El agente causante de la difteria (Corynebacterium diphtheriae). Corynebacterium diphtheriae (difteria corynebacterium)
El agente causante de la difteria pertenece al género Corynebacterium (del latín coryna - club, difteria - película). Las bacterias tienen engrosamientos en forma de maza en los extremos. Este género incluye bacilos de difteria patógenos para los humanos y especies no patógenas: bacilos de pseudodifteria y difteroides, que se encuentran en las membranas mucosas y la piel.
Los agentes causantes de la difteria, Corynebacterium diphtheriae, fueron descubiertos por T. Klebs (1883) y aislados en forma pura F. Leffler (1884).
Morfología. Los agentes causantes de la difteria son varillas delgadas, ligeramente curvadas, de 3-6 × 0,3-0,5 micrones de tamaño, con engrosamientos en los extremos. Estos espesamientos contienen granos de volutina (granos de Babesch-Ernst). Las bacterias de la difteria son inmóviles y no tienen esporas ni cápsulas. Gram positivas. Están bien coloreados con tintes de anilina básicos, mientras que los granos de volutina se colorean más intensamente. Para colorear se suele utilizar azul de metileno alcalino o violeta cristal. Una característica de Corynebacteria diphtheria es su polimorfismo; en una cultura hay bastoncillos de diferentes formas y tamaños: curvos, rectos, largos, cortos, gruesos y, a veces, cocobacterias. La ubicación de las bacterias en los frotis es característica: generalmente se ubican en pares en un ángulo agudo u obtuso, en forma de dedos extendidos, etc. La ubicación en los frotis y la presencia de granos de volutina es un signo de diagnóstico diferencial durante el examen microscópico. Los representantes no patógenos del género Corynebacteria, los bacilos pseudodiftéricos y diftériodos, suelen estar dispuestos en forma de empalizada, pueden no tener granos de volutina o estar en un extremo (ver Fig. 4).
Cultivo. Corynebacterium diphtheria son anaerobios facultativos. Crecen a una temperatura de 35-37° C, pH 7,4-7,8. No se reproducen en condiciones normales. medios nutritivos. Se cultivan en medios que contienen sangre o suero.
A finales del siglo XIX, el científico francés E. Roux propuso utilizar suero coagulado de bovino o de caballo para cultivar bacterias de la difteria, y F. Leffler recomendó agregarle caldo (25%) y 1% de glucosa. En estos medios, las corinebacterias crecen rápidamente; en 14 a 18 horas forman colonias convexas de color crema que no se fusionan (el crecimiento en un medio inclinado se asemeja al cuero de piel de shagreen). Sin embargo, es imposible diferenciar los bacilos de la difteria de los bacilos de la pseudodifteria en estos medios.
Actualmente, los principales medios de cultivo son el medio de Clauberg (que contiene suero sanguíneo y telurito de potasio), el medio de quinosol de Bunin, el medio de Tinsdal, etc. Según las propiedades culturales y enzimáticas de las corinebacterias, la difteria se divide en tres biovares: gravis, mitis), intermedius . Biovar gravis generalmente se encuentra en la forma R. En el medio de Clauberg, las bacterias de esta biovar crecen en forma de grandes colonias de 2-3 mm, de color negro grisáceo (ya que reducen el telurito a telurio) y tienen bordes dentados, lo que les da la apariencia de una roseta. Cuando tocas la colonia con un lazo, parece desmoronarse. En el caldo, las bacterias de este biovar forman una película que se desmorona y un sedimento granular.
Corynebacterium biovar mitis crece en el medio de Clauberg en forma de colonias pequeñas y lisas (forma de S) de color negro. En el caldo dan una turbidez uniforme.
Corynebacteria biovar intermedius (intermedinas) son intermedias. En el medio de Clauberg, las bacterias de este biovar a menudo crecen en forma de colonias negras, pequeñas y brillantes (este biovar es raro).
Propiedades enzimáticas. Los tres biovares de bacterias de la difteria poseen la enzima cistinasa, que descompone la cistina para producir sulfuro de hidrógeno. Estas propiedades se utilizan para diferenciar los patógenos de la difteria de los representantes no patógenos de este género (Tabla 49).
Nota. + reacción positiva (se descompone); - reacción negativa (no se divide).
Los patógenos de los tres biovares descomponen la glucosa y la maltosa para formar ácido. C. gravis descompone el almidón. Esta propiedad lo distingue de los otros dos biovares. Corynebacterium diphtheria reduce los nitratos a nitritos, no forma indol y no descompone la urea.
Corynebacterium diphtheria produce neuraminidasa, hialuronidasa y otras enzimas patógenas.
Formación de toxinas. Las cepas virulentas de patógenos de la difteria producen exotoxinas. Químicamente, es una proteína termolábil que consta de dos fracciones. La fracción B fija la toxina en los tejidos corporales sensibles a ella. La facción A es responsable de efecto tóxico. La potencia de los cultivos de toxina diftérica se puede determinar "in vivo" en cobayas sensibles a la toxina. La exotoxina diftérica tenue es la dosis letal mínima, esta es la cantidad mínima de veneno que mata a un conejillo de indias de 250 g al cuarto día.
La presencia de exotoxina también se puede detectar "in vitro", en un medio nutritivo sólido. Este método se utiliza ampliamente en el trabajo práctico. La exotoxina diftérica es inestable. Se descompone rápidamente bajo la influencia de la temperatura, la luz y el oxígeno atmosférico. Después de agregar formalina (0,3-0,4%) a la toxina y mantenerla a una temperatura de 37-38 ° C durante varias semanas, se convierte en un toxoide, que pierde su toxicidad, pero conserva las propiedades antigénicas de la toxina. Las toxinas producidas por diferentes cepas no se diferencian entre sí y pueden ser neutralizadas por la antitoxina diftérica *.
* (Ahora se ha establecido que todos los biovares de corinebacterias pueden ser toxigénicos y no toxigénicos.)
Estructura antigénica. Las bacterias de la difteria tienen un antígeno proteico termolábil de superficie y un antígeno O polisacárido específico de tipo. Además, entre las corinebacterias se distinguen 19 productos de fagos, que se tienen en cuenta a la hora de identificar cultivos. Los fagovares se utilizan para identificar la fuente de la enfermedad.
Resistencia a los factores ambientales.. Los agentes causantes de la difteria son relativamente estables. Una temperatura de 60° C los mata en 10-15 minutos, 100° C los mata en un minuto. En película resisten un calentamiento de hasta 90° C. En suero de leche enrollado a temperatura ambiente duran hasta 2 meses, en juguetes para niños, varios días. Las corinebacterias toleran bien las bajas temperaturas. Los patógenos de la difteria son bastante resistentes al secado. Los desinfectantes (solución de fenol al 3%, solución de sublimado al 1%, solución de peróxido de hidrógeno al 10%) matan estas bacterias en unos pocos minutos.
Susceptibilidad animal. EN condiciones naturales los animales no contraen difteria. De los animales de experimentación, los cobayas y los conejos son los más susceptibles. Con infección intradérmica o subcutánea, se desarrolla un cuadro de infección tóxica con formación de inflamación, edema y necrosis en el lugar de la inyección. Se observan hemorragias en las glándulas suprarrenales.
Fuentes de la enfermedad.. Personas enfermas y portadoras de bacterias.
Rutas de transmisión. Gotitas en el aire, contacto doméstico (a través de platos, juguetes, libros, toallas, etc.).
Enfermedad en humanos: 1) difteria de la faringe; 2) difteria nasal.
Menos comunes son la difteria de la tráquea, los bronquios, los ojos, los oídos, la vagina y la difteria de la piel dañada.
Patogénesis. Las puertas de entrada son las membranas mucosas del tracto respiratorio y la piel dañada. Una vez en la membrana mucosa, los patógenos de la difteria se multiplican en el lugar de penetración y causan necrosis tisular. Se forma una película que está estrechamente asociada con los tejidos subyacentes. En la superficie de la mucosa aparecen depósitos sucios de color gris o amarillento, que consisten en epitelio destruido, fibrina, leucocitos y Corynebacterium diphtheria. Al retirar la película con un hisopo de algodón o una espátula, la superficie de la mucosa puede sangrar.
Durante la proliferación de Corynebacterium diphtheria, la exotoxina se acumula en áreas necróticas, lo que puede provocar inflamación de las membranas mucosas y los tejidos. Desde la membrana mucosa, la hinchazón puede extenderse a la laringe, los bronquios y provocar asfixia. La toxina que circula en la sangre afecta selectivamente al músculo cardíaco, las glándulas suprarrenales y las células del tejido nervioso.
La difteria es una infección tóxica. La gravedad del proceso depende del grado de toxigenicidad de la cepa y de las defensas del organismo.
Inmunidad. La inmunidad es causada por inmunidad antitóxica y antibacteriana. Bebés no enferman porque tienen inmunidad pasiva transmitida por su madre.
La presencia de inmunidad antitóxica se juzga por la reacción de Schick. Para configurar una reacción 1/40 Dlm ( dosis letal Se inyecta por vía intradérmica en el antebrazo la toxina de cobaya, contenida en 0,2 ml de solución isotónica de cloruro de sodio. Si no hay antitoxina en la sangre, aparece enrojecimiento e hinchazón (hasta 2 cm de diámetro) en el lugar de la inyección después de 24 a 48 horas. Si hay antitoxina presente, no hay hinchazón ni enrojecimiento (la antitoxina presente en la sangre neutralizó la toxina inyectada).
La enfermedad transferida deja inmunidad. Sin embargo, en el 6-7% de los casos se observan enfermedades recurrentes.
Prevención. Diagnostico temprano. Aislamiento. Desinfección. Identificación de portadores del bacilo toxigénico de la difteria.
Prevención específica llevado a cabo mediante la introducción de toxoide. En la URSS llevan a cabo vacunación obligatoria niños con la vacuna DTP es una vacuna compleja que incluye difteria y toxoide tetánico y una suspensión de barras de tos ferina muertas. Los niños se vacunan a partir de los 5-6 meses con posterior revacunación. Para la revacunación se administra una vacuna sin barras de tos ferina.
Tratamiento específico. Se utiliza suero antitóxico antidiftérico. La dosis y la frecuencia las determina el médico tratante y también se administran medicamentos antimicrobianos.
Preguntas de control
1. ¿Cuál es la morfología de Corynebacterium diphtheria y qué biovares existen?
2. ¿En qué medios se cultivan las bacterias de la difteria y cuál es el patrón de crecimiento?
3. ¿La relación con qué carbohidrato permite distinguir el biovar gravis de otros biovares de difteria?
4. ¿Cuál es la vía de transmisión y dónde se localiza con mayor frecuencia el agente causante de la difteria en un paciente?
5. ¿Cuáles son la prevención específica y el tratamiento específico de la difteria?
Examen microbiológico
Objeto del estudio: aislamiento del patógeno para diagnóstico. Identificación de portadores de bacterias diftéricas según indicaciones epidemiológicas. Detección de exotoxina en cultivo aislado.
Material para la investigación
1. Descarga de la membrana mucosa de la faringe.
2. Secreción de la mucosa nasal.
3. Secreción de la membrana mucosa del ojo.
4. Pus del oído.
5. Secreción de la mucosa vaginal.
6. Secreción de la herida.
El material para la investigación depende de la localización del proceso.
Para cualquier localización del proceso, es imperativo examinar la membrana mucosa de la faringe y la nariz. El material se recoge con un hisopo de algodón, para lo cual se utiliza un alambre de metal, preferiblemente de aluminio, en un extremo del cual se enrolla firmemente un algodón, luego se monta el hisopo en un tapón de corcho, se coloca en un tubo de ensayo y se esteriliza en un Horno Pasteur a temperatura de 160°C 1 hisopo por una hora o en autoclave a temperatura 112°C.
Notas 1. El material se recoge con el estómago vacío o no antes de 2 horas después de una comida y no antes de 4 días después del tratamiento con antibióticos u otros agentes antibacterianos. 2. Si el material se extrae de la garganta y la nariz, se etiquetan y unen los tubos con ambos hisopos. Los cultivos se realizan por separado y el material de cada hisopo se examina como un trabajo independiente. 3 El material recolectado con un hisopo seco debe inocularse a más tardar 2 a 3 horas después de la recolección. Si es necesario transportar el material recolectado, el hisopo se humedece previamente con una solución de glicerina al 5% en una solución isotónica de cloruro de sodio.
Métodos básicos de investigación.
1. Microbiológico.
2. Bacterioscópico.
3. Biológico.
Progreso del estudio.
Segundo día de estudio.
Las tazas se retiran del termostato y se inspeccionan. El crecimiento de bacterias en el medio de Clauberg puede verse frenado debido a la presencia de inhibidores en el medio. En este caso, las tazas se colocan en el termostato durante otras 24 horas.
Tercer día de estudio.
Las copas se retiran del termostato y se examinan con una lupa o un microscopio estereoscópico. Si existen colonias sospechosas, parte de ellas, bajo el control de un microscopio estereoscópico, se aísla en agar con suero al 25% y en una columna con medio Pisa para determinar la enzima cistinasa. Se realiza una prueba de toxigenicidad en otra parte de las colonias.
Durante un examen microscópico de colonias extraídas del medio de Clauberg, las corinebacterias de la difteria pierden su especificidad: no hay granularidad, el tamaño cambia y la ubicación sigue siendo la misma. Cuando se inoculan en medios con suero, se restablece la especificidad morfológica de los patógenos de la difteria.
Para identificar los patógenos de la difteria, es obligatorio realizar una prueba de presencia de la enzima cistinasa y determinar la toxigenicidad. Si el resultado de estos experimentos, realizados con parte de las colonias del medio Clauberg, no es lo suficientemente claro o negativo, se repite el experimento utilizando el cultivo puro aislado.
prueba de cistinasa. El cultivo en estudio se siembra inyectándolo en el centro de una columna de medio Pisa. Si la reacción es positiva, después de 18-24 horas, se observa ennegrecimiento durante la inyección y se forma una nube oscura alrededor de la varilla negra; El ennegrecimiento se produce como resultado del hecho de que la enzima cistinasa descompone la cistina, que forma parte del medio Pisa, y el azufre liberado reacciona con el acetato de plomo: se forma el sulfito de plomo negro. Los bacilos difteroides y pseudodiftéricos no contienen la enzima cistinasa, por lo tanto, cuando crecen en medio Pisu, el color del medio no cambia.
Determinación de exotoxina.. Se realiza mediante el método de precipitación difusa en gel. El método se basa en la interacción de una toxina con una antitoxina. En aquellas zonas del agar donde interactúan estos componentes, se forma un precipitado en forma de líneas redondeadas.
Método de determinación: Se vierte agar Marten derretido y enfriado a 50°C, pH 7,8, en placas de Petri (el agar Martin produce mejor exotoxina). La cantidad de agar en el plato no debe ser superior a 12-15 ml para mantener la transparencia; en una capa gruesa, las líneas de precipitación son difíciles de ver. Una vez endurecido el agar, aplicar una tira de papel de filtro esterilizado humedecido con suero antitóxico antidiftérico.
El cultivo de prueba se inocula con “placas”. La siembra se realiza mediante bucle. El diámetro de las placas es de 0,8 a 1,0 cm, la distancia de las placas al borde de las tiras de papel es de 0,5 a 0,7 cm, entre dos placas del cultivo de prueba se inoculan placas de una cepa toxigénica conocida. El cultivo de prueba se considera toxigénico si las líneas de precipitación son claras y se fusionan con las líneas de precipitación de la cepa de control (toxigénica). Si las líneas de precipitación se cruzan con las líneas de la cepa de control o están ausentes, el cultivo aislado se considera no toxigénico (Fig. 50).
Preparando tiras de papel. Se cortan tiras de papel de filtro de 1,5 x 8 cm, se envuelven varios trozos en papel y se esterilizan en autoclave a una temperatura de 120 ° C durante 30 minutos. Antes de realizar el experimento, retire una tira con unas pinzas esterilizadas, colóquela en una placa de Petri esterilizada y humedézcala con suero antitóxico antidiftérico. Primero se diluye el suero de modo que 1 ml contenga 500 AE (unidades antitóxicas). El papel se humedece con 0,25 ml de suero (125 AU) y se coloca sobre la superficie del medio. Luego se realizan los cultivos de la forma indicada anteriormente. Todos los cultivos se colocan en un termostato. Los resultados se registran a las 18-24 y 48 horas.
Cuarto día de investigación
Se retiran los cultivos del termostato y se tienen en cuenta los resultados. Los frotis se elaboran a partir de un cultivo cultivado en un medio con suero y teñido con azul de Loeffler.
La presencia en los frotis de bastoncillos característicos de su morfología, un bastoncillo negro con una nube en medio de Pisu y líneas de precipitación en agar permiten dar una respuesta preliminar: “Se ha detectado Corynebacterium diphtheria”. La investigación continúa. Si no hay líneas de precipitación en el agar o su claridad es insuficiente, se debe repetir la prueba de toxigenicidad con un cultivo puro aislado.
Para la identificación final del cultivo aislado y la determinación del biovar del patógeno, se realiza la inoculación en glucosa, sacarosa, almidón y caldo con urea (para detectar la enzima ureasa). La siembra sobre sustrato se realiza de la forma habitual.
Prueba de ureasa. El cultivo aislado se siembra en caldo con urea y un indicador (rojo cresol) y se coloca en un termostato. Después de solo 30-40 minutos, se puede tener en cuenta el resultado: al inocular verdaderos patógenos de difteria, el color del medio no cambia, ya que no contienen ureasa. Los bacilos de Pseudodiphteria descomponen la urea y cambian el indicador: el medio se vuelve rojo carmesí.
Quinto día de investigación.
Los resultados se registran (Tabla 50).
Preguntas de control
1. ¿Qué material se examina para identificar el agente causante de la difteria?
2. ¿Cómo se recolecta el material de la garganta y la nariz para realizar pruebas de difteria?
3. ¿Qué se debe hacer con el hisopo si es necesario transportar el material recolectado?
4. ¿Qué dispositivo se utiliza para estudiar colonias en el medio de Clauberg?
5. ¿Qué estudios se realizan para la identificación final del cultivo aislado?
6. ¿Qué métodos se utilizan para determinar la toxigenicidad de Corynebacterium diphtheria?
1. Tome alambre y algodón del maestro y prepare 10 tampones, instálelos en un tapón de corcho, insértelos en un tubo de ensayo y esterilícelos.
¡Atención! Antes de la esterilización, compruebe si el tampón está lo suficientemente apretado.
2. Tome hisopos esterilizados del maestro y recoja material de la garganta y la nariz de cada uno (con diferentes hisopos).
3. Estudiar desde la mesa. 49 propiedades de los patógenos de la difteria y corinebacterias relacionadas.
4. Prueba de toxicidad. Haga las placas en un bucle sin cultivo.
5. Dibujar el avance del estudio y los resultados positivos y negativos de la prueba de toxigenicidad.
Medios culturales
Medio de telurio Clauberg: primera mezcla: se prepara una mezcla de 20 ml de sangre de cordero o caballo y 10 ml de glicerina con 1,5 meses de antelación. El día de preparar el medio se preparan otras dos mezclas; la segunda mezcla: se funden 50 ml de MPA pH 7,5 y se enfrían a una temperatura de 50 ° C, después de lo cual se añaden 2,5 ml de la primera mezcla; tercera mezcla: mezcle 17 ml de sangre de oveja y 33 ml de agua destilada (la mezcla se prepara estéril), calentada en un baño de agua a una temperatura de 50 ° C. Combine la segunda y tercera mezcla, agregue 4 ml de solución al 1%. Solución de telurito de potasio K 2 TeO 3, mezclar rápidamente todo y verter en tazas. El medio es transparente y del color del vino tinto.
Miércoles Pisa. A 90 ml de MPA fundido al 2% (pH 7,6), agregue 2 ml de solución de cistina (solución de cistina al 1% en solución de hidróxido de sodio 0,1 N), mezcle bien y agregue el mismo volumen de 0,1 N. solución de ácido sulfúrico. El medio se esteriliza durante 30 minutos a una temperatura de 112 ° C. Al medio derretido y enfriado a 50 ° C, agregar 1 ml de una solución al 10% de acetato de plomo, esterilizado dos veces con vapor continuo, mezclar y agregar 9 ml de suero normal de caballo. El medio se vierte de forma estéril en pequeños tubos de 2 ml. La siembra se realiza mediante inyección.
miércoles bunin. Se añade medio quinosol seco a 100 ml. agua fría(pH 7,6-7,8), remover y calentar a fuego lento hasta que el agar se derrita (según las instrucciones de la etiqueta). Luego, el medio se hierve durante 2-3 minutos hasta que se forma espuma, después de lo cual el medio se enfría a 50 °C y se añaden 5-10 ml de sangre desfibrinada estéril. El medio se mezcla y se vierte en placas de Petri. El medio preparado se puede almacenar durante 3-4 días a una temperatura de 4-10°.
Tinsdal miércoles. A 100 ml de agar nutritivo al 2%, derretido y enfriado a 50°C, añadir: 1) 12 ml de solución de cistina al 1% a 0,1 N. solución de ácido sulfúrico; 2) 12 ml de solución de hidróxido de sodio al 1%; 3) 1,8 ml de solución de telurito potásico al 2%; 4) 1,8 ml de solución de hiposulfito de sodio al 2,5%, 20 ml de suero normal de caballo o bovino. Después de agregar cada ingrediente, el medio se mezcla bien. Las copas con medio se almacenan durante 3-4 días a 10° C.
Pregunta 2. Corynebacterium diphtheriae (género Corynebacterium)
C. diphtheriae: bacterias con forma de bastón; causa difteria (difteria griega - piel, película): una infección aguda caracterizada por inflamación fibrinosa en la faringe, laringe, con menos frecuencia en otros órganos y síntomas de intoxicación.
Propiedades morfológicas y culturales.
Corinebacterium diphteriae son bacilos grampositivos delgados, ligeramente curvados o rectos, dispuestos en ángulo entre sí en forma de cinco romanos. Están engrosados en los extremos debido a la presencia de granos. divisa en uno o ambos polos de la célula. Los granos de moneda están compuestos de polifosfatos, perciben los colorantes de anilina más intensamente que el citoplasma de la célula y se detectan fácilmente cuando se tiñen según Neisser en forma de gránulos azul-negro, mientras que los cuerpos de las bacterias son de color amarillo-verde. La tinción de Gram no revela granos moneda.
Dibujo de un frotis de un cultivo puro. Tinción de Neisser Frotis de cultivo puro.
Tinción con azul alcalino de Loeffler
El bacilo de la difteria no tiene resistencia a los ácidos, es inmóvil, no forma esporas y tiene una microcápsula con un factor de cordón incluido en su composición. La pared celular contiene galactosa, manosa, arabinosa, así como una gran cantidad de lípidos, incluidos los ácidos micólicos no estables a los ácidos.
El agente causante de la difteria es un anaerobio facultativo, heterótrofo, que crece a 37 o C en medios nutritivos complejos: suero sanguíneo coagulado, agar telurito sanguíneo.
En medios electivos, después de 8 a 14 horas forma colonias punteadas, convexas, de color crema amarillento con una superficie lisa o ligeramente granular. Las colonias no se fusionan y tienen apariencia de piel de zapa.
En medios teluritos, el agente causante de la difteria forma colonias negras o gris negruzcas después de 24 a 48 horas como resultado de la reducción del telurito a telurio metálico.
El agente causante de la difteria tiene una alta actividad enzimática. Características de diagnóstico diferencial. C. diphteriae son:
falta de capacidad para fermentar sacarosa y descomponer la urea,
capacidad de producir la enzima cistinasa.
El agente causante de la difteria no es uniforme en propiedades culturales y bioquímicas. De acuerdo con las recomendaciones de la Oficina Regional de la OMS para Europa, la especie C. diphteriae se divide en 4 biovares: gravis, mitis, intermedius, belfanti.
En medio telurito, el biovar gravis forma colonias secas, mate, grandes, planas, de color negro grisáceo, elevadas en el centro. La periferia de la colonia es clara con estrías radiales y un borde desigual. Estas colonias se parecen a una flor de margarita. Biovar mitis forma colonias pequeñas, lisas, brillantes, negras, convexas y con un borde liso, rodeadas por una zona de hemólisis. Los biovares intermedius y belfanti en realidad pertenecen al biovar mitis, ya que no descomponen el almidón, y esta característica es la más estable en C. diphteriae.
Estructura antigénica. C. diphteriae tiene un antígeno O (fracciones de lípidos y polisacáridos ubicadas profundamente en la pared celular) y un antígeno K (una proteína superficial termolábil). El antígeno O es interespecies. Según el antígeno K, se distinguen alrededor de 58 serovares.
Factores de patogenicidad. Los principales factores de patogenicidad de C. diphteriae son Estructuras superficiales, enzimas y toxinas..
Estructuras superficiales (pili, componentes de la microcápsula: factor del cordón, antígeno K, ácidos micólicos) tienen una naturaleza proteica y lipídica, promueven la adhesión de microbios en su lugar portón de entrada, previenen la fagocitosis de las bacterias, tienen un efecto tóxico sobre las células del macroorganismo y destruyen las mitocondrias.
Enzimas de patogenicidad: neuraminidasa, hialuronidasa, hemolisina, dermonecrotoxina. Neuraminidasa divide el ácido N-acetilneuramínico del moco y las glicoproteínas de la superficie celular, liasa lo descompone en piruvato y N-acetilmanosamina, y piruvato Estimula el crecimiento de bacterias. Como resultado de la acción hialuronidasa aumenta la permeabilidad de los vasos sanguíneos y la liberación de plasma más allá de sus límites, lo que conduce a la inflamación de los tejidos circundantes. dermonecrotoxina Provoca necrosis de las células en el sitio de localización del patógeno. El fibrinógeno plasmático liberado fuera de los vasos contacta con la tromboquinasa de las células necróticas del cuerpo y se convierte en fibrina, que es la esencia de la inflamación de la difteria. Dentro de la película de difteria, C. diphteriae encuentra protección contra los efectores del sistema inmunológico y los antibióticos, multiplicándose y formando grandes cantidades de El principal factor de patogenicidad es.histotoxina diftérica.
Histotoxina diftérica tiene un efecto bloqueador sobre la síntesis de proteínas en los órganos que reciben sangre con mayor intensidad: el sistema cardiovascular, el miocardio, el sistema nervioso, los riñones y las glándulas suprarrenales.
Epidemiología. En condiciones naturales, solo las personas que no tienen resistencia al patógeno e inmunidad antitóxica padecen difteria. La enfermedad está muy extendida. El mayor número de pacientes se observa en la segunda quincena de septiembre, octubre y noviembre. Los niños en edad preescolar y primaria son los más susceptibles. Entre adultos al grupo aumento del riesgo incluyen trabajadores de la restauración pública y el comercio, escuelas, preescolares e instituciones médicas.
C. diphteriae es resistente a los factores ambientales: en las gotas de saliva que se adhieren a los platos o juguetes, en las manijas de las puertas pueden persistir hasta 15 días, en objetos ambientales durante 5,5 meses y pueden multiplicarse en la leche. Cuando se hierve, C. diphteriae muere en 1 minuto, en una solución de peróxido de hidrógeno al 10%, después de 3 minutos, en una solución de ácido carbólico al 5% y alcohol al 50-60%, después de 1 minuto.
La histotoxina diftérica es muy inestable y se destruye rápidamente mediante la exposición a la luz, el calor y la oxidación.
Patogénesis.
Fuente de infección son:
1.Portadores de cepas toxigénicas: especialmente peligrosos son aquellos portadores que no presentan manifestaciones clínicas de la enfermedad, ya que tienen inmunidad antitóxica.
2.pacientes: Entre los pacientes, los de mayor importancia son aquellos con localización del proceso en el tracto respiratorio superior. El paciente es epidemiológicamente peligroso durante todo el período de su enfermedad; incluso durante el período de recuperación libera al medio ambiente cepas toxigénicas.
Principal mecanismo de infección es aerosol. Rutas de transmisión:
el papel principal pertenece a las gotitas en el aire,
a veces pueden ocurrir vías de transmisión por polvo en el aire, contacto doméstico y también nutricional (a través de la leche).
Portón de entrada Las infecciones sirven a las membranas mucosas de la orofaringe ( anginas y tejidos circundantes), nariz, laringe, tráquea, así como membranas mucosas de los ojos y genitales, piel dañada, superficie de herida o quemadura, herida umbilical sin cicatrizar.
Más común difteria de la garganta ( 90-95%). El período de incubación dura de 2 a 10 días. Según su patogénesis, la difteria pertenece a infecciones toxinémicas cuando el microbio permanece en la puerta de entrada de la infección, y Todas las manifestaciones clínicas están asociadas con la acción de la exotoxina.
Etapa inicial proceso infeccioso es la adhesión del microbio en la puerta de entrada. Al reproducirse allí, el microbio secreta g istotoxina, que tiene un efecto local sobre las células de los tejidos y también ingresa a la sangre, lo que provoca toxinemia.
En el área de la puerta de entrada, se desarrolla una reacción inflamatoria, que se acompaña de necrosis de las células epiteliales y edema, se forma una capa blanca con un tinte grisáceo o amarillento, que contiene una gran cantidad de microbios que producen toxinas.
Un síntoma característico de la difteria es película fibrinosa:
Si se forma la membrana mucosa. epitelio de una sola capa(laringe, tráquea, bronquios), ocurre inflamación lobular, aquí la película se ubica superficialmente y se separa fácilmente de los tejidos subyacentes.
Si se forma la membrana mucosa. epitelio estratificado(orofaringe, epiglotis, cuerdas vocales), ocurre inflamación diftérica cuando todas las células están firmemente conectadas entre sí y con la base del tejido conectivo subyacente. En este caso, la película fibrinosa está firmemente adherida a los tejidos subyacentes y no se puede eliminar con un tampón. Cuando intentas hacer esto, la membrana mucosa sangra.
Inmunidad. Después de una enfermedad, se forma una inmunidad antitóxica humoral intensa y persistente. La duración de la inmunidad posvacunación es de 3 a 5 años.
Diagnóstico microbiológico.
Material para la investigación Es una película fibrinosa, mucosidad de la garganta o la nariz.
La recogida de material debe realizarse dentro de las 3-4 horas (a más tardar 12 horas) desde el momento en que el paciente contacta. Para recolectar el material se utilizan hisopos de algodón secos, si la siembra se realizará dentro de 2-3 horas, al transportar el material se humedecen los hisopos con una solución de glicerina al 5%.
Métodos de diagnóstico:
El principal método de diagnóstico es bacteriológico. El laboratorio bacteriológico deberá dar respuesta en un plazo de 48 horas sobre la presencia o ausencia de C. diphteriae en las pruebas.
El material se inocula en un medio nutritivo. Se seleccionan las colonias sospechosas y se identifica el cultivo aislado:
En función de la presencia de cistinasa (prueba de Pizou): el cultivo de prueba se inocula con cistina en una columna de agar nutritivo. Los cultivos se incuban a 37 o C durante 24 horas. C. diphteriae provoca un ennegrecimiento del medio a lo largo de la inyección como resultado de la formación de sulfuro de plomo.
Para la presencia de ureasa (prueba de Sachs): se prepara una solución alcohólica de urea y una solución de un indicador, el rojo de fenol, que se mezclan antes de su uso en una proporción de 1:9 y se vierten en tubos de aglutinación. Las bacterias a estudiar se introducen en un bucle y se frotan a lo largo de la pared del tidy up. En el caso positivo, después de 20-30 minutos de incubación a 37 o C, el medio se vuelve rojo como resultado de la degradación de la urea por la ureasa.
La capacidad de C. diphteriae para producir toxina (determinada por la reacción de precipitación en agar). Para ello, se coloca una tira de papel de filtro impregnada con suero antitóxico de difteria que contiene 5000 AE/ml en una placa de Petri con agar nutritivo que contiene 15-20% de suero de caballo, 0,3% de maltosa y 0,03% de cistina. La copa se seca a 37 0 C durante 30 minutos y las cepas de prueba se inoculan con placas a una distancia de 0,6 a 0,8 cm del borde del papel. Los cultivos se incuban durante 24 horas a 37 0 C. En un caso positivo, en la unión de la toxina con la antitoxina en el medio, se forma un precipitado en forma de líneas blancas, "antenas".
Para determinar la toxigenicidad del agente causante de la difteria, se puede utilizar. bioensayo. Al cobaya se le inyecta el cultivo de prueba por vía intradérmica o subcutánea. Los cultivos toxigénicos matan a los animales en 3 a 5 días, en la autopsia se descubren glándulas suprarrenales hiperémicas y, en caso de infección intradérmica, se encuentra necrosis de la piel.
Para examen bacterioscópico(como independiente método de diagnóstico rara vez se usa debido al polimorfismo del patógeno, pero se puede realizar a pedido de un médico) Se preparan frotis a partir del material en varios vasos, un frotis se tiñe con Gram, el otro con Neisser, el tercero se trata con fluorocromo - corifosfina para microscopía fluorescente.
La presencia de inmunidad antitóxica se juzga por la reacción de Schick, la reacción de neutralización de una toxina por una antitoxina. Se inyecta 1/40 DLM de toxina diftérica en la piel del antebrazo. El enrojecimiento y la hinchazón en el lugar de la inyección indican la ausencia de antitoxinas en la sangre. Una reacción negativa de Chic indica la presencia de antitoxinas.
Para la detección acelerada de la toxina diftérica, tanto en cultivos bacterianos como en suero sanguíneo, se utiliza lo siguiente: RNGA con anticuerpo eritrocito diagnosticum, RIA y ELISA. Se utilizan métodos de investigación genética molecular. PCR.
Preparaciones para el tratamiento específico de la difteria.
Para neutralizar la histotoxina diftérica, se utiliza. suero concentrado purificado específico antidifteria para caballos, que se obtiene hiperinmunizando a los caballos con antitoxina diftérica.
El tratamiento específico con suero antidiftérico se inicia inmediatamente si se sospecha clínicamente de difteria. Es necesario elegir el modo óptimo de administración del suero, ya que la antitoxina solo puede neutralizar la toxina que no está asociada a los tejidos. Para prevenir el desarrollo de shock anafiláctico, el suero se administra fraccionadamente según A.M. Bezredke. No se recomienda la administración de suero después del tercer día de la enfermedad.
Diseñada por inmunoglobulina humana antidiftérica para administración intravenosa. Su uso produce menos reacciones adversas.
Para suprimir la proliferación de C. diphteriae en la puerta de entrada, se deben prescribir antibióticos. Los fármacos de elección son la penicilina o la eritromicina, u otros β-lactámicos y macrólidos.
Preparaciones para la prevención específica de la difteria.
Para crear inmunidad antitóxica activa artificial, utilizan toxoide diftérico. El fármaco purificado y concentrado forma parte de las vacunas asociadas:
1. vacuna adsorbida contra la tos ferina, la difteria y el tétanos (vacuna DTP),
2. toxoide diftérico-tetánico adsorbido (toxoide ADS),
3. toxoide diftérico-tetánico adsorbido con contenido reducido de antígeno (ADS-M),
4. toxoide diftérico adsorbido con contenido reducido de antígeno (AD-M).
La inmunidad básica se crea en los niños según el calendario de vacunación. Sólo una cobertura vacunal del 95% de la población garantiza la eficacia de la vacunación.
Examen microbiológico que permite identificar el agente causante de la difteria (C. diphtheriae) en el biomaterial estudiado.
Sinónimos ruso
Cultivo para bacilos de Loeffler, cultivo para BL, cultivo para bacilo de difteria.
Sinónimos en inglés
Cultivo de Corynebacterium diphtheriae, Cultivo de difteria.
Método de investigación
Método microbiológico.
¿Qué biomaterial se puede utilizar para la investigación?
Hisopo de garganta y nariz.
¿Cuál es la forma correcta de investigar?
No se requiere preparación.
Información general sobre el estudio.
Corynebacterium diphtheriae (bacilos de Leffler) son bacterias grampositivas del género Corynebacterium que son los agentes causantes de la difteria y son capaces de producir la toxina diftérica. La enfermedad se transmite por gotitas en el aire, la fuente de infección son personas enfermas o portadores de bacterias.
El período de incubación es en promedio de 2 a 5 días. La inflamación fibrinosa de las membranas mucosas de la orofaringe y del tracto respiratorio ocurre con la formación de pseudomembranas y síntomas de intoxicación general.
En forma tóxica La difteria también puede afectar el corazón y el sistema nervioso. En algunos casos, es posible que el portador sea asintomático.
El diagnóstico de difteria se basa en datos clínicos; se realiza un cultivo de difteria para confirmarlo.
¿Para qué se utiliza la investigación?
- Para confirmar el diagnóstico de difteria.
- Para diagnóstico diferencial enfermedades que cursan con síntomas similares, como amigdalitis de diversos orígenes, absceso periamigdalino, mononucleosis infecciosa, laringotraqueítis aguda, epiglotitis, asma bronquial.
- Evaluar la eficacia del tratamiento antibacteriano en curso.
¿Cuándo está programado el estudio?
- Si se sospecha difteria.
- Cuando se sepa que el paciente ha estado en contacto con pacientes con difteria.
- Después terapia antibacteriana– al menos 2 semanas después de finalizar el tratamiento con antibióticos.
- En algunos casos, antes de la hospitalización en un hospital (con fines profilácticos).
¿Qué significan los resultados?
Valores de referencia: sin crecimiento.
La identificación del agente causante de la difteria confirma el diagnóstico de difteria o, si no hay síntomas de la enfermedad, indica portador de la bacteria. En resultado negativo cultivo en un paciente con sospecha de difteria, el diagnóstico se puede confirmar cuando personas de contacto El resultado del cultivo es positivo, es decir, se aísla el agente causante de la difteria.
Razones para un resultado positivo.
- Difteria o portador asintomático de C. diphtheriae.
Razones de un resultado negativo.
- Sin difteria. La excepción son los casos en que se realizó un tratamiento con antibióticos en el momento del estudio.
¿Qué puede influir en el resultado?
Terapia antibacteriana previa.
Notas importantes
El diagnóstico de difteria se basa en el cuadro clínico de la enfermedad, por lo que el tratamiento debe iniciarse antes de obtener la confirmación de laboratorio de la enfermedad. Si el resultado del cultivo es positivo, es necesario examinar la cepa aislada de C. diphtheriae para determinar su toxigenicidad.
- Cultivo de flora con determinación de sensibilidad a antibióticos.
¿Quién ordena el estudio?
Especialista en enfermedades infecciosas, terapeuta, médico. práctica general, pediatra, otorrinolaringólogo.
Literatura
- Macgregor R.R. Corynebacterium diphtheriae. En: Principios y práctica de las enfermedades infecciosas / G.L. Mandell, Bennett JE, Dolin R (Eds); 6ª edición. – Churchill Livingstone, Filadelfia, PA 2005. – 2701 p.
- Efstratiou A. Directrices de laboratorio. Para el diagnóstico de infecciones causadas por Corynebacterium diphtheriae y C. ulceran / A. Efstratiou, R.C. Georg // Enfermedades transmisibles y salud pública. – 1999. – Vol. 2, núm. 4. – págs. 250–257.
- Enfoques actuales para el diagnóstico de laboratorio de la difteria / A. Efstratiou // J. Infect. Dis. – 2000. – Vol. 181 (Suplemento 1). – págs. S138–S145.
El contenido del artículo.
Corynebacterium difteria
Descrito por primera vez por E. Klebs en 1983 y aislado por F. Leffler en 1984.Morfología y fisiología.
Corynebacterium diphtheria tiene una forma característica de todo el género. Están ubicados en ángulo entre sí en forma de cinco romanos. Los granos de volutina se identifican tiñendo con azul de ácido acético utilizando el método de Neisser, que tiñe solo las inclusiones sin afectar el citoplasma. El bacilo de la difteria está rodeado por una microcápsula y tiene pelos. C. diphtheriae es exigente en cuanto a sustrato nutritivo. Necesitan muchos aminoácidos, carbohidratos, sales minerales. Por lo general, se cultivan en suero sanguíneo coagulado y agar sangre de telurito potásico. En este último medio, se forman colonias de dos tipos: gravis, de color gris oscuro, y mitis, de color negro, que se diferencian entre sí en características bioquímicas.Antígenos
C. diphtheriae contiene un antígeno K en una microcápsula, lo que les permite diferenciarse en serovares y un antígeno de pared celular polisacárido específico de grupo, que produce reacciones serológicas cruzadas con micobacterias y nocardia. Patogenicidad y patogénesis. Los factores de virulencia de las bacterias de la difteria son los pelos y las microcápsulas, con la ayuda de las cuales se adhieren a las células epiteliales de las amígdalas, con menos frecuencia a la laringe, la tráquea, la cavidad nasal, la conjuntiva del ojo y la vulva. Luego se produce la colonización de las células epiteliales, que se acompaña de la aparición. proceso inflamatorio. La toxicidad está asociada con la secreción de histotoxina, que consta de dos subunidades: un polipéptido tóxico y un polipéptido de transporte responsable de llevar el componente tóxico a las células diana. La formación del primero está controlada por genes bacterianos, el segundo por los genes del fago que lisogenizó la célula bacteriana. Esto indica que sólo las células lisogénicas de C. diphtheriae pueden secretar histotoxina, cuya fijación se produce en los receptores de las membranas de las células musculares del corazón, el parénquima cardíaco, los riñones, las glándulas suprarrenales y los ganglios nerviosos. En este caso, se bloquea la síntesis de proteínas en los ribosomas, lo que finalmente conduce a la muerte celular. En la difteria, por regla general, no hay bacteriemia ni septicemia debido a la localización de C. diphtheriae en las células de la laringe, donde se desarrolla inflamación fibrinoso-necrótica con formación de películas, linfadenitis y edema, que pueden provocar asfixia. Además de la difteria de la laringe, C. diphtheriae causa difteria en las superficies de las heridas y en los genitales. Las corinebacterias similares a la difteria incluyen las siguientes: C. xerosis causa conjuntivitis crónica, C. ulcerans - formas leves de enfermedades similares a la difteria, C. pyogenes y C. haemolyticum - faringitis ulcerosa necrótica, amigdalitis, gingivoestomatitis. C. pseudodyphtheriae es un habitante permanente de la piel y las membranas mucosas.Inmunidad
La intensidad de la inmunidad posinfecciosa en la difteria se debe a nivel alto antitoxina en el suero sanguíneo. Los anticuerpos antibacterianos formados durante la difteria (aglutininas, precipitinas y otros) no tienen propiedades protectoras. La presencia o ausencia de inmunidad antitóxica se juzga mediante la reacción de Schick: neutralización de una toxina por una antitoxina. Cuando se inyecta la toxina diftérica V40 DLM en la piel del antebrazo, aparece enrojecimiento e hinchazón en ausencia de antitoxina en la sangre. En presencia de antitoxina, la reacción de Schick es negativa.Ecología y epidemiología
El hábitat de C. diphtheriae son las personas, en cuyas gargantas se localizan. La difteria afecta principalmente a los niños. Sin embargo, en los últimos 30 años, la difteria ha madurado. En los adultos, la difteria es grave y puede ser mortal. EN ambiente Las bacterias de la difteria permanecen viables durante varios días porque toleran la desecación. La infección ocurre por gotitas en el aire y con menos frecuencia. por contacto.Difteria
Difteria aguda, principalmente en niños. enfermedad infecciosa, que se manifiesta por una inflamación fibrinosa característica en el sitio de localización del patógeno y una intoxicación grave del cuerpo con exotoxina diftérica. Su agente causal es Corynebacterium diphtheriae, que pertenece al género Corynebacterium. Antes de este género existen alrededor de 20 especies más de bacterias que son patógenas para humanos, animales y plantas. De estos, el de mayor importancia es para medicina practica tener lo siguiente: 1. S. ulcerans - puede provocar faringitis, lesiones cutáneas, también se detecta en personas sanas, en productos lácteos y contenedores para su transporte, algunas cepas son toxigénicas.2. S. jeikeium (anteriormente Corynebacterium JK): causa neumonía, endocarditis, peritonitis, infecta heridas y piel.3. C. cistitidis (anteriormente corynebacterium grupo D2): inicia la formación de cálculos en tracto urinario y neumonía.4. S. minutissimum: causa eritrasma, abscesos pulmonares, endocarditis.5. S. haemolyticum: puede causar amigdalitis, celulitis, abscesos cerebrales, osteomielitis y dermatitis crónica.6. C. xerosis: anteriormente se consideraba el agente causante de la xerosis (conjuntivitis crónica), ahora se clasifica como saprófito.7. C. pseudodiphtheriticum es un saprófito que vive en la membrana mucosa de la nasofaringe humana.Recogida y entrega de material al laboratorio.
El material para la investigación es una película de amígdalas, arcos, paladar, úvula, moco de la faringe y la nariz, con menos frecuencia secreción del ojo, oído, herida, vagina y área afectada de la piel. A petición del epidemiólogo, se examinan los desechos de juguetes y otros objetos, algunos productos alimenticios(leche, helado). El material debe tomarse antes del inicio del tratamiento etiotrópico en ayunas o 2 horas después de comer, para la toma del material se utilizan tampones, secos o prehumedecidos con una solución de glicerina al 5%, colocados en un tubo de ensayo y esterilizados con él. El material de prueba se toma de la orofaringe y la nariz con dos hisopos separados, tratando de tomarlo en el borde de la zona sana y afectada mediante movimientos de rotación, sin tocar con el hisopo la mucosa de las mejillas, los dientes y la lengua, que es presionado con una espátula. Durante la laringoscopia, se extrae una película o moco directamente de la laringe. En todos los casos se deben tomar películas y mocos de la boca y la nariz, incluso en casos de difteria de localizaciones raras (piel, heridas, ojos, oídos, vulva). Si es necesario realizar una bacterioscopia inicial a petición de un médico, el El material se toma con un hisopo separado (adicional) o una parte de la muestra filmada se envía en película, cuidadosamente triturada entre dos portaobjetos de vidrio. Después de recolectar el material, los hisopos se colocan en los mismos tubos de ensayo, en los que se indica el número, la fecha y Se escriben la hora de recogida y el nombre del médico. Deben ser entregados al laboratorio a más tardar 3 horas después de la toma del material. Si el esquema de muestreo implica tomarlo junto a la cama del paciente, los tubos de ensayo y las placas con cultivos se envían inmediatamente al laboratorio o se incuban a 37 ° C y se entregan después de 20 a 23 horas, en clima frío, en bolsas con almohadillas térmicas.Examen bacterioscópico
El examen bacterioscópico del material de un paciente se lleva a cabo únicamente a petición de un médico y únicamente para reconocer la angina necrotizante de Simanovsky-Plaut-Vincent (identificación de bastoncillos fusiformes y espiroquetas de Vincent, que no crecen con el cultivo convencional). métodos) Durante muchos años examinación microscópica y la identificación de granos de volutina, teñidos según los métodos de Leffler y Neisser, fue la base para el diagnóstico de laboratorio de la difteria y la detección del transporte bacteriano. Actualmente, debido a la variabilidad de las bacterias de la difteria bajo la influencia de antibióticos, no se recomienda la microscopía primaria del material de prueba. El examen bacterioscópico se lleva a cabo para identificar colonias atípicas en medios de telurito sanguíneo y para verificar la pureza de cultivos aislados. Los frotis se tiñen con Gram, Leffler y Neisser. Se pueden pintar con violeta de acetato de metilo, azul de toluidina o colorantes de bentiazol y tiazina. Los bacilos de difteria en frotis se encuentran en ángulo, en forma de letras latinas V, X, Y, o forman grupos que se asemejan a un manojo de cerillas dispersas. Los granos de volutina se encuentran, por regla general, en los polos de las células microbianas. Las bacterias pseudodiftéricas y los difteroides se encuentran en paralelo (en forma de "valla") y, por supuesto, no tienen granos de volutina. Los granos de Babesch-Ernst se pueden detectar mediante microscopía de fluorescencia cuando los frotis se tiñen con corifosfina. Los granos adquieren un color rojo anaranjado sobre el fondo de cuerpos celulares bacterianos de color amarillo verdoso.Investigación bacteriológica
El material clínico se inocula en agar sangre y agar telurito sangre (o medio Clauberg II) y se vierte en placas de Petri. Es necesario un cultivo en agar sangre para detectar otra microflora. Además, algunas cepas de Cdiphtheriae son sensibles a la acción del telurito potásico, por lo que se puede inhibir su crecimiento en medios con telurito. Para detectar el transporte de bacterias de la difteria, los cultivos se realizan únicamente en agar telurito sangre, ya que el inóculo puede contener una pequeña cantidad de bacilos de difteria, cuyo crecimiento en medios no selectivos será suprimido por otra microflora. En este caso también se permite el uso de un medio de transporte.Agar sangre telurina
A 100 ml de agar nutritivo al 2%, pH 7,6, derretido y enfriado a 50 ° C, añadir 10-15 ml de sangre desfibrinada y 2 ml de solución de telurito potásico al 2%. La mezcla se mezcla bien y se vierte en placas de Petri estériles en una capa de 3-4 mm de espesor.Miércoles Clauberg II
A 100 ml de agar nutritivo al 3% pH 7,6, derretido y enfriado a 50 ° C, añadir 3 ml de solución de telurito potásico al 2%, 10 ml de mezcla de glicerol y 50 ml de sangre hemolizada. Se prepara una mezcla de glicerina añadiendo 20 ml de glicerina estéril a 40 ml de sangre desfibrinada. La mezcla se puede conservar en el frigorífico durante 4 meses. Para preparar sangre hemolizada (“barnizada”), agregue 16 ml de sangre desfibrinada a 34 ml de agua destilada estéril.Medio de transporte semilíquido
A 100 ml de digerido de Hottinger o caldo de peptona de carne agregar 1 g de cualquier agar comercial, ajustar el pH a 7,6, esterilizar en autoclave a 112 °C durante 30 minutos, agregar asépticamente 10 ml de suero y 1 ml de telurito potásico al 2%. . El medio se vierte en tubos de ensayo de 5 ml. Si es posible, también se utiliza un medio de transporte Emes (AMIES) más complejo, modificado por Stewart. La inoculación de un paciente se realiza en una placa, utilizando la mitad del medio para la inoculación desde la orofaringe (amígdalas, arcos, úvula). y el segundo para la inoculación con otro hisopo de la nariz. Si hay material para estudiar de la piel, ojos, oídos y otras localizaciones, agregue otra taza. No se puede sembrar material de varios pacientes en una placa. Antes de la inoculación, los medios se calientan en un termostato durante 15 a 20 minutos. Al inocular el material de prueba, frótelo con un hisopo primero en una sección separada de agar sangre con un área de 2x1 cm, luego de manera similar en agar telurito sangre. (o medio Clauberg II), mientras se gira constantemente el hisopo para inocular todo el material que queda del mismo. Luego, con el mismo hisopo, se inoculan las superficies restantes del medio (media taza) con vetas. Esta técnica de cultivo en placas produce colonias aisladas (cultivo puro), que se utilizan directamente de la placa para determinar la toxigenicidad y su posterior identificación. Las placas o tubos inoculados con medio de transporte se incuban en un termostato a 37 ° C durante 20 a 24 horas y el segundo día se examina la naturaleza de las colonias con un microscopio estereoscópico. Si no hay crecimiento en ambos medios, se vuelve a tomar una muestra del material. Se seleccionan las placas con colonias típicas y sospechosas de C.diphtheriae para una mayor identificación del cultivo mediante todas las pruebas. No es necesario realizar microscopía de colonias sospechosas. Las colonias de bacilos de difteria en agar sangre son blanquecinas o color amarillento, opaco, redondo, ligeramente convexo, de 1-2 mm de diámetro. Generalmente tienen una consistencia aceitosa, aunque algunas pueden formar colonias R duras y quebradizas. En medios de telurito sanguíneo, KonomiC.diphtheriae tiene color gris , convexo, de borde liso, viscoso. A las 48 horas adquieren un color gris oscuro o negro con brillo metálico, bordes iguales o ligeramente festoneados, lisos o con superficie rayada radialmente (forma R), viscosos o quebradizos al tacto con un lazo. Colonias de 48 horas en medios de telurito y Algunas características enzimáticas del agente causante de la difteria distinguen cuatro variantes culturales y bioquímicas (biovares): gravis, mitis, belfanti, intermedius. El biovar gravis suele formar colonias secas mate de color gris o negro, frágiles, planas, liso, de 1,5-2 mm de diámetro, con una raya radial en la superficie, es altamente tóxico, no causa hemólisis, descompone el almidón y el glucógeno. Los biovares mitis y belfanti crecen en forma de colonias grises o negras, redondas, lisas y convexas con Bordes lisos, 1-1,5 mm de diámetro, estas opciones son menos tóxicas, provocan hemólisis, pero no descomponen el almidón ni el glucógeno. Biovar intermedius forma colonias pequeñas, grises y transparentes con un diámetro de 0,5-1 mm, con una superficie plana y lisa. superficie, es ligeramente tóxico, no descompone el almidón ni el glucógeno, si no hay un crecimiento típico, se preparan frotis de otras colonias dudosas. Si en ellos se encuentran bacilos de esporas, cocos, levaduras, etc., los estudios de difteria se detienen y dan una respuesta negativa. Sin embargo, es importante recordar que las bacterias de la difteria que han formado colonias atípicas en medios con inhibidores del crecimiento (telurito de potasio) pueden acortarse, engrosarse, pero conservar el polimorfismo y la ubicación característica. Cuando las colonias típicas crecen, inmediatamente comienzan a estudiar su toxigenicidad y identificación. Las propiedades toxigénicas se examinan en al menos 2 colonias aisladas sembrando la mitad de cada colonia en un medio para determinar la toxigenicidad y sin quemar con un asa en medio Pisa, y la segunda mitad en agar suero inclinado para aislar un cultivo puro y conservarlo hasta el fin del diagnóstico de laboratorio. Si las variedades toxigénicas y no toxigénicas de C. diphtheriae crecen simultáneamente en una placa, es necesario examinar las propiedades toxigénicas de unas 20 colonias en caso de crecimiento múltiple de colonias sospechosas, sembrando material de 5 a 6 colonias en una placa. Cuando sólo crece una colonia, se inocula en un medio para determinar la toxigenicidad y, calcinando el asa, en un tubo de ensayo con medio Pisu. Si se utilizó un medio de transporte, el medio colgante se transforma en un medio denso con telurito sanguíneo. Al tercer día, cuando aparecen líneas de precipitación específicas en un gel de agar y una prueba de cistinasa positiva, se determina que el cultivo aislado es C toxigénico. difteria. Si no hay líneas de precipitación después de 24 horas, las placas se incuban un día más. En el caso de una prueba de Pisa negativa, el cultivo se identifica como una especie de corinebacteria, se siembra un cultivo puro en agar de suero inclinado en un medio hidrocarbonado con glucosa, sacarosa, almidón soluble y se toman muestras para detectar ureasa, pirazinamidasa y nitrato reductasa.Al cuarto día se registran los resultados de todos los cultivos y se da un informe razonado.Conclusión bacteriológica sobre el cultivo aislado.Se utilizan los siguientes métodos para identificar corinebacterias.Determinación de toxigenicidad in vitro.
Se basa en la interacción de una toxina con una antitoxina en un gel de agar. En lugares de óptima relación cuantitativa La toxina y la antitoxina precipitan en el espesor del agar en forma de finas y delicadas líneas blancas (“flechas”, “antenas”). En muchos países del extranjero esta prueba se llama prueba de Elek y la prueba de toxigenicidad se realiza normalmente con cultivos puros. También se puede determinar mediante cultivos contaminados con microflora extraña, lo que acelera el diagnóstico de laboratorio de difteria en un día. Pero si la prueba es negativa, se repite con un cultivo puro aislado. Para realizar esta prueba, la industria microbiológica produce un medio estándar seco especial para determinar la toxigenicidad de los microbios de la difteria (DTDM) y discos de papel estándar, empapados en antitóxicos. suero de difteria y se seca. Se colocan discos de papel sobre la superficie del medio DTDM recién preparado con antitoxina (no más de cuatro por taza). A una distancia de 0,5 cm del disco se siembran a su alrededor cultivos en forma de “placas” de 7-8 mm de diámetro, alternando “placas” del cultivo estudiado y de la cepa control. después de 18-24 y 48 años. El criterio para la especificidad de los precipitados es la fusión de las líneas de precipitación del cultivo estudiado con las líneas de la cepa toxigénica. En este caso el cultivo aislado se considera toxigénico, en caso de no disponer de discos de papel estándar se pueden utilizar tiras de papel de filtro empapadas en antitoxina diftérica. Se elaboran directamente en el laboratorio. Se humedecen tiras de papel cortadas en los tamaños especificados y esterilizadas en un autoclave a 121 ° C durante 30 minutos con 0,25 ml de antitoxina diftérica purificada, que contiene 500 UI por ml. En este caso, aplicar una tira de papel humedecida con antitoxina al vaso con el medio adecuado y secarlo abriendo el vaso durante 15-20 minutos en un termostato y dándole la vuelta. Después de esto, se inoculan cultivos de "placas" en ambos lados de las tiras, alternando las cepas de prueba y de control. Para determinar la toxigenicidad del patógeno de la difteria, también se pueden utilizar otros medios (AGV, agar de hogar abierto, etc.), cuyas recetas se dan en las "Instrucciones para el diagnóstico bacteriológico de la difteria", Kiev (1999). Durante muchos años, la toxigenicidad de las bacterias de la difteria se determinó mediante la inyección subcutánea o intradérmica de un cultivo en dos conejillos de Indias, uno de los cuales El día anterior se le inyectaron entre 100 y 1.000 UI de suero antitóxico contra la difteria. Ahora este método laboratorios bacteriológicos prácticamente casi nunca se utiliza debido al alto costo y al importante retraso en la respuesta.B Últimamente desarrolló un método muy sensible y altamente específico para determinar el gen de la toxina diftérica mediante polimerización reacción en cadena. Se basa en determinar la región del ADN de C. diphtheriae donde se localiza el gen de la toxina diftérica mediante cebadores específicos. El método tiene ventajas sobre la determinación tradicional de toxigenicidad: alta sensibilidad, resultados rápidos (4-6 horas) y no requiere el aislamiento de un cultivo puro. Pero requiere equipo especial, reactivos costosos y locales adecuados, por lo que sólo puede llevarse a cabo en un laboratorio especializado. Todas las cepas no toxigénicas de bacterias de la difteria aisladas de pacientes y portadores de bacterias deben enviarse al Centro Ucraniano de Vigilancia Sanitaria y Epidemiológica Estatal (donde exista dicho laboratorio) para la determinación final de las propiedades toxigénicas de C. diphtheriae.Determinación de cistinasa (prueba de Pizou)
C. diphtheriae, C. ulcerans secretan la enzima cistinasa, la pseudodifteria y otros difteroides la producen.El cultivo aislado se inocula en un medio con cistina y se vierte en una columna en tubos de ensayo estrechos. Las bacterias cistinasa positivas descomponen la cistina liberando sulfuro de hidrógeno, que, cuando se incluye acetato de plomo en el medio, forma sulfato de plomo, como resultado de lo cual el medio se vuelve marrón oscuro. S. diphtheriae no sólo provoca un oscurecimiento del ambiente tras el transcurso de la inyección, sino que también forma una “nube” a su alrededor. marron oscuro a una distancia de 1 cm de la superficie. Los resultados se tienen en cuenta tras 20-24 horas de incubación en un termostato.Determinación de ureasa (prueba de Sachse)
Las bacterias de la difteria no producen esta enzima. Sólo unos pocos tipos más de corinebacterias dan resultados positivos en la prueba de ureasa. Para realizar la prueba, el cultivo aislado se siembra en caldo con urea. La ureasa descompone la urea, cambia el pH del ambiente, acompañado de su enrojecimiento. Si no se libera la enzima, el color del caldo no cambia.Determinación de pirazinamidasa.
La determinación de pirazinamidasa se lleva a cabo mediante hidrólisis de pirazinamida en ácido pirazinamida y amonio. Para ello, se vierten 0,25 ml de agua destilada esterilizada en un tubo de ensayo esterilizado, en el que se prepara una suspensión espesa del cultivo aislado, y luego se añade una tableta de diagnóstico Rosko 598-21. Incubar durante 4 horas a 37°C, después de lo cual se añade una gota del 5% recién preparado. solución acuosa sulfato ferroso de amonio. En presencia de enzima, la suspensión se vuelve roja o naranja. Las corinebacterias patógenas no secretan pirazinamidasa y, por tanto, no cambian el color de la suspensión.enzimas sacarolíticas
Las enzimas sacarolíticas se determinan sembrando un asa completa del cultivo aislado en cada tubo de la serie Hiss abigarrada acortada (glucosa, sacarosa, almidón soluble). Los resultados se tienen en cuenta tras 24 horas de incubación en un termostato. La descomposición del almidón puede retrasarse hasta 48 horas.Determinación de nitrato reductasa.
La determinación de nitrato reductasa es una prueba adicional para la identificación de C. belfanti y C. ulcerans, que no producen esta enzima. El cultivo de prueba se inocula en un tubo de ensayo con caldo al que se le añade KN03 al 0,1% y se incuba en un termostato durante 24 horas. Control obligatorio con medio no inoculado. En el caso de la presencia de nitrato reductasa, cuando se añaden 3 gotas del reactivo de Kasatkin al caldo inoculado aparece un color rojo. El medio en el tubo de control no cambia de color. Para identificar las corinebacterias se utilizan recientemente discos indicadores de papel con glucosa, sacarosa, urea y almidón del grupo "B" para la identificación de enterobacterias (empresa ImBio, Nizhny Novgorod). Se prepara una suspensión espesa del cultivo de prueba en 4 tubos de ensayo y en cada uno de ellos se sumerge un disco con el carbohidrato correspondiente u otro reactivo. Después de la incubación en un termostato, la liberación de ureasa se registra después de 40 a 120 minutos y la actividad sacarolítica se determina después de 5 a 24 horas. En presencia de ureasa, el disco blanco con urea se vuelve rosa carmesí; en ausencia, permanece blanco. Los discos con glucosa y sacarosa, en presencia de las enzimas adecuadas, cambian de color de rojo a amarillo después de 5 a 6 horas. Al determinar la amilasa, se añade un disco indicador con yodo a un tubo de ensayo con el sustrato adecuado. Si no hay enzima, aparece un color azul oscuro; si la hay, el color de la solución permanece sin cambios.Prevención y tratamiento específicos
La prevención vacunal de la difteria se lleva a cabo mediante la administración de toxoide diftérico obtenido mediante el tratamiento de la toxina diftérica con formaldehído. En nuestro país, para la vacunación se utiliza DPT, la vacuna adsorbida contra la tos ferina, la difteria y el tétanos. Suero antitóxico usado para terapia especifica y antibióticos - para el saneamiento de portadores de bacterias. Los antibióticos incluyen penicilina, vancomicina, eritromicina, etc.Corynebacterium diphtheriae fue descubierto y luego aislado en cultivo puro hace 100 años. Su significado etiológico final en la aparición de la difteria se confirmó varios años después, cuando se obtuvo una toxina específica que provocaba la muerte de los animales con fenómenos similares a los observados en pacientes con difteria. Corynebacterium diphtheriae pertenece al género Corynebacterium, un grupo de bacterias corinefroma. Corynebacterium diphtheriae son bastones rectos o ligeramente curvados con extremos ensanchados o puntiagudos. La división en fractura y división proporciona una disposición característica en forma de número romano V o dedos extendidos, pero a menudo se encuentran palos ubicados individualmente en los trazos. Grandes acumulaciones de ellos, que se producen en frotis preparados a partir de moco de la garganta, nariz y secreción de heridas, tienen un carácter parecido al fieltro. La longitud media de sus varillas es de 1 a 8 micrones, y el ancho de 0,3/0,8 micrones. Son inmóviles y no forman esporas ni cápsulas. Corynebacterium diphtheriae es un anaerobio facultativo. Los bacilos de la difteria son resistentes a la desecación. Con temperatura de 60 °s en las culturas puras se destruyen durante 45-60 minutos. En productos patológicos, es decir, en presencia de protección proteica, pueden permanecer viables durante una hora a una temperatura de 90 °C. Las bajas temperaturas no tienen un efecto perjudicial sobre los bacilos de la difteria. EN desinfectantes En concentraciones normales mueren rápidamente.
Es necesario señalar el polimorfismo extremadamente grande de los bacilos de la difteria, que se manifiesta en cambios en su grosor y forma (hinchados, en forma de matraz, segmentados, filamentosos, ramificados), en los engrosamientos terminales, y a veces en la parte central, después de 12 horas. Del crecimiento del cultivo se encuentran granos de Babesh con tinción especial de Ernst, que son acumulaciones de volutina. Existe evidencia de que la volutina es un polifosfato inorgánico de cadena larga. M.A. Peshkov sugiere su naturaleza metafosfato. A. A. Imshanetsky cree que la volutina es un subproducto de los procesos metabólicos. Se sabe que el fósforo es necesario para la formación de granos. También hay suposiciones sobre la necesidad de manganeso y zinc para este proceso.
Los granos de volutina se encuentran en cultivos de un día, y luego la cantidad de bacterias con la presencia de granos disminuye. El citoplasma también contiene membranas intracitoplasmáticas de nucleótidos: lisosomas, vacuolas.
Las bacterias se tiñen con todos los tintes de anilina. Cuando se tiñen con el método de Gram, son positivos. El método Neisser se utiliza para teñir granos de volutina. Cuando se tiñen con este método, los granos de volutina, que tienen una alta afinidad por el azul de metileno, se tiñen de forma persistente. Color azul, y del cuerpo de la bacteria, con tinción adicional con crisoidina o bismarckbraun, se desplaza el azul de metileno.
El agente causante de la difteria es heterótrofo, es decir, pertenece al grupo de bacterias que necesitan para su crecimiento materia orgánica. Los medios utilizados para el cultivo deben contener aminoácidos como fuente de carbono y nitrógeno: alanina, cistina, metionina, valina, etc. En este sentido, los medios de cultivo electivos son aquellos que contienen proteína animal: sangre, suero, líquido ascítico. Sobre esta base se creó el entorno clásico de Leffler, y luego el de Clauberg, Tyndall y el de acumulación.
En el medio de Leffler, las colonias del bacilo de la difteria tienen una superficie húmeda y brillante, bordes lisos y un color amarillento. Después de varios días de crecimiento, aparecen estrías radiales de las colonias y líneas concéntricas débilmente definidas. El diámetro de las colonias alcanza los 4 mm. Los primeros signos de crecimiento aparecen después de 6 horas en un termostato a 36-38 °C. El crecimiento es claramente visible 18 horas después de la siembra. Valor óptimo El pH para el crecimiento del bacilo de la difteria es 7,6. Corynebacterium diphtheria suele ser difícil de distinguir de otras especies de corynebacterium. Para determinar la especie se utiliza un complejo de características culturales y bioquímicas.
El tipo de Corynebacterium diphtheria también es heterogéneo, se divide en 3 tipos culturales y bioquímicos gravis, mitis, intermedins, en dos variedades: toxigénico y no toxigénico, varios tipos serológicos y fagotipos.
Actualmente, en la mayoría de los territorios circulan dos tipos bioquímicos culturales: gravis y mitis. El tipo intermedins, que antes se distinguía con bastante frecuencia, recientemente se ha encontrado raramente. La diferenciación más clara de tipos se puede hacer por la forma de las colonias cuando el cultivo se cultiva en agar sangre con la adición de telurito. Las colonias del tipo gravis alcanzan 1-2 mm de diámetro después de 48-72 horas, tienen bordes ondulados, estrías radiales y un centro plano. Su aspecto suele compararse con el de una flor de margarita. Las colonias son mate debido a la capacidad de la bacteria para reducir el telurito, que luego se combina con el sulfuro de hidrógeno resultante, de color gris negruzco. Cuando se cultivan en caldo, los cultivos de tipo gravis forman una película que se desmorona en la superficie. Cuando se siembran en medios Hiss con la adición de suero, descomponen los polisacáridos: almidón, dextrina, glucógeno con la formación de ácido.
Los cultivos del tipo mitis en agar sangre telurito crecen como colonias redondas, ligeramente convexas, de bordes lisos y de color negro mate. Cuando se cultivan en caldo, producen turbidez y sedimentos uniformes. No descomponen el almidón, la dextrina ni el glucógeno.
En los frotis, los bastones del tipo gravis suelen ser cortos y los del tipo mitis son más delgados y largos.
Un estudio comparativo con microscopía electrónica de los bacilos de la difteria de varios tipos bioquímicos mostró la presencia de una estructura de tres capas en los tipos gravis y mitis. membrana celular. La cáscara del tipo intermedins tiene dos capas y es casi 3 veces más gruesa. Entre el citoplasma y la membrana existen espacios llenos de granos, que pueden estar relacionados con la exotoxina. Son visibles las estrías oblicuas de las bacterias, que se crean a través de las paredes divisorias entre las células hijas. El aparato cromosómico, en los tipos gravis y mitis, está representado por granos ordinarios con vacuolas, en el tipo intermedines, se distribuye por todo el citoplasma. Un microscopio electrónico revela una membrana multicapa, cuya presencia explica por qué los bacilos de la difteria son a veces gramnegativos.
Las colonias de bacterias de la difteria se presentan en formas S, R y SR, siendo esta última considerada intermedia. N. Morton cree que las colonias de formas S son características del tipo mitis y las formas SR, del tipo gravis. Además de estas formas principales, existen colonias mucoides (formas M), colonias enanas (formas D) y colonias gonidiales (formas L). Todas estas se consideran formas de variabilidad disociativa.
Las bacterias de la difteria deben distinguirse de los difteroides y del bacilo de la pseudodifteria.
Se dedican una gran cantidad de estudios a la variabilidad del bacilo de la difteria. Posibilidad de ocurrencia formas atípicas en condiciones de laboratorio fue confirmado por estudios epidemiológicos.
La variabilidad bioquímica, morfológica y fisicoquímica de las bacterias de la difteria, reconocida por un gran número de investigadores, complica en algunos casos el diagnóstico bacteriológico y obliga a un estudio exhaustivo de los cultivos.
Dividimos todos los cultivos aislados bajo diferentes condiciones epidemiológicas en 8 grupos; incluyeron todas las variantes morfológicas posibles de los representantes de corynebacterium que nos interesan:
1er grupo: varillas cortas, de aproximadamente 2 micrones de largo, sin granos;
Segundo grupo: varillas cortas, de aproximadamente 2 micrones de largo, pero ocasionalmente con granos;
3er grupo: varillas de tamaño mediano, de 3 a 6 micrones de largo, de 0,3 a 0,8 micrones de ancho, sin granularidad característica;
Cuarto grupo: varillas de tamaño mediano, de 3 a 7 micrones de largo, de 0,3 a 0,8 micrones de ancho, ligeramente curvadas, ocasionalmente con granos;
Quinto grupo: varillas de tamaño mediano, de 3 a 6 micrones de largo, de 0,3 a 0,8 micrones de ancho, ligeramente curvadas, granulares;
Sexto grupo: varillas largas, de 6 a 8 micrones de largo, de 0,3 a 0,6 micrones de ancho, ligeramente curvadas, ocasionalmente con granos;
Séptimo grupo: varillas largas, de 6 a 8 micrones de largo, de 0,3 a 0,8 micrones de ancho, generalmente curvadas, sin granos;
Grupo 8: varillas cortas y rugosas, de aproximadamente 2 micras de largo, aproximadamente 1 micra de ancho, sin granos.
La ubicación de las varillas no se tuvo en cuenta al clasificarlas en grupos, pero normalmente la disposición característica correspondía a la morfología.
En los grupos 1, 2, 3 y 8, que correspondían en morfología a los bastones de Hoffmann, la disposición era grupal, paralela o en forma de individuos individuales, en los grupos 4, 5 y 6, que correspondían principalmente en morfología a la difteria verdadera. Bacterias, bastones ubicados en ángulo o en forma de individuos individuales. En el grupo 7, las varillas a menudo estaban dispuestas al azar, entrelazándose entre sí. En el octavo grupo, los bastones estaban ubicados en forma de individuos individuales.
De los 428 cultivos estudiados, 111, por la totalidad de sus características, deberían haber sido clasificados como difteria verdadera, 209 fueron cultivos de bacilos de Hoffmann y 108 constituyeron un grupo de cultivos atípicos. En cultivos cercanos a la difteria, la atipicidad se manifestó en una disminución de la actividad bioquímica, a veces en la descomposición de la urea; en cultivos morfológicamente cercanos a los bastones de Hoffmann, conservan una prueba de cisteína positiva y la capacidad de descomponer uno de los azúcares.
De los 111 cultivos de difteria, 81 cultivos (73%) eran morfológicamente típicos, 28 cultivos (27%) tenían la morfología de los bastones de Hoffmann. De los 111 cultivos de difteria, hubo 20 cultivos del tipo gravis, y de estos, sólo 9 fueron asignados al 1º y 2º grupo morfológico.
Los cultivos que se clasificaron según una combinación de características como cultivos del bacilo de Hoffmann tenían la morfología de los cultivos típicos de difteria en el 20% de los casos.
El 25% de las cepas estudiadas fueron clasificadas como cultivos atípicos; su morfología correspondió tanto a bacilos de difteria como a bacilos de Hoffmann.
Así, la bioquímica y propiedades morfológicas Los cultivos no siempre coinciden, y la atipicidad bioquímica, así como la morfológica, se observa con mayor frecuencia en cultivos aislados durante un período de menor incidencia y, por lo tanto, una disminución en el nivel de portación.
Es necesario señalar la disminución general de la actividad bioquímica de los cultivos en los últimos 10 a 15 años. Un indicador de esto es el retraso en la fermentación de los azúcares, que a veces ocurre entre el día 5 y 6, así como la diferente actividad bioquímica de las colonias de un mismo cultivo.
La identificación bioquímica de cultivos puros aislados en diferentes condiciones epidemiológicas muestra que, aunque la morfología y las propiedades bioquímicas a menudo no coinciden, el principio general de distribución de los cultivos, establecido según datos morfológicos, no cambia. Tanto a la hora de distribuir los cultivos según datos morfológicos y bioquímicos, como a la hora de identificarlos plenamente con la inclusión reacciones serológicas el principio de distribución sigue siendo el mismo: los cultivos atípicos son más comunes durante los períodos de prosperidad epidémica, los bacilos de Hoffmann se detectan con mayor frecuencia durante los períodos de problemas epidémicos y se siembran por más tiempo que la verdadera difteria.
El estudio de las propiedades toxigénicas de cultivos aislados en medios nutritivos sólidos mostró que incluso durante el período de prosperidad epidémica hay un número suficiente de portadores de bacilos toxigénicos de la difteria. Cabe señalar que las propiedades toxigénicas no siempre pueden detectarse incluso en cultivos aislados de pacientes. Esto indica la necesidad de mejorar los métodos aplicados para determinar la toxigenicidad de los cultivos.
Los resultados de la reacción de aglutinación de cultivos atípicos aislados en diferentes condiciones epidemiológicas mostraron la presencia de los mismos patrones de propiedades serológicas que notamos al estudiar la morfología y bioquímica de los cultivos. La atipicidad de las culturas aisladas en una zona próspera, según datos serológicos, era más profunda que en las zonas desfavorecidas. Así, en las zonas prósperas, el 26% de los cultivos atípicos dieron una reacción de aglutinación positiva, en las zonas desfavorables, el 19%.
Una de las principales propiedades del bacilo de la difteria es la capacidad de formar toxinas. La toxinogénesis de Corynebacterium diphtheria está determinada por el gen contenido en el profago, por lo que el principal medio de agresión, la formación de toxinas, no está asociado con el cromosoma bacteriano.
La toxina diftérica es una proteína con un peso molecular de 6200 daltons. La fuerza de la toxina se determina realizando pruebas intradérmicas para detectar la presencia de efectos necróticos y el efecto en animales susceptibles ( efecto letal). La potencia de la toxina se mide utilizando la dosis letal mínima, que es la cantidad más pequeña de toxina que puede causar la muerte de un conejillo de Indias que pesa 250 g en el día 4-5 cuando se administra por vía intraperitoneal. La toxina tiene propiedades antigénicas que se conservan cuando se trata con formaldehído, lo que elimina sus propiedades tóxicas. Esto hizo posible utilizarlo para la preparación de un fármaco profiláctico.
La molécula de toxina consta de dos fragmentos, uno de los cuales es termoestable y tiene actividad enzimática, y el segundo es termolábil y realiza una función protectora. Se ha demostrado la síntesis intracelular de la toxina con su liberación a través de los túbulos de la pared celular. La síntesis de la toxina se produce cuando el microbio se cultiva en un medio líquido: caldo de carne y peptona con la adición de glucosa, maltosa y factores de crecimiento a un pH de 7,8 a 8,0.
Según datos recientes, la toxina diftérica es un producto de origen viral. Como confirmación, I. V. Chistyakova propone la capacidad de las corinebacterias no toxigénicas de transformarse en toxigénicas bajo la influencia de fagos. La posibilidad de convertir cultivos no toxigénicos en toxigénicos se confirmó en experimentos con cultivos unicelulares. El fenómeno descrito se llama conversión lisogénica. Utilizando virus templados obtenidos de cepas toxigénicas de gravis, fue posible convertir la variante no toxigénica de Corynebacterium diphtheria gravis en una toxigénica.
E.V. Bakulina, M.D. Krylova sugirió que la conversión focal puede ser importante en el proceso epidémico. En este sentido, se inició un estudio de su papel en la formación de cepas toxigénicas de Corynebacterium diphtheria en la naturaleza. La posibilidad de conversión de toxigenicidad se demostró no solo en sistemas fago-bacterias, sino también en condiciones naturales. Pero entre las culturas locales, este proceso, según varios investigadores, está lejos de ser común. Las razones de esto probablemente sean la falta de productores de fagos templados, la sensibilidad a los fagos de las cepas locales es diferente de la de las cepas de referencia y, por lo tanto, no pueden ser receptores de fagos convertidores de un espectro de acción conocido.
Sólo una parte de la población microbiana logró convertir las propiedades toxigénicas de los bacilos de la difteria bajo la influencia de fagos estafilocócicos y estreptocócicos. En trabajos recientes, la cuestión de la conversión de fagos en el proceso epidémico recibe una evaluación aún más moderada. Se cree que los corinefagos tox+ no desempeñan ningún papel en el proceso epidémico de la difteria. rol independiente. Los portadores de bacilos no toxigénicos pueden infectarse con el fago tox+ sólo junto con una cepa toxigénica, y los fagos estafilocócicos no pueden convertir las corinebacterias no toxigénicas. Para llevar a cabo la conversión en dirección a la toxigenicidad en el cuerpo humano, aparentemente es necesario un contacto estrecho entre un portador que tiene un fago convertidor y un portador que secreta una cepa lisosensible a este fago. Además de la capacidad de formar toxinas, la bacteria de la difteria tiene factores de patogenicidad como hialuronidasa, neuraminidasa, desoxirribonucleasa, catalasa, esterasa y peroxidasa. El estudio de los productos metabólicos extracelulares no mostró diferencias entre las corinebacterias de la difteria toxigénicas y no toxigénicas.
Actualmente, para la tipificación intraespecífica de Corynebacterium diphtheria, además del método bioquímico descrito anteriormente, se pueden utilizar métodos serológicos y fágicos.
La presencia de tipos serológicos se debe a antígenos específicos de tipo, termoestables, de superficie y termolábiles.
Existen varios esquemas de tipificación serológica. En nuestro país utilizamos el esquema propuesto por V. S. Suslova y M. V. Pelevina, pero no puede clasificar todas las cepas no toxigénicas. El número de tipos serológicos está creciendo. I. Ewing estableció la presencia de 4 tipos serológicos: A, B, C y D; D. Robinson y A. Peeney 5 tipos: I, II, III, IV y V. L. P. Delyagina identificaron 2 tipos serológicos más. Se cree que el número de tipos serológicos es mucho mayor, principalmente debido al tipo mitis. De los pocos datos bibliográficos disponibles sobre patrones en el aislamiento de uno u otro serotipo cuando diversas formas no se ha establecido el proceso infeccioso y las diferentes condiciones epidemiológicas. Junto a los datos sobre la diferente agresividad de los cultivos pertenecientes a diferentes tipos serológicos, existen informes que rechazan la relación del tipo serológico con la patogenicidad de los cultivos.
Es característico que se produzcan diferentes tipos serológicos en diferentes zonas. La tipificación serológica se puede utilizar para el análisis epidemiológico.
En condiciones de morbilidad esporádica, número limitado de portadores, cuando la búsqueda de la fuente de infección es mucho más difícil, el método de fagotipificación adquiere importancia, permitiendo subdividir las corinebacterias en variantes serológicas y culturales. El marcado se puede realizar según las propiedades de los fagos aislados de un cultivo y según la sensibilidad del cultivo a bacteriófagos específicos. El esquema más utilizado es el propuesto por R. Saragea y A. Maximesco. Permite etiquetar cepas toxigénicas y no toxigénicas de todas las variantes culturales. Con la ayuda de 22 fagos típicos, los cultivos se pueden dividir en 3 grupos, en los que se combinan 21 variantes de fagos: 1er grupo: cepas toxigénicas y no toxigénicas del tipo mitis (variantes de fagos I, la, II, III); 2º - cepas toxigénicas y no toxigénicas del tipo intermedinas y gravis no toxigénicas (variantes de fagos IV, V, VI, VII); En el tercer grupo se incluyeron 13 variantes de fagos (del VIII al XIX), que unían cepas toxigénicas de gravis.
El plan se probó en un gran número de cepas aisladas en Rumania y obtenidas de museos de 14 países. La fagotipificación fue positiva en el 62% de las cepas, siendo especialmente exitosas las cepas del tipo gravis. Entre estos últimos, se estableció la pertenencia a una de las variantes del fago en un 93%. Las reacciones específicas con fagos típicos en cepas toxigénicas del tipo gravis según el esquema de estos autores se basan en la infección de las cepas con diversos virus.
En nuestro país, M. D. Krylova llevó a cabo investigaciones en el campo de la tipificación de fagos. El autor desarrolló un esquema de marcado de fagos basado en el principio propuesto por Williams y Rippon para tipificar los estafilococos plasmacoagulantes: la variante del fago se designaba con el nombre del fago tipo que lo lisaba en una dilución de prueba. Los fagos y sus variantes en el esquema de M.D. Krylova se designan con letras del alfabeto latino: letras mayúsculas: fagos que producen lisis confluente y semiconfluente, minúsculas: lisis en forma de placas. En base a esto, se desarrolló un esquema de tipificación de fagos modificado para corinebacterias no toxigénicas de la variante gravis y un esquema de tipificación de fagos para corinebacterias toxigénicas de la variante gravis.
