Laboratorijska dijagnostika helmintijaza. Metoda izolacije čiste kulture lišmanije dobivene struganjem patoloških tkiva

Jednostavne metode

Makroskopska metoda. Prilikom pregleda izmeta možete pronaći helminte, njihove glave, segmente i fragmente strobila, oslobođene samostalno ili nakon dehelmintizacije. Ova metoda se posebno preporučuje za identifikaciju enterobiasis, taeniasis i teeniarynchosis.

Mali dijelovi izmeta pomiješaju se s vodom u ravnoj kupki ili u Petrijevoj zdjelici i pregledaju dobro osvjetljenje na tamnoj pozadini, po potrebi pomoću povećala, pincetom ili pipetom uklonite helminte i sve sumnjive bijele formacije. Sakupljeni materijal se prenosi u drugu šalicu s vodom ili na predmetno staklo u kapi razrijeđenog glicerola ili izotonične otopine natrijevog klorida za daljnje proučavanje.

Kod metode taloženja, cijeli dio izmeta koji se testira treba pomiješati s vodom u staklenom cilindru, a zatim pažljivo ocijediti gornji sloj voda. To se ponavlja nekoliko puta. Kad tekućina postane bistra, ocijedi se, a talog se ispituje u malim obrocima u staklenoj kupki ili Petrijevoj zdjelici, kako je gore navedeno.

Mikroskopske metode su glavni način ispitivanja izmeta za otkrivanje jaja ili ličinki helminta. U nastavku su opisane različite metode istraživanja. Kako bi se povećala pouzdanost pregleda, pretrage se mogu ponavljati više puta dnevno ili u razmaku od 1-3 dana.

Metoda nativnog razmaza. Nativni bris je najčešći i tehnički dostupna metoda fekalne studije. U nativnom razmazu mogu se otkriti jaja i ličinke svih vrsta helminta. Međutim, ako je broj jajašaca u stolici mali, ne mogu se uvijek pronaći. Stoga pregled stolice samo nativnim razmazom nije potpun i treba ga nadopuniti metodama obogaćivanja. Učinkovitost pregleda nativnog razmaza značajno se poboljšava gledanjem četiri stakalca pripremljena iz uzorka stolice na dva stakalca bez pokrovnih stakalca, što omogućuje pregled ukupno približno iste količine stolice kao kod Kato metode (vidi dolje).

Mala količina (veličine glavice šibice) miješanog izmeta tanko se razmaže drvenim štapićem po površini predmetnog stakla u kapi 50% otopine glicerina. Obično se pripremaju dva razmaza na jednom stakalcu. Razmaz se gleda pod mikroskopom s malim povećanjem (sv. 8, cca. 7). U dvojbenim slučajevima pokrije se pokrovnim staklom i pregleda pod velikim povećanjem (povećanje 40).

Za pripremu velikog nativnog razmaza 200-300 mg fecesa (veličine velikog zrna graška) samelje se na staklu dimenzija 6x9 cm u 15-20 kapi 50% vodene otopine glicerola. Pogled pod binokularnim stereoskopskim mikroskopom (obv. 4, približno 12,5 ili ob. 2, približno 17) u propusnom svjetlu bez zaštitnih stakala. U sumnjivim slučajevima, možete prebaciti leću na veće povećanje. U takvim razmazima jasno su vidljiva obojena velika jaja helminta, dok su prozirna jaja patuljaste trakavice nešto lošija. Ova metoda nije prikladna za otkrivanje malih jaja. Istodobno, veliki volumen materijala koji se proučava i veliko vidno polje s visokom dubinom polja osiguravaju značajnu učinkovitost ove modifikacije u usporedbi s konvencionalnim nativnim razmazom.

Debeli razmaz celofanom (Kato metoda) učinkovitiji je od proučavanja nativnog razmaza, ali također zahtijeva kombinaciju s metodama obogaćivanja. Otkrivaju se jaja svih vrsta helminta, no da bi se otkrila jajašca patuljaste trakavice (prozirna jajašca) ili opistorhida (mala jajašca), laboratorijski tehničar mora posebno paziti da ih ne promakne (slika 21).

Metoda se temelji na otkrivanju jaja helminta u debelom razmazu izmeta, očišćenom glicerinom i obojenom malahitno zelenom bojom. Predhidrofilni celofan izreže se na ploče dimenzija 20 x 40 mm i uroni u Kato smjesu (6 ml 3% vodene otopine malahitnog zelenila, 500 ml glicerina, 500 ml 6% otopine fenola). 3-5 ml mješavine dovoljno je za 100 pločica, koje su spremne za upotrebu u jednom danu i mogu se u istoj smjesi čuvati u dobro zatvorenoj posudi na sobnoj temperaturi 6 mjeseci. U nedostatku malahitnog zelenog (preporučuje se za smanjenje umora očiju laboratorijskog pomoćnika) i fenola (dezinfekcijsko sredstvo), možete koristiti samo 50% vodenu otopinu glicerola, učinkovitost studije se ne smanjuje.

Riža. 20. Metoda pripreme gustog razmaza stolice celofanom po Katu

100 mg izmeta nanese se na predmetno staklo, prekrije se celofanskom pločom tretiranom na gore navedeni način i pritisne gumenim čepom kako se izmet ne bi širio ispod celofana. Mikroskopija pri malom ili velikom povećanju mikroskopa provodi se najkasnije 1 sat (po vrućem vremenu - 30-40 minuta) nakon pripreme razmaza. Razlog neprozirnosti lijeka može biti debeli sloj izmeta, loša obrada ploče u smjesi Kato ili nedovoljno razdoblje izlaganja lijeka pod celofanom. Dugotrajno čišćenje glicerinom i prekomjerno sušenje preparata također otežavaju otkrivanje jaja.

Metoda uvijanja prema S.S. Shulman. Metoda je predložena za detekciju ličinki helminta, prvenstveno strongiloida, u izmetu. Pregledava se samo svježe izlučeni izmet, od kojeg se 2-3 g prenese u staklenu posudu, kružnim pokretima promiješa staklenim štapićem s 3-5 puta većom količinom fiziološke otopine, bez dodirivanja stijenki posude. U središtu se nakupljaju jaja i ličinke helminta. Nakon što je miješanje završeno, kap na kraju štapića brzo se prenese na predmetno stakalce, prekrije pokrovnim stakalcem i pregleda pod mikroskopom.

Metode obogaćivanja. Metode obogaćivanja temelje se na razlici u specifičnoj težini jaja i korištenoj slanoj otopini, što omogućuje njihovo otkrivanje u malim količinama. Ako je specifična težina jajašca veća od specifične težine tekućine, tada su jajašca koncentrirana u sedimentu koji se ispituje pod mikroskopom. Ova metoda sedimentacije koristi se za jaja trematoda. S većom specifičnom težinom otopine, jajašca isplivaju na površinu tekućine, a zatim se film pregleda. To su flotacijske (plutajuće) metode, najučinkovitije su za otkrivanje jajašca glista, bičaša i patuljaste trakavice.

Metode flotacije. Fulleborn metoda temelji se na lebdenju jaja helminta u zasićenoj otopini natrijevog klorida, koja ima visoku relativnu gustoću (1,2), što omogućuje otkrivanje jaja u malim količinama. Metoda je učinkovitija od proučavanja nativnog razmaza, iako je kompliciranija. Prednosti metode su niska cijena i pristupačnost. Preporuča se kombinirati proučavanje nativnog razmaza i Fullebornove metode.

Zasićena otopina se priprema otapanjem 400 g natrijevog klorida u 1 litri vode uz kuhanje. Relativna gustoća otopine je 1,18-1,22. Otopina se čuva u zatvorenoj bočici. Za provođenje analize 2-3 g izmeta stavi se u staklenku volumena 30-50 ml i uz miješanje štapićem doda se gotovo do vrha zasićena otopina natrijevog klorida. Traka papira koristi se za brzo uklanjanje velikih plutajućih čestica. Nakon 45-60 minuta. Nakon taloženja pomoću žičane petlje, uklonite površinski film i prenesite ga na stakalce u kapi 50% vodene otopine glicerola. Umjesto uklanjanja filma omčom, možete dodati otopinu u staklenku do vrha, pokriti predmetnim staklom, na čiju se površinu lijepe plutajuća jaja. U pripremi je nekoliko priprema. Dodatno se ispituju 2-4 preparata iz sedimenta, skupljajući ga pipetom za oko na 2 predmetna stakla. Osim površinskog filma, potrebno je ispitati i sediment, budući da jajašca trematoda, taeniida i neoplođena jaja glista ne plutaju u ovoj otopini. Jaja brojnih helminta ne isplivaju odmah na površinu u otopini soli. Dakle, ako se najveći broj jaja patuljaste trakavice pojavljuje nakon 15-20 minuta, tada ascaris - nakon 1,5-2 sata, bičaš - nakon 2-3 sata.

Dakle, prednosti ove metode su niska cijena i dostupnost, nedostaci su potreba da se preparati vide na površinskom filmu i sedimentu, kao i trajanje taloženja.

Metoda E.V. Kalantaryana također je metoda obogaćivanja, ali je učinkovitija i jednostavnija od Fullebornove metode. Koristi se zasićena otopina natrijeva nitrata relativne gustoće 1,38. Stoga jaja većine helminta plutaju i nalaze se u površinskom filmu; ispitivanje sedimenta nije potrebno.

Za pripremu zasićene otopine natrijevog nitrata, 1 kg soli natrijevog nitrata (natrijevog nitrata) otopi se u 1 litri vode i kuha dok se potpuno ne otopi i na površini ne stvori film. Bez filtriranja uliti u suhu bocu. U nedostatku natrijevog nitrata, može se zamijeniti amonijevim nitratom (amonijevim nitratom), otapanjem 1,7 kg na 1 litru vode. Relativna gustoća dobivene otopine je 1,3, što malo smanjuje učinkovitost u usporedbi s otopinom natrijeva nitrata.

Prednosti metode: jaja većine helminta brzo plutaju i nalaze se u površinskom filmu, što eliminira potrebu za ispitivanjem sedimenta. Nedostaci metode su nedostatak natrijevog nitrata, kao i činjenica da jaja trematoda i onkosfere taeniida ne plutaju i ostaju u sedimentu. Mora se uzeti u obzir da kada se izmet drži u otopini dulje vrijeme (više od 1-2 sata), jaja nekih helminta počinju bubriti i taložiti se, nestajući s površinskog filma.

Metode sedimentacije

Metoda P. P. Goryacheva temelji se na principu sedimentacije jaja. U ovom slučaju, razmaz se pokazuje laganim, bez grubih nečistoća, što olakšava otkrivanje malih jajašca trematoda (opistorchid, itd.). Specifična težina jaja opisthorcha je velika, tako da ne plutaju u slanim otopinama.

70-100 ml zasićene otopine natrijevog klorida ulije se u cilindar promjera 2-3 cm. Posebno pažljivo razmutiti 0,5 g fecesa u 20-25 ml vode i pažljivo filtrirati kroz lijevak s dva sloja gaze u cilindar za slanu otopinu, izbjegavajući miješanje (tako da se formiraju dva jasno razgraničena sloja). Nakon 2-3 sata, gornji sloj s izmetom se odsisa pipetom, a preostala fiziološka otopina ostavi stajati 12-20 sati ili centrifugira. Sediment se pipetira na predmetno stakalce, prekrije pokrovnim stakalcem i pregleda pod mikroskopom.

Metoda Goryacheva predložena je za otkrivanje jajašaca opisthorhida i pokazala se učinkovitijom od proučavanja nativnog razmaza i Fullebornove metode. Trenutno se za dijagnozu opisthorchiasis (clonorchiasis) metode Kato i Kalantaryan preporučuju kao prilično učinkovite i tehnički jednostavnije.

Krasilnikovljeva metoda. Pod utjecajem površinski aktivnih tvari uključenih u deterdžente (deterdžent), jaja helminta se oslobađaju iz izmeta i koncentriraju u sedimentu.

Prethodno pripremite 1% otopinu Lotus praška za pranje rublja. Da biste to učinili, 10 g praha se otopi u 1 litri vode iz slavine. Ako Lotus nije dostupan, možete koristiti druge praškovi za pranje, ali svakog od njih trebate uzeti onoliko koliko će se otopiti bez stvaranja taloga u 1 litri vode iz slavine. 20-30 ml otopine deterdženta ulije se u staklenu posudu kapaciteta 30-50 ml, tamo se stavi mali dio izmeta i dobro promiješa. Omjer izmeta i otopine trebao bi biti približno 1:20. Izmet treba biti u otopini najmanje 24 sata. Za to vrijeme na dnu se stvara talog od 2-3 sloja. Donji sloj sastoji se od grubih, teških čestica, jaja helminta se skupljaju u srednjem sloju, a gornji sloj su bjelkastosive pahuljice. Zatim pipetom uzmite 2-3 kapi tekućine iz srednjeg sloja i prenesite je na predmetno staklo. Na jednom stakalcu se pripreme 2 preparata, pokriju pokrovnim stakalcem i pregledaju pod mikroskopom.

Krasilnikovljeva metoda omogućuje otkrivanje jaja svih vrsta helminta izlučenih izmetom.

Metoda eter-formalinske sedimentacije i metoda kemijske sedimentacije sa visoka efikasnost su vrlo radno intenzivne, posebno tijekom masovnih pregleda, stoga je preporučljivije koristiti eter-octenu metodu. Omogućuje, nakon dodatne obrade sedimenta kemijskim reagensima, dobivanje gotovo samo jaja helminta, što olakšava prepoznavanje malih jaja trematoda. Pokazalo se da je ova metoda univerzalna, detektira jaja svih crijevnih helminta, ciste crijevnih protozoa, a može se koristiti i za kvantificiranje intenziteta invazije.

7 ml 10% otopine ulije se u graduirane epruvete centrifuge octena kiselina i dodajte 1 g fecesa do oznake od 8 ml. Izmet se štapićem dobro promiješa dok ne nastane homogena smjesa, a zatim se filtrira kroz dva sloja gaze u drugu epruvetu centrifuge (tako da nova epruveta procijeđene otopine opet sadrži 8 ml; ako je manje, onda možete dodatno isprati lijevak zavojem s 10% otopinom octene kiseline, kroz koji je filtrirao fekalnu otopinu). Dodajte 2 ml etera u tu epruvetu (do oznake od 10 ml), začepite je i snažno protresite 30 sekundi. Smjesa se centrifugira na 3000 okretaja u minuti 1 minutu (ili 2 minute na 1500 okretaja u minuti). Koagulantni sloj (u obliku čepa u gornjem dijelu epruvete) štapićem se odvoji od stijenki epruvete i pažljivo ocijedi zajedno sa supernatantom. Talog (obično malen, bezbojan) se pipetira na stakalce, prekrije pokrovnim stakalcem i pregleda mikroskopski.

Protozoe se dijele u 4 klase:

Kada se encizira, mikroorganizam dobiva okrugli oblik i prekriven je zaštitnom ljuskom. U obliku ciste, protozoa postaje manje osjetljiva na nepovoljne čimbenike okoliša.

Sljedeće može biti predmet istraživanja:

Bilješka:Postoje mnoge vrste dijagnostike, a mi ćemo razmotriti one vrste koje su najčešće u kliničkoj laboratorijskoj praksi.

Privatne vrste dijagnostike

U svakom konkretnom slučaju laboratorijski pomoćnik ima zadatak pronaći određeni patogen, ponekad se uz glavni otkrivaju i drugi.

Postoji 6 vrsta ovog mikroorganizma koji može živjeti u ljudskom crijevu. Klinički je značajna samo dizenterična ameba, koja se javlja u vegetativnom obliku iu obliku cista.

Dodatno se koriste imunološke metode:

• neizravna imunofluorescencija;
• neizravna aglutinacija (INA);
• radijalna imunodifuzija.

Bilješka: serološke metode su neinformativni i koriste se samo kao dodatak glavnim u sumnjivim slučajevima.

Dijagnostika trepljastih (ciliata)

Patogeni oblik mikroorganizama ovog roda je balantidij. To je mikrob koji uzrokuje balantidijazu, bolest praćenu ulceroznim procesom debelog crijeva. Uzročnik se otkriva u nativnom razmazu u obliku vegetativne forme i ciste. Materijal za bris (izmet i sluz) uzima se sigmoidoskopskim pregledom i sije na posebne podloge.

Dijagnostika flagelata (Leishmania, Giardia, Trypanosomes, Trichomonas)

Leishmania, tripanosomi, lamblia i trichomonas opasni su za ljude.

Lišmanija– mikrobi, izazivajući lišmaniozu, ispituju se u razmazima krvi, materijalima koštana srž, strugotine iz kožnih infiltrata. U nekim slučajevima, kada se dijagnosticira leishmania, koristi se kultura na hranjivim medijima.

Tripanosomi– uzročnici bolesti spavanja (američka/afrička tripanosomijaza ili Chagasova bolest).

Afrička varijanta određena je u početnom razdoblju tijekom proučavanja periferne krvi. Kako bolest napreduje, patološki mikrobi nalaze se u materijalu punkcija limfnih čvorova, au uznapredovalim stadijima - u cerebrospinalnoj tekućini.

Za dijagnosticiranje tripanosoma ako se sumnja na Chagasovu bolest, materijal koji se ispituje ispituje se pod mikroskopom pri malom povećanju. U ovom slučaju, mrlje i debela kap su prethodno obojeni.

Trichomonas(crijevne, oralne,) otkrivaju se mikroskopijom materijala uzetih sa zahvaćene sluznice.

Identifikacija sporozoa (malarični plazmodij, uzročnik kokcidoze i dr.)

Najčešća i opasna vrsta za ljude je malarijski plazmodij, koji ima 4 glavne vrste patogena: uzročnik trodnevne malarije, četverodnevne malarije, tropske malarije i malarije ovale.

Spolni razvoj plazmodija (sporogonija) odvija se kod komaraca Anopheles. Aseksualna (tkivna i eritrocitna shizogonija) – u tkivu i eritrocitima ljudske jetre. Ove značajke životni ciklus mora se uzeti u obzir pri postavljanju dijagnoze malaričnog plazmodija.

Tako se u krvi tek oboljelog pacijenta mogu detektirati zametne stanice ciklusa sporogonije. Ali na vrhuncu napada malarije, shizonti se pojavljuju u velikom broju u krvi.

Štoviše, u različitim fazama malarijske groznice pojavljuju se različiti oblici plazmodija:

• tijekom razdoblja hladnoće krv se puni merozoitima, vrstom shizonta;
• pri povišenim temperaturama u eritrocitima se nakupljaju prstenasti trofozoiti;
• smanjenje temperature karakterizira prevlast trofozoita sličnih amebi;
• tijekom razdoblja normalnog stanja, krv sadrži odrasle oblike šizonata.

Proučavanje uzročnika malarije (malarijski plazmodij) provodi se u razmazu i debeloj kapi.

Bilješka:Dijagnoza malarije pregledom razmaza i debelih kapi krvi ponekad je pogrešna. Krvne pločice u nekim slučajevima mogu se pogrešno pripisati uzročniku malarije. Također ponekad fragmenti leukocita i drugih stanica simuliraju plazmodij.

Osnovne metode proučavanja protozoa

Pogledajmo ukratko najčešće metode istraživanja prisutnosti protozoa.

Dijagnostika protozoa pomoću nativnog brisa i brisa obojenog Lugolovom otopinom (u stolici)

Lijek se priprema iz emulzije izmeta u izotoničnoj otopini. Dvije kapi natrijeva klora i Lugolovu otopinu nanesu na predmetno staklo. Ispitni materijal se dodaje u obje kompozicije pomoću drvenog štapića i nakon prekrivanja staklom se promatra u različitim rezolucijama mikroskopa.

Pronađene protozoe bilježe se na temelju određenih karakteristika. Za točnost pripremite 2-3 preparata od istog materijala. U sumnjivim slučajevima, analiza se ponavlja nekoliko puta tijekom 2-3 tjedna.

Metoda može otkriti vegetativne i cistične oblike:

• lamblia;
• balantidij;
• dizenterična ameba.

Uz patogene oblike identificiraju se i nepatogene protozoe. Također u zdravih nositelja postoje luminalni i cistični oblici.

Važno:istraživanje treba provoditi više puta kako bi se izbjegle netočnosti i pogreške.

Nalaz dijagnostike protozoa metodom nativnog i obojenog razmaza treba sadržavati opis oblika uzročnika (luminum, cista, tkivo).

Zahtjevi istraživanja:

• materijal uzet za analizu (tekući izmet) ispituje se najkasnije 30 minuta nakon defekacije;
• formalizirana stolica mora se dijagnosticirati unutar 2 sata nakon defekacije;
• materijal ne smije sadržavati nečistoće (dezinficijensi, voda, urin);
• za rad s materijalom koristite samo drvene štapiće, staklene nisu prikladne zbog klizanja sluzi;
• Štapići se moraju spaliti odmah nakon upotrebe.

Metoda konzerviranja (pregled stolice) za dijagnosticiranje protozoa

Studija se provodi fiksiranjem protozoa s konzervansom. Razlika između ove metode i prethodne je u tome što vam konzervansi omogućuju dugotrajno očuvanje lijeka.

Konzervansi koji se koriste:

• Barrow. Sadrži sastojke konzervansa: 0,7 ml natrijevog klorida, 5 ml formalina, 12,5 ml 96% alkohola, 2 g fenola i 100 ml destilirane vode. Sastav za bojanje: 0,01% otopina tionina (azura).
• Safarlijevo rješenje. Sastojci: 1,65 g cink sulfata, 10 ml formalina, 2,5 g kristalnog fenola, 5 ml octene kiseline, 0,2 g metilen modrila, 100 ml vode. Ovaj konzervans se koristi u slučajevima kada se materijal mora čuvati više od mjesec dana.

Prazne boce se pune konzervansom, u njih se pretače materijal u omjeru 3:1, te se po potrebi dodaje boja. Rezultati se procjenjuju proučavanjem 2-3 lijeka.

Metoda obogaćivanja formalin-eterom (analiza na prisutnost protozoa u fecesu)

Ova dijagnostička metoda omogućuje vam odvajanje i koncentriranje cista protozoa. Za analizu su potrebni sljedeći sastojci: formaldehid (10 ml), 0,85 g izotonične otopine, destilirana voda, sumporni eter, Lugolova otopina.

Smjesa biomaterijala s navedenim tekućinama se miješa i centrifugira. Dobiveni sediment na dnu epruvete boji se Lugolovom otopinom i ispituje se na prisutnost cista i vegetativnih oblika.

Metoda otkrivanja leishmanije (bris koštane srži)

Za dijagnosticiranje lišmanioze koriste se sljedeći reagensi: Nikiforovljeva smjesa (sumporni eter i etanol), fosfatni pufer, Azur-eozin po Romanovskom.

Supstanca koštane srži se nakon posebne pripreme vrlo pažljivo stavlja na predmetno staklo. Koristi se mikroskop s imerzijskim sustavom.

Tijekom akutnog razdoblja bolesti u punktatu se nalazi veliki broj lišmanija.

Bilješka:Ponekad krvne stanice može nalikovati prerađenoj lišmaniji, stoga je vrlo važno da laboratorijski tehničar bude oprezan i ima dovoljno iskustva za samostalno istraživanje.

Metoda otkrivanja lišmanije u razmazu kožnog infiltrata

Potrebni reagensi slični su prethodnim analizama.

Ispitni materijal se uzima iz postojećeg tuberkuloznog ili ulceroznog sadržaja. Ako se sumnja na lišmaniozu, struganje se radi vrlo pažljivo skalpelom, bez krvi. Zatim se preparat priprema na staklu. Kako bi se osigurala točnost dobivenih rezultata, istovremeno se ispituje nekoliko preparata.

U prisutnosti bolesti, lišmanija se otkriva i među makrofagima, fibroblastima i limfoidnim stanicama prisutnim u ispitivanom materijalu.

Metoda izolacije čiste kulture lišmanije dobivene struganjem patoloških tkiva

Ovom metodom dijagnosticiranja protozoa, strugotine tkiva stavljaju se u poseban hranjivi medij, u kojem dolazi do aktivne reprodukcije Leishmanije.

Prije uzimanja struganja, koža se temeljito tretira alkoholom, zatim se napravi rez u tuberkulozu, s čijeg se dna uklanja sadržaj i stavlja u epruvetu s medijem. Materijal se uzima nekoliko puta, nakon čega se stavlja u različite epruvete. Zatim se uzgaja u termostatu na temperaturi od 22-24 stupnja. Rezultati se procjenjuju pod mikroskopom. Ova metoda se koristi kada su druge, jeftinije i brže metode dijagnosticiranja protozoa neučinkovite.

Kako se u praksi dešifriraju testovi na prisutnost protozoa pomoću kapi krvi možete vidjeti gledajući video pregled:

Lotin Alexander, medicinski kolumnist

Metode helmintološka istraživanja dijele se na izravne i neizravne. Izravne metode: otkrivanje samih helminta, njihovih fragmenata, jaja, ličinki u izmetu, urinu, duodenalnom sekretu, sputumu, nosnoj i vaginalnoj sluzi, sadržaju subungualnih prostora, biopsiranim komadićima tkiva. Neizravne metode: identifikacija sekundarne promjene, koji nastaju u ljudskom tijelu kao rezultat vitalne aktivnosti parazita, serološke reakcije, opće istraživanje krv, urin. Najčešće metode za ispitivanje izmeta su helmintoovoskopska i protozooskopska. Prilikom dijagnosticiranja nemoguće je identificirati jaja ili ličinke svih vrsta helminta koji žive u probavni sustav osoba. Stoga, kada se koristi metoda flotacije, jajašca trematoda i, u nekim slučajevima, neoplođena jajašca valjkastih crva ne plutaju u površinskom filmu (zbog njihove visoke specifične težine). Vrlo je rijetko pronaći jaja pinworma i onkosfere taeniida u izmetu, koji se otkrivaju posebnim metodama istraživanja: struganje iz perianalnih nabora za pinworme i taeniide, metode sedimentacije za trematode (jaja opistorhida, itd.). Stoga, za ciljani pregled pacijenta za infekcije helmintima, liječnik u uputnici mora naznačiti na koje se helminte treba usredotočiti (dijagnoza), što će laboratorijskom pomoćniku omogućiti odabir odgovarajuće tehnike za identifikaciju ove vrste helminta. Izmet uzet iz razna mjesta stolicu u količini od najmanje 50 grama (žličica) u čistoj staklenoj posudi potrebno je poslati u laboratorij najkasnije 24 sata nakon defekacije i pregledati na dan primitka. Ako je potrebno sačuvati stolicu do sljedeći dan stavlja se na hladno mjesto (0-4°C) ili puni nekim od konzervansa. Prije pregleda stolica se štapićem promiješa kako bi se jaja helminta ravnomjerno rasporedila u ukupna masa. Ako se u pripravku pronađu jaja bilo kojeg helminta, gledanje se ne zaustavlja, jer može postojati dvostruka ili trostruka invazija. Praćenje učinkovitosti liječenja infekcija helmintima provodi se ispitivanjem izmeta na jaja helminta 2-3 tjedna ili 2-3 mjeseca nakon liječenja, ovisno o otkrivenom helmintu. Makroskopske metode koriste se za otkrivanje cijelih zrelih helminta ili njihovih fragmenata u izmetu golim okom ili korištenjem ručnog povećala. Često se na površini izmeta nakon defekacije mogu vidjeti aktivno gmižući pinwormi; okrugli crvi se izlučuju izmetom; Ponekad ljudi sami primjećuju prolaz helminta. U bolesnika s difilobotrijazom mogu se izlučiti fragmenti strobila trakavice (u obliku "rezanaca"), a kod zaraženih taeniidama (svinjska ili goveđa trakavica) segmenti helminta često odlaze s izmetom (u obliku "bijelih isječaka" ”) ili aktivno puze iz anusa. Makroskopska metoda je glavna za diferencijalnu dijagnozu taeniaze i taeniarinhoze (u kombinaciji s pregledom). Od specijalnih makroskopskih metoda koristi se metoda sekvencijalnog ispiranja fecesa. Izmet se miješa u vodi kako bi se dobila jednolika suspenzija, nakon čega se, pod dobrim osvjetljenjem, pažljivo ispituje u zasebnim malim obrocima u crnim fotografskim kivetama ili na tamnoj pozadini u Petrijevim zdjelicama. Pincetom ili iglom za seciranje uklonite sve sumnjive bijele čestice, velike tvorevine sumnjive na fragmente helminta i pregledajte ih pod povećalom između dva stakalca. Mali helminti ili glave cestoda ispituju se pod povećalom u kapi glicerina ili pod mikroskopom. Pri korištenju ove metode za dijagnosticiranje segmenata svinjske, goveđe i široke trakavice, isprani segmenti se stave između dvije čaše i promatranjem pod povećalom ili malim povećanjem mikroskopa vrsta se određuje prema građi maternica (u zrelom segmentu svinjska trakavica Iz središnjeg debla se proteže 8-12 bočnih ogranaka, a kod goveđe trakavice ima 18-32, češće 28-32; kod široke trakavice segmenti su širi, a maternica u sredini je u obliku “ rozeta"). Ako je maternica teško vidljiva, tada se može prvo zadržati neko vrijeme u 50% otopini glicerina, nakon čega se mogu jasno vidjeti i prazna debla maternice. Pri identifikaciji ovih cestoda prema građi odvojenih glava, pažljivo se stave s vratom u kap glicerina između stakalca (ili prekriju pokrovnim stakalcem) i, bez stiskanja, pregledaju pod mikroskopom pri malom povećanju.

Mikroskopske metode dijele se na jednostavne, složene i specijalne.

U jednostavne spadaju metode nativnog brisa, nativnog brisa s Lugolovom otopinom, metode debelog brisa pod celofanom po Katu, uvrtanja (po Shulmanu) i perianalnog struganja.

Složene metode su učinkovitije i temelje se na koncentraciji jaja u pripravcima. Oni uključuju prethodnu obradu izmeta tekućim reagensima, zbog čega se jaja helminta talože ili plutaju na površini tekućine.

DO složene metode metode obogaćivanja uključuju:

a) flotacija (kada je specifična težina jajašaca manja od specifične težine slane otopine i jajašca plutaju u površinskom filmu);

b) sedimentacija (kada je specifična težina jaja veća od specifične težine slanih otopina i jaja se talože u sediment).

Posebne metode za otkrivanje jaja i ličinki helminta, cista i vegetativnih oblika protozoa su metode struganja, flotacije, sedimentacije, larvoskopije, protozooskopije, ispitivanja žuči te metode bojenja razmaza fecesa, sputuma i dr.

Uzorkovanje i konzerviranje

Za istraživanje, izmet se uzima s različitih mjesta u obrocima od 50 g i šalje u laboratorij u čistoj staklenoj ili plastičnoj posudi s čvrstim poklopcem. Pregledava se svježi izmet (ne stariji od jednog dana), au nekim slučajevima (pri testiranju na strongiloidijazu) odmah nakon defekacije. Predloženi su brojni fekalni konzervansi koji sadrže jaja helminta: 4-10% otopina formalina, koja se mora zagrijati na temperaturu od 50-60 ° kako bi se spriječio razvoj jaja hookworm; mješavina 0,2% vodene otopine natrijevog nitrata (1900 ml), Lugolove otopine (5 g joda, 10 g kalijevog jodida, 250 ml vode), formalina (300 ml) i glicerina (25 ml), u kojoj se čuvaju jaja helminta. 6-8 mjeseci; mješavina glicerina (5 ml), formalina (5 ml) i vode (100 ml); otopine 1-1,5% deterdženata "Lotos", "Extra", "Barf", "Tide" itd. (u težinskom omjeru izmeta i otopine deterdženta 1: 5); mješavina mertiolata 1: 1000 (200 ml), formalina (25 ml), glicerina (5 ml), destilirane vode (250 ml) uz dodatak 0,6 ml Lugolove otopine (brzinom od 1 g izmeta na 10 ml smjese).

Za dijagnosticiranje helmintijaza koriste se makro- i mikrohelmintoskopske metode ispitivanja izmeta.

Makrohelmintoskopske studije

Metoda taloženja

Dnevni dio izmeta dobro se pomiješa s 5-10 puta većom količinom vode, ulije u visoke staklene cilindre (tegle, kante) i ostavi dok se suspendirane čestice potpuno ne slegnu. Gornji mutni sloj pažljivo se ocijedi i do vrha se doda čista voda (ponoviti nekoliko puta dok voda iznad taloga ne postane bistra). Nakon što ocijedite gornji sloj, premjestite sediment u kivetu ili Petrijevu zdjelicu i pogledajte ga (na tamnoj pozadini) pod povećalom ili golim okom.

Metoda probira

Fekalije pomiješane s vodom stavljaju se na gornje sito uređaja koje se sastoji od sustava sita s rupama sve manjeg promjera, uređaj se spaja na vodovodnu mrežu te se otvaranjem slavine za vodu ispire, a teče tekućina se odvodi u kanalizaciju. Veliki helminti ostaju na gornjem situ, dok se manji zadržavaju na donjem. Sita se preokrenu i nakon ispiranja sadržaja u tamne kivete pregledaju golim okom ili pod povećalom.

Mikrohelmintoskopske studije

Provesti u svrhu otkrivanja jaja (helminto-ovoskopske metode - boja. Slika 1) ili ličinki helminta (helminto-ovoskopske metode).

Helmintoovoskopske metode

Kvalitativne metode bez obogaćivanja

Nativni bris. Mala količina fecesa se samelje na predmetnom staklu u kapi 50% otopine glicerina ili prokuhane vode. Pažljivo se uklone velike čestice, smjesa se pokrije pokrovnim stakalcem i pregleda pod mikroskopom (pregledaju se dva razmaza). Pogodnije je i lakše pripremati dugačke razmaze između dva stakalca. Nativni bris se koristi samo kao dodatak metodama obogaćivanja, jer nije dovoljno učinkovit, posebno kod slabih infestacija.

Deblji premaz celofanom po Katu(K. Kato, 1954) vrlo je učinkovita metoda istraživanje. Komadići hidrofilnog celofana (veličine 4x2 cm) namaču se 24 sata u mješavini glicerina (50 ml), 6% otopine fenola (500 ml) i 3% vodene otopine (6 ml) zelenog malahita (potonji nije obavezan). ). U REDU. 100 mg fecesa razmaže se na predmetno stakalce i, pokriveno komadom vlažnog celofana, pritisne gumenim čepom br. 5. Preparat se ispituje nakon 30-60 minuta, kada se malo osuši i postane bistar, kao rezultat čega je jaja helminta lako otkriti pod mikroskopom s malim povećanjem.

Kvalitativne metode s obogaćivanjem (metode plutanja i taloženja)

Prvi se temelje na upotrebi zasićenih otopina raznih kemikalija. tvari u kojima plutaju jaja zbog razlike u specifičnoj težini.

Kofoid-Barberova metoda(Ch.A. Kofoid, M.A. Barber) modificirao Fulleborn (F. Fulleborn, 1920). U REDU. 5 g fecesa u visokoj i uskoj posudi (volumena 100 ml) promiješa se drvenim štapićem u 100 ml zasićene otopine. stolna sol, pobijediti njegova težina je 1,18 (400 g soli otopi se kuhanjem u 1 litri vode). Velike čestice koje isplivaju na površinu brzo se uklanjaju štapićem ili komadom papira. Nakon taloženja smjese 45-90 minuta. Upotrijebite žičanu omču (promjera 0,8-1 cm) kako biste uklonili sav površinski film i prenijeli ga na predmetno staklo. Kod testiranja na jajašca glista smjesa se ostavi stajati 10-15 minuta. Film možete ukloniti izravno predmetnim staklom, poklopiti staklenku tako da dođe u dodir s tekućinom (na rubove staklenke dodaje se zasićena otopina soli). Nakon taloženja, predmetno stakalce se ukloni, brzo okrene, a film s jajima helminta koji su se na njemu zalijepili pregleda se pod mikroskopom (bez pokrovnog stakla). Ova metoda je dobra u identificiranju jaja svih nematoda i patuljastih trakavica. Jaja teških metilja; Većina cestoda i neoplođenih valjkastih crva slabo pluta, pa se ispituje i sediment. Da biste to učinili, nakon uklanjanja filma, tekućina iz staklenke se brzo iscijedi i nekoliko kapi se uzme iz sedimenta omčom ili pipetom, prenese na predmetno staklo, doda se kap glicerola radi bistrenja i pregleda pod mikroskop.

Metoda E. V. Kalantaryan(1938) je učinkovitija modifikacija Fullebornove metode. U njemu se otopina kuhinjske soli zamjenjuje zasićenom otopinom natrijeva nitrata, sp. težina je 1,39 (jedan volumen natrijevog nitrata se otopi u jednakom volumenu vode kada se kuha), film se uklanja nakon 20-30 minuta.

Koriste se i metode Fausta (E. S. Faust, 1939), Brudastova i dr. (1970) i ​​drugi.

Kemikalije se koriste za polaganje jaja helminta. tvari koje otapaju masti i bjelančevine u izmetu.

Telemannova metoda (W. Telemann, 1908.) modificirana od strane Miyagawe (Y. Miyagawa, 1913.). U REDU. 5 g izmeta melje se u mortu ili staklenci, dodajući 5 ml etilnog etera i 50% otopine soli; smjesa se filtrira kroz žičano ili dlakasto sito u epruvetu i centrifugira. U epruveti se formiraju 3 sloja: na vrhu - eter s otopljenom masnoćom, ispod - klorovodična kiselina s otopljenim proteinskim tvarima, u sedimentu - netopljivi dijelovi izmeta i jaja helminta. Gornji slojevi se ocijede, a talogu se doda voda i centrifugira. Nekoliko kapi sedimenta prenese se na predmetno staklo i pregleda pod mikroskopom. Ova metoda može otkriti jaja svih vrsta helminta, ali ponekad su deformirana.

Ritchiejeva metoda (L. S. Kitchie, 1948). Formaldehid i eter koriste se za otapanje masti i proteina.

Za taloženje jaja helminta mogu se koristiti različiti deterdženti. Metoda filtracije u posebnim uređajima Bell postala je raširena u inozemstvu, koja se koristi za proučavanje ne samo izmeta, već i urina, krvi itd.

Postoji niz metoda koje kombiniraju principe flotacije i sedimentacije jaja. Tu spadaju metode S. A. Lanea, D. Rivasa, Gorkine i S. T. Darlinga. Jednu od ovih metoda flotacije-sedimentacije, kao i metodu sekvencijalnih odvoda, predložio je N.V. Demidov (1963, 1965) za istraživanje fascioliaze i dikrocelioze.

Kvantitativne metode

Stollova metoda(N. R. Stoll, 1926.). Decinormalna otopina natrijevog hidroksida ulije se u graduiranu široku epruvetu ili tikvicu (s dvije oznake: 56 i 60 ml) do prve oznake, fekalije se dodaju dok razina tekućine ne dosegne drugu oznaku, dobro se promiješa staklenim štapićem i , stavljajući 10 staklenih kuglica ili malih kamenčića, začepite i protresite 1 minutu. Brzo, da se suspenzija ne slegne, uzmite 0,075 ml smjese (0,005 g fecesa) graduiranom pipetom, prenesite na predmetno stakalce na koje je postavljena rešetka, pokrijte pokrovnim stakalcem i prebrojite jaja helminta. u preparatu pod mikroskopom; Množenjem dobivenog broja s 200 dobiva se broj jajašaca u 1 g izmeta. Za točniji rezultat prebrojite jaja u dvije ili više priprema i uzmite prosjek. Stollova metoda je neosjetljiva na blage invazije. Stoga se preporuča brojanje jaja u pripremljenim pripravcima razne metode flotacija ili sedimentacija, uz stalnu upotrebu jednakog dijela izmeta i jela istog volumena. Koristi se i gusti Kato razmaz.

Dabrova metoda(R. S. Beaver, 1950.). Priprema se standardni razmaz čija se debljina određuje elektrofotometrom, a zatim se broje sva jaja helminta u njemu.

Helmintolarvoskopske metode

Behrmannova metoda(G. Baermann, 1917.). 5-10 g svježe izlučenog izmeta stavi se na metalnu mrežicu u stakleni lijevak, s gumenom cjevčicom sa stezaljkom na užem kraju. Kako bi se izbjegla kontaminacija sedimenta česticama izmeta, preporučuje se staviti papir (na mrežicu) ili dodati životinjski ugljen ili kukuruzno brašno u izmet. Lijevak se puni toplom vodom (t° 45-50°) dok ne dođe u dodir s izmetom. Zbog termotropizma, ličinke se aktivno kreću u Topla voda i postupno se nakupljaju u donjem dijelu lijevka, iznad stezaljke. Nakon 3-4 sata stezaljka se otvori, tekućina se iscijedi u 1-2 epruvete, centrifugira 2-3 minute, gornji sloj se ocijedi, a sediment pregleda na stakalcu pod mikroskopom.

Metoda identifikacije miracidija šistosoma. Izmet se ispire u mraku na temperaturi od 8-10°, talog se drži 45 minuta. na jakom svjetlu na t° 28°, zatim uliti u tamnu tikvicu sa slamkom sa strane. Miracidije su koncentrirane u prozirnoj bočnoj cijevi, odakle se mogu birati.

Za identifikaciju ličinki ankilostoma, također se koriste metode Fulleborna i sur.

Metode proučavanja drugih sekreta, kao i tkiva i organa

U REDU. 100 ml ispitivanog urina ostavi se stajati 30 minuta. u cilindar i, nakon uklanjanja gornjeg sloja, ulijte 10-15 ml sedimenta u epruvetu, centrifugirajte na 1500 okretaja u minuti 1-2 minute; ispituje se sediment. Preporučljivo je prikupiti cijelu dnevnu količinu urina.

Urogenitalna shistosomijaza dijagnosticira se identificiranjem miracidije. Dio svježeg urina se centrifugira 5 minuta, sediment se izlije u crno obojenu tikvicu, na čijem je vrhu zalemljena prozirna staklena cjevčica. Dodajte vodu u omjeru 1:5, 1:10 i stavite u termostat na 25-30° 2 sata. Miracidije koje izlaze iz jaja vidljive su kroz prozirnu cjevčicu golim okom u obliku točkica koje se brzo kreću. U kroničnom obliku shistosomijaze, bolesnici ispuštaju krv pred kraj mokrenja, ali se u mokraći rijetko nalaze jajašca, pa se preporuča pribjeći biopsiji mokraćnog mjehura.

Ispitivanje sputuma. Sputum može sadržavati jaja paragonimusa, shistosoma, tominksa, ličinke migrirajućih nematoda i fragmente ehinokoknog mjehura. Cijeli isporučeni dio sputuma pažljivo se pregleda golim okom ili pod povećalom, odaberu se i pregledaju svi vidljivi komadići tkiva, nakupine boje hrđe itd.; zatim skenirajte cijeli dio mrljama. Gnojni ispljuvak uliti jednaku količinu 0,5% otopine kaustične lužine, centrifugirati i ispitati talog.

Kod nekih helmintijaza opaža se ispljuvak karakteristične promjene. Kod paragonimijaze, na primjer, u ispljuvku se mogu naći nakupine jajašca u obliku žućkastih grudica, kao i velika količina sluzi, leukocita, crvenih krvnih zrnaca, alveolarnih stanica, Kurschmannovih spirala, elastičnih vlakana, Charcot-Leydenovih kristala. . Također su otkriveni karakteristični kristali u obliku dijamanta sa šiljastim krajevima. Dostupnost veliki broj eozinofila omogućuje razlikovanje paragonimiaze od tuberkuloze.

Ispitivanje sadržaja apscesa i punktata. U gnojni iscjedak apscesima, kao iu tumorima i cistama odstranjenim operacijom mogu se naći helminti, njihovi fragmenti, ličinke i jajašca (ehinokok, alveokok, sparganum, cisticerk, dirofilarija, valjkasti crv, toksokara, paragonimus i dr.). Tehnika istraživanja je uobičajena; u nekim slučajevima, histološki rezovi se pripremaju iz tumorskog tkiva. Gnojni sadržaj može se liječiti Telemannovom metodom; bistra tekućina se ispituje na isti način kao duodenalni sadržaj, uz dodavanje sumpornog etera. Ehinokokna tekućina se centrifugira, a sediment se ispituje na prisutnost skoleksa i kukica; Preparati se boje karbolfuksinom po Ziehl-Neelsenu.

Krvni test. U krvi se nalaze mikrofilarije i ličinke migrirajućih nematoda. Iz prsta ili ušne resice uzima se kap krvi i pregledava se svježa ili se od nje pripremaju pripravci.

Kap krvi stavi se na predmetno stakalce s kvadratićem vazelina i lagano pritisne pokrovnim stakalcem. Pod mikroskopom su vidljive mikrofilarije koje se kreću između krvnih stanica. Krv se može staviti između dva sloja ljepljive celulozne trake; mikrofilarije ostaju pokretne 6 sati; u potpuno osušenom preparatu mogu se razlikovati pod mikroskopom unutar 30 dana. Vrste mikrofilarija mogu se identificirati samo u obojenim razmazima ili debelim kapljicama. Pripremljeni preparati se suše, hemoliziraju i boje po Romanovsky - Giemsi, Wrightu, Ziehl-Neelsenu, Leishmanu, Papanicolaouu (vidi Wrightova metoda bojenja, Romanovsky-Giemsa metoda, Ziehl-Neelsenova metoda). Nakon otkrivanja mikrofilarija u kapi krvi obojenoj prema Romanovsky-Giemsi, preparat se dodatno boji Hansenovim hematoksilinom; za 15-60 minuta. operite 2 minute. u tekućoj vodi. Ponovno obojeni pripravak diferencira se u 0,2% otopini soli; Ovojnica mikrofilarije obojena je blijedoljubičastom bojom, a jezgra tijela tamnoljubičastom bojom.

Za blage infestacije potrebno je pregledati 2-10 uzoraka krvi s antikoagulansom (npr. 5% otopinom). natrijev citrat) pomoću jedne od sljedećih metoda.

Knott-ova metoda (J. Knott, 1939.), modificirana od strane Markella i Vogea (E.K. Markell, M. Voge, 1965.). 2 ml krvi pomiješa se u epruveti za centrifugu s 10 dijelova 1% octene kiseline, centrifugira se 2 minute. pri 1500 o/min; površinski sloj ocijedi, sediment se raspodijeli na nekoliko stakalca i pregleda pod mikroskopom. Preparati se mogu obojiti Romanovsky-Giemsa ili drugim metodama.

Bell metoda filtriranja (D. R. Bell, 1967). U aparaturi koja se sastoji od lijevka od nehrđajućeg čelika s pravokutnom rupom i membranskih filtara istog oblika, dimenzija 19 x 42 mm, veličine pora od 0,8 do 5 μm, krv je hemolizirana u mješavini od 1 ml deterdženta tipol i 9 ml otopine fiziol (za ubrzavanje filtracije uređaj se spaja na vakuum pumpu). Filter se fiksira u kipućoj destiliranoj vodi i boji Romanovsky-Giemsa ili Ehrlichovim vrućim hematoksilinom. Obojeni filtar se suši u eksikatoru ili u izopropilnom alkoholu (uzastopno u 3 šalice), čisti se na staklu s uljem za uranjanje i ispituje pod pokrovnim stakalcem. Obojeni pripravci traju nekoliko tjedana. Bellova metoda je najučinkovitija za kvantitativno bilježenje mikrofilarija u krvi.

Također se koristi Goldsmid polividonska metoda.

Pregled kože. U koži se nalaze mikrofilarije onhocercia i ličinke životinjskih helminta koji uzrokuju kožni oblik larva migrans(cm.). Dijelovi kože ili materijal dobiven skarifikacijom uzimaju se s bedra, potkoljenice, stražnjice ili deltoidnog mišića. Komadić pokožice u obliku stošca podigne se entomološkom iglom i odsječe britvicom, pregleda na staklu u kapi fiziolne otopine. Na negativan rezultat svježi preparat ponovno se ispituje nakon 10 minuta; Larve su obično lokalizirane na rubovima preparata. Dobiveni materijal može se držati u 2 ml fiziol otopine 1-2 sata. i ispitati sediment. Preporuča se uzeti 5 presjeka kože od pacijenta.

Pripravci se također mogu pripremiti iz krvi i tkivne tekućine koja se oslobađa nakon snažnog pritiskanja rezova. Kapi se boje prema Mayeru, Romanovsky-Giemsi ili Delafieldovom hematoksilinu.

Standardna metoda za kvantificiranje infestacija. Biopsirana površina kože diam. 3-5 mm i težine najmanje 1-4 mg, izvažite, izrežite na male komadiće i prebrojite ličinke pod mikroskopom u fiziol. otopina na predmetnom staklu; 1-4 ličinke u vidnom polju označene su znakom +, 5-9 ličinki znakom ++, 10-19 znakom +++, 20 ili više ličinki znakom + + + +. Pogodnije je provoditi kvantitativne izračune na obojenim pripravcima.

Testiranje na trihinelozu, cisticerkozu i šistosomijazu

Detekcija ličinki trihinele

Metoda kompresije. Komad dvoglavog odn mišići lista(u blizini tetive), uzeta kirurški aseptično, iglama za seciranje razdvoji se u zasebna tanka vlakna, stisne se između dva stakalca u kapi glicerina tako da preparat bude tanak i proziran. Pod mikroskopom s tamnim vidnim poljem jasno su vidljive ličinke trihinele. Učinkovito je proučavati nekoliko dijelova mišića u kompresorijima koji se koriste u veterinarskoj medicini. praksi, posebno u specijalnim trihineloskopima.

Bechmanova metoda probave(G. W. Bachman, 1928.). 1 i zdrobljenih mišića prelije se sa 60 ml umjetnog želučanog soka (0,5 g pepsina; 0,7 ml koncentrirane klorovodične kiseline; 100 ml vode) i ostavi 18 sati. u termostatu na t° 37°; gornji sloj tekućine se ocijedi, talogu se doda topla voda (t° 37-45°) i ulije u Behrmannov aparat. Nakon sat vremena tekućina se ispusti u epruvetu, centrifugira i ispita sediment. Ako su ličinke zatvorene u ovapnjele kapsule, najprije se dekalcificiraju u otopini klorovodične, dušične ili sumporne kiseline.

Biotest. Komadići mišića koji se proučavaju daju se bijelim miševima ili štakorima. Nakon 2-3 dana u duodenalnom sadržaju mogu se naći spolno zrele trihinele, a nakon 2-3 tjedna ličinke u mišićima dijafragme i jezika.

Histološki presjeci. Dijelovi mišića fiksiraju se u Bouinovoj, Zenkerovoj ili drugoj tekućini; na uobičajeni način Presjeci se pripremaju na mikrotomu i boje Delafieldovim hematoksilinom.

Otkrivanje cisticerka

Komadić ekstirpiranog mišića, vezivnog tkiva i dr. pregleda se golim okom, pažljivo se izdvoji cisticerk - bjelkasta prozirna vezikula veličine 1-2 cm, zdrobi se između dva stakalca u kapi glicerina i pregleda pod mikroskopom. . Za određivanje održivosti cisticerka izoliranih iz tkiva, oni se drže u 50% otopini žuči za fiziol. otopina u termostatu na t° 37°; za 10-60 minuta. glava vitalnog cisticerkusa okrenuta je prema van. Kalcificirani cisticeri prethodno se dekalcificiraju 4% otopinom dušične kiseline tijekom jednog sata.

Detekcija jajašaca šistosoma

Kod kroničnih oblika shistosomijaze, kada stvaranje granuloma onemogućuje izlazak jajašca iz tkiva u lumen crijeva ili u mokraćne kanale, koristi se biopsija rektalne sluznice koja se izvodi posebnom žličicom uz pomoć rektoskopa, odabir područja s vidljivom lezijom. Biopsirani komadić se zgnječi između dva stakalca i pregleda pod mikroskopom. Ako je rezultat negativan, komadići se bistre u 4% otopini kaustične lužine i iz njih se priprema histol. kriške. Oralno se izvodi biopsija sluznice jejunuma, a dobiveni materijal se ispituje kompresijskom metodom ili se iz njega izrađuju histolni isječci. U nekim slučajevima genitourinarne shistosomijaze dijagnoza se može postaviti samo na temelju endovezikalne biopsije. U hepatolienalnom obliku shistosomijaze radi se punkcijska biopsija jetre; Iz dobivenog materijala pripremaju se histol i rezovi koji se ispituju pod fluorescentnim mikroskopom. Fluorescentni mikroskop s tamnim poljem također se koristi za ispitivanje jetrenog tkiva na jajašca šistosoma. Ako je ženski spolni trakt zahvaćen šistosomima, iscjedak se skuplja vaginalnim spekulumom ili se oštrom žlicom uzimaju komadići sluznice vrata maternice; dobiveni materijal se pregleda pod mikroskopom na staklu u kapi otopine fiziol.

Testiranje na enterobiazu i taeniazu

Perianalno struganje (preporuča se uzimanje navečer, 1 - 1,5 sat nakon što bolesnik ode u krevet ili ujutro prije toalete). Šibicom, koso zarezanom i navlaženom u kapljici tekućine (fiziol, otopina, prokuhana voda ili 2% otopina sode bikarbone), nanesenom na predmetno staklo, pažljivo to radim? struganje sa sluznice anusa i nabora oko njega (od sredine prema van). Sluz sakupljena na kraju šibice sastruže se rubom pokrovnog stakla u kap tekućine na predmetnom staklu i prekrivena istim pokrovnim staklom se pregleda. Prilikom masovnih pregleda, kada se strugotine uzimaju u dječjim ili drugim ustanovama, upotrijebljena šibica stavlja se u kap tekućine na stakalcu, a nakon što se kapljica osuši, prekrije se drugim stakalcem i zamotana u laboratorij dostavlja u laboratorij. papira i učvrstite elastičnom trakom. Za proučavanje rektalne sluzi koriste poseban uređaj - Shakhmatovu ili Ziemannovu cijev, kojom uzimaju sluz iz rektuma i pregledavaju razmaze pod mikroskopom.

Metoda pamučnog štapića. Pacijenti dobivaju epruvetu s vatom na staklenom ili drvenom štapiću za ponijeti kući; ujutro bolesnik briše perianalne nabore tupferom navlaženim kuhana voda, te ga stavi u epruvetu s malom količinom vode. U laboratoriju se brisevi ispiru u istoj epruveti novim dijelom vode, a nakon centrifugiranja ispituje sediment.

Hallova celofanska metoda (M. S. Hall, 1937.). Četvrtasti komad celofana pričvršćen je elastičnom trakom na staklenu šipku. Struganje se napravi suhim celofanom i stavi u epruvetu. U laboratoriju se celofan malo pomakne sa štapića i nakon što mu se škarama odreže vrh, izravna se na predmetnom staklu; navlažiti decinormalnom otopinom natrijevog hidroksida, prekriti pokrovnim stakalcem i pregledati pod mikroskopom.

Metoda Grahamove celulozne trake (S. F. Graham, 1941.). Traka celulozne trake prisloni se ljepljivom stranom na perianalne nabore ispitanika, zatim istom stranom na predmetno staklo i pregledava se bez pokrovnog stakla; Možete dodati kap toluena. V. V. Kaledin (1972) za ove je svrhe predložio korištenje celuloidnih diskova izrezanih iz ispranog rendgenskog filma i navlaženih glicerinom; diskovi se ispituju na predmetnom staklu u kapi silikatnog ljepila. Metoda celulozne trake također se može koristiti za ispitivanje dječjeg donjeg rublja.

Subungualno struganje. Rubovi nokta, ležište nokta i subungualni prostori se navlaže 0,5-1% otopinom kaustične lužine i brišu vlažnim pamučnim štapićima. Brisevi se stave u epruvete za centrifugiranje s istom otopinom, centrifugiraju i ispita sediment.

Metode proučavanja objekata okoliš za jaja i ličinke helminta (sanitarne i helmintološke studije)

Istraživanja se provode kako bi se utvrdio stupanj kontaminacije predmeta s jajima i ličinkama helminta. vanjsko okruženje. Dobiveni podaci koriste se za ocjenu dostojanstva. stanje institucija i poduzeća i učinkovitost mjera poduzetih za borbu protiv helmintijaze.

Pri proučavanju stupnja kontaminacije različitih okolišnih objekata jajima i ličinkama helminta i procjeni njihove uloge u epidemiologiji helmintoza, važno je utvrditi ne samo broj pronađenih jaja, već i njihovu vitalnost i invazivnost, koja se utvrđuje. : a) po izgledu, pod mikroskopom; b) bojenje raznim bojama, uključujući luminiscentne; u pravilu se živa jaja i ličinke ne farbaju; c) uzgoj u optimalnim uvjetima do invazivnog stadija; d) infekcija laboratorijskih životinja (biološki test).

Studije vodovoda i kanalizacije. Za jednu studiju koristite 10-25 litara vode (rijeke, mora, ribnjaci, bazeni, vodovod) i 1-2-5 litara kanalizacije.

Metoda 3. G. Vasilkova (1941). Voda ili otpadna voda filtrira se kroz membranske ultrafiltere u Goldmannovom aparatu koji se sastoji od staklenog ili metalnog lijevka s filtrima spojenim preko prstenaste mlaznice na Bunsenovu tikvicu. Kako bi se ubrzao proces filtracije, na uređaj je spojena vakuum pumpa. Nakon filtracije, membranski filtri se ispituju pod mikroskopom, bistre s 50% otopinom glicerola; nakupljeni sediment se čisti i zasebno ispituje u obliku razmaza. Također se koriste filtarski uređaji drugih izvedbi.

Metoda G. Sh. Gudzhabidze i G. A. Yudina (1963.) za proučavanje kanalizacijske tekućine. 1 litra tekućine ostavi se 2 sata u Lisenkovom cilindru; dobiveni sediment (5-9 ml) obrađuje se kao u ispitivanju tla (vidi dolje).

Metoda N. A. Romanenko (1967). Na 1 litru otpadne tekućine stavljene u stakleni cilindar zapremine 1200-1500 ml dodajte 0,4-0,6 g aluminijevog sulfata ili željeznog klorida (u svrhu koagulacije, ubrzavanja procesa taloženja suspendiranih čestica) i nakon 40 minuta. smjesa se centrifugira 3 minute. pri 1000 o/min; gornji sloj se ocijedi, a za otapanje pahuljica dodajte 1-2 ml 3% -tne otopine klorovodične kiseline, zatim 150 ml zasićene otopine natrijevog nitrata. Sediment se ispituje kao i tlo.

Istraživanje tla

Kontaminacija tla jajima helminta utvrđuje se kako bi se identificirala žarišta helmintijaze i procijenila učinkovitost rada na njihovom poboljšanju.

Metoda 3. G. Vasilkova i V. A. Gefter (1948). 12,5 g tla pomiješa se u epruvetama (volumena 100 ml) od nehrđajućeg čelika ili mesinga s 20 ml 5% otopine kaustične lužine, dodajući 10 staklenih kuglica ili malih kamenčića. Epruvete se zatvore gumenim čepovima i mućkaju 20 minuta. u aparatu za mućkanje ili ručno. Nakon uklanjanja čepova, epruvete se centrifugiraju 3-5 minuta, površinska tekućina se iscijedi, u sediment se doda 60-80 ml zasićene otopine natrijevog nitrata i nakon temeljitog miješanja ponovno centrifugira 3-5 minuta. Ovaj površinski film s plutajućim jajima uklanja se dodirivanjem površine smjese složenom petljom (5-6 petlji povezanih na zajedničkoj šipki) i prenosi u čašu vode; pomiješati s istom otopinom, centrifugirati; Cijeli postupak se ponavlja najmanje 3 puta. Sadržaj čašice u koju se prenese film razrijedi se vodom i filtrira kroz membranske filtere koji se mikroskopom pregledaju u kapi glicerina.

Metoda 3. G. Vasilkova i V. A. Gefter, kako ju je modificirao A. A. Namitokov (1961.), razlikuje se od glavne metode po tome što se umjesto ispitivanja filmskih preparata koristi polovica sadržaja epruvete (svaki put se dodaje novi dio zasićena otopina natrijeva nitrata), filtrirati i pregledati filtre.

N. A. Romanenko (1968.) preporučuje ispitivanje uzoraka tla i kanalizacijskog mulja na jaja helminta pomoću aparata koji je predložio G. Sh. Gudzhabidze. 50 g tla temeljito se miješa 1 minutu. u 150 ml vode u centrifugalnim epruvetama (kapaciteta 250 ml) s posebnim lopaticama koje pokreće elektromotor. Smjesa se centrifugira 3 minute. pri 1000 okretaja u minuti, ispustite vodu i dodajte 150 ml zasićene otopine natrijeva nitrata, promiješajte i ponovno centrifugirajte 3 minute. Epruvete s uzorcima stave se u stalak, doda se otopina natrijevog nitrata dok se ne formira konveksni meniskus, pokriju predmetnim stakalcem (10 x 6 cm) i ostave 10-15 minuta, zatim se stakla skinu i pregledaju; postupak se ponavlja najmanje 4 puta.

Istraživanje ličinki helminta metodom Behrmanna (1917). 200-400 g zemlje stavi se u komad gaze na metalnu mrežicu (s rupama promjera 1-2 mm) postavljenu na široki dio staklenog lijevka postavljenog na tronožac. Na uski kraj lijevka zategnuta je gumena cijev sa stezaljkom. Lijevak se napuni toplom (t° 50°) vodom tako da donji dio mrežice sa zemljom dođe u dodir s vodom. Zbog termotropizma, ličinke aktivno puze u toplu vodu i, taložeći se, nakupljaju se u donjem dijelu gumene cijevi iznad stezaljke. Nakon 3-4 sata 50 ml sadržaja ispusti se iz lijevka u epruvetu, centrifugira i pregleda sediment.

Istraživanje povrća, voća i bobičastog voća

Proučavaju uglavnom povrće, bobice i voće bez kojih se jedu toplinska obrada. Metoda 3. G. Vasilkova (1948). 5-10 komada povrća ili voća (cca. 0,5 kg) ili 100-200 g zelja (zelena salata, mladi luk) nekoliko sati prelijemo s vodom u staklenim teglicama širokog grla s brušenim čepovima i protresemo 10-20 minuta. . u aparatu za mućkanje ili ručno. Voda se ispušta, predmeti koji se proučavaju se ispiru čista voda a sva voda za ispiranje se filtrira u Goldmannovom aparatu; Filteri se ispituju čišćenjem glicerinom. Filtre možete nijansirati s 25% Lugolovom otopinom u glicerinu; u ovom slučaju, jaja helminta su obojena smeđa boja a lako ih je prepoznati među škrobnim zrncima, obojenim u Plava boja. Veliki sediment tretira se kao zemlja.

Proučavanje ispiranja s kućanskih predmeta i ruku. Kistom za ljepilo (ili štapićem od vate omotanim komadićem najlonske tkanine) namočenim u 2% otopinu sode bikarbone više puta se prijeđe preko predmeta ili ruku koje se ispituju, a zatim ispere istom otopinom ulivenom u epruvetu. U laboratoriju se kistovi i štapići ispiru čistom vodom; Sva voda za pranje se centrifugira i ispituje se sediment.

Metoda V. A. Gefter (1960). Učinkovitije je sakupljati prašinu s meke opreme pomoću usisavača spojenog na lijevak; rubovi se sastoje od 2 odvojiva dijela: membranski filtar postavljen je na površinu donjeg dijela, prekriven metalnom ili plastičnom mrežom i ojačan stavljajući ga gornji dio lijevci. Sastavljeni lijevak spojen je gumenom cijevi na crijevo usisavača. Prašina se skuplja s predmeta 3 minute, nakon čega se filter uklanja i zamjenjuje novim. U laboratoriju se filtri pregledavaju pod mikroskopom, pročišćavaju glicerinom. Ako je sloj prašine na filtru velik, ostruže se i pregledava u obliku mrlja ili tretira kao zemlja.

Imunološke dijagnostičke metode

Mogućnost korištenja imunol. metode za dijagnosticiranje helmintijaze je zbog sposobnosti helminta da proizvode aktivne antigene koji utječu na imunokompetentne stanice domaćina i stimuliraju proizvodnju antitijela. Najučinkovitije imunodijagnostičke metode su kod crijevnih helmintijaza, kada izlučevine i ekskreti helminta, koji imaju antigensku aktivnost, ulaze izravno u krv domaćina. Imunološke reakcije koriste se za dijagnostiku askaridoza, trihineloze, filarijaze, shistosomijaze, ehinokokoze i alveokokoze, cisticerkoze, paragonimiaze, kompleksa simptoma larva migrans (toksokarijaza, angiostrongiloza) itd. Koriste se različiti serolni testovi (reakcije precipitacije, reakcije aglutinacije, fiksacija komplementa). cija , fluorescentna antitijela ) i intradermalni alergijski testovi. Antigeni se pripremaju iz ličinki i zrelih helminta korištenjem solnih ekstrakata homogenata svježe smrznutih ili liofiliziranih tkiva, kao i raznih biološki aktivnih tekućina (tekućina iz ehinokoknih mjehurića, trbušne tekućine valjkastih crva itd.). Budući da helminti imaju vrlo složenu antigenu strukturu i da njihov antigenski mozaik sadrži komponente i pojedinačne determinante koje unakrsno reagiraju s drugim vrstama helminta, bakterija i antigena domaćina, razvijaju se metode za njihovo pročišćavanje od nespecifičnih komponenti. Provodi se frakcioniranje različite metode: gel filtracija u kolonama sa Sephadexom, kromatografija ionske izmjene na DEAE-Sephadexu, obrada kiselinama itd. Frakcijski antigeni obično imaju veću specifičnost od cijelih ekstrakata, ali im je aktivnost približno ista. Imunodijagnostičke metode pronalaze sve veća primjena. Reakcije se koriste ne samo za najpotpuniju i ranu identifikaciju pacijenata, već i za proučavanje žarišta i proučavanje epidemiologije helmintijaza.

Serološke reakcije. Reakcija mikroprecipitacije na živim ličinkama koristi se za dijagnosticiranje nematoda - preimaginalne faze ascariasis, ankilostomidoze i trihineloze. Reakcija postaje pozitivna 5-10 dana nakon infekcije (askaridoza, ankilostomidoza) i traje 90-100 dana. Antigen su žive ličinke nematoda izolirane iz tkiva eksperimentalno zaraženih laboratorijskih životinja. Izolirane ličinke se temeljito isperu od bjelančevina domaćina sterilnim fiziolom, otopinom i destiliranom vodom i to po 10-15 primjeraka. stavi se pomoću Pasteurove pipete na sterilno predmetno staklo s jažicom. Nanesite 2-3 kapi ispitivanog seruma, pokrijte sterilnim pokrovnim staklom, stavite u vlažnu komoru (Petrijevu zdjelicu obloženu navlaženim filter papirom) i ostavite 24-48 sati. u termostatu na t° 37°. Ako je reakcija pozitivna, pod malim povećanjem mikroskopa, vidljivo oko usta i analne rupe ličinke su sivkastobijele, blago opalescentne mase kuglastih ili cik-cak oblika precipitata. Učinkovitost reakcije doseže 85-95%.

Reakciju prstenaste precipitacije razvio je V.P. Pashuk (1957.) za dijagnozu trihineloze. Reakcija postaje pozitivna 2-3 tjedna bolesti. Njegova učinkovitost doseže 80-90%. Antigen je praškasti ekstrakt ličinki osušenih na 35°, izoliranih iz mišića zaraženih životinja. U epruvetama prom. 0,5 cm, ulijte 0,1 ml svakog razrjeđenja antigena i na njega pažljivo naslagajte (ili spustite na dno) jednaku količinu ispitnog seruma kako se tekućine ne bi pomiješale. Epruvete se drže 30 minuta. u termostatu na t° 37°, a zatim 30-60 minuta. na sobnoj temperaturi. Uz pozitivnu reakciju, na granici između antigena i seruma pojavljuje se bjelkasti nježni prsten koji se mućkanjem lako raspada.

Reakcija taloženja u gelu prema Ouchterlonyju (O. Ouchterlony, 1949) u mikromodifikaciji A. I. Guseva i V. S. Tsvetkova predložili su I. A. Ginovker, E. A. Zabozlaeva, A. V. Doronin (1970) za dijagnozu ranih faza opisthorchiasis. Prema preliminarnim podacima, njegova učinkovitost je 87%. Antigen je ekstrakt homogenata svježe smrznutog spolno zrelog opisthorchisa izoliranog iz jetre mačaka.

Razvijena je reakcija neizravne hemaglutinacije (vidi) s dijagnostikumom - suspenzijom formaliziranih i taniziranih ovčjih eritrocita, senzibiliziranih ehinokoknom tekućinom.

L. N. Stepankovskaya (1972) za dijagnozu ehinokokoze i alveokokoze.

RNGA s dijagnostikumom iz formaliziranih ovčjih eritrocita, senzibiliziranih ekstraktom homogenata svježe smrznutih cisticerka svinjske trakavice, predložio je L. M. Konovalova (1973) za dijagnozu cerebralne cisticerkoze; učinkovit je u 85% slučajeva.

RNGA s ascaris diagnosticumom predlaže se za dijagnosticiranje preimaginalne faze ascariasis.

Reakcija fiksacije komplementa (vidi) provodi se prema uobičajenoj metodi i koristi se za dijagnozu trihineloze i cisticerkoze.

Metoda luminiscentnih antitijela (indirektna metoda). Ovu metodu, s odmašćenim suhim homogenatom cisticerka svinjske trakavice kao antigenom fiksiranim na stakalcu, razvio je JI. M. Konovalova (1973) za dijagnozu ljudske cisticerkoze. Ista reakcija s histolom, rezovima ličinki trihinele kao antigenom razvijena je za dijagnozu trihineloze.

E. S. Leikina, V. A. Gefter.

Kada se otkriju jajašca helminta na različitim objektima okoliša (tlo, voda, povrće itd.), uvijek je potrebno utvrditi njihovu održivost izgledom, bojanjem vitalnim bojama, uzgojem u optimalnim uvjetima i provođenjem biološkog testa, tj.

Hranjenje laboratorijskih životinja.

Određivanje održivosti jaja ili ličinki helminta po izgledu. Jaja helminta se mikroskopiraju prvo pri malom, a zatim pri velikom povećanju. U deformiranim i mrtvim jajima helminta, ljuska je poderana ili savijena prema unutra, plazma je mutna i olabavljena. U segmentiranim jajima, kuglice za drobljenje (blastomere) su nejednake veličine, nepravilnog oblika i često pomaknute na jedan pol. Ponekad postoje abnormalna jaja koja se, unatoč vanjskim deformacijama, normalno razvijaju. Kod živih ličinki valjkastih crva fina zrnatost prisutna je samo u središnjem dijelu tijela, dok umiru zrnatost se širi po cijelom tijelu, a pojavljuju se velike sjajne hijaline vakuole - takozvane niske bisera.

Da bi se utvrdila održivost zrelih jajašaca okruglih crva, bičaša, pinworma, aktivni pokreti ličinki trebaju biti uzrokovani blagim zagrijavanjem lijeka (na temperaturu ne veću od 37 ° C). Pogodnije je promatrati vitalnost ličinki valjkastih glista i bičaša nakon što su izolirane iz ljuske jajeta pritiskom na pokrovno staklo preparata iglom za seciranje ili pincetom.

Kod ličinki invazivnih valjkastih glista često se vidi ljuštenje ovojnice na kraju glave, a kod ličinki bičaša koje su završile razvoj u jajetu, stilet se nalazi na tom mjestu pri velikom povećanju. U mrtvim ličinkama helminta, bez obzira na njihovu lokaciju (u jajetu ili izvan njega), primjećuje se propadanje tijela. pri čemu unutarnja struktura Larva postaje grudasta ili zrnasta, a tijelo mutno i neprozirno. Vakuole se nalaze u tijelu, a prijelomi se nalaze na kutikuli.

Preživljavanje taeniidnih onkosfera (goveđa, svinjska trakavica, itd.) određena je kretanjem embrija kada su im izloženi probavni enzimi. Jaja se stavljaju na satno staklo sa želučanim sokom psa ili umjetnim duodenalnim sokom. Sastav potonjeg: pankreatin 0,5 g, natrijev bikarbonat 0,09 g, destilirana voda 5 ml. Satna stakla s jajima stavljaju se u termostat na 36-38 "C 4 sata. U isto vrijeme, živi embriji se oslobađaju svojih ljuski. Ljuske živih onkosfera također se otapaju u zakiseljenom pepsinu i u alkalna otopina tripsina nakon 6-8 sati u termostatu na 38 °C.

Ako jaja taeniida stavite u 1% otopinu natrijevog sulfida, ili 20% otopinu natrijevog hipoklorida, ili u 1% otopinu klorirane vode na 36-38 °C, zreli i živi embriji se oslobađaju membrana i rade ne mijenja se unutar 1 dana. Nezrele i mrtve onkosfere se smanjuju ili bubre i naglo se povećavaju, a zatim se "otapaju" unutar 10 minuta - 2 sata. Živi embriji taeniida također se aktivno kreću u mješavini 1% otopine natrijevog klorida, 0,5% otopine natrijevog bikarbonata i žuči na 36-38. °C.

Preživljavanje skoleksa ehinokoka određuje se niskim zagrijavanjem. Da bi se to učinilo, skoleks ili rasplodne čahure oprane u vodi stave se u kap vode na predmetno staklo s rupom, pokriju pokrovnim stakalcem i pregledaju pod mikroskopom uz zagrijavanje na temperaturi od 38-39 °C. Ako nema grijaćeg stola, lijek se zagrijava pomoću bilo kojeg izvora topline. U isto vrijeme, održivi skoleks se aktivno kreće, skupljajući ili opuštajući sisaljke, produžujući i skraćujući proboscis. Ako postavite skoleks na 0,5-1% vodena otopina filicilena na sobnoj temperaturi, tada će svi živi skoleksi brzo ispasti i umrijeti. Skoleksi koji nisu održivi nisu evertirani.

Preživljavanje Adolescaria fascioli sakupljenih na biljkama i drugim objektima vodenih tijela provjerava se ispitivanjem na predmetnom stakalcu u fiziološkoj otopini pod mikroskopom s postoljem za zagrijavanje. Kada se ličinke trematoda zagriju, počinju se kretati.

Održivost jaja patuljaste trakavice određena je položajem kukica na embriju.

U živim jajima patuljaste trakavice javljaju se spori klatni pokreti protoplazme i gotovo neprimjetno razmicanje i pomicanje šiljastih krajeva bočnog para kukica u stranu od srednjeg para.

Kontrakcije protoplazme embrija i embrionalne kuke pomažu embriju da se prvo oslobodi membrane onkosfere, a zatim i vanjske ljuske jajeta.

U živom jajetu, srednji par i bočni parovi kukica nalaze se paralelno; u nekim su jajima oštrice bočnih parova blizu jedna uz drugu i smještene pod kutom manjim od 45° u odnosu na srednji par kukica.

Umirući embrij grčevito se skuplja i tromo odvaja kukice. U mrtvom embriju, kretanje kukica se zaustavlja i one su smještene u neredu; ponekad su kukice bočno od susjednog para razmaknute pod pravim, tupim ili oštrim kutom.

Ponekad se opaža naboranje embrija i stvaranje granulacija. Točnija metoda temelji se na pojavi kretanja onkosfere tijekom oštre promjene temperature: od 5-10 do 38-40 ° C.

Određivanje održivosti nezrelih nematoda treba proučavati u vlažnoj komori (Petrijeve zdjelice), stavljajući jajašca glista u 3% otopinu formaldehida pripremljenu u izotoničnoj otopini natrijevog klorida na temperaturi od 24-30 °C, jajašca glista u 3 % riješenje klorovodične kiseline na temperaturi od 30-35 °C, jaja pinworma u izotoničnoj otopini natrijevog klorida na temperaturi od 37 °C. Petrijeve zdjelice treba otvarati 1-3 puta tjedno radi boljeg prozračivanja, a filtar papir treba ponovno navlažiti čistom vodom.

Promatranja razvoja jaja helminta provode se najmanje 2 puta tjedno. Odsutnost znakova razvoja unutar 2-3 mjeseca ukazuje na njihovu nesposobnost za život. Znakovi razvoja jaja helminta su prve faze drobljenja, dijeljenje sadržaja jaja u zasebne blastomere. Tijekom prvog dana razvije se do 16 blastomera koji prelaze u drugi stadij - morula itd.

Jaja ankilostoma se uzgajaju u staklenom cilindru (50 cm visine i 7 cm u promjeru) zatvorenom čepom. Mješavina jednakih volumena sterilnog pijeska, drveni ugljen a izmet s jajima glista, razrijeđen vodom do polutekuće konzistencije, pažljivo se izlije na dno cilindra pomoću staklene cijevi. Tijekom 1-2 dana taloženja u mraku na temperaturi od 25-30 °C iz jaja se izlegu rabditiformne ličinke, koje nakon 5-7 dana postaju filariformne: ličinke pužu uz stijenke cilindra, gdje se nalaze vidljiv čak i golim okom. Jaja trematoda, kao što su opisthorchiids, diphyllobothriids, fasciolae i dr., koja se prirodno razvijaju u vodi, stave se na satno staklo, Petrijevu zdjelicu ili u drugu posudu, te se prelije malim slojem obične vode. Kod uzgoja jaja Fasciola treba voditi računa da se ona brže razvijaju u mraku, dok se miracidij stvara u živim jajima na temperaturi od 22-24 °C nakon 9-12 dana. Pri mikroskopiranju jajašaca trematoda u razvoju jasno su vidljivi pokreti miracidija. Miracidium fasciola izlazi iz ljuske jajeta samo na svjetlu. Tijekom uzgoja voda se mijenja nakon 2-3 dana.

Ličinke ankilostoma i strongiloida uzgajaju se na agaru u Petrijevoj zdjelici sa životinjskim ugljenom. Nakon što su 5-6 dana bile u termostatu na temperaturi od 26-30 °C, ličinke pužu po agaru ostavljajući za sobom stazu bakterija (Fullebornova metoda).

Metoda Harade i Morija (1955). Dodajte 7 ml destilirane vode u epruvete postavljene u stalak. Drvenim štapićem uzeti 0,5 g izmeta i napraviti razmaz na filtar papiru (15X150 mm) 5 cm od lijevog ruba (ovo se radi na listu papira radi zaštite površine laboratorijskog stola). Zatim se traka s razmazom umetne u epruvetu tako da lijevi kraj bez razmaza dospije do dna epruvete. Gornji kraj prekriven je komadom celofana i čvrsto omotan elastičnom trakom. Na epruvetu se upisuje broj i prezime osobe koja se ispituje. U tom stanju epruvete se čuvaju 8-10 dana na temperaturi od 28 °C. Za proučavanje kulture uklonite celofanski poklopac i pincetom uklonite traku filter papira. Pri tome treba biti oprezan jer se mali broj infektivnih ličinki može pomaknuti na gornji kraj filter papira ili na stranu cijevi i prodrijeti ispod površine celofana.

Epruvete se stave u vruću vodenu kupelj na temperaturi od 50 °C na 15 minuta, nakon čega se njihov sadržaj protrese i brzo izlije u epruvetu od 15 ml da se ličinke talože. Nakon centrifugiranja, supernatant se ukloni, a sediment prenese na predmetno stakalce, prekrije pokrovnim stakalcem i ispita mikroskopski pod malim povećanjem.

Za diferencijalnu dijagnozu filariformnih ličinki potrebno je koristiti podatke prikazane u tablici. 13.

Metode bojenja jaja i ličinki helminta. Mrtva tkiva u većini slučajeva percipiraju boje brže od živih. Ove se značajke koriste u helmintologiji za određivanje održivosti jaja i ličinki helminta. Međutim, u nekim slučajevima, neke boje bolje percipiraju živa tkiva nego mrtva.

Tablica 13. Diferencijalna dijagnoza filarne ličinke A.duodenale, N.americanus, Strongyloides stercoralis, Trichostrongylus spp.

Za različito prepoznavanje živih i mrtvih jaja i ličinki koriste se sljedeće boje i metode.

Leukobaza metilensko plavo se koristi za bojenje živih i mrtvih tkiva. Živa stanica ili tkivo reducira metilensko modrilo u bezbojnu leukobazu, mrtvo tkivo nema tu sposobnost pa dobiva boju.

Za bojanje jaja okruglih crva možete koristiti metilensko plavo u otopini mliječne kiseline s kaustičnim alkalijama (0,05 g metilenskog plavog, 0,5 g natrijevog hidroksida, 15 ml mliječne kiseline). Živa jaja ne percipiraju boju; embriji mrtvih jaja postaju plavi.

Metoda bojenja nije primjenjiva na nezrela jaja valjkastih glista i bičaša; pigmentirana ljuska je obojena, pa se stoga ne vidi da li je spolna stanica unutar jajeta obojena.

Ličinke ascarisa boje se bazičnom otopinom briljantne kresil plave boje u koncentraciji 1:10 000. na sljedeći način: kap tekućine s jajima glista i kap glavne otopine boje nanese se na predmetno staklo. Preparat se prekrije pokrovnim stakalcem koje se uz lagano lupkanje disekcijskom iglom čvrsto pritisne na preparat. Broj izniklih ličinki i stupanj njihove obojenosti promatra se pod mikroskopom, nakon čega se nakon 2-3 sata ponovo pregleda isti preparat.Živima se smatraju samo nedeformirane ličinke koje nisu obojane 2 sata.Uginule ličinke se boje kada ljuska pukne (djelomično ili potpuno).

Mogućnost bojenja pripravaka otopinom joda naznačena je pri određivanju održivosti jajašaca ptičjih glista. U ovom slučaju, kao boja koristi se 5% alkoholna otopina joda. Kada se nanese na pripravak, embriji mrtvih jaja Ascaridia postaju narančasti unutar 1-3 s. Mrtva jaja opistorhisa i onkosfere goveđe trakavice boje se otopinom toluidin modrila (1:1000), a mrtve onkosfere goveđe trakavice boje se otopinom briljantnog krezil modrila (1:10 000). U isto vrijeme zameci i ljuske i mrtvih i živih jaja dobivaju boju. Stoga se nakon bojenja ispiru jaja i onkosfere čista voda i dodatno bojan safraninom (razrijeđen 1:10 000 u 10% alkoholnoj otopini). Alkohol skida boju s ljuski, a safranin im daje crvenu boju. Zbog toga živa jaja postaju crvena, embrij mrtvih postaje plav, a ljuska ostaje crvena. Uginuli embriji onkosfera goveđe trakavice brzo se, u roku od nekoliko minuta, boje jarko crveno ili ružičasto safraninom ili plavo briljantnim krezil plavim u razrjeđenju 1:4000 ili indigokarminom u razrjeđenju 1:1000-1:2000.

Živi embriji ne mijenjaju se pod utjecajem ovih boja ni nakon 2-7 sati.

Da bi se odredila održivost jaja patuljaste trakavice, preporuča se korištenje sljedećih boja: 1) briljantno krezilno plavo (1: 8000) - nakon 1 sata onkosfera mrtvih jajašaca postaje posebno svijetlo obojena, što se oštro ističe na blijedoj boji. ili bezbojna pozadina ostatka jajeta; 2) safranin: razrijeđen 1:8000 uz izlaganje 2 sata i 1:5000 3-5 sati; 3) 50% otopina pirogalne kiseline u razrjeđenju 1:2 - kada je izložena 1 sat na temperaturi od 29-30 “C (što je niža temperatura, to je duži proces bojenja).

Živi plerocerkoidi trakavice vrlo se dobro boje vodenom otopinom (1:1000) neutralrota 5-20 minuta. Za postizanje postojane ružičaste boje koja ne nestaje unutar 5 dana i ne utječe na pokretljivost plerocerkoida obično je dovoljno 10 minuta. Stupanj obojenosti kontrolira se promatranjem ličinki u čistoj izotoničnoj otopini natrijevog klorida, u tu svrhu se plerocerkoidi povremeno uklanjaju iz boje. Preporučljivo je koristiti metilensko modrilo za bojenje mrtvih plerocerkoida.

R. E. Chobanov i suradnici (1986.) predložili su metodu za određivanje održivosti jaja i ličinki helminta korištenjem "rubrin" pigmenta, dobivenog uzgojem plijesni Penicilium rubrum, kao boje. Da biste to učinili, upotrijebite 3% vodenu otopinu boje.

Proces bojenja jaja i ličinki je završen nakon 1,5 h.Neživa jaja pinworma, goveđe i patuljaste trakavice, ankilostoma, trihostrongilida poprimaju intenzivno ružičastu boju, a ličinke ankilostoma i trihostrongilida postaju crvene. Manje svijetla boja uočena je u jajima valjkastih crva i bičaša, budući da, kada se oslobode iz crijeva, već imaju tamnosmeđu boju: održiva jaja i ličinke nisu obojeni.

Fizikalno-kemijske metode za poticanje oslobađanja mirakulida iz jaja trematoda. S.M. German i S.A. Beer (1984.) razvili su metode za određivanje održivosti jajašaca opisthorhida i dikrocelija izlaganjem jajašaca reakcijskom mediju. Ako su živi, ​​miracidij se oslobađa. Metode se temelje na fizikalno-kemijskoj aktivaciji žlijezde za izleganje miracidija i stimulaciji motorna aktivnost ličinke. Stimulacija se postiže izlaganjem jaja trematoda posebnom reakcijskom mediju u kombinaciji sa sekvencijalnim tehnikama - stvaranjem temperaturne razlike, sušenjem suspenzije jaja, izlaganjem slabom protoku tekućine u testnoj kapi, što doprinosi masovnom oslobađanju miracidija iz jaja.

Određivanje održivosti jajašaca opisthorhida metodom Hermana i Beera. Suspenzija jaja u vodi (vodovodnoj, taloženoj) prethodno se ohladi na 10-12 °C. Sve naredne radnje izvode se na sobnoj temperaturi (18-22 °C). U epruvetu centrifuge doda se jedna kap (oko 0,05 ml) suspenzije koja sadrži 100-400 jaja. Epruvete se stave u stalak na 5-10 minuta da se jaja talože. Zatim uska traka Pomoću filter papira pažljivo isisajte višak vode dok se potpuno ne ukloni. Dodajte 2 kapi medija u epruvetu, protresite, prenesite sadržaj pipetom na predmetno staklo i ostavite 5-10 minuta, lagano protresite (ili stavite pod sušilo za kosu) kako biste stvorili slaba strujanja tekućine u ispitnoj kapi suspenzija. Ova operacija, koja oponaša peristaltiku crijeva mekušaca, omogućuje aktiviranje oslobađanja miracidija. Nakon toga se u suspenziju dodaju još 2 kapi medija i zatim se preparat mikroskopira konvencionalnim svjetlosnim mikroskopom (X200). Tijekom tog vremena, poklopac jaja s održivim miracidijem trebao bi se otvoriti, a ličinka aktivno izlazi u okoliš. Zahvaljujući prisutnosti etanola u njemu, miracidij se imobilizira nakon 3-5 minuta, a zatim se boji bojom koja se nalazi u mediju. Kao rezultat toga, miracidije se lako otkrivaju i broje.

Priprema reakcijskog medija. Medij se priprema u 0,05 M Tris-HCi puferu pri optimalnim pH uvjetima od 8,0-9,5. U pufer se dodaje etanol do 10-13% i bojilo (safranin, metilensko plavo i druge koje djeluju unutar pH raspona) do slabo bojenje tekućine (npr. za safranin će njegova konačna koncentracija biti 1:50 000). Možete koristiti drugi pufer koji radi u alkalnim pH granicama, na primjer 0,05 M fosfata (pH 8,5). Dakle, medij sadrži 96% etanola - 12 dijelova; boja (matična otopina) - 1-10 dijelova; 0,05 M Tris-NS! pufer (pH 8,5-9,5) - do 100 dijelova. Primjer medija: 12 dijelova 96% etanola, 1 dio zasićene otopine safranina, ostatak do 100 dijelova - 0,05 M Tris-HCl pufer, pH 9,5.

Određivanje održivosti jaja dikrocelija metodom Herman, Beer, Stratan. Kap suspenzije koja sadrži 100-150 jaja trematoda stavi se u epruvetu centrifuge na 1-2 minute da se jajašca talože. Tekućina se zatim pažljivo osuši pomoću trake filter papira. Dodajte 1-2 kapi reakcijskog medija pomoću Pasteurove pipete i inkubirajte u vodenoj kupelji na 28-30 °C 2-3 minute. Sastav medija: 6 dijelova butanola, 94 dijela 0,4% otopine natrijevog klorida ili 0,3% otopine kalijevog klorida u destiliranoj vodi. Jaja u mediju se pipetom prenesu na predmetno staklo i ostave 1,5-2 sata na sobnoj temperaturi (18-22 °C), uz dodavanje 1-2 kapi (0,05) svakih 25-30 minuta (kako se suše ). ml) otopine butanola u destiliranoj vodi. Nakon toga preparat se pregleda pod mikroskopom pri povećanju od 100-200x. Preživljavanje se određuje brojem otvorenih jaja s oslobođenim miracidijama. Butanol prodire kroz pore ljuske jajeta, dolazi do miracidija i aktivira ih. Inkubacija na navedenoj temperaturi pospješuje ovaj proces. Butanol u koncentraciji od 3-7% je štetan za miracidij koji izlazi iz jaja. Prijenos suspenzije jajašaca iz epruvete na predmetno staklo omogućuje da se do trenutka otpuštanja miracidija (nakon 30-40 minuta) koncentracija butanola zbog isparavanja smanji na sigurnu razinu (1,5-0,5%). Prisutnost natrijevog klorida u mediju u koncentraciji od 0,1-0,5% (ili kalijevog klorida u koncentraciji od 0,05-0,4%) određuje aktivnost oslobođenog miracidija. Za razliku od malih prozirnih jaja opistorha, jaja dikrocelija imaju ljusku tamne boje, imaju jasno vidljivu kapicu koja se otvara nakon izlaska miracidija. Stoga je prikladnije procijeniti održivost jaja dikrocelija brojanjem otvorenih jajašaca nego bojanjem i brojanjem miracidija.

Luminescentna metoda za proučavanje jaja i ličinki helminta.

Po prvi put u helmintološkoj praksi metode fluorescentne mikroskopije korištene su 1955. godine. Objavljeno je da fluorescentna mikroskopija omogućuje razlikovanje živih i mrtvih objekata bez oštećenja jajeta. Za fluorescenciju nisu korištene UV zrake, već plavo-ljubičasti dio vidljive svjetlosti, s konvencionalnim mikroskopom i stakalcima; apliciran na iluminator OI-18 poseban set filteri u boji.

Utvrđeno je da živa i mrtva jajašca valjkastih glista, pinworma, patuljaste trakavice, goveđe trakavice, široke trakavice i drugih helminta različito fluoresciraju. Ovaj fenomen se opaža i tijekom primarne luminiscencije bez upotrebe boja, i kada se boje fluorokromima (akridin narančasta, korifosfin, primulin, aurolin, berlerin sulfat, tripaflavin, rivanol, kinin itd.).

Nebojana, živa, nesegmentirana jaja valjkastih crva svijetle svijetlo zeleno sa žućkastom nijansom; u mrtvim jajima ljuska zrači zeleno svjetlo mnogo svjetlija od tamnozelene germinativne; U jajima valjkastih glista s ličinkom pojavljuje se samo ljuska, a u mrtvim jajima i ljuska i ličinka svijetlo su žute boje.

Nepigmentirana i nesegmentirana živa jaja pinworma i patuljaste trakavice emitiraju zelenkasto-žuto svjetlo; U mrtvim jajima ljuska intenzivno svijetli na pozadini tamnozelene embrionalne mase. Uz sekundarnu luminescenciju (kada se boji akridin narančastom u razrjeđenju 1:10 000 i 1:50 000 od 30 minuta do 2 sata), ljuska živih i mrtvih nematoda, trematoda i cestoda različito svijetli.

Ljuska živih i mrtvih Ascaris lumbricoides, Toxocara leonina, Enterobius vermicularis, Hymenolepis nana, H.fraterna, H. diminuta, T.saginatus, D.latum obojena je narančasto-crvenom bojom. Embriji živih Asc. lumbricoides, T.leonina, H.diminuta, D.latum i onkosfere goveđe trakavice fluoresciraju mutno tamnozelenom ili sivozelenom bojom. Mrtvi embriji ovih jajašaca helminta emitiraju "goruće" narančasto-crveno svjetlo. Žive ličinke pinworma i toxocara (oslobođene ljuske jajeta) emitiraju prigušeno sivo-zeleno svjetlo; kada umru, boja se mijenja od vrha glave do "goruće" svijetlozelene, zatim žute, narančaste i na kraju svijetlo narančaste.

Obojana fluorokromima - korifosfilusom, primulinom - mrtva jaja valjkastih glista i bičaša pokazuju sjaj od lila-žute do bakreno-crvene. Jaja sposobna za život ne svijetle, već su obojena u tamnozelenu boju. Živa jajašca trematoda Paragonimus westermani i Clonorchis sinensis ne svijetle kada se boje akridin narančastom, ali mrtva jaja emitiraju žućkasto-zelenu svjetlost.

Metoda luminiscencije također se može koristiti za određivanje održivosti ličinki helminta. Dakle, ličinke strongylata i rhabditatusa fluorokromirane otopinom akridin narančaste (1: 2000) svijetle: žive - zelene (s nijansom), mrtve - jarko narančastom svjetlošću. Žive ličinke trihinele ne svijetle ili daju slab sjaj kada se 10 minuta tretiraju otopinama fluorescein izotiocijanata, auramina itd. Fluorokromirane mrtve ličinke (u koncentraciji 1:5000) daju jarko sjaj.

Žive miracidije koje izlaze iz ljuske emitiraju prigušeno plavkasto svjetlo s jedva primjetnim svijetložutim vjenčićem cilija, ali 10-15 minuta nakon smrti pojavljuju se sa jarkim "gorućim" svjetlozelenim, a zatim narančasto-crvenim svjetlom.