Vlastnosti bakteriofágov a ich využitie v medicíne. Praktické využitie fágov v medicíne

CM. ZAKHARENKO, Ph.D., docent, Vojenské lekárska akadémia ich. CM. Kirov, Petrohrad

Bakteriofágy sú jedinečné mikroorganizmy, na základe ktorých bola vytvorená skupina terapeutických a profylaktických liečiv so špeciálnymi vlastnosťami a charakteristikami. Základné prirodzené fyziologické mechanizmy interakcie medzi fágmi a baktériami umožňujú predpovedať nekonečnú rozmanitosť samotných bakteriofágov a možné spôsoby ich aplikácie. S rozširovaním zbierok bakteriofágov sa nepochybne objavia nové cieľové patogény a rozšíri sa okruh ochorení, pri ktorých možno fágy použiť ako monoterapiu, tak aj ako súčasť komplexných liečebných režimov.

Áno, použiť polyvalentný pyobakteriofág Sextafág v liečbe infikovanej nekrózy pankreasu (Perm State Medical Academy pomenovaná podľa akademika E.A. Wagnera) umožnil rýchlejšie obnoviť základné parametre homeostázy a funkcie orgánov a systémov u pacientov. Došlo aj k výraznému zníženiu počtu pooperačné komplikácie A úmrtia: v skupine pacientov, ktorí dostávali štandardnú terapiu, bola mortalita 100%, zatiaľ čo v skupine dostávajúcej BF to bolo 16,6%.

Vzhľadom na neškodnosť a reaktogenitu BF liekov je ich použitie v pediatrická prax vrátane novorodencov. Zaujímavá je skúsenosť regionálnej detskej školy Nižný Novgorod klinická nemocnica, kde v období komplikácií epidemiologickej situácie spolu s bežnými protiepidemickými opatreniami boli nasadené BF - Intesti-bacteriophage aj BF Pseucfomonas aeruginosa. 11-násobné zníženie výskytu nozokomiálnych infekcií pseudomonádovej etiológie ukázalo vysokú účinnosť použitia BF. Lieky BF môžu byť predpísané na liečbu dysbiózy a porúch zažívacie ústrojenstvo a na prevenciu kolonizácie slizníc gastrointestinálny trakt oportúnne baktérie. Viaczložkové BF prípravky sú ideálne na okamžitú úľavu od prvých príznakov gastrointestinálnych ťažkostí.

Dnes podnik vytýčil niekoľko prioritných oblastí pre vývoj a výrobu terapeutických a profylaktických bakteriofágov, ktoré korelujú s novovznikajúcimi globálnymi trendmi. Vytvárajú sa a zavádzajú nové lieky: boli vyvinuté BF proti zúbkovaniu a enterobaktériám, pracuje sa na vytvorení fágového lieku proti Helicobacter pylori.

Iba jeden výrobca týchto liekov je NPO Microgen, podľa správy zástupcu vedúceho oddelenia vedy a inovatívny vývoj Alla Lobastova, vyrába viac ako 2 milióny balení ročne. Bohužiaľ, predstavy mnohých lekárov o bakteriofágoch nie sú ani zďaleka objektívne. Málokto vie, že bakteriofágy aktívne proti rovnakému patogénu môžu patriť do rôznych čeľadí, mať rôzne životné cykly atď. Napríklad bakteriofágy P. aeruginosa patria do čeľadí Myoviridae, Podoviridae, Siphoviridae a majú lytický životný cyklus alebo stredný. Rôzne kmene toho istého patogénu môžu mať rôznu citlivosť na bakteriofágy. Väčšina odborníkov vie (počuli, niekto to použil) o existencii tekutiny a tablety lieková forma terapeutické a profylaktické lieky bakteriofágov. Ich rozsah je však podstatne širší, čo možno považovať za absolútnu výhodu najmä v kombinácii s rôznymi spôsobmi podania (orálne podanie, klystíry, aplikácie, výplachy rán a slizníc, podanie do dutín rany a pod.). TO zjavné výhody bakteriofágom sa tradične pripisuje špecifický účinok na pomerne obmedzenú populáciu baktérií, časovo obmedzená existencia (kým nezmizne cieľová populácia mikroorganizmov), absencia takýchto vedľajšie účinky ako toxické a alergické reakcie, dysbiotické reakcie, atď. Tieto lieky môžu byť použité v rôznych vekových skupín a počas tehotenstva. Bakteriofágy samotné nie sú významnými alergénmi. Prípady intolerancie na bakteriofágové lieky sú väčšinou spojené s reakciou na zložky živného média. Všetci hlavní výrobcovia tejto skupiny liekov sa snažia o maximálnu kvalitu použitých komponentov, čo znižuje pravdepodobnosť takýchto reakcií. V súvislosti so zvyšujúcou sa rezistenciou na antibiotiká niektorí autori navrhujú považovať bakteriofágy za najlepšiu alternatívu k antibiotikám. Terapeutické a profylaktické lieky bakteriofágov sú kokteilom špeciálne vybraných kombinácií (komplex polyklonálnych vysoko virulentných bakteriálnych vírusov, špeciálne vybraných proti najbežnejším skupinám patogénov bakteriálne infekcie) na základe fágových zbierok výrobcu. Pobočky FSUE NPO Microgen v Ufa, Perm a Nižný Novgorod – moderné centrá výrobu takýchto liekov. Možnosť tvorby na mieru patogénne mikroorganizmy terapeutické a profylaktické liečivá bakteriofágov je ďalšou dôležitou výhodou tejto skupiny liečiv. Zvyšujúca sa rezistencia baktérií na antimikrobiálne lieky a častá polyetiológia moderných infekčných ochorení si vyžadujú kombinovanú antibiotickú terapiu (dve, tri a niekedy aj viac antimikrobiálne látky). Na výber efektívna schéma antibiotickej terapie, okrem skutočnej citlivosti baktérií na liečivo, je potrebné brať do úvahy dostatočnú veľké číslo faktory. Fágová terapia má v tomto smere aj určité výhody. Na jednej strane použitie kombinácie bakteriofágov nie je sprevádzané ich vzájomnou interakciou a nevedie k zmenám vo vzorcoch ich použitia. V rámci existujúceho súboru terapeutických bakteriofágov existuje množstvo osvedčených kombinácií - koliproteový bakteriofág, polyvalentný pyobakteriofág, intesti-bakteriofág. Na druhej strane baktérie nemajú spoločné mechanizmy rezistencie na antibiotiká a fágy, preto ich možno použiť ako pri rezistencii patogénu na niektorý z liekov, tak aj v kombinácii „antibiotikum + bakteriofág“. Táto kombinácia je obzvlášť účinná pri ničení mikrobiálnych biofilmov. Experiment to presvedčivo ukazuje kombinované použitie antagonisty železa a bakteriofágy môžu narušiť tvorbu biofilmov Klebsiella pneumoniae. Súčasne dochádza k výraznému zníženiu veľkosti mikrobiálnej populácie a zníženiu počtu „mladých“ buniek. Ešte jeden dôležitá vlastnosť Pôsobenie bakteriofágov je taký jav, ako je indukcia apoptózy. Niektoré kmene E. coli majú gény, ktoré spôsobujú bunkovú smrť po zavedení bakteriofága T4. V reakcii na expresiu neskorých génov fága T4 teda gén lit (kóduje proteázu, ktorá ničí predlžovací faktor EF-Tu, potrebný na syntézu proteínov), blokuje syntézu všetkých bunkových proteínov. Gén prrC kóduje nukleázu, ktorá štiepi lyzínovú tRNA. Nukleáza je aktivovaná stp génovým produktom fágu T4. V bunkách infikovaných fágom T4 spôsobujú gény rex (patriace do fágového genómu a exprimované v lyzogénnych bunkách) tvorbu iónových kanálov, čo vedie k strate životne dôležitých iónov bunkami a následne k smrti. Samotný fág T4 môže zabrániť bunkovej smrti uzavretím kanálov svojimi proteínmi, produktmi génov rII. Ak si baktérie vyvinú rezistenciu na antibiotikum, je potrebné hľadať nové možnosti úpravy aktívnej molekuly alebo zásadne nové látky. Bohužiaľ, pre posledné roky Tempo zavádzania nových antibiotík sa výrazne spomalilo. Situácia s bakteriofágmi je zásadne odlišná. Zbierky veľkých výrobcov zahŕňajú desiatky hotových kmeňov bakteriofágov a neustále sa dopĺňajú o nové aktívne fágy. Vďaka priebežnému monitorovaniu citlivosti izolovaných patogénov na bakteriofágy výrobcovia upravujú fágové kompozície dodávané do regiónov. Vďaka adaptovaným bakteriofágom je možné eliminovať prepuknutie nozokomiálnych nákaz spôsobených kmeňmi rezistentnými na antibiotiká.

O ústne bakteriofágy sa rýchlo dostanú do miest infekcie: pri perorálnom podaní pacientom s hnisavými zápalovými ochoreniami sa fágy dostávajú do krvi do hodiny, po 1–1,5 hodine sa zistia z bronchopulmonálneho exsudátu a z povrchu popálenín, po 2 hodinách - z moču a tiež z cerebrospinálnej tekutiny pacientov s traumatickým poranením mozgu.

Bakteriofágy sú teda jedinečné mikroorganizmy, na základe ktorých bola vytvorená skupina terapeutických a profylaktických liečiv so špeciálnymi vlastnosťami a charakteristikami. Základné prirodzené fyziologické mechanizmy interakcie medzi fágmi a baktériami umožňujú predpovedať nekonečnú rozmanitosť samotných bakteriofágov a možných spôsobov ich použitia. S rozširovaním zbierok bakteriofágov sa nepochybne objavia nové cieľové patogény a rozšíri sa okruh ochorení, pri ktorých možno fágy použiť ako monoterapiu, tak aj ako súčasť komplexných liečebných režimov. Moderný pohľad na budúci osud fágovej terapie by mal byť založený jednak na vysokej špecifickosti ich pôsobenia, jednak na potrebe prísneho dodržiavania všetkých pravidiel fágovej terapie. Kontrast bakteriofágov s akýmikoľvek prostriedkami etiotropnej terapie je chybný.

Prvýkrát sa predpokladalo, že bakteriofágy sú vírusy. D. Errel. Následne boli objavené hubové vírusy atď., ktoré sa stali známymi ako fágy.

Fágová morfológia.

Rozmery - 20 - 200nm. Väčšina fágov má tvar pulca. Najzložitejšie fágy pozostávajú z mnohostrannej hlavy, v ktorej sa nachádza nukleová kyselina, krku a procesov. Na konci procesu je bazálna doska, z ktorej vychádzajú závity a zuby. Tieto vlákna a zuby slúžia na pripojenie fága k bakteriálnej membráne. V najzložitejšie organizovaných fágoch obsahuje distálna časť procesu enzým - lyzozým. Tento enzým podporuje rozpúšťanie bakteriálnej membrány počas prenikania fágového NK do cytoplazmy. V mnohých fágoch je proces obklopený plášťom, ktorý sa v niektorých fágoch môže sťahovať.

Existuje 5 morfologických skupín

1. Bakteriofágy s dlhým procesom a kontraktilným puzdrom
2. Fágy s dlhým procesom, ale bez kontraktilného obalu
3. Krátke vetvové fágy
4. Fágy s procesným analógom
5. Vláknité fágy

Chemické zloženie.

Fágy sú zložené z nukleovej kyseliny a proteínov. Väčšina z nich obsahuje 2-vláknovú DNA, uzavretú do kruhu. Niektoré fágy obsahujú jeden reťazec DNA alebo RNA.

Fágová škrupina - kapsid, pozostáva z usporiadaných proteínových podjednotiek – kapsomérov.

V najzložitejšie organizovaných fágoch obsahuje distálna časť procesu enzým - lyzozým. Tento enzým podporuje rozpúšťanie bakteriálnej membrány počas prenikania fágového NK do cytoplazmy.

Fágy dobre znášajú mrazenie, zahrievanie na 70 °C a sušenie. Citlivý na kyseliny, UV žiarenie a var. Fágy infikujú presne definované baktérie interakciou so špecifickými bunkovými receptormi.

Podľa špecifickosti interakcie -

Polyfágy – interagujúce s niekoľkými príbuznými druhmi baktérií

Monofágy – druhovo špecifické fágy – interagujú s jedným typom baktérií

Typ fágov – interaguje s jednotlivými variantmi baktérií v rámci druhu.

Podľa pôsobenia typických fágov možno druhy rozdeliť na fágová séria. Interakcia fágov s baktériami môže prebiehať prostredníctvom produktívny, aproduktívny a integračný typ.

Produktívny typ- vytvorí sa fágové potomstvo a bunka sa lýzuje

S aproduktívnym- bunka naďalej existuje, proces interakcie je v počiatočnom štádiu prerušený

Integratívny typ- fágový genóm sa integruje do bakteriálneho chromozómu a koexistuje s ním.

V závislosti od typov interakcie sa rozlišujú virulentné a mierne fágy.

Virulentný interagovať s baktériami produktívnym spôsobom. Po prvé, absorpcia fága na bakteriálnej membráne nastáva v dôsledku interakcie špecifických receptorov. Existuje penetrácia alebo penetrácia vírusovej nukleovej kyseliny do cytoplazmy baktérií. Vplyvom lyzozýmu sa v obale baktérie vytvorí malý otvor, obal fága sa stiahne a vstrekne sa NK. Fágový obal mimo baktérie. Ďalej dochádza k syntéze skorých proteínov. Zabezpečujú syntézu fágových štruktúrnych proteínov, replikáciu fágovej nukleovej kyseliny a represiu aktivity bakteriálnych chromozómov.

Potom nastáva syntéza konštrukčné komponenty fágov a replikácie nukleových kyselín. Z týchto prvkov sa poskladá nová generácia fágových častíc. Zostava sa nazýva morfogenéza, nové častice, ktorých v jednej baktérii môže vzniknúť 10-100. Ďalej nasleduje lýza baktérií a uvoľnenie novej generácie fágov do vonkajšieho prostredia.

Mierne bakteriofágy interagovať buď produktívnym alebo integračným spôsobom. Výrobný cyklus prebieha podobne. Pri integračnej interakcii sa DNA mierneho fága po vstupe do cytoplazmy v určitej oblasti integruje do chromozómu a pri delení buniek sa synchrónne replikuje s bakteriálnou DNA a tieto štruktúry sa prenášajú do dcérskych buniek. Takáto vstavaná fágová DNA - profágia a baktéria obsahujúca profág sa nazýva lyzogénna a tento jav je taký lyzogenéza.

Spontánne, alebo pod vplyvom množstva vonkajších faktorov môže dôjsť k vyrezaniu profága z chromozómu, t.j. prejsť do voľného stavu, prejaviť vlastnosti virulentného fága, čo povedie k vytvoreniu novej generácie bakteriálnych tiel - profágová indukcia.

Lyzogenéza baktérií je základom fágovej (lyzogénnej) konverzie. Toto sa chápe ako zmena charakteristík alebo vlastností lyzogénnych baktérií v porovnaní s nelyzogénnymi baktériami rovnakého druhu. Predmet zmeny rôzne vlastnosti- morfologické, antigénne atď.

Mierne fágy môžu byť defektné – neschopné tvoriť fágové potomstvo, ktoré nie je in prírodné podmienky a na indukcii.

Virion je plnohodnotná vírusová častica pozostávajúca z NK a proteínového obalu

Praktická aplikácia fágov -

1. Aplikácia v diagnostike. Vo vzťahu k množstvu bakteriálnych druhov sa monofágy používajú v reakcii fagolyzovateľnosti ako jedno z kritérií na identifikáciu bakteriálnej kultúry, typické fágy sa používajú na fagotypizáciu a vnútrodruhovú diferenciáciu baktérií. Vykonáva sa na epidemiologické účely, na zistenie zdroja infekcie a spôsobov jej eliminácie
2. Na liečbu a prevenciu mnohých bakteriálnych infekcií - brušný typ stafylokokové a streptokokové infekcie (kyselinovzdorné tablety)
3. Mierne bakteriofágy sa používajú v genetické inžinierstvo ako vektor schopný vniesť genetický materiál do živej bunky.

Genetika baktérií

Bakteriálny genóm pozostáva z genetických prvkov schopných samoreprodukcie - replikóny. Replikóny sú bakteriálne chromozómy a plazmidy. Bakteriálny chromozóm tvorí nukleoid, uzavretý kruh, ktorý nie je spojený s proteínmi a nesie haploidnú sadu génov.

Plazmid je tiež uzavretý kruh molekuly DNA, ale je oveľa menší ako chromozóm. Prítomnosť plazmidov v cytoplazme baktérií nie je potrebná, ale poskytujú výhodu v životné prostredie. Veľké plazmidy sa redukujú s chromozómom a ich počet v bunke je malý. A počet malých plazmidov môže dosiahnuť niekoľko desiatok. Niektoré plazmidy sú schopné reverzibilnej integrácie do bakteriálneho chromozómu v určitej oblasti a fungujú ako jeden replikón. Takéto plazmidy sa nazývajú integračné. Niektoré plazmidy sú schopné prenosu z jednej baktérie na druhú priamym kontaktom - konjugatívne plazmidy. Obsahujú gény zodpovedné za tvorbu F-pilies, ktoré tvoria konjugačný mostík na prenos genetických materiálov.

Hlavné typy plazmidov sú

F - integračný kongatívny plazmid. Pohlavný faktor určuje schopnosť baktérií byť darcami počas konjugácie

R - plazmidy. Odolný. Obsahuje gény, ktoré určujú syntézu faktorov, ktoré ničia antibakteriálne lieky. Baktérie, ktoré majú takéto plazmidy, nie sú citlivé na mnohé lieky. Preto sa vytvárajú faktory rezistentné voči liekom.

Plazmidový tox - určujúce faktory patogenity -

Ent – plazmidy – obsahuje gén na tvorbu enterotoxínov.

Hly - ničí červené krvinky.

Mobilné genetické prvky. Medzi ne patrí vkladanie - vkladacie prvky. Všeobecne akceptované označenie je Is. Sú to úseky DNA, ktoré sa môžu pohybovať v rámci replikónu aj medzi nimi. Obsahujú len gény potrebné pre vlastný pohyb.

transpozóny- väčšie štruktúry, ktoré majú rovnaké vlastnosti ako Is, ale navyše obsahujú štruktúrne gény, ktoré určujú syntézu biologické látky, ako sú toxíny. Mobilné genetické prvky môžu spôsobiť inaktiváciu génov, poškodenie genetického materiálu, fúziu replikónov a rozšírenie génov v celej bakteriálnej populácii.

Variabilita v baktériách.

Všetky typy variability sú rozdelené do 2 skupín – nededičná (fenotypová, modifikačná) a dedičná (genotypová).

Úpravy- fenotypové nezdedené zmeny znakov alebo vlastností. Modifikácie neovplyvňujú genotyp, a preto sa nededia. Sú to adaptívne reakcie na zmeny špecifických podmienok vonkajšie prostredie. Spravidla sa strácajú v prvej generácii, keď faktor prestane pôsobiť.

Genotypová variabilita ovplyvňuje genotyp organizmu, a preto sa môže preniesť na potomkov. Genotypová variabilita sa delí na mutácie a rekombinácie.

Mutácie- pretrvávajúce, dedičné zmeny vlastností alebo vlastností organizmu. Základom mutácií je kvalitatívna alebo kvantitatívna zmena sekvencie nukleotidov v molekule DNA. Mutácie môžu zmeniť takmer akúkoľvek vlastnosť.

Podľa pôvodu sú mutácie spontánne a indukované.

Spontánne mutácie sa vyskytuje v prirodzených podmienkach existencie organizmu a vyvolané vznikajú v dôsledku riadeného pôsobenia mutagénneho faktora. Na základe charakteru zmien primárnej štruktúry DNA u baktérií sa rozlišujú génové alebo bodové mutácie a chromozomálne aberácie.

Génové mutácie vyskytujú v rámci jedného génu a zahŕňajú minimálne jeden nukleotid. Tento typ mutácie môže byť výsledkom nahradenia jedného nukleotidu iným, straty nukleotidu alebo vloženia ďalšieho nukleotidu.

Chromozomálne- môže postihnúť niekoľko chromozómov.

Môže dôjsť k delécii – strate časti chromozómu, alebo k duplikácii – zdvojeniu časti chromozómu. Otočenie časti chromozómu o 180 stupňov je inverzia.

Akákoľvek mutácia sa vyskytuje pod vplyvom určitého mutagénneho faktora. Mutagény sú svojou povahou fyzikálne, chemické a biologické. Ionizujúce žiarenie, röntgenové lúče, UV lúče. Medzi chemické mutagény patria analógy dusíkatých zásad, samotná kyselina dusitá a dokonca aj niektoré lieky, cytostatiká. Biologické – niektoré vírusy a transfazóny

Rekombinácia- výmena chromozómových úsekov

Transdukcia - prenos genetického materiálu pomocou bakteriofága

Oprava genetického materiálu - obnovenie poškodenia spôsobeného mutáciami.

Existuje niekoľko druhov nápravy

1. Fotoreaktivácia – tento proces zabezpečuje špeciálny enzým, ktorý sa aktivuje za prítomnosti viditeľného svetla. Tento enzým sa pohybuje pozdĺž reťazca DNA a opravuje poškodenie. Kombinuje časovače, ktoré sa vytvárajú pôsobením UV žiarenia. Výsledky reparácie tmy sú výraznejšie. Nezávisí od svetla a zabezpečuje ho viacero enzýmov – najskôr nukleázy vyrežú poškodený úsek reťazca DNA, potom DNA polymeráza, na matrici komplementárneho reťazca zachovaná, syntetizuje náplasť a ligázy všijú náplasť do náplasti. poškodená oblasť.

Náhrady podliehajú génové mutácie, ale chromozomálne zvyčajne nie sú

1. Genetická rekombinácia v baktériách. Vyznačujú sa prienikom genetického materiálu z baktérie darcu do baktérie príjemcu s vytvorením dcérskeho genómu obsahujúceho gény oboch pôvodných jedincov.

Inkorporácia fragmentu donorovej DNA do príjemcu nastáva krížením

Tri typy prenosu -

1. Transformácia- proces, pri ktorom sa prenáša fragment izolovanej darcovskej DNA. Závisí od kompetencie príjemcu a stavu darcovskej DNA. kompetencie- schopnosť absorbovať DNA. Závisí od prítomnosti špeciálnych proteínov v bunkovej membráne príjemcu a vytvára sa počas určitých období rastu baktérií. Darcovská DNA musí byť dvojvláknová a nie príliš veľká. Darcovská DNA preniká bakteriálnou membránou a jeden z reťazcov je zničený, druhý je integrovaný do DNA príjemcu.
2. Transdukcia- vykonáva sa pomocou bakteriofágov. Všeobecná transdukcia a špecifická transdukcia.

Všeobecné - sa vyskytuje za účasti faktorov virulencie. Počas zostavovania fágových častíc môže hlava fága omylom obsahovať nie fágovú DNA, ale kúsok bakteriálneho chromozómu. Takéto fágy sú defektné fágy.

Špecifické- uskutočňujú ho mierne fágy. Pri rezaní sa rezanie striktne vykonáva pozdĺž hranice.Sú postavené medzi určité gény a prenášajú ich.

1. Konjugácia- prenos genetického materiálu z darcovskej baktérie na príjemcu pri ich priamom kontakte. Nevyhnutná podmienka- prítomnosť kongatívneho plazmidu v darcovskej bunke. Pri konjugácii sa vďaka pili vytvorí konjugačný mostík, cez ktorý sa prenáša genetický materiál od darcu k pacientovi.

Génová diagnostika

Súbor metód, ktoré umožňujú identifikovať genóm mikroorganizmu alebo jeho fragment v skúmanom materiáli. Ako prvá bola navrhnutá metóda NC hybridizácie. Založené na využití princípu komplementarity. Táto metóda umožňuje zistiť prítomnosť markerových fragmentov DNA patogénu v genetickom materiáli pomocou molekulárnych sond. Molekulárne sondy sú krátke reťazce DNA komplementárne k oblasti markera. K sonde sa pridá fluorescenčná značka, rádioaktívny izotop, enzým. Skúmaný materiál je podrobený špeciálnej úprave, ktorá mu umožňuje ničiť mikroorganizmy, uvoľňovať DNA a deliť ju na jednovláknové fragmenty. Potom je materiál fixovaný. Potom sa zistí aktivita značky. Táto metóda nie je príliš citlivá. Identifikovať patogén je možné len vtedy, ak je jeho množstvo dostatočne veľké. 10 až 4 mikroorganizmy. Je to dosť technicky zložité a vyžaduje si veľké množstvo sond. Rozšírené v praxi ho nenašiel. Bol vyvinutý nová metóda - polymeráza reťazová reakcia- PCR.

Táto metóda je založená na schopnosti DNA a vírusovej RNA replikovať sa, t.j. k vlastnej reprodukcii. Podstatou pacienta je opakované kopírovanie – in vitro amplifikácia fragmentu DNA, ktorý je markerom pre daný mikroorganizmus. Keďže proces prebieha pri dostatočnej vysoké teploty 70-90 sa metóda stala možná po izolácii termostabilnej DNA polymerázy z termofilných baktérií. Mechanizmus amplifikácie je taký, že kopírovanie reťazcov DNA nezačína v žiadnom bode, ale až v určitých štartovacích blokoch, na vytvorenie ktorých sa používajú tzv. Priméry sú polynukleotidové sekvencie komplementárne ku koncovým sekvenciám skopírovaného fragmentu požadovanej DNA a priméry nielen iniciujú amplifikáciu, ale ju aj obmedzujú. Teraz existuje niekoľko možností PCR, ktoré sa vyznačujú 3 fázami -

1. Denaturácia DNA (rozdelenie na 1 reťazec fragmentov)
2. Pripevnenie základného náteru.
3. Komplementárna adícia reťazcov DNA k dvojitým reťazcom

Tento cyklus trvá 1,5-2 minúty. V dôsledku toho sa počet molekúl DNA zdvojnásobí 20-40 krát. Výsledkom je 10 až 8 mocnina kópií. Po amplifikácii sa uskutoční elektroforéza a izoluje sa vo forme pruhov. Vykonáva sa v špeciálnom zariadení nazývanom zosilňovač.

Výhody PCR

1. Poskytuje priame indikácie prítomnosti patogénu v testovanom materiáli bez izolácie čistej kultúry.
2. Veľmi vysoká citlivosť. Teoreticky sa dá zistiť 1.
3. Materiál na výskum je možné po odbere ihneď dezinfikovať.
4. 100% špecifickosť
5. Rýchle výsledky. Úplná analýza- 4-5 hodín. Expresná metóda.

Široko sa používa na diagnostiku infekčných chorôb, ktorých pôvodcami sú nekultivovateľné alebo ťažko kultivovateľné organizmy. Chlamýdie, mykoplazmy, mnohé vírusy - hepatitída, herpes. Na určenie boli vyvinuté testovacie systémy antrax, tuberkulóza.

Analýza obmedzenia- pomocou enzýmov sa molekula DNA rozdelí na určité sekvencie nukleoidy a fragmenty sa analyzujú na základe zloženia. Týmto spôsobom môžete nájsť jedinečné oblasti.

Biotechnológia a genetické inžinierstvo

Biotechnológia je veda, ktorá na základe štúdia životne dôležitých procesov živých organizmov využíva tieto bioprocesy, ako aj samotné biologické objekty na priemyselnú výrobu produktov potrebných pre človeka, na reprodukciu bioefektov, ktoré sa neprejavujú neprirodzene. podmienky. Ako biologické objekty sa najčastejšie využívajú jednobunkové mikroorganizmy, ale aj bunky zvierat a rastlín. Bunky sa množia veľmi rýchlo, čo umožňuje zvýšiť biomasu výrobcu v krátkom čase. V súčasnosti je biosyntéza komplexných látok, ako sú bielkoviny, antibiotiká, ekonomickejšia a technologicky dostupnejšia ako iné druhy surovín.

Biotechnológia využíva ako zdroj cieľového produktu samotné bunky, ako aj veľké molekuly syntetizované bunkou, enzýmy, toxíny, protilátky a primárne a sekundárne metabolity – aminokyseliny, vitamíny, hormóny. Technológia získavania produktov mikrobiálnej a bunkovej syntézy pozostáva z niekoľkých typických etáp - výber alebo vytvorenie produktívneho sídla. Výber optimálneho živného média, kultivácia. Izolácia cieľového produktu, jeho čistenie, štandardizácia, poskytnutie liekovej formy. Genetické inžinierstvo spočíva v vytváraní cieľových produktov potrebných pre ľudí. Výsledný cieľový gén je fúzovaný s vektorom a vektorom môže byť plazmid a je vložený do recipientnej bunky. Príjemca - baktéria - coli, droždie. Cieľové produkty syntetizované rekombinantmi sú izolované, purifikované a používané v praxi.

Inzulín a ľudský interferón. Erytropoetín, rastový hormón, monoklonálne protilátky. Vakcína proti hepatitíde B.

Bakteriofágy alebo fágy (z iného gréckeho φᾰγω „požieram“) sú vírusy, ktoré selektívne infikujú bakteriálne bunky. Najčastejšie sa bakteriofágy množia vo vnútri baktérií a spôsobujú ich lýzu. Bakteriofág sa typicky skladá z proteínového obalu a genetického materiálu jednovláknovej alebo dvojvláknovej nukleovej kyseliny (DNA alebo menej často RNA). Celkový počet bakteriofágov v prírode sa približne rovná celkovému počtu baktérií (1030 – 1032 častíc). Bakteriofágy sa aktívne podieľajú na cirkulácii chemikálií a energie a majú významný vplyv na vývoj mikróbov a baktérií.Štruktúra typického bakteriofágového myovírusu.

Štruktúra bakteriofágov 1 - hlava, 2 - chvost, 3 - nukleová kyselina, 4 - kapsida, 5 - „golier“, 6 - proteínová pošva chvosta, 7 - chvostová fibrila, 8 - tŕne, 9 - bazálna platnička

Bakteriofágy sa líšia v chemická štruktúra, typ nukleovej kyseliny, morfológia a povaha interakcie s baktériami. Podľa veľkosti bakteriálne vírusy sto a tisíckrát menšie ako mikrobiálne bunky. Typická fágová častica (virión) pozostáva z hlavy a chvosta. Dĺžka chvosta je zvyčajne 2-4 násobok priemeru hlavy. Hlava obsahuje genetický materiál – jednovláknovú alebo dvojvláknovú RNA alebo DNA s enzýmom transkriptázou v neaktívnom stave, obklopenú proteínovým alebo lipoproteínovým obalom – kapsidou, ktorá ukladá genóm mimo bunky. Nukleová kyselina a kapsid spolu tvoria nukleokapsid. Bakteriofágy môžu mať ikosaedrickú kapsidu zostavenú z viacerých kópií jedného alebo dvoch špecifických proteínov. Typicky sú rohy vyrobené z pentamérov proteínu a podpora každej strany je vyrobená z hexamérov rovnakého alebo podobného proteínu. Okrem toho môžu mať fágy guľovitý, citrónový alebo pleomorfný tvar. Chvost alebo prívesok je proteínová trubica - pokračovanie proteínovej škrupiny hlavy; v spodnej časti chvosta je ATPáza, ktorá regeneruje energiu na injekciu genetického materiálu. Existujú aj bakteriofágy s krátkym procesom, bez procesu a vláknité.

Taxonómia bakteriofágov Veľký počet izolovaných a študovaných bakteriofágov predurčuje potrebu ich systematizácie. Robí to Medzinárodný výbor pre taxonómiu vírusov (ICTV). V súčasnosti podľa Medzinárodná klasifikácia a nomenklatúry vírusov sa bakteriofágy delia v závislosti od typu nukleovej kyseliny a morfológie. Zapnuté tento moment Rozlišuje sa devätnásť rodín. Z nich iba dve obsahujú RNA a iba päť rodín je obalených. Z rodín DNA vírusov majú iba dve rodiny jednovláknové genómy. Deväť rodín obsahujúcich DNA má kruhový DNA genóm, zatiaľ čo ďalších deväť má lineárnu DNA. Deväť čeľadí je špecifických iba pre baktérie, zvyšných deväť je špecifických iba pre archaea a (Tectiviridae) infikuje baktérie aj archaea.

Interakcia bakteriofága s bakteriálnymi bunkami Na základe povahy interakcie bakteriofága s bakteriálnou bunkou sa rozlišujú virulentné a mierne fágy. Počet virulentných fágov sa môže zvyšovať iba počas lytického cyklu. Proces interakcie medzi virulentným bakteriofágom a bunkou pozostáva z niekoľkých fáz: adsorpcia bakteriofága na bunku, penetrácia do bunky, biosyntéza zložiek fágu a ich zostavenie a uvoľnenie bakteriofágov z bunky. Spočiatku sa bakteriofágy naviažu na fágovo špecifické receptory na povrchu bakteriálnej bunky. Fágový chvost pomocou enzýmov umiestnených na jeho konci (hlavne lyzozýmu) lokálne rozpúšťa bunkovú membránu, sťahuje sa a DNA obsiahnutá v hlavičke sa vstrekuje do bunky, zatiaľ čo proteínový obal bakteriofága zostáva vonku. Injikovaná DNA spôsobuje úplnú reštrukturalizáciu metabolizmu bunky: zastaví sa syntéza bakteriálnej DNA, RNA a proteínov. DNA bakteriofága sa začne prepisovať pomocou vlastného enzýmu transkriptázy, ktorý sa aktivuje po vstupe do bakteriálnej bunky. Najprv sa syntetizujú skoré a potom neskoré. RNA, ktoré vstupujú do ribozómov hostiteľskej bunky, kde sa syntetizujú skoré (DNA polymerázy, nukleázy) a neskoré (kapsidové a chvostové proteíny, enzýmy lyzozým, ATPáza a transkriptáza) bakteriofágové proteíny. Replikácia bakteriofágovej DNA prebieha podľa semikonzervatívneho mechanizmu a uskutočňuje sa za účasti vlastných DNA polymeráz. Po syntéze neskorých proteínov a dokončení replikácie DNA, konečný proces- dozrievanie fágových častíc alebo kombinácia fágovej DNA s obalovým proteínom a tvorba zrelých infekčných fágových častíc

Životný cyklus Mierne a virulentné bakteriofágy na počiatočné štádiá interakcie s bakteriálnou bunkou majú rovnaký cyklus. Adsorpcia bakteriofága na fágovo špecifické bunkové receptory. Injekcia fágovej nukleovej kyseliny do hostiteľskej bunky. Ko-replikácia fágovej a bakteriálnej nukleovej kyseliny. Bunkové delenie. Ďalej sa bakteriofág môže vyvíjať podľa dvoch modelov: lyzogénnej alebo lytickej cesty. Mierne bakteriofágy po rozdelení sú v stave profázy (lyzogénna dráha) Virulentné bakteriofágy sa vyvíjajú podľa lytického modelu: Nukleová kyselina fága riadi syntézu fágových enzýmov pomocou aparátu baktérie syntetizujúceho proteíny. Fág tak či onak inaktivuje hostiteľskú DNA a RNA a fágové enzýmy ju úplne rozložia; RNA fága „podriaďuje“ bunkový aparát syntéze proteínov. Fágová nukleová kyselina sa replikuje a riadi syntézu nových obalových proteínov. Nové fágové častice sa tvoria ako výsledok spontánneho samousporiadania proteínového obalu (kapsid) okolo fágovej nukleovej kyseliny; Lysozým sa syntetizuje pod kontrolou fágovej RNA. Bunková lýza: bunka praskne pod vplyvom lyzozýmu; uvoľní sa asi 200-1000 nových fágov; fágy infikujú iné baktérie.

Aplikácia v medicíne Jednou z oblastí použitia bakteriofágov je antibakteriálna terapia, alternatíva k užívaniu antibiotík. Používajú sa napríklad bakteriofágy: streptokoky, stafylokoky, klebsiella, dyzentéria a polyalentné, pyobakteriofágy, coli, proteus a coliproteus a iné. V Rusku je registrovaných a používaných 13 liekov na báze fágov. V súčasnosti sa používajú na liečbu bakteriálnych infekcií, na ktoré nie sú citlivé tradičná liečba antibiotiká, najmä v Gruzínskej republike. Zvyčajne je použitie bakteriofágov sprevádzané väčším úspechom ako antibiotiká tam, kde sú prítomné. biologické membrány, obalené polysacharidmi, cez ktoré antibiotiká väčšinou nepreniknú. V súčasnosti terapeutické využitie Bakteriofágy nedostali schválenie na Západe, hoci sa fágy používajú na ničenie baktérií, ktoré spôsobujú otravu jedlom, ako je listéria. S dlhoročnými skúsenosťami vo výške veľké mesto A vidiecke oblasti bola preukázaná nezvyčajne vysoká terapeutická a profylaktická účinnosť bakteriofága dyzentérie (P. M. Lerner, 2010). V Rusku sa už dlho vyrábajú terapeutické fágové prípravky, liečili sa fágmi ešte pred antibiotikami. V posledných rokoch boli fágy široko používané po povodniach v Krymsku a Chabarovsku na prevenciu úplavice.

V biológii sa bakteriofágy využívajú v genetickom inžinierstve ako vektory, ktoré prenášajú úseky DNA, možný je aj prirodzený prenos génov medzi baktériami cez niektoré fágy (transdukcia). Fágové vektory sa zvyčajne vytvárajú na báze mierneho bakteriofága λ, ktorý obsahuje dvojvláknovú lineárnu molekulu DNA. Vľavo a pravé ramená fág má všetky gény potrebné pre lytický cyklus (replikáciu, reprodukciu). stredná časť Genóm bakteriofága λ (obsahuje gény, ktoré riadia lyzogenézu, teda jeho integráciu do DNA bakteriálnej bunky) nie je nevyhnutný pre jeho reprodukciu a tvorí približne 25 tisíc nukleotidových párov. Táto časť môže byť nahradená cudzím fragmentom DNA. Takto modifikované fágy prechádzajú lytickým cyklom, ale lyzogénia sa nevyskytuje. Bakteriofágové λ vektory sa používajú na klonovanie eukaryotických fragmentov DNA (teda väčších génov) až do 23 tisíc nukleotidových párov (kb). Navyše, fágy bez inzertov sú menšie ako 38 kb. alebo naopak s príliš veľkými vložkami - viac ako 52 kb. nevyvíjajú ani neinfikujú baktérie. Keďže reprodukcia bakteriofágov je možná len v živých bunkách, bakteriofágy možno použiť na určenie životaschopnosti baktérií. Tento smer má veľkú perspektívu, keďže jednou z hlavných otázok v rôznych biotechnologických procesoch je určenie životaschopnosti použitých plodín. Pomocou metódy elektrooptickej analýzy bunkových suspenzií bola ukázaná možnosť štúdia štádií interakcie fág-mikrobiálna bunka

A tiež vo veterinárnej medicíne na: prevenciu a liečbu bakteriálne ochorenia vtáky a zvieratá; liečba hnisavých zápalových ochorení slizníc očí a ústnej dutiny; prevencia hnisavých zápalových komplikácií pri popáleninách, ranách, chirurgických zákrokoch; v genetickom inžinierstve: na transdukciu - prirodzený prenos gény medzi baktériami; ako vektory prenášajúce úseky DNA; pomocou fágov je možné vytvoriť cielené zmeny v genóme hostiteľskej DNA; V Potravinársky priemysel: mäso a hydinové výrobky na priamu spotrebu sa už hromadne spracúvajú prostriedkami obsahujúcimi fágy; bakteriofágy sa používajú pri výrobe potravinárskych výrobkov z mäsa, hydiny, syrov, rastlinných produktov atď.;

V poľnohospodárstvo: postrek fágových prípravkov na ochranu rastlín a plodín pred hnilobou a bakteriálnymi chorobami; chrániť hospodárske zvieratá a hydinu pred infekciami a bakteriálnymi chorobami; Pre environmentálna bezpečnosť: antibakteriálna úprava semien a rastlín; čistenie priestorov potravinárskych podnikov; dezinfekcia pracovného priestoru a vybavenia; prevencia nemocničných priestorov; vykonávanie environmentálnych aktivít

Preto sú dnes bakteriofágy veľmi obľúbené v živote ľudí a zvierat. Podniky vytýčili niekoľko prioritných oblastí pre vývoj a výrobu terapeutických a profylaktických bakteriofágov, ktoré korelujú s novovznikajúcimi globálnymi trendmi. Na liečbu mnohých chorôb sa vytvárajú a zavádzajú nové lieky. Štúdium a využitie bakteriofágov vykonávajú bakteriológovia, virológovia, biochemici, genetici, biofyzici, molekulárni biológovia, experimentálni onkológovia, odborníci v oblasti genetického inžinierstva a biotechnológie.

FSBEI HPE "Mari State University"

Fakulta biológie a chémie

Katedra biochémie a fyziológie

Abstrakt o mikrobiológii a základoch virológie

"Bakterofágy"

Vykonané:

študent III kurz

skupina BPG-21

Chesnoková Elena

Skontrolované:

docent, Ph.D.

Gazheeva T.P.

Yoshkar-Ola, 2011

Úvod 3

Bakteriofágy. Ich úloha v biosfére 4

Štruktúra bakteriofágov 6

Interakcia bakteriofága s bakteriálnymi bunkami 7

Životný cyklus 9

Taxonómia bakteriofágov 10

Prihláška 11

V medicíne 11

V biológii 11

V mikrobiologickom priemysle 12

Hlavné štádiá vývoja a najjednoduchšie metódy štúdia bakteriofágov 13

Zoznam informačných zdrojov 17

Úvod

Anglický bakteriológ Frederick Twort 1 v článku z roku 1915 opísal infekčné ochorenie stafylokokov, pričom infekčný agens prešiel cez filtre a mohol sa preniesť z jednej kolónie do druhej.

Nezávisle od Fredericka Tworta informoval francúzsko-kanadský mikrobiológ Felix D'Herelle 3. septembra 1917 o objave bakteriofágov. Spolu s tým je známe, že ruský mikrobiológ Nikolaj Fedorovič Gamaleya 3 už v roku 1898 prvýkrát pozoroval fenomén lýzy baktérií (antrax bacil) pod vplyvom transplantovateľného činidla.

Felix D'Herelle tiež naznačil, že bakteriofágy majú korpuskulárny charakter. Avšak až po vynáleze elektrónového mikroskopu bolo možné vidieť a študovať ultraštruktúru fágov. Po dlhú dobu boli predstavy o morfológii a hlavných znakoch fágov založené na výsledkoch štúdia fágov T-skupiny - T1, T2, ..., T7, ktoré sa rozmnožujú na E. coli (E. coli) kmeň B. Každý rok sa však objavovali nové údaje týkajúce sa morfológie a štruktúry rôznych fágov, čo si vyžiadalo ich morfologickú klasifikáciu.

Bakteriofágy. Ich úloha v biosfére

Bakteriofágy (fágy) (zo starovekej gréčtiny φᾰγω - „požieram“) sú vírusy, ktoré selektívne infikujú bakteriálne bunky. Bakteriofágy sa najčastejšie množia vo vnútri baktérií a spôsobujú ich lýzu 4 . Bakteriofág sa typicky skladá z proteínového obalu a jednovláknového alebo dvojvláknového genetického materiálu nukleovej kyseliny (DNA alebo menej obyčajne RNA). Veľkosť častíc je približne 20 až 200 nm.

Štruktúra typického bakteriofágového myovírusu (obr. 1).

Bakteriofágy sú najpočetnejšia, v biosfére rozšírená a pravdepodobne evolučne najstaršia skupina vírusov. Odhadovaná veľkosť fágovej populácie je viac ako 1030 fágových častíc.

V prirodzených podmienkach sa fágy nachádzajú na miestach, kde sú na ne citlivé baktérie. Čím je konkrétny substrát (pôda, ľudské a zvieracie výlučky, voda atď.) bohatší na mikroorganizmy, tým väčší je počet zodpovedajúcich fágov, ktoré sa v ňom nachádzajú. V pôde sa teda nachádzajú fágy, ktoré lyzujú bunky všetkých typov pôdnych mikroorganizmov. Černozeme a pôdy, na ktoré boli aplikované organické hnojivá, sú obzvlášť bohaté na fágy.

Bakteriofágy vykonávajú dôležitá úloha pri kontrole počtu mikrobiálnych populácií, pri autolýze starnúcich buniek, pri prenose bakteriálnych génov, pôsobiacich ako vektorové „systémy“.

Bakteriofágy sú skutočne jedným z hlavných mobilných genetických prvkov. Prostredníctvom transdukcie zavádzajú nové gény do bakteriálneho genómu. Odhaduje sa, že za 1 sekundu môže byť infikovaných 1024 baktérií. To znamená, že neustály prenos genetického materiálu je distribuovaný medzi baktérie žijúce v podobných podmienkach.

Vysoká miera špecializácie, dlhodobá existencia a schopnosť rýchlej reprodukcie vo vhodnom hostiteľovi prispievajú k ich zachovaniu v dynamickej rovnováhe medzi širokou paletou bakteriálnych druhov v akomkoľvek prirodzenom ekosystéme. Keď nie je k dispozícii vhodný hostiteľ, mnohé fágy môžu zostať infekčné po celé desaťročia, pokiaľ nie sú zničené extrémnymi látkami alebo podmienkami prostredia.

Fágové prípravky sa používajú na liečbu a prevenciu infekčných ochorení, ako aj v diagnostike – na stanovenie fágovej citlivosti a fágovej typizácie pri identifikácii mikroorganizmov. Pôsobenie fágov je založené na ich prísnej špecifickosti. Terapeutický a profylaktický účinok fágov je určený lytickou aktivitou samotného fága, ako aj imunizačnou vlastnosťou zložiek (antigénov) zničených mikrobiálnych buniek nachádzajúcich sa vo fagolyzátoch, najmä v prípade opakovaného použitia. Pri získavaní fágových preparátov sa používajú overené produkčné kmene fágov a podľa toho aj typické kultúry mikroorganizmov. Bakteriálna kultúra v kvapaline živné médium, ktorý je v logaritmickej fáze reprodukcie, je infikovaný maternicovou suspenziou fága.

Kultúra lyzovaná fágom (zvyčajne nasledujúci deň) sa prefiltruje cez bakteriálne filtre a k filtrátu obsahujúcemu fág sa pridá roztok chinazolu ako konzervačná látka.
Pripravená droga fág je číra tekutina žltkastej farby. Pre dlhšie skladovanie sú niektoré fágy dostupné v suchej forme (v tabletách). V liečbe a prevencii črevné infekcie fágy sa používajú súčasne s roztokom hydrogénuhličitanu sodného, ​​pretože kyslý obsah žalúdka ničí fág. Fág nepretrváva v tele dlho (5-7 dní), preto sa odporúča jeho opätovné použitie.

Vyrobené v Sovietskom zväze nasledujúce lieky, používa sa na liečbu a prevenciu chorôb: týfus, salmonela, úplavica, kolifág, stafylokokový fág a streptokok. V súčasnosti sa fágy používajú na liečbu a prevenciu v kombinácii s antibiotikami. Táto aplikácia má viac účinná akcia pre formy baktérií rezistentných na antibiotiká.

Diagnostické bakteriofágy sa široko používajú na identifikáciu baktérií izolovaných z pacienta alebo z infikovaných environmentálnych objektov. Pomocou bakteriofágov je vďaka ich vysokej špecificite možné určiť druhy baktérií a s väčšou presnosťou aj jednotlivé druhy izolovaných baktérií. V súčasnosti je vyvinutá fágová diagnostika a fágová typizácia baktérií rodu Salmonella, Vibrio a stafylokokov. Fágová typizácia pomáha určiť zdroj infekcie, študovať epidemiologické vzťahy a odlíšiť sporadické prípady chorôb od epidemických.
Fágová diagnostika a fágová typizácia sú založené na princípe kokultivácie izolovaného mikroorganizmu s príslušnými druhmi alebo typmi fágov. Pozitívny výsledok Predpokladá sa, že existuje dobre definovaná lýza študovanej kultúry s druhovým fágom a potom s jedným z typických fágov.