology, 2004, svezak III. str.50-51. 15. Mikhailova N., Blinkova L. P.. Gataullin A.G. Proučavanje parametara uzgoja probiotičkih sojeva Bacillus subtihs na različitim hranjivim podlogama. Materijali III Moskovskog međunarodnog kongresa "Biotehnologija: stanje i perspektive razvoja". Moskva, 2005., str. 124. 16. Gataullin A.G., Blinkova L.P., Mikhailova N.A. Akumulacija biomase probiotičkih sojeva B. subtihs u hranjivim podlogama različitog sastava. sub. materijali Sveruske znanstvene konferencije s međunarodnim sudjelovanjem: “Medicinski imunobiološki pripravci u 21. stoljeću: razvoj, proizvodnja i primjena” Ufa. 2005., dio 1.e. 134-136 (prikaz, ostalo). Objavljeno 19. svibnja 2005. Volumen ispisa 1 p.l. Narudžba broj 615. Tiraž 100 primjeraka. Tisak: Sprint-Print LLC, Moskva, ul. Krasnobogatirskaja, 92 tel.: 963-41-11, 964-31-39 -»« g.i» j» "-" Ž J PREGLED LITERATURE Poglavlje 1. Mikrobni antagonizam - osnova za stvaranje bioterapijskih lijekova za korekciju disbiotičkih stanja Poglavlje 2. Spore probiotici i njihovi učinci na makroorganizam 2.1. Pripravci iz bakterija roda Bacillus 2.2. Suvremene ideje o mehanizmima terapijskog i profilaktičkog djelovanja probiotika iz bakterija roda Bacillus 2.3. Biološki aktivne tvari koje proizvode aerobne bakterije koje stvaraju spore 2.4. Patogeni čimbenici bakterija roda Bacillus 34 VLASTITA ISTRAŽIVANJA Poglavlje 3. Objekti i metode istraživanja 3.1. Objekti istraživanja 3.2. Metode istraživanja 43 3.2.1. Oprema i tehnika Poglavlje 4. Karakteristike izoliranih sojeva 4.1. Proučavanje morfoloških i fiziološko-biokemijskih svojstava sojeva 4.2. Antagonističko i adhezivno djelovanje sojeva B.subtilis u in vitro pokusima 4.3. Određivanje rezistencije na antibiotike i plazmidskog profila sojeva B.subtilis Poglavlje 5. Učinak soja B.subtilis 1719 na makroorganizam 5.1. Ispitivanje toksičnosti, toksigenosti, virulencije i probiotičke aktivnosti soja B.subtilis 1719 u pokusima in vivo 5.2. Proučavanje utjecaja soja B. subtilis 1719 na parametre imuniteta u in vivo pokusima s eksperimentalnom disbiozom Poglavlje 6. Tehnološke karakteristike soja B.subtilis 1719 kao osnove probiotičkog pripravka 6.1. Procjena svojstava rasta na različitim tekućim hranjivim podlogama 6.2. Ispitivanje održivosti i antagonističkog djelovanja soja B.subtilis 1719 tijekom skladištenja Poglavlje 7. Usporedne karakteristike svojstava soja B.subtilis\l\9 i sojeva koji čine osnovu nekih komercijalnih probiotičkih pripravaka. ZAKLJUČAK Relevantnost problema U sadašnjoj fazi medicinske mikrobiologije pojavili su se novi podaci koji potkrepljuju korištenje saprofitne mikroflore, koja je sposobna tijekom svojih životnih procesa proizvoditi biološki aktivne tvari (BAS) koje suzbijaju rast patogenih mikroorganizama, malignih tumora i normaliziraju različite patološke i biokemijski procesi u ljudskom tijelu. U posljednjem desetljeću biološki pripravci koji se temelje na živim mikrobnim kulturama bakterija koje stvaraju spore naširoko se koriste za prevenciju i liječenje bolesti probavnog trakta. Bakterije roda Bacillus, jedne od najraznovrsnijih i najraširenijih skupina mikroorganizama, važne su komponente egzogene flore ljudi i životinja. Rod Bacillus privlači pažnju istraživača od davnina. Skupljena znanja iz područja mikrobiologije, fiziologije, biokemije i bakterijske genetike ukazuju na prednosti Bacillusa kao proizvođača biološki aktivnih tvari: enzima, antibiotika, insekticida. Visoka prilagodljivost različitim životnim uvjetima (prisutnost ili odsutnost kisika, rast i razvoj u širokom rasponu temperatura, korištenje raznih organskih i anorganskih spojeva kao izvora hrane i dr.) pridonose širenju bacila u tlu, vodi, zraku, prehrambenim proizvodima i drugim predmetima vanjskog okoliša, kao iu tijelu ljudi i životinja. Raznolikost metaboličkih procesa, genetska i biokemijska varijabilnost, otpornost na litičke i probavne enzime poslužili su kao razlog za korištenje bacila u različitim područjima medicine. Američka Agencija za hranu i lijekove dodijelila je Bacillus subtilis status GRAS (generally considered as safe) – potpuno sigurnih organizama, što je preduvjet za korištenje ovih bakterija u proizvodnji lijekova. Djelovanje bacila očituje se protiv širokog spektra patogenih i uvjetno patogenih mikroorganizama. Zahvaljujući sintezi raznih enzima i drugih tvari, reguliraju i potiču probavu, te djeluju antialergijski i antitoksično. Primjenom bacila značajno se povećava nespecifična otpornost makroorganizama. Ovi mikroorganizmi su jednostavni za proizvodnju, stabilni su i, što je najvažnije, ekološki prihvatljivi. Terapijski i profilaktički lijekovi koji se temelje na živim nepatogenim mikroorganizmima, koji prirodnim načinom primjene mogu povoljno djelovati na fiziološke i biokemijske funkcije tijela domaćina kroz optimizaciju njegovog mikrobiološkog statusa, trenutno se klasificiraju kao probiotici. Od bacila, sojevi B. subtilis su od najvećeg interesa. Po poznavanju genetskih i fizioloških svojstava zauzimaju drugo mjesto iza E. coli. O velikom potencijalu B. subtilis u biotehnologiji svjedoči i stvaranje banke podataka o molekularnoj genetici ovog soja - SubtiList, u koju se unose svi podaci o genomu bakterije. Na temelju živih bakterija iz roda Bacillus stvoreni su probiotički pripravci koji su neškodljivi za makroorganizam, imaju širok raspon terapijskih i profilaktičkih učinaka te su ekološki sigurni. Rezultati o korištenju živih mikrobnih kultura roda Bacillus za liječenje gastrointestinalnih bolesti ljudi i domaćih životinja od velikog su znanstvenog i praktičnog značaja. Trenutno se u praktičnoj zdravstvenoj zaštiti široko koriste poznati probiotici: baktisubtil, sporobakterin, biosporin, baktisporin, subalin, cereobiogen, enterogermin i drugi. Indikacije za terapijsku primjenu i terapijska učinkovitost ovih lijekova ograničeni su svojstvima sojeva korištenih za njihovu proizvodnju. Spektar antagonističkog djelovanja protiv patogenih i oportunističkih mikroorganizama koji uzrokuju mikroekološke poremećaje u različitim biotopima ljudskog ili životinjskog organizma od odlučujuće je važnosti. Osim toga, ne može se zanemariti sposobnost bacila da proizvode biološki aktivne tvari (polipeptidne antibiotike, enzime itd.) i njihovu otpornost na antibiotike. Raznolikost i nova otpornost mikroorganizama na antibiotike koji su uključeni u razvoj disbiotičkih poremećaja, s jedne strane, kao i varijabilnost biosintetskih sposobnosti različitih sojeva B. subtilis, s druge strane, čine preporučljivim stalno praćenje sojeva koji su ciljano probiotičko djelovanje i/ili su proizvođači različitih biološki aktivnih tvari. Cilj rada: Proučiti biološka svojstva izoliranih sojeva B. subtilis i procijeniti mogućnost njihove uporabe za razvoj originalnog probiotika za spore. Ciljevi istraživanja: 1. Proučiti morfološka, fiziološko-biokemijska, antagonistička, adhezivna i druga svojstva izoliranih kultura B.subtilis u in vitro pokusima i odabrati najperspektivniji soj za daljnja istraživanja. 2. Ocijenite probiotičku aktivnost odabranog soja B.subtilis u pokusima in vivo. 3. Odaberite hranjivu podlogu koja je optimalna za akumulaciju biomase proučavanog soja B.subtilis. 4. Odredite vitalnost i antagonističku aktivnost odabranog soja B.subtilis tijekom skladištenja. 5. Usporedite svojstva izvornog soja B. subtilis i kultura korištenih za proizvodnju komercijalnih probiotičkih pripravaka. Znanstvena novost. Na temelju proučavanja morfoloških, fiziološko-biokemijskih, genetskih i drugih bioloških svojstava izoliranih sojeva odabran je soj bez plazmida B. subtilis 1719, koji pokazuje antagonizam prema oportunističkim i patogenim mikroorganizmima različitih taksonomskih skupina, ima nisku adhezivnost. aktivnost, otporan je na gentamicin, polimiksin i eritromicin. Eksperimentalno su potkrijepljeni pristupi stvaranju proizvodne tehnologije, uključujući proučavanje svojstava rasta soja B. subtilis 1719 na izvornim hranjivim medijima, uvjeta za stabilizaciju njegove održivosti i antagonističkog djelovanja kao faza u dobivanju novog probiotičkog lijeka. Podnesena je prijava izuma (br. 2005111301 od 19. travnja 2005.): “Bakterijski soj Bacillus subtilis 1719 je proizvođač antagonistički aktivne biomase protiv patogenih mikroorganizama, te proteolitičkih, amilolitičkih i lipolitičkih enzima.” Praktični značaj. Izolirani i identificirani soj B.subtilis 1719 pohranjen je u Državnoj zbirci kultura GISC naz. J.I.A. Tarasevicha pod brojem 277 i može se preporučiti za razvoj industrijske tehnologije za proizvodnju originalnog bioterapijskog probiotika. Glavne odredbe podnesene na obranu: 1. Identificirana tri soja bakterijskih kultura odgovaraju vrsti B. subtilis po morfološkim, fiziološkim, biokemijskim i drugim svojstvima. Ne sadrže plazmide, antagonistički su aktivni protiv oportunističkih i patogenih bakterija različitih taksonomskih skupina te imaju nisku ili srednju razinu adhezije. 2. Soj B.subtilis 1719 ima probiotička svojstva, koja se očituju u eliminaciji oportunističkih i patogenih mikroorganizama uz obnovu kvantitativnog i kvalitativnog sastava normalne mikroflore u eksperimentalnoj disbiozi, a ima i imunomodulatorni učinak na makroorganizam. 3. Na temelju svojih tehnoloških karakteristika soj B.subtilis 1719 može se preporučiti kao kandidat za stvaranje originalnog probiotika. PREGLED LITERATURE 1. Na temelju morfoloških i fiziološko-biokemijskih svojstava izolirani sojevi identificirani su kao B.subtilis. U preparatima DNA sojeva B. subtilis nisu pronađeni plazmidi, što očito ukazuje na kromosomsku kontrolu rezistencije na antibiotike. 2. Na modelu disbioze u bijelih miševa prikazana je probiotička aktivnost soja B.subtilis 1719 koja se očituje u eliminaciji oportunističkih i patogenih mikroorganizama uz obnovu kvalitativnog i kvantitativnog sastava normalne mikroflore. 3. Optimalna podloga za nakupljanje biomase pri uzgoju soja B. subtilis 1719 je podloga VK-2 s dodatkom glukoze ili saharoze kao izvora ugljikohidrata. 4. Utvrđeno je da soj B.subtilis 1719 zadržava vitalnost i antagonističko djelovanje u liofiliziranom stanju sa saharoza-želatinskim stabilizatorom najmanje 4 godine (razdoblje promatranja), u tekućem obliku stabiliziranom 7% otopinom NaCl - 2. godine, a 1 godinu u prisutnosti destilirane vode ili 10% otopine glicerina. 5. Antagonistički aktivan, nisko adhezivan, bez plazmida, netoksičan soj B.subtilis 1719, koji ima probiotičko i imunomodulatorno djelovanje, pohranjen je u Državnoj zbirci kultura GISC naz. J1.A. Tarasevich. 6. Soj B.subtilis 1719 (277) na temelju svojih bioloških svojstava i osnovnih tehnoloških karakteristika perspektivan je za primjenu u razvoju novih probiotičkih pripravaka. ZAKLJUČAK Otkrića i dostignuća suvremene biološke i medicinske znanosti omogućila su razvoj i primjenu novih bioloških proizvoda – probiotika. Ovi lijekovi se temelje na živim mikrobnim kulturama. Terapeutski učinak ovih lijekova temelji se na izraženom mikrobnom antagonizmu protiv patogenih i uvjetno patogenih sojeva - patogena. U procesu liječenja nije manje važno imunomodulatorno djelovanje probiotika. Neosporne prednosti lijekova proizvedenih od živih bakterija u odnosu na lijekove sintetizirane kemijskim putem su njihova neškodljivost, njihova fiziološka svojstva za ljudski organizam i odsutnost alergijskih reakcija. Probiotici su već zauzeli vodeća mjesta u korekciji gastrointestinalne mikroflore, metaboličkih poremećaja, te liječenju posljedica antibakterijske, kemoterapije, hormonske i zračne terapije. Istraživanje fenomena bakterijske translokacije pokazalo je da probiotici mogu uspješno zamijeniti antibiotike i proteolitičke enzime u prevenciji i liječenju raznih kirurških infekcija. U posljednjem desetljeću biološki pripravci koji se temelje na živim mikrobnim kulturama bakterija koje stvaraju spore naširoko se koriste za prevenciju i liječenje bolesti probavnog trakta. Raznolikost metaboličkih procesa, genetska i biokemijska varijabilnost, otpornost na litičke i probavne enzime poslužili su kao razlog za korištenje bacila u različitim područjima medicine. Ovi mikroorganizmi su jednostavni za proizvodnju, stabilni tijekom skladištenja i, što je najvažnije, ekološki prihvatljivi. Visoka aktivnost sojeva protiv jednog skupa testnih kultura ne jamči njihovu aktivnost protiv drugih. U tom smislu, uporaba probiotika spora ograničena je na specifične terapeutske svrhe. Varijabilnost nozoloških oblika gnojno-septičkih bolesti i raznolikost etiološki značajnih mikroorganizama za razvoj disbiotičkih poremećaja određuju zahtjeve za korišteni biološki pripravak. Ovo potiče istraživače da kontinuirano traže sojeve antagonista sa željenim svojstvima. Sojevi koje smo proučavali imali su morfološka i fiziološko-biokemijska svojstva tipična za predstavnike B. subtilis, a karakterizirani su skupom enzima koji razgrađuju različite supstrate. Prema literaturi, B.subtilis imaju izražena antagonistička svojstva protiv širokog spektra patogenih mikroorganizama i visoku enzimsku aktivnost, zbog čega normaliziraju probavne procese, a također pružaju antitoksični i antialergijski učinak. Proučavani sojevi B. subtilis imali su širok raspon antagonističke aktivnosti, nisku (B. subtilis br. 1719) ili srednju (B. subtilis br. 1594, B. subtilis br. 1318) razinu adhezije. Dakle, sojevi koje smo proučavali karakteriziraju visoka probiotička aktivnost. Međutim, proučavanje biokemijskih svojstava pokazalo je da soj B. subtilis 1719 ima veću enzimsku aktivnost (proteaza, amilaza, lipaza), koja je izražena u najvećoj zoni hidrolize ispitivanih supstrata. Osim toga, niska razina adhezivne aktivnosti soja B. subtilis 1719 i, očito, njegova prirodna otpornost na antibiotike, kontrolirana kromosomom, omogućili su nam da zaključimo da je daljnje proučavanje ove kulture obećavajuće. Po našem mišljenju, izgledi za širenje industrijske proizvodnje lijekova na bazi roda Bacillus su vrlo veliki. Bacili su sposobni lučiti mnoge enzime u tekućinu kulture. Služe kao važno industrijsko mjesto za proizvodnju proteolitičkih i amilolitičkih enzima koji se koriste u proizvodnji prehrambenih proizvoda, deterdženata i biomedicinskih tvari. U posljednjem desetljeću, uz njihovo sudjelovanje, dobiven je niz novih antibiotika, bakterijskih insekticida i drugih biološki aktivnih tvari. Unatoč činjenici da B. subtilis ima GRAS status, u literaturi postoje izolirani izvještaji o prisutnosti faktora patogenosti u nekim sojevima B. subtilis. Naznačeno je da ovo nije trajni znak, budući da nestaje tijekom ponovnog sjetve. Pretpostavlja se da su patogena svojstva bakterija povezana s prisutnošću plazmida. Na primjer, Le N. i Anagnostopoulos S. izolirali su plazmide iz 8 sojeva B. subtilis od 83 ispitana subjekta. Plazmidna DNA određena je samo u stanicama toksigenih sojeva B. subtilis i nije nađena u stanicama drugih sojeva iste vrste koji nisu toksigeni. Eliminacija plazmida iz toksigenih sojeva pod utjecajem eliminirajućih sredstava dovela je do eliminacije toksigenih svojstava filtrata kulture. Međutim, genetska uloga plazmida nije dovoljno proučena. U našim studijama nisu pronađeni nikakvi plazmidi u izoliranim DNA preparatima tri proučavana soja B. subtilis. Autori koji su proučavali djelovanje bacila na organizam toplokrvnih životinja došli su do zaključka da su sojevi B. subtilis potpuno bezopasni za ljude i životinje. O neškodljivosti za makroorganizam dokazuju eksperimentalni podaci da se unutar nekoliko dana nakon parenteralne primjene B.subtilis eliminira iz organizma. Mehanizmi terapijskog učinka ovih usjeva proučavani su na životinjama. Trenutno se vjeruje da je terapeutski učinak spornih probiotika određen nizom čimbenika, uključujući: proizvodnju bakteriocina kulturama B. subtilis, koji suzbijaju rast patogenih i uvjetno patogenih mikroorganizama; sinteza visoko aktivnih enzima: proteaza, ribonukleaza, transaminaza itd.; proizvodnja tvari koje neutraliziraju bakterijske toksine. Studija svojstava odabranog soja na miševima pokazala je da je avirulentan i da nema toksičnost niti toksigenost. Čimbenici pozitivnog djelovanja probiotika na makroorganizam su različiti produkti mikrobne sinteze: aminokiseline, polipeptidni antibiotici, hidrolitički enzimi i niz drugih biološki aktivnih tvari manjeg značaja. Stoga je hitno potrebno proučavanje i izolacija zaštitnih tvari koje proizvode mikroorganizmi iz roda Bacillus, te stvaranje biomedicinskih lijekova na njihovoj osnovi. U gastrointestinalnom traktu očituje se izravni antagonistički učinak bacila, koji je pretežno selektivan u odnosu na patogene i uvjetno patogene mikroorganizme. Istodobno ih karakterizira odsutnost antagonizma prema predstavnicima normalne mikroflore. U našim istraživanjima, tijekom korekcije eksperimentalne disbioze izazvane primjenom antibiotika doksiciklina, kultura B. subtilis 1719 pridonijela je normalizaciji sastava i brojnosti crijevne mikroflore, kao i eliminaciji uvjetno patogenih mikroorganizama u organizmu. parijetalnu i luminalnu mikrofloru. Iz literature proizlazi da industrijski sojevi roda Bacillus imaju nizak indeks adhezivne aktivnosti na eritrocite i slabu ili umjerenu adhezivnost na stanice crijevnog epitela. Sojevi B. subtilis 534 i ZN imaju više adhezina na receptore enterocita, soj B. licheniformis - na kolonocite, tj. Čini se da različiti sojevi imaju adhezine za receptore na različitim crijevnim stanicama. Njihova se aktivnost odvija u lumenu crijeva i usmjerena je protiv patogenih mikroorganizama, bez antagonističkog učinka na predstavnike normalne mikroflore. Uzimanjem spornih probiotika ostvaruje se mogućnost obnavljanja autoflore u različitim intestinalnim lokusima, te se nakon 3-5 dana broj laktobacila, bifidobakterija, E. coli i dr. povećava, a zatim se vraća na normalnu razinu. Rezultati naših istraživanja o adheziji mikroorganizama na enterocite omogućuju veću tvrdnju da adhezivna sposobnost crijevnih stanica ovisi o kvantitativnom i kvalitativnom sastavu normalne mikroflore. U disbiotičkim stanjima na površini enterocita otvaraju se receptori za koje se vežu uvjetno patogeni i patogeni mikroorganizmi, a kada se disbioza koriguje, crijevo se naseljava normalnom mikroflorom i brojem enterocitnih receptora sposobnih adherirati na njegovu površinu ne- autohtonih mikroorganizama smanjuje. Poznato je da normalna mikroflora ima važnu pokretačku ulogu u mehanizmu stvaranja imuniteta i specifičnih zaštitnih reakcija u postnatalnom razvoju makroorganizma. Uloga mikroflore u razvoju imunološkog odgovora je zbog njezinih univerzalnih imunomodulatornih svojstava, koja uključuju imunostimulaciju i imunosupresiju. Utvrđeno je da bakterijski lipopolisaharidi (LPS) imaju imunoregulacijski učinak na Ig A imunološki odgovor i imaju ulogu adjuvansa. Mikroflora osigurava razvoj kompleksa nespecifičnih i specifičnih imunoloških reakcija, formirajući prilagodbene i zaštitne mehanizme. Bez obzira na to koliko je visoka antimikrobna aktivnost lijeka, ona igra odlučujuću ulogu u uklanjanju infektivnog patološkog statusa. Čini se da je stvaranje lijekova koji su učinkoviti u antimikrobnim svojstvima i stimuliraju imunološki odgovor važan zadatak. Stoga je veliki broj studija usmjeren na proučavanje učinka probiotika na različite dijelove imunološkog sustava ljudi i životinja. Primjena živih kultura aerobnih bacila značajno stimulira in vivo proizvodnju serumskog interferona i interferona induciranog in vitro virusom newcastleske bolesti. Niz studija pokazuje da probiotici imaju imunomodulatorni učinak, vraćaju imunološki status oštećen patologijom, povećavaju proizvodnju endogenog interferona, povećavaju funkcionalnu aktivnost stanica makrofaga, povećavaju fagocitnu aktivnost krvnih leukocita - monocita i neutrofila. Naša istraživanja su pokazala da je kultura B. subtilis 1719 značajno promijenila metaboličku aktivnost neutrofila tijekom korekcije disbioze i nije uzrokovala promjene u funkcionalnoj aktivnosti neutrofila u normalnom stanju autohtone mikroflore. Osim toga, utvrđeno je da je disbioza popraćena povećanjem razine TNF-a, što ukazuje na izraženu fagocitnu, citotoksičnu, adhezivnu aktivnost makrofaga, limfocita, kao i endotelnih i epitelnih stanica tankog crijeva. Povećano izlučivanje proupalnog citokina u miševa s disbiozom vjerojatno odražava aktivaciju imunokompetentnih stanica (limfociti T, monociti/makrofagi). Pod utjecajem kulture B.subtilis 1719* uočeno je smanjenje proizvodnje TNF-a. Uvođenje kulture intaktnim životinjama nije uzrokovalo promjene u razini proizvodnje TNF-a. S obzirom da je TNF-a marker upalnih reakcija, zaključeno je da probiotik ima važnu ulogu u povećanju protuupalne aktivnosti imunokompetentnih stanica u životinja. Studije provedene za proučavanje dinamike proizvodnje citokina pod utjecajem soja B. subtilis 1719 pokazale su da kultura nije imala utjecaja na proizvodnju citokina u prvim satima nakon primjene, osim IL-lp, čija se količina postupno akumulirala. . Razina ostalih proučavanih citokina (IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IFN-y) značajno je porasla u intervalu od 12 do 24 sata. Dakle, modulacija stanica imunološkog sustava i promjene u potencijalu citokina mogu biti jedan od mehanizama putem kojih kultura B. subtilis 1719 doprinosi korekciji disbioze. Analiza rezultata znanstvenih istraživanja provedenih u zemlji i inozemstvu ukazuje na razmjere korištenja bakterija roda Bacillus za dobivanje proizvoda iz bakterijske biomase ili njihovih metabolita. Poznate metode uzgoja bakterija roda Bacillus temelj su tehnologije za proizvodnju niza bakterijskih i enzimskih pripravaka. . Proučavanjem svojstava rasta kulture B. subtilis 1719 na različitim tekućim hranjivim podlogama utvrđeno je da se za maksimalnu akumulaciju biomase najadekvatnijim supstratom za uzgoj soja može smatrati podloga BK-2 s dodatkom glukoze ili saharoza Trenutno se pri odabiru i karakterizaciji proizvodnih kultura mikroorganizama uglavnom uzimaju u obzir sljedeći pokazatelji bioloških svojstava: spektar i razina antagonističke aktivnosti, mogućnost proizvodnje, tj. sposobnost brzog nakupljanja bio* mase, otpornost na sušenje zamrzavanjem, održivost tijekom skladištenja. Posebna pozornost pridaje se kriterijima stupnja sigurnosti korištenih mikroorganizama za zdravlje ljudi. U studijama provedenim za procjenu održivosti mikrobnih stanica B.subtilis 1719 kada su pohranjene u prisutnosti tekućih stabilizatora, otkriveno je da je optimalni stabilizator bila 7% otopina NaCl, koja je omogućila održavanje vitalnosti i antagonističkih svojstava soja za 2 godine. Za očuvanje svojstava kulture 1,5 godina moguće je koristiti 10% otopinu glicerola, 1 godinu - destiliranu vodu, a utvrđeno je da ta punila nisu imala statistički značajan učinak na antagonistička svojstva B. subtilis 1719 soj. Treba napomenuti da je važna činjenica sposobnost soja B.subtilis 1719 da zadrži antagonističku aktivnost prema S.sonnei i S.aureus u tekućim stabilizatorima kroz dugo razdoblje od 36 mjeseci. (razdoblje promatranja). Sušenje smrzavanjem sa stabilizatorom saharoza-želatina očuvalo je vitalnost i antagonističku aktivnost soja B. subtilis 1719 tijekom 4 godine (razdoblje promatranja). Trenutno se u praktičnoj zdravstvenoj zaštiti široko koriste poznati probiotici: baktisubtil, sporobakterin, biosporin, baktisporin, subalin, cereobiogen, enterogermin i drugi. Usporedna studija B. subtilis soja 1719 za antagonističku i adhezivnu aktivnost s komercijalnim kulturama sljedećih probiotičkih pripravaka: Sporobacterin, Rusija (B. subtilis 534), Cereobiogen, Kina (B. cereus DM423), Subtil, Vijetnam (B. cereus var. Vietnami), Baktisubtil, Francuska (B.cereus IP5832), Nutrolin, Indija (B.coagulans), pokazalo je da je izolirani soj originalan i da se može preporučiti kao proizvodni pri dobivanju novog probiotika. Dakle, u smislu fizioloških i biokemijskih svojstava, soj B. subtilis 1719 ima jasno prepoznatljive pojedinačne karakteristike, koje su uključene u putovnicu kulture kada se pohranjuju u zbirku kultura GISC-a nazvanog po. J.I.A. Tarasevich. Osim toga, dominantan položaj izoliranog soja B. subtilis 1719 u pogledu antagonističkog djelovanja ukazuje na perspektivnost korištenja ove kulture za razvoj probiotičkog pripravka na njezinoj osnovi. 1. Ashmarin I.P., Vorobyov A.A. Statističke metode u mikrobiološkim istraživanjima. Medizd, 1962., 180 str. 2. Baibakov V.I., Karikh T.L., Borukaeva L.A. i dr. Normalizacija crijevne mikroflore i općeg stanja JCR miševa pod utjecajem koncentrata bifidobakterija.//Antibiotici i kemoterapija. 1997. - T. 42, br. 3. - Str. 20-24. 3. Baida G.E., Budarina Zh.I. Primarna struktura i analiza gena za hemolizin II bakterije Bacillus cereus // 2 Rev. planine znanstveni konf. oni kažu Znanstvenici, Pushchino, 23.-25. travnja. 1997: Sažetak. izvješće Puščino. - 1997. - str. 45-46. 4. Baida G.E., Kuzmin N.P. Gen HLY-III Bacillus cereus, kloniran u Escherichia coli, kodira novi hemolizin koji stvara pore.Int. konf. posvećen u znak sjećanja na akademika A. A. Baeva: Sažeci izvješća, Moskva, 20.-22. svibnja 1996. M. - 1996. - P. 108, 291. 5. Baranovsky A.Yu., Kondrashina E.A. Disbakterioza i crijevna disbioza // St. Petersburg. "Petar". -2000. -209 str. 6. Bakhanova E.M., Nikolaev S.M., Nikolaeva I.G., i dr. Rast. resursi. 2001. godine. T. 37, br. 1. str. 70-76. Učinak ekstrakta izdanaka Pentaphylloides fruticosa na tijek eksperimentalne crijevne disbioze uzrokovane sulfadimetoksinom i izoniazidom 7. Belyavskaya V.A., Sorokulova I.B., Ilyichev A.A. Izgledi za dizajn imunopreparata na bazi rekombinantnih bacila // New directions of biotechnology: Proc. doc. YI Conf. RF, 24.-26. svibnja 1994. Puščino. -1994.-S. 68. 8. Belyavskaya V.A., Sorokulova I.B., Masycheva V.A. Rekombinantni probiotici: problemi i izgledi za upotrebu u medicini i veterini // Disbakterioza i eubiotici: Sažeci Sveruske znanstvene i praktične konferencije. M. - 1996. - S. 7. 9. Belyavskaya V.A., Cherdyntseva N.V., Bondarenko V.M., i dr. Biološki učinci interferona proizvedenog rekombinantnim bakterijama probiotičkog lijeka Subalin. Časopis mikrobiol., 2003, br. 2, str. 102-109 (prikaz, ostalo). 10. Belyaev E.I. Načini poboljšanja lijekova koji normaliziraju crijevnu mikrofloru / Rep. zbornik znanstvenih radova: “Autoflora čovjeka u normalnim i patološkim stanjima. Gorak. - 1988. - Str. 74-78. 11. Bilibin A.F. // Ter. arh. -1967. broj 11. - str. 21-28. 12. Bilibin A.F. // Klin. Lijek. 1970. - br. 2. - str. 7-12. 13. Birger M.O. Priručnik mikrobioloških i viroloških metoda ispitivanja. Određivanje osjetljivosti mikroorganizama na antibiotike. M.: Medicina, 1982. - 180 str. 14. Blinkova L.P., Semenov S.A., Butova L.G. i dr. Antagonističko djelovanje svježe izoliranih sojeva bakterija iz roda Bacillus // JMEI. 1994. -N5.-S. 71-72 (prikaz, ostalo). 15. Boyko N.V., Turyanitsa A.I., Popovich E.P., Vyunitskaya V.A. Antagonistički učinak kultura Bacillus subtilis na bakterije roda Klebsiella / Microbiol. i. 1989. - T. 51, N 1. - P. 87-91. 16. Boyko N.V., Lisetska M.V. Rozrobka probutiyuv vib1rkovostn: Protiskle-romna efektivshst dyakikh sojeva V. subtilis // Nauk. Vyun. Užgor. un-tu. Ser. Bik. 1997. - N 4. - P. 194-198. 17. Bondarenko V.M., Petrovskaya V.G. Rane faze razvoja infektivnog procesa i dvostruka uloga normalne mikroflore // Bilten Ruske akademije medicinskih znanosti. -M.- 1997.-N3.-C. 7-10 (prikaz, ostalo). 18. Bondarenko V.M., Chuprinina R.P., Aladysheva Zh.I., Matsulevich T.V. Probiotici i mehanizmi njihovog terapijskog djelovanja // Eksperiment. i klin, gastroenterol. 2004. br. 3. str. 83-87. 19. Bochkareva N.G., Belogortsev Yu.A., Udalova E.V. i dr. Bakterijski soj Bacillus subtilis je proizvođač kompleksa hidrolitičkih enzima obogaćenih b-glukanazom // Pat. N 2046141 Rusija, C12 N 9/42, Publ. 20.10.95. - Bik. N 29. 20. Briliš V.I. Adhezivna svojstva laktobacila // Sažetak. dis. dr.sc. med. Sci. Tartu. -1990. - 25 s. 21. Brilis V.I., Briline T.A., Lenzner H.P., Lenzner A.A. Adhezivna i hemaglutinirajuća svojstva laktobacila. Časopis Microbiol., 1982, 9:7578. 22. Vasilyeva V.L., Tatskaya V.N., Reznik S.R. Iskustvo korištenja biljnih i mikrobnih pomoćnih sredstava u dobivanju imunološke ascitne tekućine u laboratorijskih životinja // Mzhrobyul. časopis 1974. T. 36, N 3. - P. 358-360. 23. Vershigora A.E. Osnove imunologije // Kijev: škola Vishcha. 1975. - 319 str. 24. Vinnik Yu.S., Peryanova O.P., Yakimov S.V. i sur., Metoda liječenja gnojnih rana primjenom antagonista / Međunarodni časopis o imunorehabilitaciji. 1998. - N 4., str. 143. 25. Vinogradov E.Ya., Shichkina V.P. Bakterijski soj B. mucilaginosus kao proizvođač biostimulatora nespecifične imunosti kod teladi // A.S. 1210452, SSSR -1/00. Publ. 27.04.96. - Bik. N 12. 26. Vladimirov Yu.A., Sherstnev M.P. Rezultati znanosti i tehnologije: Biofizika 1989; 24:172. 27. Vorobyov A.A., Abramov N.A., Bondarenko V.M., Shenderov B.A. Disbakterioza je hitan problem u medicini // Bilten Akademije medicinskih znanosti. -1997. - Br. 3. -P.3-9. 28. Vorobyov A.A., Nesvizhsky Yu.V., Zudenkova A.E., Budanova E.V. Usporedna studija parijetalne i luminalne mikroflore debelog crijeva u pokusima na miševima. Časopis mikrobiol., 2001, 1: 62-67. 29. Vorobyov A.A., Nesvizhsky Yu.V., Lipnitsky E.M. i dr. Proučavanje parijetalne mikroflore ljudskog crijeva. Časopis mikrobiol., 2003, 1: 6063. 30. Vyunitskaya V.A., Boyko N.V., Spivak N.Ya., Ganova L.A./ Neki mehanizmi djelovanja novih mikrobiotika // Mikrobiološke i biotehnološke osnove intenziviranja proizvodnje usjeva i proizvodnje hrane za životinje: Zbornik sažetaka Alma-Ata, 1990. - P 17. 31. Galaev Yu.V. Patogeni enzimi bakterija // M.: Medicina. 1968. - 115 str. 32. Goncharova G.I., Semenova A.P., Lyannaya A.M., et al. Kvantitativna razina bifidne flore u crijevu i njezin korelativni odnos s ljudskim zdravljem // Antibiotici i mikroekologija ljudi i životinja. -1988.-P.118-123 33. Gorskaya E.M. Mehanizmi nastanka mikroekoloških poremećaja u crijevima i novi pristupi njihovoj korekciji.//Disertacija u obliku znanstvenog 34. Gracheva N.M., Goncharova G.I. i dr. Primjena bakterijskih bioloških pripravaka u praksi liječenja bolesnika s crijevnim infekcijama. Dijagnostika i liječenje crijevne disbioze. Smjernice. 1986., str. 23 35. Gracheva N.M., Gavrilov A.F., Avakov A.A. itd. - Novi lijekovi. 1994, br. 1, str. 3-12 36. Gracheva N.M., Gavrilov A.F., Solovyova A.I. i dr. Učinkovitost novog bakterijskog lijeka biosporin u liječenju akutnih crijevnih infekcija // Journal. mikrobiol. 1996. - N 1. - P. 75-77. 37. Grebneva A.J1., Myagkova L.P. Intestinalna disbakterioza // Vodič za gastroenterologiju u 3 sveska, M., 1996. -T.Z. -P.324-334 38. Grigorieva T.M., Kuznetsova N.I., Shagov E.M. Soj Bacillus thuringiensis 4KN, koji sintetizira egzotoksin sa specifičnim djelovanjem protiv koloradske krumpirove zlatice // Biotehnologija. 1994. - N 9-10. - Str. 7-10. 39. Gulko M.A., Kazarinova JI.A., Pozdnyakova T.M. Metoda za proizvodnju inozina // Pat. N 175583, C12P 19/32. Publ. 30.08.94. - Bik. N 16. 40. Demyanov A.V., Kotov A.Yu., Simbirtsev A.S., Dijagnostička vrijednost proučavanja razine citokina u kliničkoj praksi. Journal of Cytokines and Inflammation, 2003, svezak 2, broj 3, str. 20-35 (prikaz, ostalo). 41. Egorov N.S., Zarubina A.P., Vybornykh S.N., Landau N.S. Sintetski * medij za uzgoj bakterija roda Bacillus // Bilten Moskovskog državnog sveučilišta. 1989. N 4.1. Str. 52. 42. Ermakova L.M., Smirnova T.A., Alikhanyan S.I. i sur., Kristalne inkluzije u mutantu bakterije Bacillus subtilis s promijenjenim spektrom proteinaza // Dokl. Akademija znanosti SSSR-a. 1977. - T. 236, N 4. - P. 1001-1003. 43. Zhirkov I.N., Bratukhin I.I. Primjena probiotika RAS za korekciju disbakterioze kod teladi // Veterinarska medicina. 1999. N 4. - str. 40-42. 44. Zgonnik V.V., Furtat I.M., Vasilevskaya I.A. i dr. Antagonistička svojstva bakterija koje stvaraju spore i kontaminiraju proces proizvodnje lizina // Microbiol. i. 1993. -T.55, N4. - str. 53-58. 45. Zinkin V.Yu. Fotometrijski NBT test s neutrofilima ljudske krvi i njegov klinički i imunološki značaj u bolesnika s mišićno-koštanom traumom. Autorski sažetak. dis. dr.sc. med. Znanosti - Moskva, 2004. 46. Zudenkov A.E. Mikroflora i sastav imunokompetentnih stanica parijetalnog mucina debelog crijeva u normalnim uvjetima iu nekim patološkim stanjima. Autorski sažetak. dis. dr.sc. med. Nauke, Moskva, 2001. 47. Ivanovsky A.A., Novi probiotik baktocelolaktin za različite patologije kod životinja // Veterinarska medicina. 1996 - N11. - str. 34-35. 48. Ivanovski A.A., Vepreva N.S., Zimireva V.V., Lagunova O.P. Metoda za proizvodnju probiotika za veterinarsku medicinu / RU Patent N 2084233, publ. 20.07.97. Bik. N 20. 49. Kandybin N.V., Ermolova V.P., Smirnov O.V. Rezultati i izgledi za korištenje bakterokulicida // Sovrem. postignuće biotehnol.: Mater. 1 konf. Sjeverni Kavkaz regija, Stavropolj, ruj. 1995. Stavropolj. - 1995. - str. 14-15. 50. Kashirska N.Yu. Značaj probiotika i prebiotika u regulaciji crijevne mikroflore.//Ruski medicinski časopis. 2000. - T. 8, br. 13-14. - str. 572-575. 51. Kovalchuk L.V., Gankovskaya L.V., Rubakova E.I. Citokinski sustav. M., 2000. (monografija). 52. Kozachko I.A., Vyunitskaya V.A., Berezhnizkaya T.G. i dr. Bakterije roda 4 Bacillus su obećavajući usjevi za stvaranje bioloških sredstava za zaštitu biljaka od bolesti // Mshrobyul. i. - 1995.- T.57, N 5. - P. 69-78. 53. Krasnogolovets V.N. Intestinalna disbioza. M., 1979. -198 str. 54. Kudryavtsev V.A., Safronova J.I.A., Osadchaya A.I. i dr. Utjecaj živih kultura Bacillus subtilis na nespecifičnu rezistenciju organizma // Microbiol. i. 1996. - T.58, N 2. - P. 46-53. 55. Kuznetsova N.I., Smirnova T.A., Shamshina T.N. i dr. Soj Bacillus thuringiensis, otrovan za kućne muhe // Biotehnologija. 1995. -N3-4.-S. 11-14 (prikaz, ostalo). 56. Lapchinskaya A.V., Shenderov B.A. Korekcija disbakterioze uzrokovane cefaleksinom i nekim imunomodulatorima.//Medicinski aspekti mikrobne ekologije. M., 1991. -P.70-79 57. Lenzner A.A., Lenzner H.T., Michelsaar M.E. et al. Rezistencija na laktofloru i kolonizaciju.//Antibiotici i med. biotehnologija. -1987. -32. -Br. 3. -S. 173-180 (prikaz, ostalo). 58. Leščenko V.M. Klinika, dijagnostika i liječenje visceralne kandidijaze. Smjernice. M., 19871. 59. Lisecka M.V. Eksperimentalno istraživanje antagonističkog djelovanja soja 1b Bacillus subtilis i Klebsiella rhinoscleromatis // Nauk. Vyun. Užgor. un-tu. Ser. Bik. 1997. - N 4. - P. 207-212 60. Lopatina T.K. et al. Imunomodulacijski učinak eubiotičkih lijekova* // Bilten Ruske akademije medicinskih znanosti. M., "Medicina". -1997. broj 3. -P.30-34 61. Lukin A.A. Stvaranje antibiotika i sporulacija u mikroorganizmima bez plazmida i plazmida // Pushchino. 1978. - str. 25-28. 62. Mazankova JI.H., Mikhailova N.A., Kurokhtina I.S. i dr. Bactisporin je novi probiotik za liječenje akutnih crijevnih infekcija u djece // Man and Medicine: Proc. izvješće V Ruski nacionalni kongres, Moskva, 8.-12. travnja 1997. - M. - Str. 199. 63. Mazankova L.N., Vaulina O.V. Novi lijekovi za korekciju disbiotičkih poremećaja.//Dječji liječnik. 2000. br.3. - Str. 51-53. 64. Maniatis T., French E., Sambrook J. Metode genetskog inženjeringa. Molekularno kloniranje, 1984. 65. Markov I.I., Zhdanov I.P., Markov A.I. Soj Bacillus subtilis MZh-6 antagonist Mycobacterium tuberculosis // Pat. N 2120992, C 12N 1/20. - Publ. 10.27.98.-Bul.N30. 68. Mikshis N.I., Shevchenko O.V., Eremin S.A. et al., Populaciona heterogenost sojeva Bacillus anthracis II Dep. na VINITI 04.06.98. Saratov. -1998.-7 str. 69. Mitrokhin S.D. // Antibiotici i kemoterapija. 1991. - br. 8. - str.46 - 50. 70. Mitrokhin S.D. Metaboliti normalne ljudske mikroflore u ekspresnoj dijagnostici i praćenju liječenja disbioze debelog crijeva: Sažetak disertacije. dr. med. Znanosti, M., 1998. 37 str. 71. Mitrokhin S.D., Ardatskaja M.D., Nikuškin E.V., Ivanikov I.O. i drugi - M., 1997. 45 str. Sveobuhvatna dijagnostika, liječenje i prevencija crijevne disbakterioze (disbioze) u klinici za interne bolesti (Smjernice). 72. Mitrokhin S.D., Shenderov B.A. Mikrobiološki i biokemijski pokazatelji promjena u mikrobnoj ekologiji debelog crijeva štakora pod utjecajem rifampicina. Antibiotici i kemoterapija - 1999, T. 34 br. 6 (482-4). 73. Molchanov O.JL, Poznyak A.JI. Primjena biosporina u kompleksnoj terapiji bakterijske vaginoze // Proc. Dokl: Suvremene tehnologije dijagnostike i terapije zaraznih bolesti. Sv. P. - 1999., str.187. 74. Muzychenko JI.A., Senatorova V.N., Alkhovskaya JI.JI. i dr. Morfometrijska analiza razvoja mikroorganizama / Biotehnologija. 1990. - N 3. - S. 3-6. 75. Müller G., Litz P., Munch G. Mikrobiologija prehrambenih proizvoda biljnog podrijetla// M.: B.I..- 1977.- P.343 347 76. Nikitenko V.I. Bakterijski lijek za prevenciju i liječenje upala. gorući procesi i alergijske bolesti // Međunarodna prijava. N 89/09607, WO, objav. 19.10.1989. 77. Nikitenko V.I. Umjesto lijekova, bakterije // Znanost u SSSR-u. - 1991. - N 4. -S. 116-121 (prikaz, stručni). 78. Nikitenko V.I. Soj bakterije Bacillus subtilis koji se koristi za dobivanje mliječnog proizvoda namijenjenog liječenju dijateze, disbakterioze i bakterijskih infekcija // A.S. N 1648975, S.U. objavljeno 15.05. 91. 79. Nikitenko V.I., Nikitenko I.K. Soj bakterije Bacillus pulvifaciens koji se koristi za proizvodnju terapeutskog i profilaktičkog lijeka protiv bakterijskih infekcija kod životinja // A.S. N 1723117, S.U. objav. 12. 1992. godine. 80. Nikitenko V.I., Nikitenko I.K. Soj bakterije Bacillus subtilis koji se koristi za dobivanje lijeka za prevenciju i liječenje protuupalnih procesa i alergijskih bolesti // A.S. N 1723116, S.U. objav. 12. 1992. godine. 81. Nikitenko L.I., Nikitenko V.I. Bakterijski soj Bacillus sp. komponenta terapeutskog i profilaktičkog lijeka protiv disbakterioze i alergija // A.S. N 1710575, S.U. - objav. 5. 1992. godine. 82. Nikitenko V.I., Gorbunova N.N., Zhigailov A.V. Sporobacterin je novi lijek za liječenje disbakterioze i gnojno-upalnih procesa // Disbakterioza i eubiotici: Sažeci izvješća All-Russian. znanstveno-praktične konf. -M.- 1996.-S. 26. 83. Nikolicheva T.A., Tarakanov B.V., Golinkevich E.K., Komkova E.E. Promjene u biocenozi probavnog trakta prasadi kada se Bacillus micilaginosis uključi u prehranu // Bilten. Sveruski istraživački institut za fiziologiju, biokemiju i prehranu domaćih životinja. 1989.-N 2. - P. 31-35. 84. Obukhova O.V., Soboleva N.N. O prisutnosti faktora distribucije u kulturama saprofitnih spora bakterija // Journal. mikrobiol. 1950. - N 12. Str. 482-485. 85. Određivanje osjetljivosti mikroorganizama na antibakterijske lijekove. Metodološke preporuke MUK 4.2.1980-04, 2004. 86. Osadchaya A.I., Kudryavtsev V.A., Safronova JI.A. Utjecaj srednje kiselosti i temperature na rast i izlučivanje polisaharida Bacillus subtilis tijekom uronjenog uzgoja // Misrobyul. časopis 1998. - T. 60., N 4. - P. 25-32. 87. Osipova I.G. Neki aspekti mehanizma zaštitnog djelovanja kolibakterina i spornih eubiotika i nove metode njihove kontrole // Autorski sažetak. Doktorska disertacija iz biologije - M., 1997. - 25 str. 88. Osipova I.G., Sorokulova I.B., Tereškina N.V., Grigorieva JI.B. Studija sigurnosti bakterija roda Bacillus, koje čine temelj nekih probiotika // Journal. mikrobiol. 1998. - N 6. - P. 68-70. 89. Osipova I.G., Mikhailova N.A., Sorokulova I.G., Vasiljeva E.A., Gaiderov A.A. Spore probiotici. Časopis mikrobiol. - 2003. br.3. S. 113-119 (prikaz, ostalo). 90. Osterman L.D. Metode proučavanja proteina i nukleinskih kiselina. 1981. godine. 91. Panin A.N., Serykh N.I., Malik E.V. i dr. Povećanje učinkovitosti probiotičke terapije u prasadi / Veterinarska medicina, 1996. - N 3. - S. 17. 92. Panchishina M.V., Oleinik S.F. Intestinalna disbioza. Kijev, 1983 93. Parshina S.N., Imshenetsky A.A., Nesterova N.G. i dr. Bakterijski soj Bacillus segesh je proizvođač proteolitičkih enzima s trombolitičkim učinkom // A. C. N 1615177, C 12N 1/20. Objavljeno 23. 12. 90. - Bilten N 4. 1988. 94. Perth S. D. Osnove uzgoja mikroorganizama i stanica. M. Mir, 1978, 332 str. 95. Petrov L.N., Verbitskaya N.B., Vakhitov T.Ya. Dizajn lijekova za liječenje i prevenciju disbioze na temelju ideja o ljudskoj endoekologiji // Rus. i. HIV/AIDS i srodni problem 1997.- T. 1, N 1. P. 161-162. 96. Petrovskaya V.G., Marko O.P. Ljudska mikroflora u normalnim i patološkim stanjima. M.: Medicina. -1976. -217 C. 97. Poberiy I.A., Kharechko A.T., Sadovoy N.V., Litusov N.V. Novi složeni eubiotik "biosporin" za djecu i odrasle / Zdravstvena zaštita Baškortostana. 1998. -N 1. - P. 97-99. 98. Pogosyan G.P., Nadirova A.B., Kaliev A.B., Karabaev M.K. Plazmid pCLl i antimikrobna aktivnost Bacillus sp. 62 II Molekularna genetika, mikrobiol. i virologija. 1999. - N 1. - P. 37-38. 99. Podberezny V.V., Parikov V.A. Medij za uzgoj simbionskih bakterija Bacillus pulvifaciens ili Bacillus subtilis - proizvođač probiotika // RU patent br. 2100029, publ. 27.12.97. Bilten br.36. 100. Podberezny V.V., Polyantsev N.I., Ropaeva L.V. Uzgoj proizvodnih sojeva Bacillus subtilis u sirutki // Veterinarska medicina - 1996.-N 1.-S. 21-29 (prikaz, ostalo). 101. Podoprigora G.I. Imuni i nespecifični mehanizmi kolonizacijske rezistencije.//Antibiotici i kolonizacijska rezistencija/Hrpe Sveruskog istraživačkog instituta za antibiotike. - M. -1990. - izdanje X1X. -S. 15-25 (prikaz, ostalo). 102. Polkhovsky V.A., Bulanov P.A. O dekarboksilazama aminokiselina u Bacillus cereus //Microbiology. 1968. - T. 37, N 4. - P. 600-604. 103. Pospelova V. V., Gracheva N. M., Antonova L. V. i dr. Biološki mikrobni pripravci, njihovi oblici doziranja i područja primjene // Novi lijekovi: Ekspresne informacije. -1990. -sv. 5. - str. 1-8. 104. Pospelova V.V., Rakhimova N.G., Khaleneva M.P. i dr. Nova područja primjene mikrobnih bioloških proizvoda za korekciju bakteriocenoze ljudskog tijela.//Immunobiol. droge. M. -1989. -S. 142-152 (prikaz, ostalo). 105. Reznik S.R. Metoda za liječenje i prevenciju virusnih i bakterijskih bolesti životinja // SU, A.s. N 1311243, objavljeno. 1982. godine. 106. Reznik S.R., Sorokulova I.B., Vyunitskaya V.A. i dr. Preventivni biološki proizvod sporolakt // Patent N 2035186. RU. - A 61 K 35/66, objav. 20.05.95., bilten. N 14. 107. Reznik S.R., Shust I.I. Hematološki i citokemijski parametri teladi pri davanju lijeka Bacteria-SL // Biokemija poljoprivrednih životinja i prehrambeni program: Proc. izvješće svesavezni simpozij -Kijev, 1989. S. 25. 108. Reshedko G.K., Stetsyuk O.U. Značajke određivanja osjetljivosti mikroorganizama metodom disk-difuzije. Moderne metode kliničke mikrobiologije, broj 1. Smolensk, 2003. 109. Ryapis JI.A., Lipnitsky A.V. Mikrobiološki i populacijsko genetski aspekti bakterijske patogenosti // Časopis. mikrobiol. 1998. - N 6. S. 109-112. 110. Savitskaya K.I. Poremećaji mikroekologije gastrointestinalnog trakta i kronične crijevne bolesti // Terra medica. - 1998. N 2. - str. 13-15. 111. Svechnikova E.B., Maksyutova L.F., Khunafin S.N. i sur., Iskustvo korištenja baktisporina u složenom liječenju djece s toplinskom ozljedom // Proc. Dokl: Suvremene tehnologije dijagnostike i terapije zaraznih bolesti. Sv. P. - 1999. - str. 268. 112. Sinev M.A., Budarina Zh.I., Gavrilenko I.V. i sur., Dokaz postojanja Bacillus cereus hemolizina II: kloniranje genetske determinante hemolizina II // Molek. biol. 1993. - T. 27, N 6. - P. 1218-1229. 113. Slabospitskaya A.T., Krymovskaya S.S., Reznik S.R. Enzimska aktivnost bacila koji obećavaju uključivanje u biološke proizvode // Microbiol. i. 1990. - N2. - Str. 9-14. 114. Smirnov V.V., Reznik S.R., Vasilevskaya I.A. Aerobne bakterije koje stvaraju spore su proizvođači biološki aktivnih tvari. - Kijev, 1982. - 280 str. 116. Smirnov V.V., Reznik S.R., Vasilevskaya I.A. Aerobne bakterije koje stvaraju spore - proizvođači biološki aktivnih tvari // Kijev. Naukova Duma.- 1983.- 278 str. 117. Smirnov V.V., Reznik S.R., Sorokulova I.B. i dr. O nekim mehanizmima nastanka asimptomatske bakterijemije // Microbiol. časopis 1988 -T. 50, N6.-S. 56-59 (prikaz, ostalo). 118. Smirnov V.V., Reznik S.R., Sorokulova I.B. i dr. Metoda liječenja gnojno-septičkih postporođajnih bolesti suspenzijom živih kultura // A. str. N 1398868 S.U. - A 61 K 35/74. - objav. 30.05.88, bilten. N 20. 119. Smirnov V.V., Reznik S.R., Sorokulova I.B. i dr. Lijek biosporin za prevenciju i liječenje gastrointestinalnih bolesti ljudi // A. str. N 1722502. S.U. - A 61 K. 39/02, objav. 30.03.92. 120. Smirnov V.V., Reznik S.R., Sorokulova I.B., Vyunitskaya V.A. Kontroverzna pitanja stvaranja i upotrebe bakterijskih pripravaka za korekciju mikroflore toplokrvnih životinja // Microbiol. časopis 1992. - T.54, N 6.- P. 82-92. 121. Smirnov V.V., Reznik S.R., Vyunitskaya V.A., et al.. Moderne ideje o mehanizmima terapeutskog i profilaktičkog djelovanja probiotika iz bakterija roda Bacillus II Microbiol. časopis - 1993. - 55, - br. 4. Str. 92-112 122. Smirnov V.V., Osadchaya A.I., Kudryavtsev V.A., Safronova JI.A. Rast i sporulacija Bacillus subtilis u različitim uvjetima prozračivanja // Microbiol. časopis 1993. - T. 55, N 3. - P. 38-44. 123. Smirnov V.V., Reznik S.R., Sorokulova I.B. i dr. Preventivni biološki proizvod subalin // Patent N 2035185, RU. A 61 K 35/66, objav. 20.05.95., bilten. N 14. 124. Smirnov V.V., Sorokulova I.B., Osipova I.G. Biološki proizvod subticol za prevenciju i liječenje zaraznih bolesti // Patent N 2129432. -A. 61 K 35/74. - Bik. N 12, publik. 27.04.99. 125. Smirnov V.V., Reva O.N., Vyunitskaya V.A. Stvaranje i praktična primjena matematičkog modela antagonističkog djelovanja bacila u dizajnu probiotika // Mshrobyulopchnyi zhurn. 1995. -T. 64, N 5. -S. 661-667 (prikaz, ostalo). 126. Smirnov V.V., Kosyuk I.V. Adhezivna svojstva bakterija roda Bacillus - komponente drobiotika // Mshrobyulopchnyi zhurnal. 1997. - T. 69, N 6. - P. 36-43. 127. Sorokulova I.B. Izgledi za korištenje bakterija roda Bacillus za dizajn novih bioloških proizvoda // Antibiotici i kemoterapija. -1996. T.41, N 10. - str. 13-15. 128. Sorokulova I.B. Usporedna studija bioloških svojstava biosporina i drugih komercijalnih pripravaka na bazi bacila // Mshrobyu-lopchny journal. 1997. - T. 69, N 6. - P. 43-49. 129. Sorokulova I.B. Utjecaj probiotika iz bacila na funkcionalnu aktivnost makrofaga / Antibiotici i kemoterapija. 1998. - T. 43, N 2. - P. 20-23. 130. Storozhuk P.G., Bykov I.M., Storozhuk A.P. Patogenetska orijentacija proteinske prehrane i enzimske nadomjesne terapije u stanjima imunodeficijencije tijela // Međunarodni časopis o imunorehabilitaciji. 1998. - N 10., str. 110-115. 131. Tabolin V.A., Belmer S.V., Gasilina T.V. i dr. Racionalna terapija crijevne disbioze u djece. Smjernice. M., 1998. -11 str. 132. Topchy M.P. Primjena lijekova iz živih kultura Bacillus subtilis za disbakteriozu teladi: Sažetak disertacije. dis. dr.sc. biol. Sci. Minsk, 1997. -21 str. 133. Trishina N.V. Odnos između razvoja crijevne disbioze i stanja antiendotoksinskog imuniteta. Autorski sažetak. dis. dr.sc. med. Sci. -Moskva, 2003., 24 str. 134. Učitelj I.Ya. Makrofagi u imunološkom sustavu. M 1978; 175.). 135. Fazylova A.A. Kliničko i imunološko obrazloženje za uporabu sporobakterina i baktisporina za crijevnu disbiozu u male djece // Autor. limenka. dis. Ufa. - 1998. - 24 str. 136. Harwood K. Bacillus. Genetika i biotehnologija. M., 1992. - S. 52. 137. Kharchenko S.N., Reznik S.R., Litvin V.P. Metoda za borbu protiv plijesni u stočnoj hrani // A.S. N 751382, SSSR, publik. u B.I., 1980., br. 28. 138. Khmel I.A., Chernin L.S., Levanova N.B. i dr. Soj bakterije Bacillus pumilus za dobivanje lijeka protiv fitopatogenih mikroorganizama // Patenti 1817875 Rusija F01N 63/00, C12N 1/20. objav. 20.05.95. - Bik. N 14. 139. Chernyakova V.I., Bereza N.M., Selezneva S.I. Bakteriološka i imunološka učinkovitost lijeka biosporin u nespecifičnom ulceroznom kolitisu // Mikrobiol.zh. 1993. - T. 55, N 3. - P. 63-67. 140. Chkhaidze I.G., V.G. Likhoded i dr. Korektivni učinak protutijela u eksperimentalnoj disbakteriozi // Journal. Microbiol. 1998, broj 4: 12-14. 141. Sharp R., Skaven M., Atkinson T. Bacillus: Genetika i biotehnologija. -M. 1992. - 398 str. 142. Sheveleva S.A. Probiotici, prebiotici i probiotski proizvodi. Trenutno stanje problematike // Issues of nutricionizam. -1999. -T.68. -br. 2. -P.32 143. Shenderov B. A. Medicinska mikrobna ekologija i funkcionalna prehrana - M., 1998, T. I, str. 287. 144. Shenderov B.A. Rezistencija na kolonizaciju i kemoterapijski i antibakterijski lijekovi // Antibiotici i rezistencija na kolonizaciju: Zbornik radova Sveruskog istraživačkog instituta za antibiotike. M. -1990. - izdanje X1X. -P.5-16. 145. Shenderov B.A., Manvelova M.A., Stepanchuk Yu.B., Skiba N.E. Probiotici i funkcionalna prehrana // Antibiotici i kemoterapija. 1997. - T. 42, N 7. - P. 30-34. 146. Shenderov B.A. Medicinska mikrobna ekologija i funkcionalna prehrana.-M., 1998, T. II, str. 413 147. Yampolskaya T.A., Velikzhanina G.A., Zhdanova N.I. itd. Bakterijski soj Bacillus subtilis koji proizvodi L-fenilalanin: A.s. N 1693056, C 12 R 13/22, objavljeno. 23.11.91. Bik. N 43. 148. Adami A., Sandrucci A., Cavazzoni V. Praščići hranjeni od rođenja s probiotikom Bacillus coagulans kao dodatkom: Zootehnički i mikrobiološki aspekti // Ann. mikrobiol. ed enzimol. 1997. - V. 47, N 1. - P. 139-149. 149. Azuma I., Sugimura C., Iton S. Adjuvantna aktivnost bakterijskih glikolipida // Jap. J. Microbiol. 1977. - V. 20, N 5. - P. 465-468. 150. Benedettini J. i sur. Imunomodulacija sporama Bacillus subtilis // Boll. 1., Sierote Milano. 1983.-V. 62., N6.-Str. 509-516 (prikaz, ostalo). 151. Berkel H., Hadlok R. Lecithinase-und Toxinbildung durch Stamme der Gat-tung Bacillus // Lebensmittelhygiene. 1976. - V. 27, N 2. - str. 63-65 (prikaz, ostalo). 152. Bernheimer A., Avigad L. Priroda i svojstva citolitičkog sredstva koje proizvodi Bacillus subtilis // J. Gen. Microb. - 1970. V. 61, N 2. - P. 361-369. 153. Blaznić J, Kumel I.M., Salamum B. et al. Sdravljenje kronične granulomotozne bolezni s acidofilnim mlekom // Zdrav.Vesth. 1976. N 45. - P. 77-79. 154. Boer A.S., Priest F., Diderichsen B. O industrijskoj upotrebi Bacillus licheniformis: Pregled // Appl. Microbiol i Biotechnol. 1994. - V. 40, N 5. - P. 595-598. 155. Buchell M.E., Smith J., Lynch H.C. Fiziološki model za kontrolu proizvodnje eritromicina u šaržnoj i cikličkoj hranjenoj šaržnoj kulturi // Microbiology. -1997. V. 143, N 2. - Str. 475-480. 156. Cipradi G. i sur. Učinci dodatnog liječenja s Bacillus subtilis za alergiju na hranu // Chemioterapia. -1986. 5, N6. -P.408-410 157. Cromwick A.M., Birrer G.A., Gross R.A. Učinci pH i prozračivanja na stvaranje y-poli (glutaminske kiseline) pomoću bacillus licheniformis u kulturama kontroliranih šaržnih fermentora // Biotechnol. i Bioeng. 1996. - V. 50, N 2. - P. 222-227. 158. Danchin A., Glasser P., Kunst F. et al. Geni Bacillus subtilis devoile ses // Biofutur. 1998. - N 174. - P. 14-17. 159. Devin K.M. Projekt genoma Bacillus subtilis: Ciljevi i napredak // Trends Biotechnol. 1995. - V. 13, N 6. - P. 210-216. 160. Donovan W.P., Rupar M.J., Slanei A.C. Bacillus thuringiensis crytic, protein toksičan za koleopteranske insekte // Patent N 5378625 USA A61K 31/00. Publ. 03.01.95. 161. Dubos R. Toksični čimbenici u enzimima koji se koriste u proizvodima za pranje rublja // Science. 1971. - N 3993. - P. 259-260. 162. Edlund C., Nord C.E. Učinak kinolona na ekologiju crijeva. Droge, 1998, 58(2): 65-70. 163. Flindt M. Plućna bolest uzrokovana inhalacijom derivata Bacillus subtilis koji sadrže proteolitički enzim // Lancet - 1969. V. 1, N 7607. - P. 1177-1181. 164. Fox M. Filogenija prokariota // Science. -1980. V. 209, N 4455. Str. 457-463. 165. Fuller R. J Appl Bacteriol 1989; 66:5:365-378. 166. Gastro G.R., Ferrero M.A., Abate C.M. et al. Simultana proizvodnja alfa i beta amilaza pomoću Bacillus subtilis Mir-5 u šaržnoj i kontinuiranoj kulturi // Biotechnol. Lett. 1992. - V. 14, N 1. - P. 49-54. 167. Glatz B.A., Spira W.M., Goepfert J.M. Promjena vaskularne propusnosti u kunića filtratima kulture Bacillus cereus i srodnih vrsta // Infect, and Immunol. 1974. V. 10, N 2. - P. 299-303. 168. Guida V., Guida R. Importansia dos Bacillos esporulados aerobios em gastroenterologia e nutricao // Rev. Brazil. med. 1978. - V. 35, N 12. - P. 702707. 169. Haenel H., Bending J. Crijevna flora u zdravlju i bolesti // Progr. Hrana i prehrana sci.- 1975.-V. 21, N l.-P. 64. 170. Himanen J.-P., Pyhala L., Olander R.-M. et al. Biološka aktivnost lipo-teihoične kiseline i peptidoglikana teihoične kiseline Bacillus subtilis 168 // J. Gen. Microbiol. - 1993.-V. 139, N 11.-Str. 2659-2665. 171. Hirano Y., Matsudo M., Kameyama T. Dvodimenzionalna poliakrilamidna gel elektroforeza proteina sintetiziranih tijekom ranog klijanja Bacillus subtilis 168 u prisutnosti aktinomicina D // J. Basic Microbiol. 1991. - V. 31, N 6. - P. 429-436. 172. Humbert Florence Les probiotigues: un sujet d" actualite // Bull. inf. Stat. exp. auicult. Ploufragan. 1988. - V. 28, br. 3. - P. 128-130. 173. Inouye S., Kondo S. Amicoumacin i SF-2370, farmakološki aktivni agensi mikrobiološkog podrijetla // Novel Microbial Prod. Med. i Agr. Amsterdam. -1989.-Str. 179-193 (prikaz, ostalo). 174. Johnson S. E. Smrtonosni toksin Bacillus cereus 1. Odnosi i priroda toksina, hemolizina i fosfolipaze // J. Bacterid. 1967. V. 94, N 2. - P. 306316. 175. Kakinuma A., Hori M., Isono M. Određivanje masne kiseline u surfaktinu i razjašnjenje ukupne strukture surfaktina // Agric. i Biol. Chem. 1969. - V. 33. - P. 973-976. 176. Kaneko J., Matsushima H. Kristalna struktura u sporulacijskim stanicama Bacillus subtilis 168 // J. Electron. Microsc - 1973. V. 22, N 2. - P. 217-219. 177. Kaneko J., Matsushima H. Kristalne inkluzije u sporulirajućim stanicama Bacillus subtilis // U: Spore YI. Izaberi. Papa 6. međ. Spore Conf. Washington. - 1975. -Str. 580-585 (prikaz, ostalo). 178. Kitazawa H, Nomura M, Itoh T. J Dairy Sci 1991; 74:7:2082 2088. 179. Kubo Kazuhiro. Čista kultura Bacillus subtilis FERM BP-3418 // Pat. N 5364738. SAD. MKI A01N 25//00. - objav. 15.11.94. 180. Kudrya V.A., Simonenko L.A. Izolacija alkalne serin proteinaze i lektina iz tekućine kulture Bacillus subtilis // Appl. Microbiol i Biotechnol. -1994.-V. 41, N5.-P. 505-509 (prikaz, ostalo). 181. Le H., Anagnostopoulos C. Detekcija i karakterizacija prirodnih plazmida // Molec. Gen. Genet. 1977. - V. 157. - P. 167-174. 182. Legakis N.J., Papavassilion J. Tehnika tankoslojne kromatografije za brzo otkrivanje bakterijskih fosfolipaza // J. Clin. Microbiol. - 1975. V.2, N 5. - P. 373-376. 183. Leviveld H.L.M., Bachmayer H., Boon B. et al. Sigurna biotehnologija. Dio 6. Procjena sigurnosti mikroorganizama koji se koriste u biotehnologiji za ljudsko zdravlje // Appl. Microbiol i Biotechnol. 1995. V. 43, N 3. - P. 389-393. 184. Lin S.-C., Carswell K.S., Sharma M.M., Georgiou G. Kontinuirana proizvodnja lipopeptidnog biosurfaktanta Bacillus licheniformis JF-2 // Appl. Microbiol i Biotechnol. 1994. - V. 41, N 3. - P. 281-285. 185. Lovett P., Bramucci M. Plazmidna DNA u bacilima // U: Microbiology-Washington. 1976. - Str. 388-393. 186. Markham R., Wilkie B. Utjecaj deterdženta na aerosolnu alergijsku senzibilizaciju s enzimima vas. subtilis // Int. Arh. Alergija i prim. Immunol. 1976.-V. 51, N 5. - P. 529-543. 187. Maruta Kiyoshi Isključivanje crijevnih patogena kontinuiranim hranjenjem Bacillus subtilis C-3102 i njegov utjecaj na crijevnu mikrofloru brojlera // Anim. Sci. i tehnol. 1996. - V. 67, N 3. - P. 273-280. 188. Moszer I., Glaser P., Danchin A. SubtiList: Relacijska baza podataka za genom Bacillus subtilis // Microbiology. 1995. - V. 141, N 2. - P. 261-268. 189. Murray P.R., Baron E.J., Pfaller M.A., Tenover F.C., Jolken R.H., Priručnik kliničke mikrobiologije, 7. izdanje, Washington D.C., ASM Press, 1999. 190. Nozari-Renard J. Indukcija d 5, O Interferon par Bacillus subtilis // Ann. Microbiol. 1978. - V. 129a. - N 4. - Str. 525-542. 191. Oh M.K., Kim B.G., Park S.H. Važnost mutanata spora za šaržnu i kontinuiranu fermentaciju Bacillus subtilis // Biotechnol. i Bioeng. 1995.-V. 47, N 6. - Str. 696-702. 192. Payne Jewel M. Izolati Bacillus thuringiensis Hist su aktivne ajanističke nematode / Patent N 5151363, C12 N 1/20, A 01 N 63/00, prijava. 27.07.90., objav. 29.09.92. 193. Pepys J., Hargreave F., Longbotton Y. Alergijske reakcije pluća na enzime Bacillus subtilis // Lancet. 1969. - V. 1, N 44 - 7607. - P. 1181-1184. 194. Peterson W.L., Mackrowiak Ph.A., Barnett C.C. et al. Ljudska želučana baktericidna barijera: Mehanizmi djelovanja, relativna antibakterijska aktivnost i utjecaj prehrane.//J. infekcija bolesti. -1989. -159 broj 5. -str.978-985. 195. Prasad S.S.V., Shethna G.J. Biokemijske biološke aktivnosti proteinskih kristala Bacillus thuringiensis // J. Sci. i Ind. Res. 1976. - V. 35, N 10. - P. 626-632. 196. Rocchietta I. Upotreba Bacillus subtilis u liječenju bolesti/Minerva Med. -1969. -60. N3/4. -P. 117-123 (prikaz, ostalo). 197. Rosenthal G.J., Corsini E. // Methods Immunotoxicol. 1995. V 1, P 327-343 198. Rychen G., Simoes Nunes C. Effets des flores lactigues des produits laitiers fermentes: Une base scientifigue pour l "etude des probiotiques microbiens dans l"espece porcine // Prod. anim. 1995. - V. 8, N 2. - P. 97-104. 199. Salminen Seppo Klinički aspekti probiotika //Ecol. zdravlje i bolest.-1999.- 11.-N4.-P. 251-252 (prikaz, ostalo). 200. Shore N., Greene R., Kezeni H. Disfukcija pluća u trudnica izloženih Bacillus subtilis // Environm. Res. 1971. - V. 4, N 6. - P. 512-519. 201. Slein M., Logan G., Karakterizacija vasih fosfolipaza. cereus i njihovi učinci na eritrocite, koštane i bubrežne stanice // J. Bacteriol. 1965. - V. 90, Nl.-P. 69-81 (prikaz, stručni). 202. Somerville H.J. Insekticidni endotoksin Bacillus thuringiensis // U: Sem. etida tema Prod., natur. et prot. biljka. 1977. - P. 253-268. 203. Spira W., Goepfert J. Biološka svojstva enterotoksina koje proizvodi Bacillus cereus // Can. J. Microbiol. 1975. - V. 21, N 8. - P. 1236-1246. 204. Stgard Henri Microbielle v kstfremmer til svin. Teori og prasksis/ Dan veterinaertidsskr. 1989. - V. 72, N 15. - P. 855-864. 205. Su Li, Zhang Zhihong, Xiao Xianzhi, Wang Xiaomin Wuhan daxue xuebao. Ziran kexue ban // J. Wuhan Univ. Natur. Sci. ur. 1996. - V. 42, N 4. - C. 516518. 206. Sumi H. Fiziološka funkcija natto // J. Brew. Soc. Japanac 1990. - V. 85, N 8.-P. 518-524 (prikaz, ostalo). 207. Tihole F. Fiziološki pomer backteriemije z geiunalo mikroflore // Zdravstv vestn 1982. - V. 51, N 1. P. 3-5. 208. Towalski Z., Rothman H. Enzimska tehnologija //u: Biotehnološki izazov. Cambridge University Press. Cambridge, 1986. - str. 37 -76. 209. Tsuge Kenji, Ano Takashi, Shoda Makoto. Karakterizacija Bacillus subtilis YB8, koproducenta lipopeptida surfaktina i plipastatina B1 //J. Gen. i prim. Microbiol. 1995.- 41, N 6. Str. 541-545. 210. Van der Waaij D. Kolonizacijska otpornost probavnog trakta: mehanizam i kliničke posljedice.//Nahrung. -1987. -31 broj 5. -str.507-524. 211. Vollaard E.J., Clasener H.A.L., Janssen J.H.M. Doprinos Escherichia coli otpornosti mikrobne kolonizacije.//.!, Antimikrobne kemoterapije. -1990.- 26. -str.411-418Uvod Disertacija iz biologije na temu "Biološka svojstva sojeva Bacillus subtilis perspektivna za stvaranje novih probiotika"
Zaključak Disertacija na temu "Mikrobiologija", Gataullin, Airat Gafuanovich
Bibliografija Disertacija iz biologije, kandidat bioloških znanosti, Gataullin, Airat Gafuanovich, Moskva
