Reacții serologice. Reacția de precipitare

Acest articol se va concentra pe fenomenul reacției de precipitare. Aici ne vom uita la trăsăturile acestui fenomen, fenomenul de difuzie, caracteristicile generale, rolul în viața umană și multe altele.

Introducere în fenomen

Precipitația este un fenomen de tip serologic, în timpul căruia antigenele solubile interacționează cu anticorpii și, ca urmare, se formează un precipitat.
Caracteristica generală a reacției de precipitare este o formă de influență concertată a antigenului și a anticorpului. Aceste tipuri de interacțiuni fac posibilă determinarea prezenței antigenelor necunoscute în substanța de testat prin adăugarea de anticorpi și antigeni cunoscuți. Procesul de precipitare fără prezența sărurilor va continua mai rău, iar cel mai bun optim se află în intervalul 7,0-7,4 pH.

Componentele unei reacții

Dintre componentele reacției de precipitare se disting trei elemente principale:

1. Un antigen de natură moleculară. Este într-o stare fin divizată, cu alte cuvinte, este solubilă. Și, de asemenea, un astfel de antigen se numește precipitogen, care este un lizat sau extract de țesut etc. Precipitogenul are o diferență caracteristică față de un aglutinogen, care constă în dimensiunea particulelor din care constă. Aglutinogenul are o dimensiune celulară inerentă, în timp ce precipitații sunt proporționali cu dimensiunea moleculei. Soluția de antigen se caracterizează prin transparență.
2. Un anticorp găsit în serul de sânge uman, precum și în serul de diagnostic imun, care conține anticorpii studiați.
3. Electroliții sunt o soluție de clorură de sodiu, care se caracterizează printr-o stare izotonă.

Obținerea precipitatogenului

Reacția de precipitare este imposibilă fără precipitatogen, care se obține prin măcinarea materialelor și extragerea antigenelor proteice din acestea. Extracția are loc prin fierbere sau prin alte metode.
Un exemplu izbitor de precipitatogeni sunt lizatele, precum și extractele de țesuturi și organe, serul de sânge, diferite tipuri de filtrate pe bază de culturi de microbi în bulion, precum și extractele saline de microorganisme și substanțe autolizate.

Stadializarea în precipitații

Acum să ne uităm la metoda de stabilire a reacției de precipitare.
Se efectuează o reacție de precipitare inelă, care are loc în eprubete special pregătite. Serul este introdus în cavitatea vasului, turnându-l de-a lungul peretelui folosind nasul unei pipete. Apoi, cantitatea adecvată de precipitatogen este stratificată cu grijă deasupra, iar apoi eprubeta este adusă într-o poziție verticală de la una orizontală. Stabilirea și luarea în considerare a reacției de precipitare este o operație foarte scrupuloasă. Rezultatul este luat în considerare după apariția unui inel alb la granița dintre antigen și anticorp. Dacă elementele de reacție ale reacției corespund între ele, atunci ele comunică, dar acest lucru devine vizibil după o perioadă lungă de timp a interacțiunii lor.
Reacția de precipitare se realizează și într-o cutie Petri sau pe o lamă de sticlă, unde se transferă gelul de agar, aplicându-l într-un strat mic. După ce se întărește, un număr mic de godeuri sunt tăiate în gel în care vor fi plasați antigenele și anticorpii. Există două modalități de a efectua această acțiune: metoda imunodifuziei radiale și imunodifuziei duble.

Informații generale

Mecanica de precipitare este similară cu dispozitivul de aglutinare. Când este expus influenței serului de tip imun, antigenul, care a reacționat deja, își reduce.O condiție importantă este transparența atât a serului, cât și a antigenului.
Înregistrarea unei reacții poate fi îmbunătățită prin stratificarea antigenelor pe anticorpi. Ca urmare, se poate observa apariția precipitatelor în formă de inel. Acest fenomen se numește precipitare inelară și se realizează în tuburi speciale cu un diametru de 2,5 până la 3,5 mm. Unul dintre cele mai răspândite exemple de reacție de precipitare este diagnosticul de antrax.
Precipitația face posibilă determinarea nivelului de toxicitate al unei culturi de difterie în agar.
În timpul reacției luate în considerare, are loc precipitarea complexelor antigenice și a anticorpilor. Precipitația este un fenomen imunologic care permite determinarea cantității de anticorpi din serul sanguin al oamenilor și animalelor bolnave sau vaccinate.

Consecința titrarii

Este important de știut că datele obținute prin titrarea metodei de mai sus nu sunt cantitative. Pentru a crea și analiza o estimare cantitativă a numărului de anticorpi conținut, a fost dezvoltată o tehnică specială de reacție de către M. Heidelberger și E. Kabat, care se bazează pe căutarea și identificarea zonei de echivalență. Amestecarea numărului de antigene specific vârstei cu un volum constant de antiser duce la o creștere a precipitatului format inițial, iar apoi scade din nou datorită creșterii capacității de a dizolva complexele antigene. Prin determinarea cantității de anticorpi din supernatantele conținute în fiecare tub, puteți constata că într-un anumit număr de vase cu anticorpi nu va exista lichid. Aici, în comparație cu alte eprubete, se va forma cel mai mare precipitat. Datorită acestui fapt și scăderii precipitatului proteic antigenic din valoarea totală a proteinelor, este posibil să se obțină valoarea exactă a anticorpilor conținuti în volumul serului studiat special. În continuare, cantitatea de molecule de proteine ​​din precipitat este determinată de cantitatea de azot sau folosind metode colorimetrice.

Estimarea valorilor

O evaluare a valorilor precipitației în metodologia de diagnosticare trebuie să țină cont de probabilitatea prezenței în serul imunitar a unui anticorp care nu are proprietatea precipitinei, ceea ce înseamnă că precipitatul în sine nu se poate forma după reacția cu antigenele. Lista acestor molecule include anticorpi parțiali și unele specii din grupul de gamma A-globuline.

Reacția de precipitare în condiții de laborator își găsește aplicarea în diferite tipuri de modificări. De exemplu, reacția de termoprecipitare este utilizată pentru a detecta antigenele bacteriene de botulism, antrax etc., care nu sunt supuse denaturarii termice. Spre deosebire de precipitarea inelară, acest tip de reacție utilizează filtrate ale materialului în cauză în stare de fierbere.
Precipitarea într-un amestec complex nu permite caracterizarea proprietăților elementelor individuale ale amestecului. În astfel de cazuri, o persoană recurge la metoda de precipitare în agar și utilizează, de asemenea, imunoelectrofereză.

Precipitații difuze

În acest domeniu de cercetare, există conceptul de reacție de precipitare difuză (DPR). Se bazează pe capacitatea anticorpilor și a antigenelor solubile de a difuza într-un gel. Difuzia este capacitatea unei molecule dintr-o anumită substanță de a pătrunde în moleculele alteia, care este cauzată de mișcarea termică.
Un gel este un sistem de tip dispersat în care faza lichidă este distribuită uniform în faza solidă. Cel mai adesea, pentru această reacție se folosește un gel de agar.
După ce se dau parametrii sub care moleculele pot difuza între ele, întâlnirea lor va fi însoțită de formarea unui complex antigen + anticorp. Un astfel de neoplasm poate difuza în timp ce se află în gel și va precipita, luând forma unei benzi care poate fi detectată cu ochiul liber. Dacă antigenul și anticorpul sunt omoloage, nu se va forma o bandă.
Crearea condițiilor în care difuzia va avea loc în timpul stratului de agar implică turnarea componentelor, dar numărul total de godeuri și poziția relativă a acestora este determinat de tipul de problemă care trebuie rezolvată. RPD oferă unei persoane capacitatea de a detecta și identifica virusuri izolate necunoscute prin testarea utilizând un ser cu anticorpi cunoscut.

Aplicație

Precipitația este utilizată pe scară largă nu numai în diagnosticarea bolilor, dar își găsește aplicarea și în medicina legală. Este greu de imaginat o analiză în care să fie posibilă determinarea speciei de sânge, a unei părți a unui organ sau a țesuturilor găsite pe o armă criminală care nu folosește reacția de precipitare. In timpul acestui proces se folosesc seruri precipitante care se obtin prin imunizarea diferitelor animale si pasari. Este important ca nivelul titrului seric să fie de cel puțin 1:10.000 și, de asemenea, trebuie să aibă suficientă specificitate. Din pata de sânge detectată sau crusta acesteia, se face un extract pentru examinare fizică. soluție, care va fi ulterior expusă serului precipitant. Folosind această reacție, este posibil să se determine tipurile de proteine ​​​​de țesut și organ atât ale oamenilor, cât și ale animalelor. Obținerea extractelor tulburi obligă să recurgă la precipitarea pe agar.

concluzii

Analizând informațiile pe care le-am citit, putem concluziona că reacțiile de precipitare sunt extrem de importante pentru om, deoarece permit diagnosticarea diferitelor antigene cu ajutorul anticorpilor; acest fenomen este utilizat pe scară largă și în medicina legală și permite identificarea tipului de sânge, țesut. sau organ în raport cu un anumit subiect. Există mai multe tipuri și metode de precipitare care sunt utilizate în conformitate cu nevoile emergente ale problemei care se rezolvă.

Reacția de precipitare (RP) este formarea și precipitarea unui complex de antigen molecular solubil cu anticorpi sub forma unui nor numit precipitat. Se formează prin amestecarea antigenelor și anticorpilor în cantități echivalente; un exces al unuia dintre ele reduce nivelul de formare a complexului imun.

RP se pune în eprubete (reacție de precipitare inelă), în geluri, medii nutritive etc. Sunt răspândite soiurile de RP în agar semi-lichid sau gel de agaroză: imunodifuzie dublă conform Ouchterlony, imunodifuzie radială, imunoelectroforeză etc.

Mecanism. Se efectuează cu antigene solubile coloidale transparente extrase din material patologic, obiecte de mediu sau culturi bacteriene pure. Reacția folosește seruri de precipitare diagnostice clare cu titruri mari de anticorpi. Titrul serului de precipitare este considerat a fi cea mai mare diluție a antigenului, care, atunci când interacționează cu serul imunitar, determină formarea unui precipitat vizibil - turbiditate.

Reacția de precipitare inelară se efectuează în eprubete înguste (diametru 0,5 cm), în care se adaugă 0,2-0,3 ml de ser precipitant. Apoi, folosind o pipetă Pasteur, 0,1-0,2 ml de soluție de antigen sunt stratificate încet. Tuburile se transferă cu grijă în poziție verticală.Reacția se înregistrează după 1-2 minute.În cazul unei reacții pozitive apare un precipitat sub forma unui inel alb la limita dintre ser și antigenul de testat.În tuburile de control, nu se formează nici un precipitat.

15. Reacție care implică complement: reacție de hemoliză, reacție de fixare a complementului. Mecanism, componente, aplicație.

Reacția de fixare a complementului (CFR) este aceea că atunci când antigenele și anticorpii corespund între ele, ele formează un complex imun la care complementul (C) este atașat prin fragmentul Fc al anticorpilor, adică complementul este legat de complexul antigen-anticorp. Dacă nu se formează complexul antigen-anticorp, atunci complementul rămâne liber.

Interacțiunea specifică a AG și AT este însoțită de adsorbția (legarea) complementului. Deoarece procesul de fixare a complementului nu este vizibil vizual, J. Bordet și O. Zhang au sugerat utilizarea sistemului hemolitic (eritrocite de oaie + ser hemolitic) ca indicator, care arată dacă complementul este fixat.

complex AG-AT. Dacă AG și AT corespund între ele, adică s-a format un complex imunitar, atunci complementul este legat de acest complex și nu are loc hemoliză. Dacă AT nu corespunde cu AG, atunci complexul nu se formează și complementul, rămânând liber, se combină cu cel de-al doilea sistem și provoacă hemoliză.

Componente. Reacția de fixare a complementului (CFR) este o reacție serologică complexă. Pentru a-l realiza sunt necesare 5 ingrediente si anume: AG, AT si complement (primul sistem), eritrocite de oaie si ser hemolitic (al doilea sistem).

Antigenul pentru CSC poate fi culturi de diferite microorganisme ucise, lizatele acestora, componente ale bacteriilor, organe alterate patologic și normale, lipide tisulare, viruși și materiale care conțin virusuri.

Serul de cobai proaspat sau uscat este folosit ca complement.

Mecanism. RSK se efectuează în două faze: prima fază - incubarea unui amestec care conține trei componente antigen + anticorp + complement; Faza a 2-a (indicator) - detectarea complementului liber în amestec prin adăugarea acestuia a unui sistem hemolitic format din eritrocite de oaie și ser hemolitic care conține anticorpi împotriva acestora. În prima fază a reacției, când se formează complexul antigen-anticorp, complementul se leagă, iar apoi în a 2-a fază nu va avea loc hemoliza eritrocitelor sensibilizate de anticorpi; reactia este pozitiva. Dacă antigenul și anticorpul nu se potrivesc între ele (nu există antigen sau anticorp în proba de testat), complementul rămâne liber și în a 2-a fază se va alătura complexului eritrocit - anticorp antieritrocitar, determinând hemoliză; reactie negativa.Aplicatie. RSC este utilizat pentru a diagnostica multe boli infecțioase, în special sifilisul (reacția Wassermann)

Reacții de imunodiagnostic. Reacții antigen-anticorp și reacții cu componente marcate. Utilizare pentru identificarea microorganismelor și diagnosticarea bolilor infecțioase.

Reacțiile imune sunt utilizate în studiile de diagnostic și imunologic la persoanele bolnave și sănătoase. În acest scop folosesc metode serologice(din lat. ser - zer și logos - predare), adică metode de studiere a anticorpilor și antigenilor folosind reacții antigen-anticorp determinate în serul sanguin și alte fluide, precum și în țesuturile corpului.

Detectarea anticorpilor împotriva antigenilor patogeni în serul sanguin al pacientului permite stabilirea unui diagnostic al bolii. Studiile serologice sunt folosite și pentru identificarea antigenelor microbiene, a diferitelor substanțe biologic active, a grupelor sanguine, a antigenelor tisulare și tumorale, a complexelor imune, a receptorilor celulari etc.

La izolarea unui microb de la un pacient, agentul patogen este identificat prin studierea proprietăților sale antigenice folosind seruri de diagnostic imun, adică seruri de sânge ale animalelor hiperimunizate care conțin anticorpi specifici. Acesta este așa-numitul identificarea serologică microorganisme.

În microbiologie și imunologie, reacțiile de aglutinare, precipitare, neutralizare, reacții care implică complement, folosind anticorpi și antigeni marcați (radioimunologic, imunotest enzimatic, metode imunofluorescente) sunt utilizate pe scară largă. Reacțiile enumerate diferă în ceea ce privește efectul înregistrat și tehnica de producție, cu toate acestea, toate sunt de bază. se bazează pe reacția de interacțiune a antigenului cu anticorpul și sunt utilizate pentru a detecta atât anticorpi, cât și antigene. Reacțiile imune se caracterizează prin sensibilitate și specificitate ridicate.

Mai jos sunt prezentate principiile și diagramele principalelor reacții de imunodiagnostic. O tehnică detaliată pentru stabilirea reacțiilor este dată în. ghiduri practice pentru imunodiagnostic.

Reacția de aglutinare - RA(din lat. agluti- natio- adeziune) este o reacție simplă în care anticorpii leagă antigenele corpusculare (bacterii, eritrocite sau alte celule, particule insolubile cu antigeni adsorbiți pe acestea, precum și agregate macromoleculare). Apare în prezența electroliților, de exemplu, atunci când se adaugă o soluție izotonică de clorură de sodiu.

Pentru reacția de aglutinare sunt utilizate diverse opțiuni: extensivă, indicativă, indirectă etc. Reacția de aglutinare se manifestă prin formarea de fulgi sau sedimente.

RA este folosit pentru:

determinarea anticorpilor în serul sanguin al pacienților, de exemplu, cu bruceloză (reacție Wright, Heddelson), febră tifoidă și febră paratifoidă (reacție Vidal) și alte boli infecțioase;

determinarea agentului patogen izolat de la pacient;

determinarea grupelor sanguine folosind anticorpi monoclonali împotriva aloantigenelor eritrocitare.

Pentru a determina anticorpii la un pacient a punereacție de aglutinare detaliată: adăugați la diluțiile serului sanguin al pacientului diagnosticum(suspendarea microbilor omorâți) și după câteva ore de incubare la 37 °C, se notează cea mai mare diluție a serului (titru de ser), la care a avut loc aglutinarea, adică s-a format un precipitat.

Natura și viteza aglutinarii depind de tipul de antigen și de anticorpi. Un exemplu este particularitățile interacțiunii diagnosticelor (antigene O și R) cu anticorpi specifici. Reacție de aglutinare cu O-diagnosticum(bacterii ucise de căldură, păstrându-se stabile la căldură O-antigen) apare sub formă de aglutinare cu granulație fină. Reacția de aglutinare cu H-diagnosticum (bacterii ucise de formaldehidă, reținând antigenul H flagelar termolabil) este grosieră și decurge mai rapid.

Dacă este necesar să se determine agentul patogen izolat de la pacient, se pune reacție indicativă de aglutinare, folosind anticorpi de diagnostic (ser aglutinant), adică se efectuează serotiparea agentului patogen. O reacție indicativă este efectuată pe o lamă de sticlă. O cultură pură a agentului patogen izolat de la pacient este adăugată la o picătură de ser aglutinant diagnostic la o diluție de 1:10 sau 1:20. În apropiere este plasat un control: în loc de ser, se aplică o picătură de soluție de clorură de sodiu. Când un sediment floculent apare într-o picătură care conține ser și microbi, a reacție extinsă de aglutinareîn eprubete cu diluții crescânde de ser aglutinant, la care se adaugă 2-3 picături de suspensie de agent patogen. Aglutinarea este luată în considerare de cantitatea de sediment și de gradul de limpezime a lichidului. Reacția este considerată pozitivă dacă se observă aglutinare într-o diluție apropiată de titrul serului de diagnostic. În același timp, se ține cont de controale: serul diluat cu soluție izotonică de clorură de sodiu trebuie să fie transparent, suspensia de microbi în aceeași soluție să fie uniform tulbure, fără sedimente.

Diferitele bacterii înrudite pot fi aglutinate de același ser aglutinant diagnostic, ceea ce face dificilă identificarea lor. Prin urmare ei folosesc seruri aglutinante adsorbite, din care anticorpii cu reacție încrucișată au fost îndepărtați prin adsorbție la bacteriile înrudite. Astfel de seruri rețin anticorpi care sunt specifici doar unei anumite bacterii. Producerea de seruri aglutinante speciale de diagnostic monoreceptor a fost propusă de A. Castellani (1902).

Reacție de hemaglutinare indirectă (pasivă). (RNGA, RPGA) se bazează pe utilizarea eritrocitelor cu antigene sau anticorpi adsorbiți pe suprafața lor, a căror interacțiune cu anticorpii sau antigenii corespunzători ai serului sanguin face ca eritrocitele să se lipească și să cadă la fundul testului. tub sau celulă V sub formă de sediment festonat (Fig. 13.2). În cazul unei reacții negative, globulele roșii se depun ■ sub forma unui „buton”. De obicei, anticorpii sunt detectați în RNGA folosind un diagnostic de eritrocite antigenice, care este eritrocite cu adsorbție pe le cu antigene. Uneori se utilizează diagnosticul de eritrocite cu anticorpi, pe care anticorpii sunt adsorbiți. De exemplu, toxina botulinica poate fi detectata prin adaugarea de toxina botulinica cu anticorpi eritrocitari (aceasta reactie se numeste reacție inversă de hemaglutinare indirectă- RONG). RNGA este utilizat pentru a diagnostica bolile infecțioase și pentru a determina hormonul gonadotrop V urină la stabilirea sarcinii, pentru a identifica hipersensibilitatea la medicamente, hormoni și în unele alte cazuri.

Reacția de coaglutinare . Celulele patogene sunt determinate folosind stafilococi pretratați cu ser de diagnostic imun. Stafilococi care conțin proteine A, având afinitate pentru Fc - fragment de imunoglobuline, adsorb nespecific anticorpi antimicrobieni, care interacționează apoi cu centrii activi cu microbii corespunzători izolați de la pacienți. Ca urmare a coaglutinării, se formează fulgi formați din stafilococi, anticorpi serici de diagnostic și microbul detectat.

Reacția de inhibare a hemaglutinării (RTGA) se bazează pe blocarea, suprimarea antigenelor virale de către anticorpii serici imunitari, drept urmare virușii își pierd capacitatea de a aglutina globulele roșii (Fig. 13.3). RTGA este utilizat pentru a diagnostica multe boli virale, ai căror agenți cauzali (virusuri gripale, rujeolă, rubeolă, encefalită transmisă de căpușe etc.) pot aglutina globulele roșii ale diferitelor animale.

Reacție de aglutinare pentru determinarea grupelor sanguine utilizat pentru stabilirea sistemului ABO (vezi secțiunea 10.1.4.1) utilizând aglutinarea globulelor roșii cu anticorpi serici imun împotriva antigenelor de grup sanguin A (II), B (III). Martorul este: ser care nu conține anticorpi, adică ser AB (GU) tipuri de sânge; antigenele conținute în globulele roșii din grupele A (II), B (III). Martorul negativ nu conține antigene, adică se folosesc eritrocite din grupa 0 (I).

ÎN reacţii de aglutinare pentru determinarea factorului Rh(vezi secțiunea 10.1.4.1) utilizați seruri anti-Rhesus (cel puțin două serii diferite). Dacă există un antigen Rh pe membrana eritrocitelor studiate, are loc aglutinarea acestor celule. Eritrocitele standard Rh pozitive și Rh negative ale tuturor grupelor de sânge servesc drept control.

Reacție de aglutinare pentru determinarea anticorpilor anti-Rhesus (testul Coombs indirect)utilizat la pacienții cu hemoliză intravasculară. La unii dintre acești pacienți sunt detectați anticorpi anti-Rhesus, care sunt incompleti și monovalenți. Ele interacționează în mod specific cu eritrocitele Rh-pozitive, dar nu provoacă aglutinarea acestora. Prezența unor astfel de anticorpi incompleti este determinată de testul Coombs indirect. Pentru a face acest lucru, la sistemul de anticorpi anti-Rh + eritrocite Rh-pozitive se adaugă ser antiglobuline (anticorpi împotriva imunoglobulinelor umane), ceea ce determină aglutinarea eritrocitelor (Fig. 13.4). Folosind reacția Coombs, sunt diagnosticate condiții patologice asociate cu liza intravasculară a eritrocitelor de origine imună, de exemplu, boala hemolitică a nou-născutului: eritrocitele unui făt Rh pozitiv se combină cu anticorpi incompleti la factorul Rh care circulă în sânge, care au a trecut prin placentă de la o mamă Rh negativ.

Reacții de precipitare

Reacția de precipitare - RP (de lalat. praecipito- precipitat) - aceasta este formarea și precipitarea unui complex de antigen molecular solubil cu anticorpi sub formă de tulburare, numit precipitat. Se formează prin amestecarea antigenelor și anticorpilor în cantități echivalente; un exces al unuia dintre ele reduce nivelul de formare a complexului imun.

Reacțiile de precipitare se efectuează în eprubete (reacție de precipitare inelară),în geluri, medii nutritive etc. Au devenit larg răspândite varietăți de reacții de precipitare în geluri semi-lichide de agar sau agaroză: imunodifuzie dublă conform Ouchterlony. imunodifuzie radială, imunoelectroforeză si etc.

Reacția de precipitare inelară . Reacția este efectuată în tuburi înguste de precipitare cu ser imun, pe care este stratificat un antigen solubil. Cu un raport optim de antigen și anticorpi, la marginea acestor două soluții se formează un inel opac de precipitat (Fig. 13.5). Un exces de antigen nu afectează rezultatul reacției de precipitare a inelului datorită difuzării treptate a reactivilor la limita lichidului. Dacă extractele apoase fierte și filtrate de organe sau țesuturi sunt folosite ca antigene în reacția de precipitare a inelului, atunci această reacție se numește reacția de termoprecipitare (reacția Ascoli, cu antrax/

Reacție de imunodifuzie dublă conform Ouchteruny . Pentru a stabili reacția, gelul de agar topit este turnat într-un strat subțire pe o placă de sticlă și, după ce se întărește, se decupează godeuri de 2-3 mm. Antigenii și serurile imune sunt plasate separat în aceste godeuri, care difuzează unul spre celălalt. La punctul de întâlnire, în proporții echivalente, formează un precipitat sub formă de dungă albă. În sistemele multicomponente, între godeuri apar mai multe linii de precipitat cu antigeni diferiți și anticorpi serici; pentru antigeni identici, liniile de precipitat fuzionează; pentru cele neidentice, acestea se intersectează (Fig. 13.6).

Reacție de imunodifuzie radială . Serul imunitar cu gel de agar topit este turnat uniform pe pahar. După solidificare în gel, se fac godeuri în care antigenul este plasat în diferite diluții. Antigenul, difuzând în gel, formează zone de precipitare în formă de inel în jurul godeurilor cu anticorpi (Fig. 13.7). Diametrul inelului de precipitare este proporțional cu concentrația de antigen. Reacția este utilizată pentru a determina conținutul de imunoglobuline din diferite clase, componente ale sistemului complementului etc. în sânge.

Imunoelectroforeza- o combinație de electroforeză și imunoprecipitare: un amestec de antigeni este introdus în godeurile gelului și separat în gel prin electroforeză. Apoi, serul imun este introdus în șanțul paralel cu zonele de electroforeză, ai căror anticorpi, difuzând în gel, formează linii de precipitare la punctul de întâlnire cu antigenul.

Reacția de floculare(după Ramon) (din lat. flocul - fulgi de lână) - apariția opalescenței sau a masei floculente (imunoprecipitare) într-o eprubetă în timpul unei reacții toxină-antitoxină sau toxoid-antitoxină. Este utilizat pentru determinarea activității serului antitoxic sau a toxoidului.

Microscopia electronică imunitară- microscopia electronică a microbilor, adesea viruși, tratați cu anticorpi corespunzători. Virușii tratați cu ser imun formează agregate imunitare (microprecipitate). În jurul virionilor se formează o „corolă” de anticorpi, în contrast cu acidul fosfotungstic sau alte preparate dense electron-optic.

Reacții care implică complement

Reacții care implică complementse bazează pe activarea complementului de către complexul antigen-anticorp (reacție de fixare a complementului, hemoliză radială etc.).

Reacția de fixare a complementului (RSK) este că atunci când antigenele și anticorpii corespund între ele, ele formează un complex imun, la care, prin Fc -fragmentul de anticorp este atașat la complement (C), adică complementul este legat de complexul antigen-anticorp. Dacă nu se formează complexul antigen-anticorp, atunci complementul rămâne liber (Fig. 13.8). RSK se efectuează în două faze: prima fază - incubarea unui amestec care conține trei componente antigen + anticorp + complement; Faza a 2-a (indicator) - detectarea complementului liber în amestec prin adăugarea acestuia a unui sistem hemolitic format din eritrocite de oaie și ser hemolitic care conține anticorpi împotriva acestora. În prima fază a reacției, când se formează complexul antigen-anticorp, complementul se leagă, iar apoi în a 2-a fază nu va avea loc hemoliza eritrocitelor sensibilizate de anticorpi; reactia este pozitiva. Dacă antigenul și anticorpul nu se potrivesc între ele (nu există antigen sau anticorp în proba de testat), complementul rămâne liber și în a 2-a fază se va alătura complexului eritrocit - anticorp antieritrocitar, determinând hemoliză; reactia este negativa.

RSC este utilizat pentru a diagnostica multe boli infecțioase, în special sifilisul (reacția Wassermann).

Reacția de hemoliză radială (RRH) ) plasat în godeurile unui gel de agar care conține globule roșii de oaie și complement. După introducerea serului hemolitic (anticorpi împotriva globulelor roșii de oaie) în godeurile gelului, în jurul lor se formează o zonă de hemoliză (ca urmare a difuziei radiale a anticorpilor). În acest fel, este posibilă determinarea activității complementului și a serului hemolitic, precum și a anticorpilor din serul sanguin al pacienților cu gripă, rubeolă și encefalită transmisă de căpușe. Pentru a face acest lucru, antigenele corespunzătoare ale virusului sunt adsorbite pe eritrocite, iar serul de sânge al pacientului este adăugat în godeurile gelului care conține aceste eritrocite. Anticorpii antivirali interacționează cu antigenele virale adsorbite pe eritrocite, după care

Apoi componentele complementului se alătură acestui complex, provocând hemoliză.

Reacție de aderență imună (IAR) ) se bazează pe activarea sistemului complement de către antigeni corpusculari (bacterii, viruși) tratați cu ser imun. Ca rezultat, se formează o a treia componentă activată a complementului (C3b), care se atașează la antigenul corpuscular ca parte a complexului imun. Eritrocitele, trombocitele și macrofagele au receptori pentru C3b, datorită cărora, atunci când aceste celule sunt amestecate cu complexe imune purtătoare de C3b, se produce combinarea și aglutinarea lor.

Reacția de neutralizare

Anticorpii serului imunitar sunt capabili să neutralizeze efectul dăunător al microbilor sau al toxinelor acestora asupra celulelor și țesuturilor sensibile, care este asociat cu blocarea antigenelor microbiene de către anticorpi, de exemplu. neutralizare. Reacția de neutralizare(RN) se efectuează prin introducerea unui amestec antigen-anticorp în animale sau în obiecte de testare sensibile (cultură celulară, embrioni). În absența efectelor dăunătoare ale microorganismelor sau ale antigenelor sau toxinelor acestora la animale și obiectele de testat, ele vorbesc despre efectul neutralizant al serului imun și, prin urmare, despre specificitatea interacțiunii complexului antigen-anticorp (Fig. 13.9).

Reacție de imunofluorescență - RIF (metoda Coons)

Există trei tipuri principale de metodă: directă, indirectă (Fig. 13.10), cu complement. Reacția Koons este o metodă rapidă de diagnosticare pentru identificarea antigenelor microbiene sau determinarea anticorpilor.

Metoda RIF directă se bazează pe faptul că antigenele tisulare sau microbii tratați cu seruri imune cu anticorpi marcați cu fluorocromi sunt capabili să strălucească în razele UV ale unui microscop fluorescent.

Bacteriile dintr-un frotiu tratat cu un astfel de ser luminiscent strălucesc de-a lungul periferiei celulei sub forma unui chenar verde.

Metoda RIF indirectă constă în identificarea complexului antigen-anticorp folosind ser antiglobulină (anti-anticorp) marcat cu fluorocrom. Pentru a face acest lucru, frotiurile dintr-o suspensie de microbi sunt tratate cu anticorpi din serul de diagnostic antimicrobian de iepure. Apoi anticorpii care nu sunt legați de antigenele microbiene sunt spălați, iar anticorpii rămași pe microbi sunt detectați prin tratarea frotiului cu ser antiglobulină (anti-iepure) marcat cu fluorocromi. Ca rezultat, se formează un complex de anticorpi antimicrobieni de iepure + anticorpi antimicrobieni de iepure marcați cu fluorocrom. Acest complex este observat la un microscop fluorescent, ca și în metoda directă.

Metoda de imunosorbție enzimatică sau analiză (ELISA)

ELISA -detectarea antigenelor folosind anticorpii corespunzători acestora conjugați la o enzimă marca (peroxidază de hrean, beta-galactozidază sau fosfatază alcalină). După combinarea antigenului cu serul imun marcat cu enzimă, substratul/cromogenul este adăugat la amestec. Substratul este scindat de enzimă, iar culoarea produsului de reacție se modifică - intensitatea culorii este direct proporțională cu numărul de molecule de antigen și anticorpi legate.

ELISA în fază solidă - cea mai comună variantă a unui test imunologic, atunci când una dintre componentele reacției imune (antigen sau anticorpi) este absorbită pe un purtător solid, de exemplu, în godeurile plăcilor de polistiren

La determinarea anticorpilor, serul de sânge al pacientului, serul antiglobulinic marcat cu o enzimă și un substrat (cromogen) pentru enzimă sunt adăugate secvenţial în godeurile plăcilor cu antigenul sorbit.

De fiecare dată după adăugarea unei alte componente, reactivii nelegați sunt îndepărtați din godeuri prin spălare temeinică. Dacă rezultatul este pozitiv, culoarea soluției de cromogen se schimbă. Un purtător în fază solidă poate fi sensibilizat nu numai cu antigen, ci și cu anticorpi. Apoi antigenul dorit este adăugat în godeurile cu anticorpi absorbiți, se adaugă ser imun împotriva antigenului marcat cu o enzimă și apoi se adaugă un substrat pentru enzimă.

Opțiune ELISA competitivă . antigenul țintă și antigenul marcat cu enzimă concurează unul cu celălalt pentru a lega o cantitate limitată de anticorpi din ser imun. Un alt test - anticorpii pe care îi cauți

iar anticorpii marcaţi concurează între ei pentru antigeni.

Metodă radioimunologică sau analiză (RIA)

O metodă foarte sensibilă bazată pe reacția antigen-anticorp folosind antigene sau anticorpi marcați cu radionuclid (125 J, 14 C, 3 H, 51 Cr etc.). După interacțiunea lor, complexul imunitar radioactiv rezultat este separat și radioactivitatea acestuia este determinată în contorul corespunzător (radiații beta sau gamma):

intensitatea radiației este direct proporțională cu numărul de molecule de antigen și anticorpi legați.

La versiunea RIA în fază solidă unul dintre componentele de reacție (antigen sau anticorpi) este absorbit pe un suport solid, de exemplu, în godeurile micropanourilor de polistiren. O altă opțiune de metodă este RIA competitivă. antigenul dorit și antigenul marcat cu radionuclid concurează unul cu celălalt pentru a lega o cantitate limitată de anticorpi serici imunitari. Această opțiune este utilizată pentru a determina cantitatea de antigen din materialul de testat.

RIA este utilizat pentru identificarea antigenelor microbiene, determinarea hormonilor, enzimelor, medicamentelor și imunoglobulinelor, precum și a altor substanțe conținute în materialul de testat în concentrații minore - 10~ |0 -I0~ 12 g/l. Metoda prezintă un anumit pericol pentru mediu.

Imunoblotting

Imunoblotting (IB)- o metodă foarte sensibilă bazată pe o combinație de electroforeză și ELISA sau RIA.

Antigenul este izolat folosind electroforeză într-un gel de poliacrilamidă, apoi transferat (blotting - din engleză. pata, pete) din gel pe hârtie activată sau membrană de nitroceluloză și dezvoltate folosind ELISA. Companiile produc astfel de benzi cu „blots”

antigene. Pe aceste benzi se aplică serul pacientului. Apoi, după incubare, pacientul este spălat de anticorpii nelegați și se aplică ser împotriva imunoglobulinelor umane marcate cu o enzimă. Complexul antigen + anticorp pacient + anticorp împotriva Ig-ului uman format pe bandă este detectat prin adăugarea unui substrat/cromogen care își schimbă culoarea sub acțiunea unei enzime (Fig. 13.12).

IB este folosit ca metodă de diagnosticare a infecției cu HIV etc.

13.1. Reacții antigen-anticorp și aplicațiile lor

Când se introduce un antigen, se formează anticorpi în organism. Anticorpii sunt complementari cu antigenul care a determinat sinteza lor și sunt capabili să se lege de acesta. Legarea antigenelor de anticorpi constă în două faze. Prima fază este specifică, în care are loc legarea rapidă a determinantului antigenic la centrul activ al fragmentului Fab de anticorpi. Trebuie remarcat faptul că legarea se datorează forțelor van der Waals, hidrogenului și interacțiunilor hidrofobe. Forța legăturii este determinată de gradul de corespondență spațială dintre locul activ al anticorpului și epitopul antigenului. După faza specifică, începe o fază mai lentă - nespecifică, care se manifestă printr-un fenomen fizic vizibil (de exemplu, formarea de fulgi în timpul aglutinarii etc.).

Reacțiile imune sunt interacțiuni între anticorpi și antigeni, iar aceste reacții sunt specifice și foarte sensibile. Sunt utilizate pe scară largă în practica medicală. Cu ajutorul reacțiilor imune pot fi rezolvate următoarele probleme:

Determinarea anticorpilor necunoscuți prin antigeni cunoscuți (diagnostic antigenic). Această sarcină apare atunci când este necesar să se determine anticorpii la un agent patogen în serul sanguin al pacientului (serodiagnostic). Găsirea anticorpilor vă permite să confirmați diagnosticul;

Determinarea antigenelor necunoscute folosind anticorpi cunoscuți (ser diagnostic). Acest studiu se realizează la identificarea unei culturi de patogen izolată din materialul unui pacient (serotipizare), precum și la detectarea

antigenele microbiene și toxinele lor din sânge și alte fluide biologice. Există multe tipuri de reacții imune, care diferă în tehnica de stadializare și efectul înregistrat. Acestea sunt reacții de aglutinare (RA), reacții de precipitare (RP), reacții care implică complement (RSC), reacții care utilizează componente marcate (RIF, ELISA, RIA).

13.2. Reacția de aglutinare

O reacție de aglutinare (RA) este o reacție imună a interacțiunii unui antigen cu anticorpi în prezența electroliților, iar antigenul se află în stare corpusculară (eritrocite, bacterii, particule de latex cu antigene adsorbite). În timpul aglutinării, antigenele corpusculare sunt lipite împreună de anticorpi, ceea ce se manifestă prin formarea unui precipitat floculent. Formarea fulgilor are loc datorită faptului că anticorpii au doi centri activi, iar antigenele sunt polivalente, adică. au mai mulți determinanți antigenici. RA este utilizat pentru a identifica agentul patogen izolat din materialul pacientului, precum și pentru a detecta anticorpi la agentul patogen în serul sanguin al pacientului (de exemplu, reacțiile Wright și Heddleson pentru bruceloză, reacția Widal pentru febra tifoidă și febra paratifoidă).

Cel mai simplu mod de a diagnostica RA este reacția pe sticlă; aceasta este o RA aproximativă, care este utilizată pentru a determina agentul patogen izolat de la pacient. Când se stabilește o reacție, pe o lamă de sticlă se aplică ser aglutinant diagnostic (la o diluție de 1:10 sau 1:20), apoi se adaugă o cultură de la pacient. Reacția este pozitivă dacă în picătură apare un sediment floculant. În apropiere este plasat un control: în loc de ser, se aplică o picătură de soluție de clorură de sodiu. Dacă serul aglutinant de diagnostic nu este adsorbit 1, atunci este diluat (la titrul - diluția la care ar trebui să aibă loc aglutinarea), adică. pune RA expandată în eprubete cu creștere

1 Serul aglutinant neadsorbit poate aglutina bacteriile înrudite care au antigene comune (reacții încrucișate). Prin urmare ei folosescseruri aglutinante adsorbite, din care anticorpii cu reacție încrucișată au fost îndepărtați prin adsorbție la bacteriile înrudite. Astfel de seruri rețin anticorpi care sunt specifici doar unei anumite bacterii.

diluții de ser aglutinant, la care se adaugă 2-3 picături dintr-o suspensie de agent patogen izolat de la pacient. Aglutinarea este luată în considerare de cantitatea de sediment și de gradul de curățare a lichidului din eprubete. Reacția este considerată pozitivă dacă se observă aglutinare într-o diluție apropiată de titrul serului de diagnostic. Reacția este însoțită de controale: serul diluat cu soluție izotonică de clorură de sodiu trebuie să fie transparent, suspensia de microbi în aceeași soluție să fie uniform tulbure, fără sedimente.

Pentru a determina anticorpii la agentul patogen din serul sanguin al pacientului, se utilizează RA la scară completă. Când se instalează, serul de sânge al pacientului este diluat în eprubete și se adaugă o cantitate egală de suspensie de diagnostic (suspensie de microbi uciși) în eprubete. După incubare, se determină cea mai mare diluție a serului la care a avut loc aglutinarea, adică. s-a format un precipitat (titru seric). În acest caz, reacția de aglutinare cu O-diagnosticum (bacterii ucise prin încălzire, reținând antigenul O termostabil) are loc sub formă de aglutinare cu granulație fină. Reacția de aglutinare cu H-diagnosticum (bacterii ucise de formaldehidă, reținând antigenul H flagelar termolabil) este grosieră și decurge mai rapid.

Reacție de hemaglutinare indirectă (pasivă).(RNGA sau RPGA) este un tip de RA. Această metodă este foarte sensibilă. Cu ajutorul RNGA se pot rezolva două probleme: determinarea anticorpilor în serul sanguin al pacientului, la care se adaugă un diagnostic eritrocitar antigenic, adică eritrocite pe care sunt adsorbiți antigeni cunoscuți; determinați prezența antigenelor în materialul de testat. În acest caz, reacția este uneori numită reacție de hemaglutinare indirectă inversă (RONHA). În timpul procedurii, la materialul de testat se adaugă un anticorp erythrocyte diagnosticum (eritrocite cu anticorpi adsorbiți pe suprafața lor). În această reacție, celulele roșii din sânge acționează ca purtători și sunt implicate pasiv în formarea agregatelor imune. Cu o reacție pozitivă, globulele roșii lipite pasiv acoperă fundul găurii într-un strat uniform cu margini festonate („umbrelă”); în absența aglutinarii, celulele roșii din sânge se acumulează în adâncitura centrală a găurii, formând un „buton” compact cu margini bine definite.

Reacția de coaglutinare folosit pentru determinarea celulelor patogene (antigeni) folosind anticorpi adsorbiți pe Staphylococcus aureus, conţinând proteina A. Proteina A are afinitate pentru fragmentul Fc al imunoglobulinelor. Datorită acestui fapt, anticorpii se leagă de stafilococ indirect prin fragmentul Fc, iar fragmentele Fab sunt orientate spre exterior și sunt capabile să interacționeze cu microbii corespunzători izolați de la pacienți. În acest caz, se formează fulgi.

Reacția de inhibare a hemaglutinării (HAI) utilizat în diagnosticul infecțiilor virale, și numai infecții cauzate de virusuri hemaglutinante. Acești virusuri conțin o proteină la suprafața lor - hemaglutinină, care este responsabilă de reacția de hemaglutinare (HRA) atunci când celulele roșii din sânge sunt adăugate virușilor. RTGA implică blocarea antigenelor virale cu anticorpi, în urma cărora virușii își pierd capacitatea de a aglutina globulele roșii.

Reacția Coombs - RA pentru determinarea anticorpilor incompleti. În unele boli infecțioase, cum ar fi bruceloza, în serul sanguin al pacientului circulă anticorpi incompleti împotriva agentului patogen. Anticorpii incompleti sunt numiți anticorpi de blocare deoarece au un loc de legare a antigenului, și nu două, ca anticorpii completi. Prin urmare, atunci când se adaugă un diagnostic antigenic, anticorpii incompleti se leagă de antigene, dar nu îi lipesc împreună. Pentru a manifesta reacția se adaugă ser antiglobulinic (anticorpi la imunoglobulinele umane), care va duce la aglutinarea complexelor imune (diagnostic antigenic + anticorpi incompleti) formate în prima etapă a reacției.

Reacția Coombs indirectă este utilizată la pacienții cu hemoliză intravasculară. La unii dintre acești pacienți sunt detectați anticorpi anti-Rhesus monovalenți incompleti. Ele interacționează în mod specific cu eritrocitele Rh-pozitive, dar nu provoacă aglutinarea acestora. Prin urmare, serul antiglobulinic este adăugat la sistemul de anticorpi anti-Rh + eritrocite Rh-pozitive, ceea ce determină aglutinarea eritrocitelor. Folosind reacția Coombs, sunt diagnosticate stările patologice asociate cu liza intravasculară a eritrocitelor de origine imună, de exemplu, boala hemolitică a nou-născutului cauzată de conflictul Rh.

RA pentru determinarea grupelor sanguine se bazează pe aglutinarea eritrocitelor de către anticorpii serici imun la antigenele grupelor sanguine A(II), B(III). Martorul este ser care nu conține anticorpi, adică. grupa sanguină AB(IV) serică și antigenele eritrocitare din grupele A(P) și B(III). Eritrocitele din grupa 0(I) sunt folosite ca martor negativ deoarece nu au antigeni.

Pentru determinarea factorului Rh se folosesc seruri anti-Rh (cel puțin două serii diferite). Dacă există un antigen Rh pe membrana eritrocitelor studiate, are loc aglutinarea acestor celule.

13.3. Reacția de precipitare

RP este o reacție imună a interacțiunii anticorpilor cu antigenele în prezența electroliților, iar antigenul este în stare solubilă. În timpul precipitării, antigenele solubile sunt precipitate de anticorpi, ceea ce se manifestă prin tulbureală sub formă de benzi de precipitare. Formarea unui precipitat vizibil se observă atunci când ambii reactivi sunt amestecați în rapoarte echivalente. Un exces al unuia dintre ele reduce numărul de complexe imune precipitate. Există diferite moduri de a efectua reacția de precipitare.

Reacția de precipitare inelară plasate în tuburi de precipitare cu diametru mic. Serul imunitar este adăugat în eprubetă și antigenul solubil este stratificat cu grijă. Dacă rezultatul este pozitiv, la interfața celor două soluții se formează un inel lăptos. Reacția de precipitare inelară, care este utilizată pentru a determina prezența antigenelor în organe și țesuturi, ale căror extracte sunt fierte și filtrate, se numește reacția de termoprecipitare (reacția Ascoli pentru determinarea antigenului antrax termostabil).

Reacție de imunodifuzie dublă Ouchterlony. Această reacție este efectuată într-un gel de agar. Într-un strat de gel de grosime uniformă, godeurile sunt tăiate la o anumită distanță unele de altele și umplute cu antigen și, respectiv, ser imun. După aceasta, antigenele și anticorpii difuzează în gel, se întâlnesc și formează complexe imune, care precipită în gel și devin vizibile ca linii de precizie.

nutriție. Această reacție poate fi utilizată pentru a identifica antigene sau anticorpi necunoscuți și, de asemenea, pentru a testa asemănarea dintre diferiți antigeni: dacă antigenele sunt identice, liniile de precipitare se contopesc, dacă antigenele nu sunt identice, liniile de precipitare se intersectează, dacă antigenele sunt parțial identic, se formează un pinten.

Reacție de imunodifuzie radială. La gelul de agar topit se adaugă anticorpi și gelul este aplicat într-un strat uniform pe sticlă. Godeurile sunt tăiate în gel și li se adaugă un volum standard de soluții de antigen de diferite concentrații. În timpul incubației, antigenele difuzează radial din godeu și, întâlnind anticorpii, formează un inel de precipitare. Atâta timp cât excesul de antigen rămâne în godeu, are loc o creștere treptată a diametrului inelului de precipitare. Această metodă este utilizată pentru a determina antigene sau anticorpi în soluția de testare (de exemplu, pentru a determina concentrația de imunoglobuline de diferite clase în serul sanguin).

Imunoelectroforeza. Amestecul de antigen este mai întâi separat electroforetic, apoi antiserul precipitant este adăugat în canalul care merge de-a lungul direcției de mișcare a proteinei. Antigenii și anticorpii difuzează în gel unul către celălalt; interacționând, ele formează linii de precipitații arcuite.

Reacția de floculare(după Ramon) - un tip de reacție de precipitare care este utilizat pentru a determina activitatea serului antitoxic sau a toxoidului. Reacția se realizează în eprubete. Într-o eprubetă în care toxoidul și antitoxina sunt într-un raport echivalent, se observă turbiditate.

13.4. Reacția de fixare a complementului

Anticorpii, care interacționează cu antigenul corespunzător, leagă complementul adăugat (primul sistem). Un indicator al fixării complementului sunt eritrocitele sensibilizate cu ser hemolitic, adică. anticorpi la celulele roșii din sânge (sistemul 2). Dacă complementul nu este fixat în primul sistem, i.e. Dacă nu are loc reacția antigen-anticorp, globulele roșii sensibilizate sunt complet lizate (reacție negativă). Când complementul este fixat de complexele imune ale primului sistem după adăugarea eritrocitelor sensibilizate, hemoliza din

absent (reacție pozitivă). Reacția de fixare a complementului este utilizată pentru a diagnostica boli infecțioase (gonoree, sifilis, gripă etc.).

13.5. Reacția de neutralizare

Microbii și toxinele lor au un efect dăunător asupra organelor și țesuturilor corpului uman. Anticorpii sunt capabili să se lege de acești agenți dăunători și să-i blocheze, de exemplu. neutraliza. Reacția de neutralizare diagnostică se bazează pe această caracteristică a anticorpilor. Se realizează prin introducerea unui amestec antigen-anticorp în animale sau în obiecte de testare sensibile (cultură celulară, embrioni). De exemplu, pentru a detecta toxine în materialul unui pacient, animalele din primul grup sunt injectate cu material de la pacient. Animalele din grupa a 2-a sunt injectate cu material similar, pre-tratat cu antiser adecvat. Animalele din primul grup mor dacă există o toxină în material. Al doilea grup de animale supraviețuiește; efectul dăunător al toxinei nu se manifestă, deoarece este neutralizat.

13.6. Reacții folosind anticorpi sau antigeni marcați

13.6.1. Reacție de imunofluorescență (RIF, metoda Koons)

Această metodă este utilizată pentru diagnosticare expresă. Poate fi folosit pentru a detecta atât antigenele microbiene, cât și anticorpii.

Metoda RIF directă- o reacție imună a interacțiunii anticorpilor cu antigenii, iar anticorpii sunt marcați cu un fluorocrom - o substanță capabilă să emită cuante de lumină de o anumită lungime de undă atunci când sunt expuși la lumină de o anumită lungime de undă. Particularitatea acestei metode este necesitatea de a elimina componentele nereacționate pentru a exclude detectarea luminiscenței nespecifice. Pentru a face acest lucru, spălați anticorpii nereacționați. Rezultatele sunt evaluate cu ajutorul unui microscop cu fluorescență. Bacteriile dintr-un frotiu tratat cu un astfel de ser luminiscent strălucesc pe un fundal întunecat de-a lungul periferiei celulei.

Metoda RIF indirectă este folosit mai des decât precedentul. Această reacție se realizează în două etape. În prima etapă, antigenele reciproc

interacționează cu anticorpii corespunzători, formând complexe imune. Toate componentele care nu au reacționat (adică nu fac parte din complexele imune) trebuie îndepărtate prin spălare. În a doua etapă, complexul antigen-anticorp rezultat este detectat folosind ser antiglobulină fluorocromat. Ca urmare, se formează un complex de microbi + anticorpi antimicrobieni de iepure + anticorpi la imunoglobulinele de iepure, marcați cu fluorocrom. Rezultatele sunt evaluate cu ajutorul unui microscop cu fluorescență.

13.6.2. Metoda sau testul imunosorbent enzimatic

ELISA este cea mai comună metodă modernă utilizată pentru diagnosticarea infecțiilor virale, bacteriene, protozoare, în special pentru diagnosticarea infecției cu HIV, hepatitei virale etc.

Există o mulțime de modificări ELISA. ELISA necompetitiv în fază solidă este utilizat pe scară largă. Se realizează în plăci de polistiren cu 96 de godeuri (fază solidă). Când se efectuează o reacție, este necesar să se spele componentele nereacționate în fiecare etapă. La determinarea anticorpilor, serul sanguin de testat este adăugat în godeurile pe care sunt absorbiți antigenele, apoi serul antiglobulinic marcat cu o enzimă. Reacția se realizează prin adăugarea unui substrat pentru enzimă. În prezența unei enzime, substratul se schimbă și complexul enzimă-substrat este selectat astfel încât produsul format în reacție să fie colorat. Astfel, cu o reacție pozitivă, se observă o schimbare a culorii soluției. Pentru a determina antigenele, purtătorul în fază solidă este sensibilizat cu anticorpi, apoi materialul de testat (antigenele) și serul marcat cu enzimă la antigeni sunt adăugate secvenţial. Pentru ca reacția să aibă loc, se adaugă un substrat pentru enzimă. O schimbare a culorii soluției are loc cu o reacție pozitivă.

13.6.3. Imunoblotting

Această metodă se bazează pe o combinație de electroforeză și ELISA. Când se efectuează imunoblotting (blotting din engleză. pata- spot) un amestec complex de antigeni este mai întâi supus electroforezei într-un gel de poliacrilamidă. Anti-

peptidele genice sunt transferate pe o membrană de nitroceluloză. Petele sunt apoi tratate cu anticorpi marcați cu enzimă la un antigen specific, de ex. efectuați ELISA blot. Imunoblotting este utilizat în diagnosticarea infecțiilor precum HIV.

13.6.4. Microscopia electronică imunitară

Metoda implică microscopia virușilor (mai puțin frecvent alți microbi) într-un microscop electronic, pre-tratat cu serul imunitar corespunzător marcat cu preparate dense electron-optic, de exemplu feritina, o proteină care conține fier.

13.7. Citometrie în flux

Celulele sanguine sunt diferențiate pe baza citofluorometriei cu laser. Pentru a face acest lucru, celulele dorite sunt colorate cu anticorpi monoclonali fluorescenți la antigenele CD. Proba de sânge, după ce a fost tratată cu anticorpi marcați, este trecută printr-un tub subțire și trece un fascicul laser prin acesta, care excită fluorocromul să strălucească. Intensitatea fluorescenței se corelează cu densitatea antigenelor de pe suprafața celulei și poate fi măsurată cantitativ folosind un tub fotomultiplicator. Rezultatele obţinute sunt convertite într-o histogramă.

Citometria în flux este utilizată pentru a determina starea imunitară (conținutul principalelor populații de limfocite, conținutul de citokine intracelulare și extracelulare, activitatea funcțională a celulelor NK, activitatea de fagocitoză etc.).

Sub formă de tulbureală numită precipitat. Se formează prin amestecarea antigenelor și anticorpilor în cantități echivalente; un exces al unuia dintre ele reduce nivelul de formare a complexului imun. Reacția de precipitare se desfășoară în eprubete (reacție de precipitare inelară), în geluri, medii nutritive etc. Sunt răspândite varietăți ale reacției de precipitare în agar semi-lichid sau gel de agaroză: imunodifuzie dublă conform Ouchterlony, imunodifuzie radială, imunoelectroforeză , etc.
Reacția de precipitare inelară. Reacția se efectuează în tuburi înguste de precipitare: antigenul solubil este stratificat pe serul imunitar. Cu un raport optim de antigen și anticorpi, la limita acestor două soluții se formează un inel opac de precipitat (Fig. 7.50). Dacă extractele de țesut fierte și filtrate sunt folosite ca antigene în reacție, atunci această reacție se numește reacție de termoprecipitare (reacția Ascoli, în care este detectată haptena de antrax).

Orez. 7.50.

Reacție de imunodifuzie dublă Ouchterlony.

Pentru a stabili reacția, se toarnă un strat subțire de gel de agar topit pe o placă de sticlă și după întărire, se decupează godeuri în ea. Antigenele și serurile imune sunt plasate separat în godeurile gelului, care difuzează unul spre celălalt. La punctul de întâlnire, în proporţii echivalente, ele formează un precipitat sub formă de dungă albă (Fig. 7.51). În sistemele multicomponente, între godeurile cu antigeni și anticorpi apar mai multe linii de precipitat; Pentru antigene identice, liniile de precipitat fuzionează, iar pentru antigenele neidentice, acestea se intersectează.

Orez. 7,51

Serul imunitar cu gel de agar topit este turnat uniform pe pahar. După întărirea în gel, se fac godeuri în care antigenul (Ag) este plasat în diferite diluții. Antigenul, difuzând în gel, formează zone de precipitare în inel în jurul godeurilor cu anticorpi. Diametrul inelului de precipitare este proporțional cu concentrația antigenului (Fig. 7.52). Reacția este utilizată pentru determinarea imunoglobulinelor de diferite clase, componente ale sistemului complementului etc. în serul sanguin.

Orez. 7,52.

O combinație de electroforeză și imunoprecipitare: un amestec de antigene este introdus în godeurile gelului și separat în gel folosind electroforeză, apoi se adaugă ser imun în canalul de gel paralel cu zonele de electroforeză. Anticorpii din serul imun difuzează în gel și formează linii de precipitare la locul „întâlnirii” cu antigenul (Fig. 7.53).

Orez. 7,53.

Reacția de floculare (după Ramon) (din lat. flocul- fulgi de lână) - apariţia opalescenţei sau a masei floculente (imunoprecipitare) într-o eprubetă în timpul reacţiei toxină-antitoxină sau toxoid-antitoxină (Fig. 7.54). Este utilizat pentru determinarea activității serului antitoxic sau a toxoidului.

Orez. 7,54.

Tulpinile agentului cauzal al difteriei - C. diphtheriae pot fi toxigenice (producând exotoxină) și non-toxigenice. Formarea unei exotoxine depinde de prezența în bacterii a unui profag care poartă o genă toxică care codifică formarea unei exotoxine. În caz de boală, toate izolatele sunt testate pentru toxicitate - producerea de exotoxină difteric folosind reacția de precipitare cu agar (Fig. 7.55).

Orez. 7.55