Agentul cauzal al difteriei (Corynebacterium diphtheriae). Corynebacterium diphtheriae (diphtheria corynebacterium)
Agentul cauzal al difteriei aparține genului Corynebacterium (din latină coryna - club, diftera - film). Bacteriile au îngroșări în formă de club la capete. Acest gen include bacili difterici patogeni pentru oameni și specii nepatogene - bacilii pseudodifterici și difteroizi, care se găsesc pe membranele mucoase și pe piele.
Agenții cauzali ai difteriei - Corynebacterium diphtheriae - au fost descoperiți de T. Klebs (1883) și izolați în formă pură F. Leffler (1884).
Morfologie. Agenții cauzali ai difteriei sunt tije ușor curbate, subțiri, de 3-6 × 0,3-0,5 microni, cu îngroșări la capete. Aceste îngroșări conțin boabe de volutină (boabe Babesch-Ernst). Bacteriile difterice sunt imobile și nu au spori sau capsule. Gram pozitiv. Sunt bine colorate cu coloranți bazici de anilină, în timp ce boabele de volutină sunt colorate mai intens. Pentru colorare se folosesc de obicei albastru de metilen alcalin sau violet cristal. O caracteristică a difteriei Corynebacteria este polimorfismul lor; într-o cultură există tije de diferite forme și dimensiuni: curbate, drepte, lungi, scurte, groase, uneori cocobacterii. Localizarea bacteriilor în frotiuri este caracteristică - de obicei sunt localizate în perechi la un unghi acut sau obtuz, sub formă de degete înclinate etc. Localizarea în frotiuri și prezența granulelor de volutină este un semn de diagnostic diferențial în timpul examinării microscopice. Reprezentanții nepatogeni ai genului Corynebacteria - bacilii pseudodifterici și difterozii sunt adesea aranjați sub formă de palisadă, pot să nu aibă boabe de volutină sau pot fi la un capăt (vezi Fig. 4).
Cultivare. Corynebacterium diphtheria sunt anaerobi facultativi. Ele cresc la o temperatură de 35-37° C, pH 7,4-7,8. Nu se reproduc normal medii nutritive. Sunt cultivate pe medii care conțin sânge sau ser.
La sfârșitul secolului al XIX-lea, omul de știință francez E. Roux a propus utilizarea serului coagulat de bovine sau de cal pentru a cultiva bacteriile difterice, iar F. Leffler a recomandat adăugarea de bulion (25%) și 1% glucoză. Pe aceste medii, corynebacteriile cresc rapid, în 14-18 ore formează colonii convexe de culoare crem care nu se contopesc (creșterea pe un mediu înclinat seamănă cu pielea de șagreen). Cu toate acestea, este imposibil să se diferențieze bacilii difteriei de bacilii pseudodifteriei pe aceste medii.
În prezent, principalele medii de cultură sunt mediul Clauberg (conținând ser sanguin și telurit de potasiu), mediul chinosol Bunin, mediul Tinsdal etc. Pe baza proprietăților culturale și enzimatice ale corynebacteriilor, difteria este împărțită în trei biovari: gravis, mitis ), intermedius. . Biovar gravis se găsește de obicei sub forma R. Pe mediul lui Clauberg, bacteriile acestui biovar cresc sub forma unor colonii mari de 2-3 mm, de culoare gri-negru (deoarece reduc teluritul la teluriu) si au margini zimtate, ceea ce le da aspectul unei rozete. Când atingeți colonia cu o buclă, pare să se prăbușească. În bulion, bacteriile acestui biovar formează o peliculă care se prăbușește și un sediment granular.
Corynebacterium biovar mitis crește pe mediul Clauberg sub formă de colonii mici, netede (în formă de S) de culoare neagră. În bulion dau o tulburare uniformă.
Corynebacteria biovar intermedius (intermedinele) sunt intermediare. Pe mediul lui Clauberg, bacteriile acestui biovar cresc adesea sub formă de colonii strălucitoare, mici, negre (acest biovar este rar).
Proprietăți enzimatice. Toate cele trei biovaruri de bacterii difterice posedă enzima cistinază, care descompune cistina pentru a produce hidrogen sulfurat. Aceste proprietăți sunt utilizate pentru a diferenția agenții patogeni difteriei de reprezentanții nepatogeni ai acestui gen (Tabelul 49).
Notă. + reacție pozitivă (se defectează); - reacție negativă (nu se desparte).
Agenții patogeni din toate cele trei biovaruri descompun glucoza și maltoza pentru a forma acid. C. gravis descompune amidonul. Această proprietate îl deosebește de celelalte două biovari. Corynebacterium diphtheria reduce nitrații la nitriți, nu formează indol și nu descompune ureea.
Corynebacterium diphtheria produce neuraminidază, hialuronidază și alte enzime de patogenitate.
Formarea toxinelor. Tulpinile virulente ale agenților patogeni difteriei produc exotoxină. Din punct de vedere chimic, este o proteină termolabilă constând din două fracții. Fracția B fixează toxina pe țesuturile corpului sensibile la aceasta. Fracțiunea A este responsabilă pentru efect toxic. Potența culturilor de toxine difterice poate fi determinată „in vivo” la cobai sensibili la toxină. Exotoxina difterică slabă este doza minimă letală, aceasta este cantitatea minimă de otravă care ucide un cobai de 250 g în a 4-a zi.
Prezența exotoxinei poate fi detectată și „in vitro” - pe un mediu nutritiv solid. Această metodă este utilizată pe scară largă în lucrările practice. Exotoxina difterică este instabilă. Se descompune rapid sub influența temperaturii, luminii și oxigenului atmosferic. După adăugarea de formol (0,3-0,4%) la toxină și menținerea acesteia la o temperatură de 37-38 ° C timp de câteva săptămâni, se transformă în toxoid, care își pierde toxicitatea, dar păstrează proprietățile antigenice ale toxinei. Toxinele produse de diferite tulpini nu diferă unele de altele și pot fi neutralizate de antitoxina difterice*.
* (S-a stabilit acum că toate biovarurile de corinebacterii pot fi toxigenice și non-toxigenice.)
Structura antigenică. Bacteriile difterice au un antigen proteic labil la suprafață la căldură și un antigen O polizaharid specific de tip. În plus, dintre corinebacterii se disting 19 produse fagice, care sunt luate în considerare la identificarea culturilor. Phagovars sunt folosite pentru a identifica sursa bolii.
Rezistenta la factorii de mediu. Agenții cauzali ai difteriei sunt relativ stabili. O temperatură de 60° C îi omoară în 10-15 minute, 100° C îi omoară într-un minut. În peliculă pot rezista la încălzire până la 90° C. Pe zerul rulat la temperatura camerei rezistă până la 2 luni, pe jucăriile pentru copii - câteva zile. Corynebacteriile tolerează bine temperaturile scăzute. Agenții patogeni difterici sunt destul de rezistenți la uscare. Dezinfectanții (soluție de fenol 3%, soluție de sublimare 1%, soluție de peroxid de hidrogen 10%) ucid aceste bacterii în câteva minute.
Susceptibilitatea animalelor. ÎN conditii naturale animalele nu fac difterie. Dintre animalele de experiment, cobai și iepuri sunt cei mai sensibili. Cu infecția intradermică sau subcutanată, ei dezvoltă o imagine a infecției toxice cu formarea de inflamație, edem și necroză la locul injectării. La nivelul glandelor suprarenale se observă hemoragii.
Sursele bolii. Bolnavi și purtători de bacterii.
Căile de transmisie. Picături în aer, contact în gospodărie (prin vase, jucării, cărți, prosoape etc.).
Boala la om: 1) difteria faringelui; 2) difterie nazală.
Mai puțin frecvente sunt difteria traheei, bronhiilor, ochilor, urechilor, vaginului și difteriei pielii deteriorate.
Patogeneza. Porțile de intrare sunt membranele mucoase ale tractului respirator și pielea deteriorată. Odată ajunși pe membrana mucoasă, agenții patogeni difterici se înmulțesc la locul de penetrare și provoacă necroză tisulară. Se formează un film care este strâns asociat cu țesuturile subiacente. Pe suprafața mucoasei apar depozite murdare de culoare gri sau gălbui, constând din epiteliu distrus, fibrină, leucocite și difterie corynebacterium. Când îndepărtați filmul cu un tampon de bumbac sau o spatulă, suprafața mucoasei poate sângera.
În timpul proliferării Corynebacterium diphtheria, exotoxina se acumulează în zonele necrotice, ceea ce poate duce la umflarea membranei mucoase și a țesutului. Din membrana mucoasă, umflarea se poate răspândi la laringe, bronhii și poate provoca asfixie. Toxina care circulă în sânge afectează selectiv mușchiul inimii, glandele suprarenale și celulele țesutului nervos.
Difteria este o infecție toxică. Severitatea procesului depinde de gradul de toxicitate al tulpinii și de apărarea organismului.
Imunitate. Imunitatea este cauzată de imunitatea antitoxică și antibacteriană. Sugarii nu se imbolnavesc pentru ca au imunitate pasiva transmisa de la mama lor.
Prezența imunității antitoxice este apreciată de reacția Schick. Pentru a configura o reacție 1 / 40 Dlm ( doză letală Toxina de cobai), conținută în 0,2 ml soluție izotonică de clorură de sodiu, se injectează intradermic în antebraț. Dacă nu există antitoxină în sânge, la locul injectării apar roșeață și umflare (până la 2 cm în diametru) după 24-48 de ore. Dacă antitoxina este prezentă, nu există umflare sau roșeață (antitoxina prezentă în sânge a neutralizat toxina injectată).
Boala transferată lasă imunitatea. Cu toate acestea, în 6-7% din cazuri se observă boli recurente.
Prevenirea. Diagnosticul precoce. Izolatie. Dezinfectare. Identificarea purtătorilor bacilului difteric toxigen.
Prevenirea specifică efectuată prin introducerea de toxoid. În URSS conduc vaccinare obligatorie copiii cu vaccinul DTP este un vaccin complex care include difteria și toxoid tetanicși o suspensie de bastoane de pertussis ucise. Copiii sunt vaccinați de la 5-6 luni cu revaccinarea ulterioară. Pentru revaccinare se administreaza un vaccin fara bastonase pertussis.
Tratament specific. Se folosește ser antitoxic antidifteric. Doza și frecvența sunt determinate de medicul curant și se administrează și medicamente antimicrobiene.
Întrebări de control
1. Care este morfologia Corynebacterium diphtheria și ce biovaruri există?
2. Pe ce medii se cultivă bacteriile difterice și care este modelul de creștere?
3. Relația cu care carbohidrați permite să se distingă biovarul gravis de alte biovari cu difterie?
4. Care este calea de transmitere și unde este cel mai des localizat agentul cauzal al difteriei la un pacient?
5. Care sunt prevenirea și tratamentul specific al difteriei?
Examen microbiologic
Scopul studiului: izolarea agentului patogen pentru diagnostic. Identificarea purtătorilor de bacterii difterice conform indicațiilor epidemiologice. Detectarea exotoxinei în culturi izolate.
Material pentru cercetare
1. Secreția din membrana mucoasă a faringelui.
2. Secreție din mucoasa nazală.
3. Secreția din membrana mucoasă a ochiului.
4. Puroi din ureche.
5. Secreții din mucoasa vaginală.
6. Secreția plăgii.
Materialul pentru cercetare depinde de localizarea procesului.
Pentru orice localizare a procesului, asigurați-vă că examinați membrana mucoasă a faringelui și a nasului. Materialul se colectează cu un tampon de bumbac, pentru care se folosește un fir metalic, de preferință aluminiu, la un capăt al căruia se înfășoară strâns vată, apoi tamponul se montează într-un dop de plută, se pune într-o eprubetă și se sterilizează într-un Cuptor Pasteur la o temperatură de 160 ° C 1 tampon timp de o oră sau într-o autoclavă la temperatura de 112 ° C.
Note 1. Materialul se colectează pe stomacul gol sau nu mai devreme de 2 ore după masă și nu mai devreme de 4 zile după tratamentul cu antibiotice sau alți agenți antibacterieni. 2. Dacă materialul este luat din gât și nas, atunci tuburile cu ambele tampoane sunt etichetate și legate împreună. Culturile se fac separat, iar materialul din fiecare tampon este examinat ca o lucrare independentă. 3 Materialul colectat cu un tampon uscat trebuie inoculat nu mai târziu de 2-3 ore după colectare. Dacă este necesar să transportați materialul colectat, tamponul este umezit în prealabil cu o soluție de glicerină 5% într-o soluție izotonică de clorură de sodiu.
Metode de cercetare de bază
1. Microbiologic.
2. Bacteroscopic.
3. Biologic.
Progresul studiului
A doua zi de studiu
Cupele sunt scoase de pe termostat și inspectate. Creșterea bacteriilor pe mediul Clauberg poate fi încetinită din cauza prezenței inhibitorilor în mediu. În acest caz, ceștile se pun în termostat pentru încă 24 de ore.
A treia zi de studiu
Cupele sunt scoase de pe termostat și examinate folosind o lupă sau un microscop stereoscopic. Dacă există colonii suspecte, o parte din ele, sub controlul unui microscop stereoscopic, se izolează pe agar cu ser 25% și pe o coloană cu mediu Pisa pentru determinarea enzimei cistinază. Un test de toxicitate este luat dintr-o altă parte a coloniilor.
În timpul unei examinări microscopice a coloniilor prelevate din mediul Clauberg, corinebacteriile difterice își pierd specificitatea: nu există granularitate, dimensiunea se modifică, iar localizarea rămâne aceeași. Când sunt inoculate pe medii cu ser, specificitatea morfologică a agenților patogeni difteriei este restabilită.
Un test pentru prezența enzimei cistinază și determinarea toxicității sunt obligatorii la identificarea agenților patogeni difterici. Dacă rezultatul acestor experimente, efectuate cu o parte din coloniile din mediul Clauberg, nu este suficient de clar sau negativ, atunci experimentul se repetă folosind cultura pură izolată.
Testul cistinază. Cultura studiată este însămânțată prin injectarea acesteia în centrul unei coloane de mediu Pisa. Dacă reacția este pozitivă, după 18-24 de ore, în timpul injectării se observă înnegrire, iar în jurul tijei negre se formează un nor închis; înnegrirea apare ca urmare a faptului că enzima cistinaza descompune cistina, care face parte din mediul Pisa, iar sulful eliberat reacţionează cu acetatul de plumb - se formează sulfitul de plumb negru. Difteroizii și bacilii pseudodifterici nu conțin enzima cistinază, prin urmare, atunci când cresc pe mediu Pisu, culoarea mediului nu se schimbă.
Determinarea exotoxinei. Se realizează prin metoda precipitării difuze într-un gel. Metoda se bazează pe interacțiunea unei toxine cu o antitoxină. În acele zone ale agarului în care aceste componente interacționează, se formează un precipitat sub formă de linii rotunjite.
Metoda de determinare: topită și răcită la 50°C Agar Jder, pH 7,8, este turnat în vase Petri (agar Martin produce exotoxină mai bună). Cantitatea de agar din vas nu trebuie să depășească 12-15 ml pentru a menține transparența - într-un strat gros, liniile de precipitare sunt greu de văzut. După ce agarul s-a întărit, se aplică o fâșie de hârtie de filtru sterilă umezită cu ser anti-difteric antitoxic.
Cultura test este inoculată cu „plăci”. Semănatul se face folosind o buclă. Diametrul plăcilor este de 0,8-1,0 cm Distanța plăcilor de la marginea benzilor de hârtie este de 0,5-0,7 cm, plăci de o tulpină toxigenă cunoscută sunt inoculate între două plăci ale culturii de testare. Cultura testată este considerată toxigenă dacă liniile de precipitare sunt clare și se îmbină cu liniile de precipitare ale tulpinii martor (toxigene). Dacă liniile de precipitare se intersectează cu liniile tulpinii martor sau sunt absente, cultura izolată este considerată netoxigenă (Fig. 50).
Pregătirea benzilor de hârtie. Se taie benzi de 1,5 x 8 cm din hârtie de filtru, mai multe bucăți sunt învelite în hârtie și sterilizate într-o autoclavă la o temperatură de 120 ° C timp de 30 de minute. Înainte de a efectua experimentul, scoateți o bandă cu pensete sterile, puneți-o într-o cutie Petri sterilă și umeziți-o cu ser anti-difteriec antitoxic. Serul este mai întâi diluat astfel încât 1 ml să conțină 500 AE (unități antitoxice). Hârtia se umezește cu 0,25 ml de ser (125 AU) și se pune pe suprafața mediului. Apoi recoltele se fac în modul indicat mai sus. Toate culturile sunt plasate într-un termostat. Rezultatele se înregistrează după 18-24 și 48 de ore.
A patra zi de cercetare
Culturile sunt scoase din termostat și se iau în considerare rezultatele. Frotiurile sunt realizate dintr-o cultură crescută pe mediu cu ser și colorată cu albastru Loeffler.
Prezența în frotiurile de bastonașe caracteristice morfologiei lor, o tijă neagră cu nor în mediul lui Pisu și linii de precipitare în agar ne permite să dăm un răspuns preliminar: „Corynebacterium diphtheria a fost detectat”. Cercetarea continuă. Dacă nu există linii de precipitare în agar sau claritatea lor insuficientă, testul de toxicitate trebuie repetat cu o cultură pură izolată.
Pentru identificarea finală a culturii izolate și determinarea biovarului agentului patogen, se efectuează inocularea pe glucoză, zaharoză, amidon și bulion cu uree (pentru a detecta enzima urază). Semănatul pe medii se face în mod obișnuit.
Test pentru ureaza. Cultura izolată se seamănă în bulion cu uree și indicator (roșu crezol) și se pune într-un termostat. După numai 30-40 de minute, rezultatul poate fi luat în considerare: la inocularea agenților patogeni adevărați ai difteriei, culoarea mediului nu se schimbă, deoarece nu conțin urază. Bacilii pseudodifteriei descompun ureea și schimbă indicatorul - mediul devine roșu purpuriu.
A cincea zi de cercetare
Rezultatele sunt înregistrate (Tabelul 50).
Întrebări de control
1. Ce material este examinat pentru a identifica agentul cauzal al difteriei?
2. Cum se colectează materialul pentru testarea difteriei din gât și nas?
3. Ce trebuie făcut cu tamponul dacă materialul colectat trebuie transportat?
4. Ce dispozitiv este folosit pentru a studia coloniile pe mediul lui Clauberg?
5. Ce studii se realizează pentru identificarea finală a culturii izolate?
6. Ce metode sunt folosite pentru a determina toxicitatea Corynebacterium diphtheria?
1. Luați sârmă și vată de la profesor și pregătiți 10 tampoane, instalați-le într-un dop de plută, introduceți-le într-o eprubetă și sterilizați.
Atenţie! Înainte de sterilizare, verificați dacă tamponul este înfășurat suficient de strâns.
2. Luați tampoane sterile de la profesor și colectați material unul din gâtul și nasul celuilalt (cu tampoane diferite).
3. Studiază din masă. 49 proprietățile agenților patogeni difterici și corinebacterii înrudite.
4. Test de toxicitate. Faceți plăcile într-o buclă fără cultură.
5. Schițați progresul studiului și rezultatele pozitive și negative ale testului de toxicitate.
Medii de cultură
Tellurium Clauberg mediu: primul amestec - un amestec de 20 ml sânge de miel sau cal și 10 ml de glicerină se prepară cu 1,5 luni înainte. În ziua pregătirii mediului se prepară alte două amestecuri; al doilea amestec - 50 ml de MPA pH 7,5 este topit și răcit la o temperatură de 50 ° C, după care se adaugă 2,5 ml din primul amestec; al treilea amestec - amestecați 17 ml de sânge de oaie și 33 ml de apă distilată (amestecul este preparat steril), încălzit într-o baie de apă la o temperatură de 50 ° C. Combinați al doilea și al treilea amestec, adăugați 4 ml de 1% soluție de telurit de potasiu K 2 TeO 3, se amestecă rapid totul și se toarnă în căni. Mediul este transparent și are culoarea vinului roșu.
Miercuri Pisa. La 90 ml de MPA topit 2% (pH 7,6), se adaugă 2 ml de soluție de cistină (soluție de cistină 1% în soluție de hidroxid de sodiu 0,1 N), se amestecă bine și se adaugă același volum de 0,1 N. soluție de acid sulfuric. Mediul este sterilizat timp de 30 de minute la o temperatură de 112 ° C. La mediul topit și răcit la 50 ° C, se adaugă 1 ml dintr-o soluție 10% de acetat de plumb, sterilizat de două ori cu abur curgător, se amestecă și se adaugă 9 ml de ser normal de cal. Mediul este turnat steril în tuburi mici de 2 ml. Semănatul se face prin injecție.
Miercuri Bunin. Mediul de chinosol uscat se adaugă la 100 ml apă rece(pH 7,6-7,8), se amestecă și se încălzește la foc mic până când agarul se topește (conform instrucțiunilor de pe etichetă). Apoi mediul se fierbe timp de 2-3 minute până se formează spumă, după care mediul este răcit la 50 ° C și se adaugă 5-10 ml de sânge steril defibrinat. Mediul se amestecă și se toarnă în vase Petri. Mediul preparat poate fi păstrat timp de 3-4 zile la o temperatură de 4-10°.
Tinsdal miercuri. La 100 ml de agar nutritiv 2%, topit și răcit la 50 ° C, adăugați: 1) 12 ml de soluție de cistină 1% la 0,1 N. soluție de acid sulfuric; 2) 12 ml soluție de hidroxid de sodiu 1%; 3) 1,8 ml soluție de telurit de potasiu 2%; 4) 1,8 ml soluție de hiposulfit de sodiu 2,5%, 20 ml ser normal de cal sau bovin. După adăugarea fiecărui ingredient, mediul este bine amestecat. Cupele cu mediu se păstrează 3-4 zile la 10°C.
Întrebarea 2. Corynebacterium diphtheriae (genul Corynebacterium)
C. diphtheriae - bacterii în formă de tijă; provoca difterie (difterie greacă - piele, film) - o infecție acută caracterizată prin inflamație fibrinoasă la nivelul faringelui, laringelui, mai rar în alte organe și simptome de intoxicație.
Proprietăți morfologice și culturale.
Corinebacterium diphteriae sunt tije gram-pozitive subțiri, ușor curbate sau drepte, dispuse în unghi una față de cealaltă sub formă de cinci romane. Sunt îngroșate la capete datorită prezenței boabelor valută la unul sau ambii poli ai celulei. Granulele de monedă constau din polifosfați; ei percep coloranții de anilină mai intens decât citoplasma celulei și sunt ușor de detectat atunci când sunt colorați conform lui Neisser sub formă de granule albastru-negru, în timp ce corpurile bacteriilor sunt colorate în galben-verde. Colorația Gram nu dezvăluie boabe de monedă.
Desenul unui frotiu dintr-o cultură pură. Pata de Neisser Frotiu din cultura pura.
Colorarea albastră alcalină a lui Loeffler
Bacilul difteric nu are rezistență la acid, este imobil, nu formează spori și are o microcapsulă cu un factor de cordon inclus în compoziția sa. Peretele celular conține galactoză, manoză, arabinoză, precum și un număr mare de lipide, inclusiv acizi micolici nestabili la acid.
Agentul cauzal al difteriei este un anaerob facultativ, heterotrof, care crește la 37 o C pe medii nutritive complexe: ser sanguin coagulat, agar cu telurit sânge.
Pe medii elective, după 8-14 ore formează colonii punctate, convexe gălbui-crem, cu o suprafață netedă sau ușor granulată. Coloniile nu se unesc și au aspectul pielii de șagreen.
Pe medii cu telurit, agentul cauzal al difteriei formează colonii negre sau gri-negru după 24-48 de ore ca urmare a reducerii teluritului la teluriu metalic.
Agentul cauzal al difteriei are activitate enzimatică ridicată. Caracteristici de diagnostic diferențial C. diphteriae sunt:
lipsa capacității de a fermenta zaharoza și de a descompune ureea,
capacitatea de a produce enzima cistinază.
Agentul cauzal al difteriei nu este uniform în proprietățile culturale și biochimice. În conformitate cu recomandările Biroului Regional al OMS pentru Europa, specia C. diphteriae este împărțită în 4 biovari: gravis, mitis, intermedius, belfanti.
Pe mediu de telurit, biovar gravis formează colonii uscate, mate, mari, plate, de culoare gri-negru, ridicate în centru. Periferia coloniei este ușoară, cu striații radiale și o margine neuniformă. Astfel de colonii seamănă cu o floare de margaretă. Biovar mitis formează colonii mici, netede, strălucitoare, negre, convexe, cu marginea netedă, înconjurate de o zonă de hemoliză. Biovarurile intermedius și belfanti aparțin de fapt biovarului mitis, deoarece nu descompun amidonul, iar această trăsătură este cea mai stabilă la C. diphteriae.
Structura antigenică. C. diphteriae are un antigen O (fracții lipidice și polizaharidice situate adânc în peretele celular) și un antigen K (o proteină termolabilă la suprafață). Antigenul O este interspecie. Pe baza antigenului K, se disting aproximativ 58 de serovari.
Factori de patogenitate. Principalii factori de patogenitate ai C. diphteriae sunt structuri de suprafață, enzime și toxine.
Structuri de suprafață (pili, componente microcapsule: factor de cordon, antigen K, acizi micolici) au o natură proteică și lipidă, favorizează aderența microbilor în loc poartă de intrare, previne fagocitoza bacteriilor, au un efect toxic asupra celulelor macroorganismului și distrug mitocondriile.
Enzime de patogenitate: neuraminidază, hialuronidază, hemolizină, dermonecrotoxină. Neuraminidaza desparte acidul N-acetilneuraminic de mucus și glicoproteinele de suprafață celulară, lyaseîl descompune în piruvat și N-acetilmanozamină și piruvat stimulează creșterea bacteriilor. Ca urmare a actiunii hialuronidază permeabilitatea vaselor de sânge crește și eliberarea de plasmă dincolo de limitele acestora, ceea ce duce la umflarea țesuturilor din jur. Dermonecrotoxina provoacă necroza celulelor la locul de localizare a agentului patogen. Fibrinogenul plasmatic eliberat în afara vaselor intră în contact cu trombokinaza celulelor necrotice ale corpului și se transformă în fibrină, care este esența inflamației difteriei. În interiorul filmului de difterie, C. diphteriae găsește protecție împotriva efectorilor sistemului imunitar și a antibioticelor, înmulțind și formând cantități mari de principalul factor de patogenitate estehistotoxina difterică.
Histotoxina difterică are un efect blocant asupra sintezei proteinelor în organele cel mai intens alimentate cu sânge: sistemul cardiovascular, miocardul, sistemul nervos, rinichii și glandele suprarenale.
Epidemiologie.În condiții naturale, doar persoanele care nu au rezistență la agentul patogen și imunitate antitoxică suferă de difterie. Boala este larg răspândită. Cel mai mare număr de pacienți este observat în a doua jumătate a lunii septembrie, octombrie și noiembrie. Copiii de vârstă preșcolară și primară sunt cei mai susceptibili. Printre adulți la grup risc crescut includ lucrători din alimentație publică și comerț, școli, grădinițe și instituții medicale.
C. diphteriae este rezistentă la factorii de mediu: în picăturile de salivă care aderă la vase sau jucării, pe mânerele ușilor pot persista până la 15 zile, pe obiectele din mediu 5,5 luni și se pot înmulți în lapte. Când este fiert, C. diphteriae moare în decurs de 1 minut, într-o soluție de peroxid de hidrogen 10% - după 3 minute, într-o soluție de acid carbolic 5% și alcool 50-60% - după 1 minut.
Histotoxina difterică este foarte instabilă și este rapid distrusă prin expunerea la lumină, încălzire și oxidare.
Patogeneza.
Sursa de infectie sunt:
1.purtători ai tulpinilor toxigenice - deosebit de periculoși sunt acei purtători care nu prezintă manifestări clinice ale bolii, întrucât au imunitate antitoxică.
2.pacienți: Dintre pacienți, cei cu localizare a procesului în căile respiratorii superioare au cea mai mare importanță. Pacientul este periculos din punct de vedere epidemiologic pe toată perioada de boală; chiar și în perioada de recuperare, el eliberează tulpini toxice în mediu.
Principal mecanism de infectare este aerosol. Căi de transmisie:
rolul principal revine picăturilor din aer,
uneori pot apărea praf din aer, contact cu gospodăria și, de asemenea, căi de transmitere nutriționale (prin lapte).
Poartă de intrare infecțiile deservesc membranele mucoase ale orofaringelui ( amigdaleleși țesuturile înconjurătoare), nas, laringe, trahee, precum și mucoase ale ochilor și ale organelor genitale, pielea deteriorată, suprafața rănii sau arsurilor, rana ombilicală nevindecată.
Cel mai comun difteria gâtului ( 90-95%). Perioada de incubație durează de la 2 la 10 zile. În funcție de patogeneza sa, îi aparține difteria infectii toxinemice când microbul rămâne la poarta de intrare a infecției și toate manifestările clinice sunt asociate cu acţiunea exotoxinei.
Stadiul inițial proces infecțios este aderența microbilor la poarta de intrare. Reproducându-se acolo, microbul secretă g istotoxină, care are un efect local asupra celulelor țesuturilor și pătrunde și în sânge, ceea ce duce la toxinemie.
În zona porții de intrare se dezvoltă o reacție inflamatorie, care este însoțită de necroza celulelor epiteliale și edem, se formează un strat alb cu o tentă cenușie sau gălbuie, care conține un număr mare de microbi care produc toxină.
Un simptom caracteristic al difteriei este film fibrinos:
Dacă se formează membrana mucoasă epiteliu cu un singur strat(laringele, traheea, bronhiile), apare inflamație lobară, aici pelicula este localizată superficial și se desparte ușor de țesuturile subiacente.
Dacă se formează membrana mucoasă epiteliu stratificat(orofaringe, epiglotă, corzi vocale), apare inflamație difterică când toate celulele sunt ferm conectate între ele și cu baza de țesut conjunctiv subiacent. În acest caz, pelicula fibrinoasă este strâns legată de țesuturile subiacente și nu poate fi îndepărtată cu un tampon. Când încercați să faceți acest lucru, membrana mucoasă sângerează.
Imunitate. După o boală se formează imunitatea umorală antitoxică persistentă și intensă. Durata imunității post-vaccinare este de 3-5 ani.
Diagnosticul microbiologic.
Material pentru cercetare este un film fibrinos, mucus din gât sau nas.
Colectarea materialului trebuie efectuată în 3-4 ore (nu mai târziu de 12 ore) din momentul contactării pacientului. Pentru colectarea materialului se folosesc tampoane de bumbac uscate; dacă semănatul se va face în 2-3 ore, la transportul materialului, tampoanele sunt umezite cu o soluție de glicerină 5%.
Metode de diagnosticare:
Principala metodă de diagnosticare este bacteriologic. Laboratorul bacteriologic trebuie să ofere un răspuns în termen de 48 de ore despre prezența sau absența C. diphteriae în teste.
Materialul este inoculat pe un mediu nutritiv. Se selectează coloniile suspecte și se identifică cultura izolată:
Pe baza prezenței cistinazei (testul Pizou): cultura de testat este inoculată într-o coloană de agar nutritiv cu cistina. Culturile sunt incubate la 37 o C timp de 24 ore.C. diphteriae determină înnegrirea mediului de-a lungul injectării ca urmare a formării sulfurei de plumb.
Pentru prezența ureazei (testul Sachs): se prepară o soluție alcoolică de uree și o soluție de indicator - roșu fenol, care se amestecă înainte de utilizare într-un raport de 1:9 și se toarnă în tuburi de aglutinare. Bacteriile care urmează a fi studiate sunt introduse într-o buclă și frecate de-a lungul peretelui curelei. În cazul pozitiv, după 20-30 de minute de incubare la 37 o C, mediul devine roșu ca urmare a descompunerii ureei de către urează.
Capacitatea C. diphteriae de a produce toxină (determinată prin reacția de precipitare în agar). Pentru a face acest lucru, o bandă de hârtie de filtru impregnată cu ser antitoxic de difterie care conține 5000 AE/ml este plasată într-un vas Petri cu agar nutritiv care conține 15-20% ser de cal, 0,3% maltoză și 0,03% cistină. Cupa se usucă la 37 0 C timp de 30 de minute și tulpinile de testat se inoculează cu plăci la o distanță de 0,6-0,8 cm de marginea hârtiei. Culturile sunt incubate la 37 0 C timp de 24 de ore.În caz pozitiv, la joncțiunea toxinei cu antitoxina din mediu se formează un precipitat sub formă de linii albe - „antene”.
Pentru a determina toxicitatea agentului cauzal al difteriei, acesta poate fi utilizat biotest. Cobaiul este injectat intradermic sau subcutanat cu cultura de testare. Culturile toxice ucid animalele în decurs de 3-5 zile; la autopsie se descoperă glandele suprarenale hiperemice, iar la infecție intradermică se constată necroza pielii.
Pentru examen bacterioscopic(ca independent metoda de diagnostic rar folosit din cauza polimorfismului agentului patogen, dar poate fi efectuat la cererea medicului) frotiurile sunt preparate din material pe mai multe pahare, un frotiu este colorat cu Gram, celălalt cu Neisser, al treilea este tratat cu fluorocrom - corifosfină pentru microscopie fluorescentă.
Prezența imunității antitoxice este apreciată de reacția Schick - reacția de neutralizare a unei toxine de către o antitoxină. 1/40 DLM de toxină difterice este injectat în pielea antebrațului. Roșeața și umflarea la locul injectării indică absența antitoxinelor în sânge. O reacție negativă de la Chic indică prezența antitoxinelor.
Pentru detectarea accelerată a toxinei difterice, atât în culturile bacteriene, cât și în serul sanguin, se utilizează următoarele: RNGA cu anticorp erythrocyte diagnosticum, RIA și ELISA. Se folosesc metode de cercetare genetică moleculară PCR.
Preparate pentru tratamentul specific al difteriei.
Pentru a neutraliza histotoxina difterică, se utilizează ser concentrat purificat specific anti-difteriei cal, care se obţine prin hiperimunizarea cailor cu antitoxină difterică.
Tratamentul specific cu ser antidifteric se începe imediat dacă se suspectează clinic difterie. Este necesar să se aleagă modul optim de administrare a serului, deoarece antitoxina poate neutraliza doar toxina care nu este asociată cu țesuturile. Pentru a preveni dezvoltarea șocului anafilactic, serul se administrează fracționat conform A.M. Bezredke. Administrarea serului mai târziu de a 3-a zi de boală nu este recomandată.
Proiectat de imunoglobuline umane anti-difterie pentru administrare intravenoasă. Utilizarea sa dă mai puține reacții adverse.
Pentru a suprima proliferarea C. diphteriae la poarta de intrare, trebuie prescrise antibiotice. Medicamentele de elecție sunt penicilina sau eritromicina sau alte β-lactamine și macrolide.
Preparate pentru prevenirea specifică a difteriei.
Pentru a crea imunitate antitoxică activă artificială, folosesc toxoid difteric. Medicamentul purificat și concentrat face parte din vaccinurile asociate:
1. vaccin antipertussis-difterie-tetanos adsorbit (vaccin DTP),
2. toxoid difteric-tetanic adsorbit (ADS-toxoid),
3. toxoid difteric-tetanic adsorbit cu conținut redus de antigen (ADS-M),
4. toxoid difteric adsorbit cu conținut redus de antigen (AD-M).
Imunitatea de bază este creată la copii conform programului de vaccinare. Doar o acoperire de vaccinare de 95% a populației garantează eficacitatea vaccinării.
Examen microbiologic care permite identificarea agentului cauzal al difteriei (C. diphtheriae) în biomaterialul studiat.
Sinonime rusă
Cultura pentru bacilii Loeffler, cultura pentru BL, cultura pentru bacilul difteric.
Sinonime în engleză
Cultura Corynebacterium diphtheriae, cultura Diphtheria.
Metodă de cercetare
Metoda microbiologică.
Ce biomaterial poate fi folosit pentru cercetare?
Tampon pentru gât și nas.
Care este modalitatea corectă de a face cercetare?
Nu necesită pregătire.
Informații generale despre studiu
Corynebacterium diphtheriae (bacilii lui Leffler) sunt bacterii gram-pozitive din genul Corynebacterium care sunt agenții cauzatori ai difteriei și sunt capabili să producă toxină difterică. Boala se transmite prin picături în aer, sursa de infecție sunt persoanele bolnave sau purtătorii de bacterii.
Perioada de incubație este în medie de 2-5 zile. Inflamația fibrinoasă a membranelor mucoase ale orofaringelui și tractului respirator apare cu formarea de pseudomembrane și simptome de intoxicație generală.
La formă toxică Difteria poate afecta, de asemenea, inima și sistemul nervos. În unele cazuri, transportul asimptomatic este posibil.
Diagnosticul de difterie se bazează pe date clinice, se efectuează cultura difteriei pentru confirmare.
La ce se folosește cercetarea?
- Pentru a confirma diagnosticul de difterie.
- Pentru diagnostic diferentiat boli care apar cu simptome similare, cum ar fi amigdalita de diverse origini, abcesul periamigdalian, mononucleoza infectioasa, laringotraheita acuta, epiglotita, astmul bronsic.
- Pentru a evalua eficacitatea terapiei antibacteriene în curs.
Când este programat studiul?
- Dacă se suspectează difterie.
- Când se știe că pacientul a fost în contact cu pacienți cu difterie.
- După terapie antibacteriană– nu mai puțin de 2 săptămâni după terminarea cursului de antibiotice.
- În unele cazuri, înainte de internarea într-un spital (în scop profilactic).
Ce înseamnă rezultatele?
Valori de referinta: nicio creștere.
Identificarea agentului cauzal al difteriei confirmă diagnosticul de difterie sau, dacă nu există simptome ale bolii, indică transportul bacteriei. La rezultat negativ cultură la un pacient cu suspiciune de difterie, diagnosticul poate fi confirmat când persoane de contact Rezultatul culturii este pozitiv, adică agentul cauzal al difteriei este izolat.
Motive pentru un rezultat pozitiv
- Difteria sau transportul asimptomatic al C. diphtheriae.
Motive pentru un rezultat negativ
- Fără difterie. Excepție fac cazurile în care tratamentul cu antibiotice a fost efectuat la momentul studiului.
Ce poate influența rezultatul?
Terapie antibacteriană anterioară.
Notite importante
Diagnosticul de difterie se bazează pe tabloul clinic al bolii, astfel încât tratamentul trebuie început înainte de a obține confirmarea de laborator a bolii. Dacă rezultatul culturii este pozitiv, este necesar să se examineze tulpina izolată de C. diphtheriae pentru toxicitate.
- Cultura florei cu determinarea sensibilității la antibiotice
Cine comandă studiul?
Specialist în boli infecțioase, terapeut, medic practică generală, medic pediatru, ORL.
Literatură
- Macgregor R.R. Corynebacterium diphtheriae. În: Principii și practica bolilor infecțioase / G.L. Mandell, Bennett JE, Dolin R (eds); a 6-a ed. – Churchill Livingstone, Philadelphia, PA 2005. – 2701 p.
- Efstratiou A. Ghid de laborator pentru diagnosticul infecțiilor cauzate de Corynebacterium diphtheriae și C. ulceran / A. Efstratiou, R.C. Georg // Bolile transmisibile și sănătatea publică. – 1999. – Vol. 2, nr 4. – P. 250–257.
- Abordări actuale ale diagnosticului de laborator al difteriei / A. Efstratiou // J. Infect. Dis. – 2000. – Vol. 181 (Supliment 1). – P. S138–S145.
Conținutul articolului
Corynebacterium difterie
Descris pentru prima dată de E. Klebs în 1983 și izolat de F. Leffler în 1984.Morfologie și fiziologie
Corynebacterium diphtheria are o formă caracteristică întregului gen. Ele sunt situate într-un unghi unul față de celălalt sub formă de cinci romane. Boabele de volutină sunt identificate prin colorarea cu albastru de acid acetic prin metoda Neisser, care colorează doar incluziunile fără a afecta citoplasma. Bacilul difteric este inconjurat de o microcapsula si are pili. C. diphtheriae este solicitant când vine vorba de substratul nutritiv. Au nevoie de mulți aminoacizi, carbohidrați, saruri minerale. Ele sunt de obicei cultivate pe ser de sânge coagulat și agar cu sânge telurit de potasiu. Pe acest din urmă mediu se formează colonii de două tipuri: gravis - gri închis la culoare și mitis - culoare neagră, care diferă unele de altele prin caracteristicile biochimice.Antigene
C. diphtheriae conțin un antigen K într-o microcapsulă, care le permite să fie diferențiate în serovare și un antigen de perete celular polizaharid specific grupului, care dă reacții serologice încrucișate cu micobacterii și nocardie. Patogenitate și patogeneză. Factorii de virulență ai bacteriilor difterice sunt pili și microcapsule, cu ajutorul cărora se atașează la celulele epiteliale ale amigdalelor, mai rar laringele, traheea, cavitatea nazală, conjunctiva ochiului și vulva. Apoi are loc colonizarea celulelor epiteliale, care este însoțită de apariție proces inflamator. Toxicitatea este asociată cu secreția de histotoxină, care constă din două subunități: o polipeptidă toxică și o polipeptidă de transport responsabile pentru livrarea componentului toxic către celulele țintă. Formarea primei este controlată de genele bacteriene, a doua de genele fagului care a lizogenizat celula bacteriană. Acest lucru indică faptul că numai celulele lizogenice ale C. diphtheriae pot secreta histotoxina.Fixarea histotoxinei are loc pe receptorii membranelor celulelor musculare ale inimii, parenchimului cardiac, rinichilor, glandelor suprarenale și ganglionilor nervoși. În acest caz, sinteza proteinelor pe ribozomi este blocată, ceea ce duce în cele din urmă la moartea celulelor. Cu difterie, de regulă, nu există bacteriemie și septicemie din cauza localizării C. diphtheriae în celulele laringelui, unde se dezvoltă inflamația fibrinos-necrotică cu formarea de filme, limfadenită și edem, care poate duce la asfixie. Pe lângă difteria laringelui, C. diphtheriae provoacă difteria suprafețelor rănilor și organelor genitale. Corinebacteriile asemănătoare difteriei includ următoarele: C. xerosis provoacă conjunctivită cronică, C. ulcerans - forme ușoare de boli asemănătoare difteriei, C. pyogenes și C. haemolyticum - faringită necrotică ulceroasă, amigdalita, gingivostomatită. C. pseudodyphtheriae este un locuitor permanent al pielii și mucoaselor.Imunitate
Intensitatea imunității post-infecțioase în difterie se datorează nivel inalt antitoxină în serul sanguin. Anticorpii antibacterieni formați în timpul difteriei - aglutinine, precipitine și altele - nu au proprietăți protectoare. Prezența sau absența imunității antitoxice se apreciază prin reacția Schick - neutralizarea unei toxine de către o antitoxină. Când toxina difteric V40 DLM este injectată în pielea antebrațului, apare roșeață și umflare în absența antitoxinei în sânge. În prezența antitoxinei, reacția Schick este negativă.Ecologie și epidemiologie
Habitatul pentru C. diphtheriae este oamenii, în gâtul cărora sunt localizați. Difteria afectează în principal copiii. Cu toate acestea, în ultimii 30 de ani, difteria s-a maturizat. La adulți, difteria este severă și poate fi fatală. ÎN mediu inconjurator Bacteriile difterice rămân viabile câteva zile deoarece tolerează deshidratarea. Infecția are loc prin picături în aer și mai rar prin contact.Difterie
Difterie - acută, în principal la copii boală infecțioasă, care se manifestă prin inflamație fibrinoasă caracteristică la locul de localizare a agentului patogen și intoxicație severă a organismului cu exotoxină difterică. Agentul său cauzator este Corynebacterium diphtheriae, care aparține genului Corynebacterium. Înainte de acest gen, există încă aproximativ 20 de specii de bacterii care sunt patogene pentru oameni, animale și plante. Dintre acestea, cea mai mare importanță este pentru medicina practica au urmatoarele:1. S. ulcerans - poate provoca faringite, leziuni cutanate, este depistat si la oameni sanatosi, in lactate si recipiente pentru transportul acestora, unele tulpini sunt toxigenice.2. S. jeikeium (fost Corynebacterium JK) – provoacă pneumonie, endocardită, peritonită, infectează rănile și pielea.3. C. cistitidis (fost corynebacterium grup D2) - inițiază formarea calculilor în tractului urinarşi pneumonie.4. S. minutissimum – provoacă eritrasmă, abcese pulmonare, endocardită.5. S. haemolyticum - poate provoca amigdalita, celulita, abcese cerebrale, osteomielita, dermatita cronica.6. C. xerosis - a fost considerat anterior agentul cauzal al xerozei (conjunctivita cronica), acum este clasificat ca saprofit.7. C. pseudodiphtheriticum este un saprofit care trăiește pe membrana mucoasă a nazofaringelui uman.Colectarea si livrarea materialului la laborator
Materialul pentru cercetare este un film din amigdale, arcade, palat, uvulă, mucus din faringe și nas, mai rar scurgeri din ochi, ureche, rană, vagin, zona afectată a pielii. La solicitarea medicului epidemiolog se examinează spălări de la jucării și alte obiecte, unele Produse alimentare(lapte, inghetata). Materialul trebuie luat înainte de începerea tratamentului etiotrop pe stomacul gol sau la 2 ore după masă.Pentru a lua materialul se folosesc tampoane uscate sau umezite în prealabil cu o soluție de glicerină 5%, introduse într-o eprubetă și sterilizate cu aceasta. Materialul de testat este prelevat din orofaringe și nas cu două tampoane separate, încercând să-l preia la limita zonei sănătoase și afectate folosind mișcări de rotație, fără a atinge tamponul de membrana mucoasă a obrajilor, dinților și limbii, care este presat cu o spatula. În timpul laringoscopiei, filmul sau mucusul este prelevat direct din laringe. Filmele și mucusul din gură și nas trebuie luate în toate cazurile, chiar și în cazul difteriei cu localizări rare (piele, rană, ochi, ureche, vulvă).Dacă este necesar să se efectueze o bacterioscopie inițială la cererea medicului, materialul se prelevează cu un tampon separat (suplimentar) sau se trimite o parte din proba filmată film, măcinat cu grijă între două lame de sticlă.După colectarea materialului, tampoanele se pun în aceleași eprubete, pe care se indică numărul, data și ora colectării și se scrie numele medicului. Acestea trebuie livrate la laborator nu mai târziu de 3 ore de la preluarea materialului. Dacă schema de prelevare implică prelevarea acestuia la patul pacientului, atunci eprubetele și vasele cu culturi sunt trimise imediat la laborator sau incubate la 37 ° C și livrate după 20-23 de ore, pe vreme rece, în pungi cu perne de încălzire.Examen bacterioscopic
O examinare bacterioscopică a materialului de la un pacient este efectuată numai la cererea medicului și numai pentru a recunoaște angina necrozantă a Simanovsky-Plaut-Vincent (identificarea tijelor în formă de fus și a spirochetelor lui Vincent, care nu cresc cu cultivarea convențională). metode).De mulţi ani examinare microscopica iar identificarea boabelor de volutină, colorate după metodele lui Leffler și Neisser, a stat la baza diagnosticului de laborator al difteriei și a detectării purtării bacteriene. Acum, din cauza variabilității bacteriilor difteriei sub influența antibioticelor, microscopia primară a materialului de testat nu este recomandată.Se efectuează examinarea bacterioscopică pentru identificarea coloniilor atipice pe medii sanguine-telurite și pentru verificarea purității culturilor izolate. Frotiurile sunt colorate cu Gram, Leffler și Neisser. Le puteți picta cu violet de acetat de metil, albastru de toluidină sau coloranți de bentiazol și tiazină.Bacilii difteriei în frotiuri sunt așezați în unghi, sub forma literelor latine V, X, Y, sau formează ciorchini care seamănă cu o grămadă de chibrituri împrăștiate. Boabele de volutină sunt localizate, de regulă, la polii celulelor microbiene. Bacteriile pseudodifterice și difteroizii sunt situate în paralel (sub formă de „gard”) și, desigur, nu au boabe de volutină. Boabele Babesch-Ernst pot fi detectate folosind microscopia cu fluorescență atunci când frotiurile sunt colorate cu corifosfină. Boabele capătă o culoare portocalie-roșu pe fundalul corpurilor celulare bacteriene galben-verzui.Cercetări bacteriologice
Materialul clinic este inoculat pe agar cu sânge și pe agar cu telurit sânge (sau mediu Clauberg II), turnat în vase Petri. Cultura pe agar-sânge este necesară pentru a detecta alte microflore. În plus, unele tulpini de Cdiphtheriae sunt sensibile la acțiunea teluritului de potasiu, astfel încât creșterea lor pe mediul telurit poate fi inhibată. Pentru a detecta transportul bacteriilor difterice, culturile se efectuează numai pe agar telurit de sânge, deoarece inoculul poate conține o cantitate mică de bacili difterici, a căror creștere pe medii neselective va fi suprimată de altă microfloră. În acest caz, este permisă și utilizarea unui mediu de transport.Agar telurin de sânge
La 100 ml de agar nutrient 2%, pH 7,6, topit și răcit la 50 ° C, se adaugă 10-15 ml de sânge defibrinat și 2 ml de soluție de telurit de potasiu 2%. Amestecul se amestecă bine și se toarnă în vase Petri sterile într-un strat de 3-4 mm grosime.Clauberg Miercuri II
La 100 ml de agar nutrient 3% pH 7,6, topit și răcit la 50 ° C, se adaugă 3 ml de soluție de telurit de potasiu 2%, 10 ml amestec de glicerol și 50 ml sânge hemolizat. Se prepară un amestec de glicerină prin adăugarea a 20 ml de glicerină sterilă la 40 ml de sânge defibrinat. Amestecul poate fi păstrat la frigider timp de 4 luni. Pentru a prepara sânge hemolizat („lacuit”), adăugați 16 ml de sânge defibrinat la 34 ml de apă distilată sterilă.Mediu de transport semi-lichid
La 100 ml de Hottinger's digest sau bulion de peptonă de carne se adaugă 1 g de orice agar comercial, se stabilește pH-ul la 7,6, se sterilizează într-o autoclavă la 112 ° C timp de 30 de minute, se adaugă 10 ml ser și 1 ml telurit de potasiu 2% aseptic. . Mediul se toarnă în eprubete de 5 ml. Dacă este posibil, se folosește și un mediu de transport Emes (AMIES) mai complex, modificat de Stewart.Inocularea de la un pacient se efectuează pe o singură placă, folosind jumătate din mediu pentru inocularea din orofaringe (amigdale, arcade, uvulă), iar al doilea pentru inoculare cu un alt tampon din nas. Dacă există material de studiat din piele, ochi, urechi și alte localizări, adăugați o altă ceașcă. Nu puteți semăna material de la mai mulți pacienți pe o singură farfurie. Înainte de inoculare, mediul este încălzit într-un termostat timp de 15-20 de minute. Când inoculați materialul de testat, frecați-l cu un tampon mai întâi într-o secțiune separată de agar cu sânge cu o suprafață de 2x1 cm, apoi în mod similar pe agar cu telurit sânge. (sau mediu Clauberg II), în timp ce tamponul este întoarse constant pentru a inocula tot materialul care provine din acesta. Apoi, cu același tampon, suprafețele rămase ale mediului (o jumătate de cană) sunt inoculate cu dungi. Această tehnică de placare produce colonii izolate (cultură pură), care sunt utilizate direct din placă pentru a determina toxigenitatea și identificarea ulterioară. Vasele sau tuburile inoculate cu mediu de transport sunt incubate într-un termostat la 37 ° C timp de 20-24 ore.În a doua zi, natura coloniilor este examinată cu ajutorul unui microscop stereoscopic. Dacă nu există nicio creștere pe ambele medii, materialul este reeșantionat.Vasele cu colonii tipice și suspecte pentru C.diphtheriae sunt selectate pentru identificarea ulterioară a culturii folosind toate testele. Nu este necesar să se efectueze microscopia coloniilor suspecte Coloniile de bacili difteriei pe agar-sânge sunt albicioase sau culoare gălbuie, opac, rotund, ușor convex, 1-2 mm în diametru. Au de obicei o consistență uleioasă, deși unele pot forma colonii R fragile, dure. culoare gri , convex, cu marginea netedă, vâscos. După 48 de ore, ele capătă o culoare gri închis sau negru cu strălucire metalică, margini egale sau ușor festonate, netede sau cu suprafața dungi radial (forma R), vâscoasă sau fragilă la atingere cu o buclă.După structura de Colonii de 48 de ore pe medii de telurit și Unele caracteristici enzimatice ale agentului cauzal al difteriei disting patru variante culturale și biochimice (biovaruri) - gravis, mitis, belfanti, intermedius.Biovar gravis formează de obicei colonii uscate gri sau negre mat, fragile, plate, neted, de 1,5-2 mm in diametru, cu dungi radiale la suprafata, este foarte toxic, nu produce hemoliza, descompune amidonul si glicogenul.Biovarurile mitis si belfanti cresc sub forma de colonii netede si convexe gri sau negre, rotunde, cu margini netede, 1-1,5 mm în diametru, aceste opțiuni sunt mai puțin toxice, provoacă hemoliză, dar nu descompun amidonul și glicogenul.Biovar intermedius formează colonii mici, cenușii, transparente, cu un diametru de 0,5-1 mm, cu un strat plat, neted. de suprafață, este ușor toxic, nu descompune amidonul și glicogenul.Dacă nu există o creștere tipică, frotiurile sunt preparate din alte colonii îndoielnice. Dacă în ei se găsesc bacili spori, coci, drojdii etc., studiile pentru difterie sunt oprite și dau un răspuns negativ. Cu toate acestea, este important de reținut că bacteriile difterice care au format colonii atipice pe medii cu inhibitori de creștere (telurit de potasiu) pot fi scurtate, îngroșate, dar păstrează polimorfismul și locația caracteristică.Când coloniile tipice cresc, încep imediat să-și studieze toxigenitatea și Identificare. Proprietățile toxice sunt examinate în cel puțin 2 colonii izolate prin însămânțarea unei jumătăți din fiecare colonie pe un mediu pentru a determina toxicitatea și nearse cu o ansă pe mediu Pisa, iar a doua jumătate pe un agar seric înclinat pentru a izola o cultură pură și a o conserva până când sfârşitul diagnosticului de laborator. Dacă soiurile toxigenice și netoxigenice de C. diphtheriae cresc simultan pe o placă, este necesar să se examineze proprietățile toxigenice a aproximativ 20 de colonii în cazul creșterii multiple a coloniilor suspecte, însămânțarea materialului din 5-6 colonii într-o singură placă. Cand creste o singura colonie, aceasta este inoculata pe un mediu pentru a determina toxicitatea si, calcinand ansa, intr-o eprubeta cu mediu Pisu.Daca s-a folosit un mediu de transport, mediul suspendat este transformat in mediu dens de sange-telurit. a treia zi, când apar linii de precipitare specifice într-un gel de agar și un test de cistinază pozitiv, cultura izolată este determinată a fi toxigenă C. difterie. Dacă nu există linii de precipitații după 24 de ore, vasele sunt incubate încă o zi. În cazul unui test Pisa negativ, cultura este identificată ca o specie de corinebacterii.O cultură pură pe un agar din zer înclinat este însămânțată pe medii de hidrocarburi cu glucoză, zaharoză, amidon solubil și se prelevează probe pentru a detecta ureaza, pirazinamidaza și nitrat reductază.În a patra zi se înregistrează rezultatele tuturor culturilor și se dă un raport motivat.concluzie bacteriologică despre cultura izolată.Se folosesc următoarele metode de identificare a corinebacteriilor.Determinarea toxicității in vitro
Se bazează pe interacțiunea toxinei cu antitoxina într-un gel de agar. În locurile optime raportul cantitativ Toxina și antitoxina precipită în grosimea agarului sub formă de linii subțiri și albe („săgeți”, „antene”). Acest test se numește testul Elek în multe țări din străinătate.Testul de toxicitate se efectuează de obicei cu culturi pure. Se poate determina și cu culturi contaminate cu microfloră străină, ceea ce accelerează diagnosticul de laborator al difteriei pe zi. Dar dacă testul este negativ, se repetă cu o cultură pură izolată.Pentru efectuarea acestui test, industria microbiologică produce un mediu standard uscat special pentru determinarea toxigenității microbilor difterici (DTDM) și discuri standard de hârtie, înmuiate în antitoxice anti- ser difteric și uscat.Discuri de hârtie se pun pe suprafața mediului DTDM proaspăt preparat cu antitoxină (nu mai mult de patru la cană). La o distanță de 0,5 cm de disc, culturile sunt semănate în jurul acestuia sub formă de „plăci” cu diametrul de 7-8 mm, alternând „plăci” ale culturii studiate și ale tulpinii martor.Rezultatele sunt luate în considerare. dupa 18-24 si 48 de ani. Criteriul de specificitate a precipitatelor este fuziunea liniilor de precipitare ale culturii studiate cu liniile tulpinii toxigene. În acest caz, cultura izolată este considerată toxigenă.În absența discurilor standard de hârtie se pot folosi benzi de hârtie de filtru înmuiate în antitoxină difterică. se fac direct in laborator. Benzile de hârtie tăiate la dimensiunile specificate și sterilizate într-o autoclavă la 121 ° C timp de 30 de minute sunt umezite cu 0,25 ml de antitoxină difterică purificată, care conține 500 UI per ml. În acest caz, aplicați o fâșie de hârtie umezită cu antitoxină pe ceașcă cu mediul adecvat și uscați-o deschizând ceașca timp de 15-20 de minute într-un termostat și răsturnând-o cu susul în jos. După aceasta, culturile de „plăci” sunt inoculate pe ambele părți ale benzilor, alternând tulpinile de testare și de control. Pentru a determina toxigenitatea agentului patogen difteric, puteți utiliza și alte medii (AGV, agar cu focar deschis etc.), rețetele pentru care sunt date în „Instrucțiunile pentru diagnosticul bacteriologic al difteriei”, Kiev (1999). Timp de mulți ani, toxigenitatea bacteriilor difteriei a fost determinată prin injectarea subcutanată sau intradermică a unei culturi în doi cobai, dintre care unul. a fost injectat cu 100-1000 UI de ser antidifteric antitoxic cu o zi înainte. Acum această metodă laboratoare bacteriologice practic aproape niciodată utilizat din cauza costului ridicat și a întârzierii semnificative de răspuns.B În ultima vreme a dezvoltat o metodă foarte sensibilă și foarte specifică pentru determinarea genei toxinei difterice prin polimerizare reacție în lanț. Se bazează pe determinarea regiunii ADN a C. diphtheriae unde gena toxinei difterice este localizată folosind primeri specifici. Metoda are avantaje față de determinarea tradițională a toxicității: sensibilitate ridicată, rezultate rapide (4-6 ore), și nu necesită izolarea unei culturi pure. Dar necesită echipament special, reactivi scumpi și spații adecvate și, prin urmare, poate fi efectuat numai într-un laborator specializat. Toate tulpinile netoxigenice de bacterii difteriei izolate de la pacienți și purtători de bacterii trebuie trimise la Centrul Ucrainean de Supraveghere Sanitară și Epidemiologică de Stat (unde există un astfel de laborator) pentru determinarea finală a proprietăților toxigenice ale C. diphtheriae.Determinarea cistinazei (testul Pizou)
C. diphtheriae, C. ulcerans secretă enzima cistinază, bacteriile pseudodifterice și alte difteroizi o produc.Cultura izolată se inoculează într-un mediu cu cistină, se toarnă în coloană în eprubete înguste. Bacteriile pozitive pentru cistinază descompun cistina cu eliberarea de hidrogen sulfurat, care, cu acetat de plumb inclus în mediu, formează sulfat de plumb, în urma căruia mediul devine maro închis. S. diphtheriae nu numai că provoacă o întunecare a mediului în urma cursului injectării, dar formează și un „nor” în jurul acestuia. maro inchis la o distanta de 1 cm de suprafata. Rezultatele sunt luate în considerare după 20-24 de ore de incubare într-un termostat.Determinarea ureazei (testul Sachse)
Bacteriile difterice nu produc această enzimă. Doar alte câteva tipuri de corinebacterii dau un test pozitiv pentru ureaza. Pentru efectuarea testului, cultura izolată se seamănă în bulion cu uree. Uraza descompune ureea, modifică pH-ul mediului, însoțită de roșeața acesteia. Dacă enzima nu este eliberată, culoarea bulionului nu se schimbă.Determinarea pirazinamidazei
Determinarea pirazinamidazei se efectuează prin hidroliza pirazinamidei în acid pirazinoic și amoniu. Pentru a face acest lucru, turnați 0,25 ml de apă distilată sterilă într-o eprubetă sterilă, în care se prepară o suspensie groasă a culturii izolate, apoi adăugați o tabletă de diagnostic Rosko 598-21. Se incubează timp de 4 ore la 37 ° C, după care se adaugă o picătură de 5% proaspăt preparat soluție apoasă sulfat feros de amoniu. În prezența enzimei, suspensia devine roșie sau portocalie. Corinebacteriile patogene nu secretă pirazinamidază și, prin urmare, nu schimbă culoarea suspensiei.Enzime zaharolitice
Enzimele zaharolitice sunt determinate prin însămânțarea unei bucle complete a culturii izolate în fiecare tub din seria Hiss pestriță scurtată (glucoză, zaharoză, amidon solubil). Rezultatele sunt luate în considerare după 24 de ore de incubare într-un termostat. Descompunerea amidonului poate fi amânată cu până la 48 de ore.Determinarea nitrat reductazei
Determinarea nitrat reductazei este un test suplimentar pentru identificarea C. belfanti și C. ulcerans, care nu produc această enzimă. Cultura de testat se inoculează într-o eprubetă cu bulion la care se adaugă 0,1% KN03 și se incubează într-un termostat timp de 24 de ore. Control obligatoriu cu mediu neinoculat. În cazul prezenței nitrat-reductazei, atunci când în bulionul inoculat se adaugă 3 picături de reactiv Kasatkin, apare o culoare roșie. Mediul din tubul de control nu își schimbă culoarea.Pentru identificarea corinebacteriilor, au fost utilizate recent discuri indicatoare de hârtie cu glucoză, zaharoză, uree și amidon din setul „B” pentru identificarea enterobacteriilor (compania ImBio, Nizhny Novgorod). Se prepară o suspensie groasă a culturii de testat în 4 eprubete și se scufundă în fiecare dintre ele un disc cu carbohidratul sau alt reactiv corespunzător. După incubare într-un termostat, se înregistrează eliberarea de urază după 40-120 de minute, iar activitatea zaharolitică se determină după 5-24 ore. În prezența ureazei, discul alb cu uree devine roz-puriu; în absență, rămâne alb. Discurile cu glucoză și zaharoză, în prezența enzimelor adecvate, își schimbă culoarea de la roșu la galben după 5-6 ore. La determinarea amilazei, se adaugă un disc indicator cu iod într-o eprubetă cu substratul corespunzător. Dacă nu există enzimă, apare o culoare albastru închis; dacă există, culoarea soluției rămâne neschimbată.Prevenție și tratament specific
Prevenirea vaccinală a difteriei se realizează prin administrarea de toxoid difteric obținut prin tratarea toxinei difterice cu formaldehidă. La noi in tara se foloseste pentru vaccinare DPT - vaccin antipertussis-difterie-tetanos adsorbit. Ser antitoxic folosit pentru terapie specifică, și antibiotice - pentru igienizarea purtătorilor de bacterii. Antibioticele includ penicilina, vancomicina, eritromicina etc.Corynebacterium diphtheriae a fost descoperit și apoi izolat în cultură pură acum 100 de ani. Semnificația sa etiologică finală în apariția difteriei a fost confirmată câțiva ani mai târziu, când s-a obținut o toxină specifică care a provocat moartea animalelor cu fenomene similare celor observate la pacienții cu difterie. Corynebacterium diphtheriae aparține genului Corynebacterium, un grup de bacterii corynephroma. Corynebacterium diphtheriae sunt tije drepte sau ușor curbate cu capete lărgite sau ascuțite. Împărțirea în fractură și despicare oferă un aranjament caracteristic sub forma unui număr roman V sau a degetelor întinse, dar bastoanele localizate individual se găsesc adesea în lovituri. Acumulări mari ale acestora, care apar în frotiurile preparate din mucusul gâtului, nasului și scurgerii rănilor, au un caracter de simțit. Lungimea medie a tijelor lor este de 1-8 microni, lățimea - 0,3/0,8 microni. Sunt imobili și nu formează spori sau capsule. Corynebacterium diphtheriae este un anaerob facultativ. Bacilii difteriei sunt rezistenți la uscare. La o temperatură de 60 °C în culturi pure, acestea sunt distruse în 45-60 de minute. În produsele patologice, adică în prezența protecției proteice, acestea pot rămâne viabile timp de o oră la o temperatură de 90 ° C. Temperaturile scăzute nu au un efect dăunător asupra bacililor difterici. ÎN dezinfectante La concentrații normale mor rapid.
Este de remarcat polimorfismul extrem de mare al bacililor difterici, manifestat prin modificări ale grosimii și formei acestora (umflate, în formă de balon, segmentate, filamentoase, ramificate).În îngroșările terminale, iar uneori în partea centrală, după 12 ore. de crestere a culturii, boabele Babesh se gasesc cu coloratii speciale Ernst, care sunt acumulari de volutina. Există dovezi că volutina este un polifosfat anorganic cu lanț lung. M.A. Peshkov sugerează natura lor metafosfat. A. A. Imshanetsky crede că volutina este un produs secundar al proceselor metabolice. Se știe că fosforul este necesar pentru formarea boabelor. Există, de asemenea, presupuneri cu privire la nevoia de mangan și zinc pentru acest proces.
Boabele de volutină se găsesc în culturi vechi de o zi, iar apoi numărul bacteriilor cu prezența boabelor scade.Citoplasma conține și nucleotide, membrane intracitoplasmatice - lizozomi, vacuole.
Bacteriile sunt colorate cu toți coloranții de anilină. Când sunt colorate folosind metoda Gram, acestea sunt pozitive. Metoda Neisser este folosită pentru colorarea boabelor de volutină. Când sunt colorate cu această metodă, boabele de volutină, care au o mare afinitate pentru albastrul de metilen, sunt colorate în mod persistent Culoarea albastră, iar din corpul bacteriei, cu colorare suplimentară cu crisoidină sau bismarckbraun, albastrul de metilen este deplasat.
Agentul cauzal al difteriei este un heterotrof, adică aparține grupului de bacterii care necesită creșterea lor. materie organică. Mediile folosite pentru cultivare trebuie să conțină aminoacizi ca sursă de carbon și azot - alanină, cistină, metionină, valină etc. În acest sens, mediile elective pentru cultivare sunt cele care conțin proteine animale: sânge, ser, lichid ascitic. Pe baza acestui fapt, a fost creat mediul clasic Leffler, apoi mediile Clauberg, Tyndall și de acumulare.
Pe mediul lui Leffler, coloniile de bacil difteric au o suprafață lucioasă, umedă, margini netede și o culoare gălbuie. După câteva zile de creștere, apar striații radiale ale coloniilor și linii concentrice slab definite. Diametrul coloniilor ajunge la 4 mm. Primele semne de creștere apar după 6 ore într-un termostat la 36-38 °C. Creșterea este clar vizibilă la 18 ore după însămânțare. Valoare optimă pH-ul pentru creșterea bacilului difteric este 7,6. Corynebacterium diphtheria este adesea dificil de distins de alte specii de corynebacterium. Pentru determinarea speciei se folosește un complex de caracteristici culturale și biochimice.
Tipul de Corynebacterium diphtheria este, de asemenea, eterogen; este împărțit în 3 tipuri culturale și biochimice gravis, mitis, intermedins, în două soiuri - toxigenic și netoxigenic, o serie de tipuri serologice și fagotipuri.
În prezent, în majoritatea teritoriilor circulă două tipuri cultural-biochimice - gravis și mitis. Tipul de intermedin, care înainte se distingea destul de larg, a fost recent găsit rar. Cea mai clară diferențiere a tipurilor se poate face prin forma coloniilor atunci când cultura este crescută pe agar sânge cu adaos de telurit. Coloniile de tip gravis ajung la 1-2 mm în diametru după 48-72 de ore, au marginile ondulate, striații radiale și un centru plat. Aspectul lor este de obicei comparat cu o floare de margaretă. Coloniile sunt mate datorită capacității bacteriei de a reduce teluritul, care apoi se combină cu hidrogenul sulfurat rezultat, de culoare gri-negru. Când cresc în bulion, culturile de tip gravis formează o peliculă care se prăbușește la suprafață. Când sunt semănate pe mediul Hiss cu adăugarea de zer, ele descompun polizaharidele - amidon, dextrină, glicogen cu formarea de acid.
Culturile de tip mitis pe agar cu sânge telurit cresc sub formă de colonii rotunde, ușor convexe, cu margini netede, de culoare neagră mat. Când sunt cultivate în bulion, produc turbiditate și sedimente uniforme. Nu descompun amidonul, dextrina și glicogenul.
În frotiuri, tijele de tip gravis sunt adesea scurte, iar tipul mitis este mai subțire și mai lung.
Un studiu comparativ cu microscopul electronic al bacililor difteriei de diferite tipuri biochimice a arătat prezența unei structuri cu trei straturi în tipurile gravis și mitis. membrana celulara. Coaja de tip intermedin este cu două straturi și de aproape 3 ori mai groasă. Între citoplasmă și membrană există spații umplute cu boabe, care pot fi legate de exotoxină. Sunt vizibile striațiile oblice ale bacteriilor, care sunt create de pereții despărțitori dintre celulele fiice. Aparatul cromozomial, la tipurile gravis si mitis, este reprezentat de boabe obisnuite cu vacuole; la tipul intermedin, este distribuit in toata citoplasma. Un microscop electronic dezvăluie o membrană multistratificată, a cărei prezență explică de ce bacilii difteriei sunt uneori gram-negativi.
Coloniile de bacterii difterice vin în forme S-, R- și SR, acestea din urmă fiind considerate intermediare. N. Morton crede că coloniile de forme S sunt caracteristice tipului mitis, iar formele SR - de tip gravis. Pe lângă aceste forme principale, există colonii mucoide - forme M, colonii pitice - forme D și colonii gonidiale - forme L. Toate acestea sunt considerate forme de variabilitate disociativă.
Bacteriile difterice trebuie distinse de difteroizi și bacilul pseudodifteric.
Un număr mare de studii sunt dedicate variabilității bacilului difteric. Posibilitatea de apariție forme atipiceîn condiţii de laborator a fost confirmată prin studii epidemiologice.
Variabilitatea biochimică, morfologică, fizico-chimică a bacteriilor difteriei, recunoscută de un număr mare de cercetători, complică în unele cazuri diagnosticul bacteriologic și obligă la un studiu cuprinzător al culturilor.
Am împărțit toate culturile izolate în diferite condiții epidemiologice în 8 grupe; au inclus toate variantele morfologice posibile ale reprezentanților corynebacterium de interes pentru noi:
Grupa 1 - tije scurte, de aproximativ 2 microni, fara boabe;
Grupa a 2-a - tije scurte, de aproximativ 2 microni, dar ocazional cu boabe;
Grupa a 3-a - tije de dimensiuni medii, 3-6 microni lungime, 0,3-0,8 microni latime, fara granularitate caracteristica;
Grupa a 4-a - tije de dimensiuni medii, lungi de 3-7 microni, late de 0,3-0,8 microni, usor curbate, ocazional cu boabe;
Grupa a 5-a - tije de dimensiuni medii, lungi de 3-6 microni, latime de 0,3-0,8 microni, usor curbate, granulare;
Grupa a 6-a - tije lungi, 6-8 microni lungime, 0,3-0,6 microni latime, usor curbate, ocazional cu boabe;
Grupa a 7-a - tije lungi, 6-8 microni lungime, 0,3-0,8 microni latime, de obicei curbate, fara boabe;
Grupa 8 - tije scurte, aspre, lungi de aproximativ 2 microni, late de aproximativ 1 microni, fara boabe.
Localizarea tijelor nu a fost luată în considerare la repartizarea lor pe grupuri, dar de obicei aranjamentul caracteristic corespundea morfologiei.
În grupele 1, 2, 3 și 8, care corespundeau ca morfologie bastonașelor lui Hoffmann, aranjarea a fost grupată, paralelă sau sub formă de indivizi unici, în grupele 4, 5 și 6, care corespundeau în principal ca morfologie difteriei adevărate. bacterii, tije situate în unghi sau sub formă de indivizi singuri. În grupa 7, tijele au fost mai des aranjate aleatoriu, împletindu-se între ele. În al 8-lea grup, tijele au fost localizate sub formă de indivizi singuri.
Din cele 428 de culturi studiate, 111, pe baza totalității caracteristicilor lor, ar fi trebuit clasificate drept difterie adevărată, 209 au fost culturi de bacili Hoffmann, iar 108 au constituit un grup de culturi atipice. În culturile apropiate de difterie, atipicitatea s-a manifestat prin scăderea activității biochimice, uneori în descompunerea ureei; în culturile care sunt morfologic apropiate de bastonașele lui Hoffmann, ele păstrează un test de cisteină pozitiv și capacitatea de a descompune unul dintre zaharuri.
Din cele 111 culturi de difterie, 81 de culturi (73%) au fost tipice din punct de vedere morfologic, 28 de culturi (27%) au avut morfologia bastonașelor Hoffmann. Din cele 111 culturi de difterie, au existat 20 de culturi de tip gravis, iar dintre acestea doar 9 au fost repartizate grupelor morfologice I și II.
Culturile care au fost clasificate pe baza unei combinații de caracteristici ca culturi de bacil Hoffmann au avut morfologia culturilor tipice de difterie în 20% din cazuri.
25% dintre tulpinile studiate au fost clasificate ca culturi atipice; morfologia lor corespunde atât bacililor difteriei, cât și bacililor Hoffmann.
Astfel, biochimice și proprietăți morfologice culturile nu coincid întotdeauna, iar atipicitatea biochimică, precum și morfologică, se observă mai des în culturile izolate într-o perioadă de incidență scăzută și, prin urmare, o scădere a nivelului de transport.
Este necesar de remarcat scăderea generală a activității biochimice a culturilor în ultimii 10-15 ani. Un indicator al acestui lucru este fermentația întârziată a zaharurilor, care apare uneori în ziua a 5-6-a, precum și activitatea biochimică diferită a coloniilor aceleiași culturi.
Identificarea biochimică a culturilor pure izolate în diferite condiții epidemiologice arată că, deși morfologia și proprietățile biochimice adesea nu coincid, principiul general de distribuție a culturilor, stabilit în funcție de datele morfologice, nu se modifică. Atât la distribuirea culturilor în funcție de datele morfologice și biochimice, cât și la identificarea lor completă cu includerea reacții serologice principiul de distribuție rămâne același: culturile atipice sunt mai frecvente în perioadele de prosperitate epidemică, bacilii Hoffmann sunt detectați mai des în perioadele de probleme epidemice și sunt semănați mai mult decât adevărata difterie.
Studiul proprietăților toxigenice ale culturilor izolate pe medii nutritive solide a arătat că și în perioada de prosperitate epidemică există un număr suficient de purtători de bacili difterici toxigeni. Trebuie remarcat faptul că proprietățile toxigenice nu pot fi întotdeauna detectate chiar și în culturile izolate de la pacienți. Aceasta indică necesitatea îmbunătățirii metodelor aplicate pentru determinarea toxicității culturilor.
Rezultatele reacției de aglutinare a culturilor atipice izolate în diferite condiții epidemiologice au arătat prezența acelorași modele pentru proprietățile serologice pe care le-am remarcat atunci când am studiat morfologia și biochimia culturilor. Atipicitatea culturilor izolate într-o zonă prosperă, conform datelor serologice, a fost mai profundă decât în zonele defavorizate. Astfel, într-o zonă prosperă, 26% din culturile atipice au dat o reacție de aglutinare pozitivă, în zonele nefavorabile - 19%.
Una dintre principalele proprietăți ale bacilului difteric este capacitatea de a forma toxine. Toxinogeneza Corynebacterium diphtheria este determinată de gena conținută în profag; prin urmare, principalul mijloc de agresiune - formarea toxinelor - nu este asociat cu cromozomul bacterian.
Toxina difterică este o proteină cu o greutate moleculară de 6200 daltoni. Puterea toxinei este determinată prin efectuarea de teste intradermice pentru prezența efectelor necrotice și efectul asupra animalelor sensibile ( efect letal). Puterea toxinei se măsoară utilizând doza minimă letală, care este cea mai mică cantitate de toxină care poate provoca moartea unui cobai cu greutatea de 250 g în a 4-5-a zi când este administrată intraperitoneal. Toxina are proprietăți antigenice care se păstrează atunci când este tratată cu formaldehidă, care îi îndepărtează proprietățile toxice. Acest lucru a făcut posibilă utilizarea acestuia pentru prepararea unui medicament profilactic.
Molecula de toxină este formată din două fragmente, dintre care unul este termostabil și are activitate enzimatică, iar al doilea este termolabil și îndeplinește o funcție de protecție. S-a dovedit sinteza intracelulară a toxinei cu eliberarea acesteia prin tubulii peretelui celular. Sinteza toxinei are loc atunci când microbul este crescut într-un mediu lichid - bulion de carne-peptonă cu adaos de glucoză, maltoză și factori de creștere la pH 7,8-8,0.
Conform datelor recente, toxina difterice este un produs de origine virală. Ca confirmare, I. V. Chistyakova propune capacitatea corinebacteriilor netoxigenice de a se transforma în cele toxigenice sub influența fagului. Posibilitatea transformării culturilor netoxigenice în culturi toxice a fost confirmată în experimente pe culturi unicelulare. Fenomenul descris se numește conversie lizogenă. Folosind virusuri temperate obținute din tulpini toxigenice de gravis, a fost posibilă transformarea variantei netoxigene a Corynebacterium diphtheria gravis într-una toxigenă.
E.V. Bakulina, M.D. Krylova a sugerat că conversia focală poate fi importantă în procesul epidemiei. În acest sens, a fost început un studiu al rolului său în formarea tulpinilor toxice de Corynebacterium diphtheria în natură. Posibilitatea conversiei toxigenității a fost demonstrată nu numai în sistemele fago-bacterii, ci și în conditii naturale. Dar în rândul culturilor locale, acest proces, potrivit unui număr de cercetători, este departe de a fi comun. Motivele pentru aceasta sunt probabil lipsa producătorilor de fagi temperați, sensibilitatea fagilor tulpinilor locale este diferită de tulpinile de referință și, prin urmare, nu pot fi receptori de fagi de conversie cu un spectru de acțiune cunoscut.
Numai într-o parte a populației microbiene a fost posibilă convertirea proprietăților toxigenice ale bacililor difteriei sub influența fagilor stafilococici și streptococici. În lucrările recente, problema conversiei fagilor în procesul epidemic primește o evaluare și mai restrânsă. Se crede că corinefagii tox+ nu joacă un rol în procesul epidemic al difteriei. rol independent. Purtătorii de bacili netoxigeni pot fi infectați cu fagul tox+ numai împreună cu o tulpină toxigenă, iar fagii stafilococici nu sunt capabili să transforme corinebacteriile netoxigenice. Pentru a efectua conversia în direcția toxicității în corpul uman, este aparent necesar să existe un contact strâns între un purtător care are un fag de conversie și un purtător care secretă o tulpină care este lizosensibilă la acest fag. În plus față de capacitatea de a forma toxine, bacteria difteriei are factori de patogenitate precum hialuronidază, neuraminidază, dezoxiribonuclează, catalază, esterază și peroxidază. Studiul produselor metabolice extracelulare nu a evidențiat diferențe între corinebacterii difteriei toxigenice și non-toxigenice.
În prezent, pentru tiparea intraspecifică a Corynebacterium diphtheria, pe lângă metoda biochimică descrisă mai sus, pot fi utilizate metode serologice și fagice.
Prezența tipurilor serologice se datorează antigenelor specifice tipului, termostabile, de suprafață și termolabile.
Există o serie de scheme de tipizare serologică. În țara noastră, folosim schema propusă de V. S. Suslova și M. V. Pelevina, dar nu poate oferi clasificarea tuturor tulpinilor netoxigenice. Numărul de tipuri serologice este în creștere. I. Ewing a stabilit prezența a 4 tipuri serologice - A, B, C și D; D. Robinson și A. Peeney 5 tipuri - I, II, III, IV și V. L. P. Delyagina au identificat încă 2 tipuri serologice. Se crede că numărul de tipuri serologice este mult mai mare, în principal din cauza tipului mitis. Din puținele date disponibile din literatură privind modelele în izolarea unuia sau altuia serotip când diferite forme procesul infecţios şi diferitele condiţii epidemiologice nu au fost stabilite. Alături de datele privind agresivitatea diferită a culturilor aparținând diferitelor tipuri serologice, există rapoarte care resping legătura dintre tipul serologic și patogenitatea culturilor.
Este caracteristic că diferite tipuri serologice apar în zone diferite. Tiparea serologică poate fi utilizată pentru analiza epidemiologică.
În condiții de morbiditate sporadică, număr limitat de purtători, când căutarea sursei de infecție este mult mai dificilă, metoda de tipărire a fagilor devine importantă, făcând posibilă subdivizarea corinebacteriilor în variante serologice și culturale. Marcarea poate fi efectuată în funcție de proprietățile fagilor izolați dintr-o cultură și în funcție de sensibilitatea culturii la bacteriofagi specifici. Schema cea mai utilizată este cea propusă de R. Saragea şi A. Maximesco. Vă permite să etichetați tulpinile toxigenice și non-toxigenice din toate variantele culturale. Cu ajutorul a 22 de fagi tipici, culturile pot fi împărțite în 3 grupe, în care sunt combinate 21 de variante de fagi: Grupa I - tulpini toxigenice și netoxigenice de tip mitis (variante fagice I, la, II, III); al 2-lea - tulpini toxigenice și netoxigenice de tip intermedin și gravis netoxigeni (variante fagice IV, V, VI, VII); 13 variante de fagi (de la VIII la XIX) au fost incluse în al treilea grup, care a unit tulpinile toxigenice gravis.
Schema a fost testată pe un număr mare de tulpini izolate în România și obținute din muzee din 14 țări. Tiparea fagilor a fost pozitivă în 62% dintre tulpini; tulpinile de tip gravis au fost etichetate cu succes în special. Dintre acestea din urmă, apartenența uneia dintre variantele fagice a fost stabilită în proporție de 93%. Reacțiile specifice cu fagi tipici la tulpinile toxigenice de tip gravis conform schemei acestor autori se bazează pe infectarea tulpinilor cu diverși virusuri.
În țara noastră, cercetările în domeniul tipării fagilor au fost efectuate de M. D. Krylova. Autorul a dezvoltat o schemă de marcare a fagilor bazată pe principiul propus de Williams și Rippon pentru tiparea stafilococilor plasmocoagulant: varianta de fag a fost desemnată prin numele tipului de fag care l-a lizat într-o diluție de testare. Fagii și variantele de fagi din schema lui M.D. Krylova sunt desemnate prin litere ale alfabetului latin: majuscule - fagi care dau liză confluentă și semi-confluentă, minuscule - liză sub formă de plăci. Pe baza acesteia, s-au dezvoltat o schemă de tipizare fagică modificată pentru corinebacteriile netoxigenice ale variantei gravis și o schemă de tipizare fagică pentru corinebacteriile toxigenice ale variantei gravis.
