Proprietățile bacteriofagelor și utilizarea lor în medicină. Aplicarea practică a fagilor în medicină
CM. ZAKHARENKO, Ph.D., Profesor asociat, Militar Academiei medicale lor. CM. Kirov, Sankt Petersburg
Bacteriofagii sunt microorganisme unice pe baza cărora a fost creat un grup de medicamente terapeutice și profilactice cu proprietăți și caracteristici speciale. Mecanismele fiziologice naturale care stau la baza interacțiunii dintre fagi și bacterii fac posibilă prezicerea diversității infinite atât a bacteriofagelor înșiși, cât și a acestora. moduri posibile aplicatiile lor. Pe măsură ce colecțiile de bacteriofagi se extind, vor apărea, fără îndoială, noi agenți patogeni țintă și se va extinde gama de boli pentru care fagii pot fi utilizați atât ca monoterapie, cât și ca parte a schemelor de tratament complexe.
Da, folosește piobacteriofag polivalent Sextafagul în tratamentul necrozei pancreatice infectate (Academia Medicală de Stat Perm numită după Academicianul E.A. Wagner) a făcut posibilă restabilirea mai rapidă a parametrilor de bază ai homeostaziei și a funcției organelor și sistemelor la pacienți. A existat și o reducere semnificativă a numărului complicatii postoperatoriiȘi decese: în lotul de pacienți care au primit terapie standard, mortalitatea a fost de 100%, în timp ce în grupul care a primit BF a fost de 16,6%.
Datorită inofensivității și reactogenității medicamentelor BF, utilizarea lor în practica pediatrica, inclusiv la nou-născuți. Experiența școlii regionale de copii Nijni Novgorod este interesantă spital clinic, unde în perioada de complicații ale situației epidemiologice, alături de măsurile obișnuite antiepidemice, s-au folosit atât BF - Intesti-bacteriophage, cât și BF Pseucfomonas aeruginosa. O reducere de 11 ori a incidenței infecțiilor nosocomiale de etiologie pseudomonas a arătat eficiența ridicată a utilizării BF. Medicamentele BF pot fi prescrise pentru tratamentul disbiozei și tulburărilor sistem digestiv, și pentru a preveni colonizarea membranelor mucoase tract gastrointestinal bacterii oportuniste. Preparatele BF multicomponente sunt ideale pentru ameliorarea imediata a primelor semne de suferinta gastrointestinala.
Astăzi, întreprinderea a evidențiat o serie de domenii prioritare pentru dezvoltarea și producerea bacteriofagelor terapeutice și profilactice, care se corelează cu tendințele globale nou apărute. Sunt create și introduse noi medicamente: BF-urile au fost dezvoltate împotriva dinturilor și a enterobacteriilor, se lucrează pentru a crea un medicament fagic împotriva Helicobacter pylori.
Un singur producător al acestor medicamente este NPO Microgen, potrivit raportului șefului adjunct al departamentului de știință și dezvoltare inovatoare Alla Lobastova, produce peste 2 milioane de pachete anual. Din păcate, ideile multor medici despre bacteriofagi sunt departe de a fi obiective. Nu mulți oameni știu că bacteriofagii activi împotriva aceluiași agent patogen pot aparține unor familii diferite, au cicluri de viață diferite etc. De exemplu, bacteriofagii P. aeruginosa aparțin familiilor Myoviridae, Podoviridae, Siphoviridae și au un ciclu de viață litic sau moderat. Tulpini diferite ale aceluiași agent patogen pot avea sensibilități diferite la bacteriofagi. Majoritatea specialiștilor știu (au auzit, cineva a folosit-o) despre existența lichidului și a tabletei forma de dozare medicamentele terapeutice și profilactice ale bacteriofagelor. Cu toate acestea, gama lor este semnificativ mai largă, ceea ce poate fi considerat un avantaj absolut, mai ales în combinație cu o varietate de căi de administrare (administrare orală, clisme, aplicații, irigarea rănilor și a mucoaselor, administrarea în cavitățile plăgii etc.). LA avantaje evidente bacteriofagii sunt atribuiți în mod tradițional unui efect specific asupra unei populații destul de limitate de bacterii, existenței limitate în timp (până când populația țintă de microorganisme dispare), absența unui astfel de efecte secundare ca toxice şi reactii alergice, reacții disbiotice etc. Aceste medicamente pot fi utilizate într-o varietate de grupe de vârstă si in timpul sarcinii. Bacteriofagii înșiși nu sunt alergeni semnificativi. Cazurile de intoleranță la medicamentele bacteriofage sunt asociate în cea mai mare parte cu o reacție la componentele mediului nutritiv. Toți producătorii importanți ai acestui grup de medicamente se străduiesc pentru calitatea maximă a componentelor utilizate, ceea ce reduce probabilitatea unor astfel de reacții. În contextul creșterii rezistenței la antibiotice, unii autori propun să considere bacteriofagii drept cea mai bună alternativă la antibiotice. Medicamentele terapeutice și profilactice ale bacteriofagelor sunt un cocktail de combinații special selectate (un complex de virusuri bacteriene policlonale foarte virulente, special selectate împotriva celor mai comune grupuri de agenți patogeni infecții bacteriene) pe baza colecțiilor de fagi ale producătorului. Filialele FSUE NPO Microgen din Ufa, Perm și Nijni Novgorod – centre moderne producerea unor astfel de medicamente. Posibilitatea de a crea personalizate microorganisme patogene medicamentele terapeutice și profilactice ale bacteriofagelor este un alt avantaj important al acestui grup de medicamente. Creșterea rezistenței bacteriilor la medicamentele antimicrobiene și polietiologia frecventă a bolilor infecțioase moderne necesită terapie combinată cu antibiotice (două, trei și uneori mai multe). antimicrobiene). Pentru selecție schema eficienta terapia cu antibiotice, pe lângă sensibilitatea reală a bacteriilor la medicament, este necesar să se ia în considerare suficient număr mare factori. Terapia fagică are și anumite avantaje în acest sens. Pe de o parte, utilizarea unei combinații de bacteriofagi nu este însoțită de interacțiunea lor între ele și nu duce la modificări ale modelelor de utilizare a acestora. În setul existent de bacteriofagi terapeutici, există o serie de combinații bine dovedite - bacteriofag coliprotean, piobacteriofag polivalent, intestin-bacteriofag. Pe de altă parte, bacteriile nu au mecanisme comune de rezistență la antibiotice și fagi; prin urmare, ele pot fi utilizate atât atunci când agentul patogen este rezistent la unul dintre medicamente, cât și într-o combinație de „antibiotic + bacteriofag”. Această combinație este eficientă în special pentru distrugerea biofilmelor microbiene. Experimentul arată în mod convingător că utilizare combinată antagoniştii de fier şi bacteriofagii pot perturba formarea biofilmelor Klebsiella pneumoniae. În același timp, există atât o scădere semnificativă a dimensiunii populației microbiene, cât și o scădere a numărului de celule „tinere”. Încă una caracteristică importantă Acțiunea bacteriofagelor este un astfel de fenomen precum inducerea apoptozei. Unele tulpini de E. coli au gene care provoacă moartea celulelor după introducerea bacteriofagului T4 în ele. Astfel, ca răspuns la expresia genelor tardive ale fagului T4, gena lit (codifică o protează care distruge factorul de alungire EF-Tu, necesar sintezei proteinelor), blochează sinteza tuturor proteinelor celulare. Gena prrC codifică o nuclează care scindează ARNt al lizinei. Nucleaza este activată de produsul genei stp al fagului T4. În celulele infectate cu fagul T4, genele rex (aparținând genomului fagului și exprimate în celulele lizogenice) determină formarea de canale ionice, ducând la pierderea ionilor vitali de către celule și ulterior la moarte. Fagul T4 în sine poate preveni moartea celulelor prin închiderea canalelor cu proteinele sale, produse ale genelor rII. Dacă bacteriile dezvoltă rezistență la un antibiotic, este necesar să se caute noi opțiuni pentru modificarea moleculei active sau substanțe fundamental noi. Din păcate, pentru anul trecut Ritmul introducerii de noi antibiotice a încetinit semnificativ. Situația cu bacteriofagi este fundamental diferită. Colecțiile marilor producători includ zeci de tulpini de bacteriofagi gata preparate și sunt în mod constant completate cu noi fagi activi. Datorită monitorizării continue a sensibilității agenților patogeni izolați la bacteriofagi, producătorii ajustează compozițiile fagilor furnizate regiunilor. Datorită bacteriofagelor adaptați, este posibilă eliminarea focarelor de infecții nosocomiale cauzate de tulpini rezistente la antibiotice. 
La oral bacteriofagii ajung rapid la locurile de infecție: atunci când sunt administrați oral de către pacienții cu boli purulent-inflamatorii, în decurs de o oră, fagii intră în sânge, după 1-1,5 ore sunt detectați din exudatul bronhopulmonar și de pe suprafața rănilor de arsuri, după 2 ore. - din urină, precum și din lichidul cefalorahidian al pacienților cu leziuni cerebrale traumatice.
Astfel, bacteriofagii sunt microorganisme unice, pe baza cărora a fost creat un grup de medicamente terapeutice și profilactice cu proprietăți și caracteristici speciale. Mecanismele fiziologice naturale care stau la baza interacțiunii dintre fagi și bacterii fac posibilă prezicerea unei varietăți infinite atât a bacteriofagelor înșiși, cât și a modalităților posibile de utilizare a acestora. Pe măsură ce colecțiile de bacteriofagi se extind, vor apărea, fără îndoială, noi agenți patogeni țintă și se va extinde gama de boli pentru care fagii pot fi utilizați atât ca monoterapie, cât și ca parte a schemelor de tratament complexe. O viziune modernă asupra soartei viitoare a terapiei cu fagi ar trebui să se bazeze atât pe specificitatea ridicată a acțiunii lor, cât și pe necesitatea de a respecta cu strictețe toate regulile terapiei cu fagi. Contrastarea bacteriofagelor cu orice mijloc de terapie etiotropă este eronată.
Pentru prima dată s-a făcut presupunerea că bacteriofagii sunt viruși. D. Errel. Ulterior, virusurile fungice etc., au fost descoperite și au devenit cunoscute sub numele de fagi.
Morfologia fagilor.
Dimensiuni - 20 - 200nm. Majoritatea fagilor sunt în formă de mormoloc. Cei mai complexi fagi constau dintr-un cap cu mai multe fațete, în care se află acidul nucleic, un gât și procese. La sfârșitul procesului există o placă bazală, cu fire și dinți care se extind din aceasta. Aceste fire și dinți servesc pentru a atașa fagul de membrana bacteriană. În fagii cel mai complex organizat, partea distală a procesului conține enzima - lizozimă. Această enzimă promovează dizolvarea membranei bacteriene în timpul pătrunderii fagului NK în citoplasmă. La mulți fagi, procesul este înconjurat de o teacă, care la unii fagi se poate contracta.
Există 5 grupe morfologice
- Bacteriofagi cu proces lung și înveliș contractil
- Fagi cu proces lung, dar fără înveliș contractil
- Fagi de ramuri scurte
- Fagi cu un analog de proces
- Fagi filamentosi
Compoziție chimică.
Fagii sunt formați din acid nucleic și proteine. Cele mai multe dintre ele conțin ADN cu 2 catene, închise într-un cerc. Unii fagi conțin o singură catenă de ADN sau ARN.
înveliș fagic - capside, constă din subunități proteice ordonate - capsomeri.
În fagii cel mai complex organizat, partea distală a procesului conține enzima - lizozimă. Această enzimă promovează dizolvarea membranei bacteriene în timpul pătrunderii fagului NK în citoplasmă.
Fagii tolerează înghețarea, încălzirea la 70 și uscarea bine. Sensibil la acizi, UV și fierbere. Fagii infectează bacterii strict definite prin interacțiunea cu receptorii celulari specifici.
După specificul interacţiunii -
Polifage - interacționează cu mai multe specii înrudite de bacterii
Monofagii - fagi specifici speciei - interacționează cu un tip de bacterii
Tip fagi - interacționează cu variante individuale de bacterii din cadrul unei specii.
După acțiunea fagilor tipici, speciile pot fi împărțite în serie de fagi. Interacțiunea fagilor cu bacteriile poate avea loc prin tip productiv, aproductiv și integrator.
Tip productiv- se formează descendenți de fagi, iar celula este lizată
Cu aproductiv- celula continuă să existe, procesul de interacțiune este întrerupt în stadiul inițial
Tip integrativ- genomul fagilor se integrează în cromozomul bacterian și coexistă cu acesta.
În funcție de tipurile de interacțiune, se disting fagi virulenți și temperați.
Virulent interacționează cu bacteriile într-un mod productiv. În primul rând, absorbția fagului pe membrana bacteriană are loc datorită interacțiunii unor receptori specifici. Există pătrunderea sau pătrunderea acidului nucleic viral în citoplasma bacteriilor. Sub influența lizozimei, se formează o mică gaură în învelișul bacterian, învelișul fagului se contractă și se injectează NK. Învelișul fagului din afara bacteriei. În continuare, are loc sinteza proteinelor timpurii. Ele asigură sinteza proteinelor structurale fagice, replicarea acidului nucleic fagic și reprimarea activității cromozomilor bacterieni.
După aceasta, are loc sinteza componente structurale replicarea fagilor și a acidului nucleic. Din aceste elemente, este asamblată o nouă generație de particule de fagi. Ansamblul se numește morfogeneză, particule noi, dintre care 10-100 pot fi formate într-o singură bacterie. Urmează liza bacteriilor și eliberarea unei noi generații de fagi în mediul extern.
Bacteriofagi temperați interacționează fie într-o manieră productivă, fie integrativă. Ciclul productiv decurge similar. Cu interacțiune integrativă, ADN-ul unui fag temperat, după ce intră în citoplasmă, este integrat în cromozom într-o anumită zonă, iar în timpul diviziunii celulare este replicat sincron cu ADN-ul bacterian și aceste structuri sunt transmise celulelor fiice. Un astfel de ADN fag încorporat - profag, iar o bacterie care conține un profag este numită lizogenă, iar fenomenul este lizogenie.
În mod spontan sau sub influența unui număr de factori externi, profagul poate fi tăiat din cromozom, adică. trec într-o stare liberă, prezintă proprietățile unui fag virulent, ceea ce va duce la formarea unei noi generații de corpuri bacteriene - inducția profagului.
Lizogeneza bacteriilor stă la baza conversiei fagice (lizogenă). Acest lucru este înțeles ca o schimbare a caracteristicilor sau proprietăților bacteriilor lizogenice în comparație cu bacteriile nelizogene din aceeași specie. Pot fi modificate proprietăți diferite- morfologice, antigenice etc.
Fagii temperați pot fi defecte - incapabili să formeze descendenți de fagi care nu sunt în conditii naturaleși în inducție.
Virionul este o particulă virală cu drepturi depline, constând din NK și o înveliș proteic
Aplicarea practică a fagilor -
- Aplicare în diagnosticare. În raport cu un număr de specii bacteriene, monofagii sunt utilizați în reacția de fagolizabilitate ca unul dintre criteriile de identificare a unei culturi bacteriene; fagii tipici sunt utilizați pentru fagotipare și pentru diferențierea intraspecifică a bacteriilor. Realizat în scopuri epidemiologice, pentru a stabili sursa de infecție și modalitățile de eliminare a acesteia
- Pentru tratamentul și prevenirea unui număr de infecții bacteriene - tip abdominal, infecții cu stafilococ și streptococ (comprimate rezistente la acid)
- Bacteriofagii temperați sunt utilizați în Inginerie genetică ca vector capabil să introducă material genetic într-o celulă vie.
Genetica bacteriilor
Genomul bacterian este format din elemente genetice capabile de auto-reproducere - replicoane. Repliconii sunt cromozomi și plasmide bacteriene. Cromozomul bacterian formează un nucleoid, un inel închis care nu este asociat cu proteine și poartă un set haploid de gene.
O plasmidă este, de asemenea, un inel închis al unei molecule de ADN, dar mult mai mică ca dimensiune decât un cromozom. Prezența plasmidelor în citoplasma bacteriilor nu este necesară, dar acestea oferă un avantaj în mediu inconjurator. Plasmidele mari sunt reduse cu cromozomul și numărul lor în celulă este mic. Iar numărul de plasmide mici poate ajunge la câteva zeci. Unele plasmide sunt capabile să se integreze reversibil în cromozomul bacterian dintr-o anumită regiune și să funcționeze ca un singur replicon. Astfel de plasmide se numesc integrative. Unele plasmide sunt capabile să fie transmise de la o bacterie la alta prin contact direct - plasmide conjugative. Acestea conțin gene responsabile de formarea pilor F, care formează o punte conjugativă pentru transferul materialelor genetice.
Principalele tipuri de plasmide sunt
F - plasmidă congativă integrativă. Factorul sexual determină capacitatea bacteriilor de a fi donatori în timpul conjugării
R - plasmide. Rezistent. Conține gene care determină sinteza factorilor care distrug medicamente antibacteriene. Bacteriile care posedă astfel de plasmide nu sunt sensibile la multe medicamente. Prin urmare, se formează factori rezistenți la medicamente.
Plasmid tox - factori determinanți ai patogenității -
Ent - plasmide - contine o gena pentru producerea de enterotoxine.
Hly - distruge celulele roșii din sânge.
Elemente genetice mobile. Acestea includ inserarea - elemente de inserare. Denumirea general acceptată este Is. Acestea sunt secțiuni de ADN care se pot mișca atât în interiorul repliconului, cât și între ele. Conțin doar genele necesare propriei mișcări.
Transpozonii- structuri mai mari care au aceleasi proprietati ca Is, dar in plus contin gene structurale care determina sinteza substante biologice, cum ar fi toxinele. Elementele genetice mobile pot provoca inactivarea genelor, deteriorarea materialului genetic, fuziunea repliconilor și răspândirea genelor în întreaga populație bacteriană.
Variabilitatea bacteriilor.
Toate tipurile de variabilitate sunt împărțite în 2 grupe - neereditare (fenotipică, modificare) și ereditară (genotipică).
Modificări- modificări fenotipice nemoștenite ale trăsăturilor sau proprietăților. Modificările nu afectează genotipul și, prin urmare, nu sunt moștenite. Sunt reacții adaptative la schimbări în condiții specifice Mediul extern. De regulă, ele se pierd în prima generație, după ce factorul încetează să mai acționeze.
Variabilitatea genotipică afectează genotipul organismului și, prin urmare, poate fi transmis descendenților. Variabilitatea genotipică este împărțită în mutații și recombinări.
Mutații- modificări persistente, ereditare, ale caracteristicilor sau proprietăților unui organism. Baza mutațiilor este o modificare calitativă sau cantitativă a secvenței nucleotidelor dintr-o moleculă de ADN. Mutațiile pot schimba aproape orice proprietate.
Prin origine, mutațiile sunt spontane și induse.
Mutații spontane are loc în condițiile naturale ale existenței organismului și induse apar ca urmare a acțiunii dirijate a unui factor mutagen. Pe baza naturii modificărilor în structura primară a ADN-ului în bacterii, se disting mutațiile genice sau punctiforme și aberațiile cromozomiale.
Mutații genetice apar într-o singură genă și implică minim o nucleotidă. Acest tip de mutație poate fi rezultatul înlocuirii unei nucleotide cu alta, pierderii unei nucleotide sau inserării unuia suplimentar.
Cromozomiale- poate afecta mai multi cromozomi.
Poate exista o ștergere - pierderea unei secțiuni a unui cromozom sau o duplicare - dublarea unei secțiuni a unui cromozom. Rotirea unei secțiuni a unui cromozom cu 180 de grade este o inversare.
Orice mutație apare sub influența unui anumit factor mutagen. Prin natura lor, mutagenii sunt fizici, chimici și biologici. radiatii ionizante, raze X, Raze UV. Mutagenii chimici includ analogi ai bazelor azotate, acidul azotat în sine și chiar unele medicamente, citostatice. Biologic - unii virusi si transfazoni
Recombinare- schimb de secțiuni cromozomiale
Transducție - transfer de material genetic folosind un bacteriofag
Repararea materialului genetic - refacerea daunelor rezultate din mutații.
Există mai multe tipuri de reparații
- Fotoreactivare - acest proces este asigurat de o enzimă specială care este activată în prezența luminii vizibile. Această enzimă se mișcă de-a lungul catenei ADN și repară daunele. Combină temporizatoarele care se formează sub acțiunea UV. Rezultatele reparației întunecate sunt mai semnificative. Nu depinde de lumină și este furnizată de mai multe enzime - mai întâi, nucleazele decupează secțiunea deteriorată a lanțului ADN, apoi ADN polimeraza, pe matricea lanțului complementar conservat, sintetizează un plasture, iar ligazele coase plasturele în zona deteriorata.
Reparațiile sunt supuse mutații genetice, dar cele cromozomiale de obicei nu sunt
- Recombinarea genetică în bacterii. Ele sunt caracterizate prin pătrunderea materialului genetic din bacteria donatoare în bacteria primitoare cu formarea unui genom fiică care conține genele ambilor indivizi originali.
Încorporarea unui fragment de ADN donor în receptor are loc prin încrucișare
Trei tipuri de transmisie -
- Transformare- un proces în care se transferă un fragment de ADN donator izolat. Depinde de competența primitorului și de starea ADN-ului donatorului. Competență- capacitatea de a absorbi ADN-ul. Depinde de prezența proteinelor speciale în membrana celulară a primitorului și se formează în anumite perioade de creștere bacteriană. ADN-ul donatorului trebuie să fie dublu catenar și să nu aibă dimensiuni foarte mari. ADN-ul donatorului pătrunde în membrana bacteriană, iar unul dintre lanțuri este distrus, celălalt este integrat în ADN-ul primitorului.
- Transducția- realizat cu ajutorul bacteriofagelor. Transducția generală și transducția specifică.
general - apare cu participarea factorilor de virulență. În timpul asamblarii particulelor fagice, capul fagului poate include în mod eronat nu ADN fag, ci o bucată din cromozomul bacterian. Astfel de fagi sunt fagi defecte.
Specific- este realizat de fagi temperati. La tăiere, tăierea se efectuează strict de-a lungul graniței.Sunt construite între anumite gene și le transferă.
- Conjugare- transferul materialului genetic de la bacteria donatoare la destinatar, la contactul direct al acestora. O condiție necesară- prezenţa unei plasmide congative în celula donatoare. În timpul conjugării, se formează o punte de conjugare datorită pili, prin care materialul genetic este transferat de la donator la pacient.
Diagnosticul genetic
Un set de metode care fac posibilă identificarea genomului unui microorganism sau a fragmentului acestuia în materialul studiat. Metoda de hibridizare NC a fost prima propusă. Pe baza utilizării principiului complementarităţii. Această metodă vă permite să detectați prezența fragmentelor de ADN marker ale agentului patogen în materialul genetic folosind sonde moleculare. Sondele moleculare sunt lanțuri scurte de ADN complementare regiunii marker. O etichetă fluorescentă este adăugată la sondă, izotop radioactiv, enzimă. Materialul studiat este supus unui tratament special, care îi permite să distrugă microorganismele, să elibereze ADN-ul și să-l împartă în fragmente monocatenar. După aceasta, materialul este fixat. Activitatea etichetei este apoi detectată. Această metodă nu este foarte sensibilă. Este posibil să se identifice agentul patogen numai dacă cantitatea acestuia este suficient de mare. 10 până la 4 microorganisme. Este destul de complex din punct de vedere tehnic și necesită un număr mare de sonde. Răspânditîn practică nu l-a găsit. A fost dezvoltat metoda noua - polimeraza reacție în lanț- PCR.
Această metodă se bazează pe capacitatea ADN-ului și a ARN-ului viral de a se replica, de exemplu. la auto-reproducere. Esența pacientului este copierea repetată - amplificarea in vitro a unui fragment de ADN, care este un marker pentru un anumit microorganism. Deoarece procesul are loc la suficient temperaturi mari 70-90, metoda a devenit posibilă după izolarea ADN polimerazei termostabile din bacteriile termofile. Mecanismul de amplificare este de așa natură încât copiarea lanțurilor de ADN nu începe în niciun moment, ci doar la anumite blocuri de pornire, pentru crearea cărora se folosesc așa-numiții primeri. Primerii sunt secvențe de polinucleotide complementare cu secvențele terminale ale fragmentului copiat al ADN-ului dorit, iar primerii nu numai că inițiază amplificarea, ci și o limitează. Acum există mai multe opțiuni PCR, caracterizate prin 3 etape -
- Denaturarea ADN-ului (diviziunea în 1 fragmente de lanț)
- Atașarea grundului.
- Adăugarea complementară a catenelor de ADN la catenele duble
Acest ciclu durează 1,5-2 minute. Ca urmare, numărul de molecule de ADN se dublează de 20-40 de ori. Rezultatul este de la 10 la puterea a opta a copiilor. După amplificare, se efectuează electroforeza și se izolează sub formă de dungi. Se realizează într-un dispozitiv special numit amplificator.
Avantajele PCR
- Oferă indicii directe ale prezenței unui agent patogen în materialul de testat, fără a izola o cultură pură.
- Sensibilitate foarte mare. Teoretic, se poate detecta pe primul.
- Materialul pentru cercetare poate fi dezinfectat imediat după colectare.
- 100% specificitate
- Rezultate rapide. Analiză completă- 4-5 ore. Metoda expresă.
Este utilizat pe scară largă pentru diagnosticarea bolilor infecțioase, ai căror agenți cauzali sunt organisme necultivabile sau dificil de cultivat. Chlamydia, micoplasma, multe virusuri - hepatită, herpes. Au fost dezvoltate sisteme de testare pentru a determina antrax, tuberculoza.
Analiza restricțiilor- cu ajutorul enzimelor se împarte molecula de ADN în anumite secvențe nucleoizii și fragmentele sunt analizate pe baza compoziției. Astfel puteți găsi zone unice.
Biotehnologie și inginerie genetică
Biotehnologia este o știință care, pe baza studiului proceselor vitale ale organismelor vii, utilizează aceste bioprocese, precum și obiectele biologice în sine, pentru producerea industrială a produselor necesare omului, pentru a reproduce bioefecte care nu se manifestă în mod nenatural. conditii. Microorganismele unicelulare, precum și celulele animalelor și plantelor, sunt cel mai adesea folosite ca obiecte biologice. Celulele se reproduc foarte repede, ceea ce face posibilă creșterea biomasei producătorului într-un timp scurt. În prezent, biosinteza unor substanțe complexe, precum proteinele, antibioticele, este mai economică și mai accesibilă din punct de vedere tehnologic decât alte tipuri de materii prime.
Biotehnologia folosește celulele în sine ca sursă a produsului țintă, precum și molecule mari sintetizate de celulă, enzime, toxine, anticorpi și metaboliți primari și secundari - aminoacizi, vitamine, hormoni. Tehnologia de obținere a produselor de sinteză microbiană și celulară se rezumă la mai multe etape tipice - selectarea sau crearea unui sediu productiv. Selectarea mediului nutritiv optim, cultivare. Izolarea produsului țintă, purificarea acestuia, standardizarea, oferirea unei forme de dozare. Ingineria genetică se reduce la crearea produselor țintă necesare oamenilor. Gena țintă rezultată este fuzionată cu un vector, iar vectorul poate fi o plasmidă și este inserată în celula primitoare. Destinatar - bacterie - coli, drojdie. Produsele țintă sintetizate de recombinanți sunt izolate, purificate și utilizate în practică.
Insulina si interferon uman. Eritropoietina, hormon de creștere, anticorpi monoclonali. Vaccinul împotriva hepatitei B.
Bacteriofagii sau fagii (din altă greacă φᾰγω „Devor”) sunt viruși care infectează selectiv celulele bacteriene. Cel mai adesea, bacteriofagii se înmulțesc în interiorul bacteriilor și provoacă liza acestora. De obicei, un bacteriofag constă dintr-o înveliș proteic și material genetic de acid nucleic monocatenar sau dublu (ADN sau, mai rar, ARN). Numărul total de bacteriofagi din natură este aproximativ egal cu numărul total de bacterii (1030 – 1032 particule). Bacteriofagii participă activ la circulația substanțelor chimice și a energiei și au o influență semnificativă asupra evoluției microbilor și bacteriilor.Structura unui miovirus tipic bacteriofag.
Structura bacteriofagelor 1 - cap, 2 - coadă, 3 - acid nucleic, 4 - capsid, 5 - „guler”, 6 - teaca proteică a cozii, 7 - fibrila cozii, 8 - spini, 9 - placa bazală
Bacteriofagii diferă în structura chimica, tipul de acid nucleic, morfologia și natura interacțiunii cu bacteriile. La dimensiune virusuri bacteriene de sute și de mii de ori mai mici decât celulele microbiene. O particulă tipică de fag (virion) constă dintr-un cap și o coadă. Lungimea cozii este de obicei de 2-4 ori diametrul capului. Capul conține material genetic - ARN sau ADN monocatenar sau dublu catenar cu enzima transcriptaza în stare inactivă, înconjurat de o înveliș proteic sau lipoproteic - capsid, care stochează genomul în afara celulei. Acidul nucleic și capsida formează împreună nucleocapsidul. Bacteriofagii pot avea o capsidă icosaedrică asamblată din mai multe copii ale uneia sau două proteine specifice. În mod obișnuit, colțurile sunt făcute din pentameri ai unei proteine, iar suportul fiecărei părți este format din hexameri ai aceleiași proteine sau similare. Mai mult, fagii pot avea formă sferică, în formă de lămâie sau pleomorfă. Coada sau apendicele este un tub proteic - o continuare a învelișului proteic al capului; la baza cozii există o ATPază care regenerează energia pentru injectarea materialului genetic. Există și bacteriofagi cu proces scurt, fără proces și filamentoși.
Taxonomia bacteriofagelor Numărul mare de bacteriofagi izolați și studiati determină necesitatea sistematizării acestora. Acest lucru este realizat de Comitetul Internațional pentru Taxonomia Virușilor (ICTV). În prezent, conform Clasificarea internațională iar nomenclatura virusurilor, bacteriofagii se impart in functie de tipul de acid nucleic si morfologie. Pe acest moment Se disting nouăsprezece familii. Dintre acestea, doar două conțin ARN și doar cinci familii sunt învăluite. Dintre familiile de virusuri ADN, doar două familii au genomi monocatenar. Nouă familii care conțin ADN au un genom ADN circular, în timp ce celelalte nouă au ADN liniar. Nouă familii sunt specifice numai bacteriilor, restul de nouă sunt specifice numai arheilor și (Tectiviridae) infectează atât bacteriile, cât și arheile.
Interacțiunea unui bacteriofag cu celulele bacteriene Pe baza naturii interacțiunii unui bacteriofag cu o celulă bacteriană, se disting fagii virulenți și temperați. Fagii virulenți pot crește în număr doar prin ciclul litic. Procesul de interacțiune dintre un bacteriofag virulent și o celulă constă din mai multe etape: adsorbția bacteriofagului pe celulă, pătrunderea în celulă, biosinteza componentelor fagilor și asamblarea acestora și eliberarea bacteriofagelor din celulă. Inițial, bacteriofagii se atașează de receptorii specifici fagilor de pe suprafața celulei bacteriene. Coada fagului, cu ajutorul enzimelor situate la capătul său (în principal lizozima), dizolvă local membrana celulară, se contractă, iar ADN-ul conținut în cap este injectat în celulă, în timp ce învelișul proteic al bacteriofagului rămâne în exterior. ADN-ul injectat determină o restructurare completă a metabolismului celulei: sinteza ADN-ului bacterian, ARN-ului și proteinelor se oprește. ADN-ul bacteriofagului începe să fie transcris folosind propria sa enzimă transcriptază, care este activată după intrarea în celula bacteriană. Se sintetizează mai întâi cele timpurii, apoi cele târzii. ARN-urile care intră în ribozomii celulei gazdă, unde sunt sintetizate proteine bacteriofage precoce (ADN polimeraze, nucleaze) și tardive (proteine capside și coadă, enzime lizozimă, ATPază și transcriptază). Replicarea ADN-ului bacteriofag are loc conform unui mecanism semi-conservator și se realizează cu participarea propriilor ADN polimeraze. După sinteza proteinelor târzii și finalizarea replicării ADN-ului, proces final- maturarea particulelor de fagi sau combinarea ADN-ului fagilor cu proteina de înveliș și formarea particulelor de fagi infecțioase mature
Ciclu de viață Bacteriofagi temperați și virulenți pe etapele inițiale interacțiunile cu o celulă bacteriană au același ciclu. Adsorbția bacteriofagului pe receptorii celulari specifici fagilor. Injectarea acidului nucleic fag într-o celulă gazdă. Co-replicarea fagului și a acidului nucleic bacterian. Diviziune celulara. Mai mult, bacteriofagul se poate dezvolta după două modele: cale lizogenă sau litică. Bacterofagii temperați după divizare sunt în stare de profază (cale lizogenă).Bacterofagii virulenți se dezvoltă după modelul litic: Acidul nucleic al fagului direcționează sinteza enzimelor fagice, folosind aparatul de sinteză a proteinelor al bacteriei. Fagul într-un fel sau altul inactivează ADN-ul și ARN-ul gazdei, iar enzimele fagilor îl descompun complet; ARN-ul fagului „subordonează” aparatul celular pentru sinteza proteinelor. Acidul nucleic fag se replic și direcționează sinteza de noi proteine de înveliș. Noi particule de fagi se formează ca rezultat al auto-asamblării spontane a învelișului proteic (capside) în jurul acidului nucleic fag; Lizozima este sintetizată sub controlul ARN-ului fagului. Liza celulară: celula sparge sub influența lizozimei; sunt eliberați aproximativ 200-1000 de fagi noi; fagii infectează alte bacterii.
Aplicare În medicină Unul dintre domeniile de utilizare a bacteriofagelor este terapie antibacteriană, o alternativă la administrarea de antibiotice. De exemplu, se folosesc bacteriofagi: streptococi, stafilococi, klebsiella, dizenterie și polialent, piobacteriofagi, coli, proteus și coliproteus și altele. În Rusia, sunt înregistrate și utilizate 13 produse medicale pe bază de fagi. Ele sunt utilizate în prezent pentru a trata infecțiile bacteriene la care nu sunt sensibile tratament traditional antibiotice, în special în Republica Georgia. De obicei, utilizarea bacteriofagelor este însoțită de un succes mai mare decât antibioticele acolo unde acestea sunt prezente. membrane biologice, acoperit cu polizaharide, prin care antibioticele de obicei nu pătrund. În prezent utilizare terapeutică Bacteriofagii nu au primit aprobare în Occident, deși fagii sunt folosiți pentru a ucide bacteriile care provoacă intoxicații alimentare, cum ar fi listeria. Cu mulți ani de experiență în valoare de oraș mareȘi zone rurale eficiența terapeutică și profilactică neobișnuit de ridicată a bacteriofagului de dizenterie a fost dovedită (P. M. Lerner, 2010). În Rusia, preparatele terapeutice cu fagi au fost făcute de mult timp; au fost tratate cu fagi chiar înainte de antibiotice. În ultimii ani, fagii au fost folosiți pe scară largă după inundațiile din Krymsk și Khabarovsk pentru a preveni dizenteria.
În biologie, bacteriofagii sunt utilizați în inginerie genetică ca vectori care transferă secțiuni de ADN; transferul natural de gene între bacterii prin intermediul unor fagi (transducție) este de asemenea posibil. Vectorii fagi sunt de obicei creați pe baza bacteriofagului temperat λ, care conține o moleculă de ADN liniar dublu catenar. Stânga și umerii drepti fagii au toate genele necesare ciclului litic (replicare, reproducere). partea de mijloc Genomul bacteriofagului λ (conține gene care controlează lizogenia, adică integrarea sa în ADN-ul celulei bacteriene) nu este esențial pentru reproducerea sa și este de aproximativ 25 de mii de perechi de nucleotide. Această parte poate fi înlocuită cu un fragment străin de ADN. Astfel de fagi modificați suferă un ciclu litic, dar lizogenia nu are loc. Vectorii bacteriofagi λ sunt utilizați pentru a clona fragmente de ADN eucariote (adică gene mai mari) până la 23 de mii de perechi de nucleotide (kb). Mai mult, fagii fără inserții au mai puțin de 38 kb. sau, dimpotrivă, cu inserții prea mari - mai mult de 52 kb. nu dezvolta sau infecta bacterii. Deoarece reproducerea bacteriofagelor este posibilă numai în celulele vii, bacteriofagii pot fi utilizați pentru a determina viabilitatea bacteriilor. Această direcție are perspective mari, întrucât una dintre problemele principale în diferite procese biotehnologice este determinarea viabilității culturilor utilizate. Folosind metoda analizei electro-optice a suspensiilor celulare, a fost demonstrata posibilitatea studierii etapelor interactiunii fago-celula microbiana.
Și, de asemenea, în medicina veterinară pentru: prevenire și tratament boli bacteriene păsări și animale; tratamentul bolilor purulent-inflamatorii ale membranelor mucoase ale ochilor și cavității bucale; prevenirea complicațiilor purulent-inflamatorii în arsuri, răni, intervenții chirurgicale; în inginerie genetică: pentru transducție - transmitere naturală gene între bacterii; ca vectori care transferă secțiuni de ADN; folosind fagi, este posibil să se realizeze modificări țintite în genomul ADN-ului gazdă; V Industria alimentară: carnea și produsele de pasăre gata de consumat sunt deja prelucrate în masă cu agenți care conțin fagi; bacteriofagii sunt utilizați la fabricarea produselor alimentare din carne, păsări de curte, brânză, produse vegetale etc.;
V agricultură: pulverizarea preparatelor fagice pentru a proteja plantele și culturile de putrezire și boli bacteriene; pentru a proteja animalele și păsările de curte de infecții și boli bacteriene; Pentru siguranța mediului: tratamentul antibacterian al semintelor si plantelor; curățarea spațiilor întreprinderilor de prelucrare a produselor alimentare; igienizarea spațiului de lucru și a echipamentelor; prevenirea spațiilor spitalicești; desfasurarea activitatilor de mediu
Astfel, astăzi bacteriofagii sunt foarte populari în viața oamenilor și a animalelor. Întreprinderile au evidențiat o serie de domenii prioritare pentru dezvoltarea și producerea bacteriofagelor terapeutice și profilactice, care se corelează cu noile tendințe globale emergente. Sunt create și introduse noi medicamente pentru tratarea multor boli. Studiul și utilizarea bacteriofagelor este efectuată de bacteriologi, virologi, biochimiști, geneticieni, biofizicieni, biologi moleculari, oncologi experimentali, specialiști în inginerie genetică și biotehnologie.
FSBEI HPE „Universitatea de Stat Mari”
Facultatea de Biologie și Chimie
Catedra de Biochimie și Fiziologie
Rezumat despre microbiologie și bazele virologiei
„Bacteriofagi”
Efectuat:
student III curs
grupa BPG-21
Chesnokova Elena
Verificat:
Conf. univ. dr.
Gazheeva T.P.
Yoshkar-Ola, 2011
Introducere 3
Bacteriofagi. Rolul lor în biosferă 4
Structura bacteriofagelor 6
Interacțiunea bacteriofagului cu celulele bacteriene 7
Ciclul de viață 9
Taxonomia bacteriofagelor 10
Aplicație 11
În medicină 11
În biologie 11
În industria microbiologică 12
Principalele etape de dezvoltare și cele mai simple metode de studiere a bacteriofagelor 13
Lista surselor de informare 17
Introducere
Bacteriologul englez Frederick Twort 1 într-un articol din 1915 a descris o boală infecțioasă a stafilococilor, agentul infecțios trecut prin filtre și putea fi transferat de la o colonie la alta.
Independent de Frederick Twort, microbiologul franco-canadian Felix D'Herelle a raportat descoperirea bacteriofagelor pe 3 septembrie 1917. Împreună cu aceasta, se știe că microbiologul rus Nikolai Fedorovich Gamaleya 3, încă din 1898, a observat pentru prima dată fenomenul de liză a bacteriilor (bacilul antraxului) sub influența unui agent transplantabil.
Felix D'Herelle a sugerat, de asemenea, că bacteriofagii sunt de natură corpusculară. Cu toate acestea, numai după inventarea microscopului electronic a fost posibil să se vadă și să se studieze ultrastructura fagilor. Multă vreme, ideile despre morfologia și caracteristicile principale ale fagilor s-au bazat pe rezultatele studierii fagilor din grupul T - T1, T2, ..., T7, care se reproduc pe E. coli (E. coli) tulpina B. Cu toate acestea, în fiecare an au apărut date noi privind morfologia și structura diverșilor fagi, ceea ce a necesitat clasificarea morfologică a acestora.
Bacteriofagi. Rolul lor în biosferă
Bacteriofagii (fagii) (din greaca veche φᾰγω - „Devor”) sunt viruși care infectează selectiv celulele bacteriene. Cel mai adesea, bacteriofagii se înmulțesc în interiorul bacteriilor și provoacă liza acestora 4 . În mod obișnuit, un bacteriofag constă dintr-un înveliș proteic și material genetic de acid nucleic simplu sau dublu catenar (ADN sau, mai rar, ARN). Dimensiunea particulelor este de aproximativ 20 până la 200 nm.
Structura unui miovirus tipic bacteriofag (Fig. 1).
Bacteriofagii sunt cei mai numeroși, răspândiți în biosferă și, probabil, cel mai vechi grup de viruși din punct de vedere evolutiv. Dimensiunea estimată a populației de fagi este de peste 1030 de particule de fagi.
În condiții naturale, fagii se găsesc în locuri unde există bacterii sensibile la aceștia. Cu cât un anumit substrat (sol, excreții umane și animale, apă etc.) este mai bogat în microorganisme, cu atât este mai mare numărul de fagi corespunzători găsiți în el. Astfel, în sol se găsesc fagi care lizează celulele tuturor tipurilor de microorganisme din sol. Cernoziomurile și solurile pe care s-au aplicat îngrășăminte organice sunt deosebit de bogate în fagi.
Bacteriofagii efectuează rol importantîn controlul numărului de populații microbiene, în autoliza celulelor îmbătrânite, în transferul de gene bacteriene, acționând ca „sisteme” vectoriale.
Într-adevăr, bacteriofagii sunt unul dintre principalele elemente genetice mobile. Prin transducție, ei introduc noi gene în genomul bacterian. S-a estimat că 1024 de bacterii pot fi infectate într-o secundă. Aceasta înseamnă că transferul constant de material genetic este distribuit între bacteriile care trăiesc în condiții similare.
Un nivel ridicat de specializare, existența pe termen lung și capacitatea de a se reproduce rapid într-o gazdă adecvată contribuie la păstrarea acestora într-un echilibru dinamic între o mare varietate de specii bacteriene din orice ecosistem natural. Atunci când o gazdă adecvată nu este disponibilă, mulți fagi pot rămâne infecțioși timp de zeci de ani, dacă nu sunt distruși de substanțe extreme sau de condițiile de mediu.
Preparatele fagice sunt utilizate pentru tratamentul și prevenirea bolilor infecțioase, precum și în diagnosticare - pentru a determina sensibilitatea fagilor și tiparea fagilor în identificarea microorganismelor. Acțiunea fagilor se bazează pe specificitatea lor strictă. Efectul terapeutic și profilactic al fagilor este determinat de activitatea litică a fagului însuși, precum și de proprietatea de imunizare a componentelor (antigenelor) celulelor microbiene distruse găsite în fagolizate, în special în cazul utilizării repetate. La obținerea preparatelor de fagi, se folosesc tulpini de producție dovedite de fagi și, în consecință, culturi tipice de microorganisme. Cultură bacteriană în lichid mediu nutritiv, care se află în faza logaritmică de reproducere, este infectată cu o suspensie uterină a fagului.
Cultura lizată cu fagi (de obicei a doua zi) este filtrată prin filtre bacteriene și se adaugă o soluție de chinosol la filtratul care conține fagul ca conservant.
Medicament gata fagul este lichid limpede culoare gălbuie. Pentru depozitare mai lungă, unii fagi sunt disponibili sub formă uscată (sub formă de tablete). În tratament și prevenție infectii intestinale fagii sunt utilizați simultan cu o soluție de bicarbonat de sodiu, deoarece conținutul acid al stomacului distruge fagul. Fagul nu persistă în organism mult timp (5-7 zile), așa că se recomandă reutilizarea lui.
Produs în Uniunea Sovietică următoarele medicamente, utilizat pentru tratamentul și prevenirea bolilor: tifoidă, salmonela, dizenterie, colifag, fag stafilococic și streptococ. În prezent, fagii sunt utilizați pentru tratament și prevenire în combinație cu antibiotice. Această aplicație are mai multe actiune eficienta pentru formele bacteriene rezistente la antibiotice.
Bacteriofagii de diagnosticare sunt utilizați pe scară largă pentru a identifica bacteriile izolate de la un pacient sau de la obiectele din mediu infectate. Cu ajutorul bacteriofagelor, datorită specificității lor ridicate, este posibil să se determine tipurile de bacterii și, cu o precizie mai mare, tipuri individuale de bacterii izolate. În prezent, au fost dezvoltate diagnosticarea fagică și tiparea fagică a bacteriilor din genul Salmonella, Vibrio și stafilococi. Tiparea fagilor ajută la stabilirea sursei infecției, la studiul relațiilor epidemiologice și la distingerea cazurilor sporadice de boli de cele epidemice.
Diagnosticarea fagilor și tiparea fagilor se bazează pe principiul co-cultivării unui microorganism izolat cu speciile sau tipul de fagi corespunzătoare. Rezultat pozitiv Se consideră că există o liză bine definită a culturii studiate cu fagul speciei, iar apoi cu unul dintre fagii tipici.
