Bacillus cereus ip 5832 proprietăți culturale și morfologice. Bactisubtil

Bacilul cereus

Trăsături distinctive ale bacililor: sunt reprezentați de tije drepte mari care se colorează pozitiv pentru Gram, sunt capabili să formeze spori în condiții aerobe, singura specie patogenă pentru om este Bacillus anthracis (bacilul antrax), unele specii oportuniste sunt și ele capabile de provocând intoxicații alimentare și infecții spitalicești. Bacilii sunt izolați din sol, apa dulce și de mare, precum și din plante. Pot crește la temperaturi cuprinse între 5 și 75 °C, iar supraviețuirea lor în condiții extreme este facilitată de sporulare. Leziunile spitalicești (pneumonie, septicemie, endocardită, meningită etc.) sunt cauzate de B. subtilis, B. cereus și B. megaterium (Fig. 4, vezi insert color), B. alvei, B. laterosporus, B. pumilus, B thuringiensis și B. sphaericus. Leziunile sunt înregistrate relativ rar, iar dezvoltarea lor la om este facilitată de prevalența pe scară largă a bacteriilor și de rezistența ridicată a sporilor acestora la diferite influențe.

Bacillus cereus este o tijă mobilă omniprezentă, gram-pozitivă, care formează spori.

Poziția sistematică a microorganismului.

Familie

Fungi impcrfecti Eubacteriale Bacilaceae Bacil subtilis

Ele provoacă boli gastrice la oameni (diaree etc.), precum și septicemie, endocardită și leziuni ale sistemului nervos central. Boala este de obicei de scurtă durată și dispare fără niciun tratament, dar au fost raportate și decese izolate. Toxiinfecția alimentară cu Bacillus cereus nu este raportată din cauza numărului relativ scăzut de cazuri de îmbolnăvire cauzate de acesta (până la 1% din total). Incidența bolii variază geografic. Astfel, în unele țări, acestea reprezintă mai puțin de 1% din toate toxiinfecțiile alimentare, în timp ce în altele – mai mult de 30%. Bacillus cereus este izolat din produse relativ des, ceea ce face din acest tip de bacterii un organism de testare indicator semnificativ pentru industria alimentară. Alimentele cu cel mai mare risc de contaminare sunt carnea și produsele lactate, legumele, supele, mirodeniile și, în special, alimentele pentru copii. Aproape toate tulpinile de Bacillus cereus produc toxine. Aproape 95% din izolatele de Bacillus cereus produc enterotoxine citotoxice. Dintre acestea, enterotoxina nehemolitică (NHE) este produsă de mai mult de 90% dintre tulpini, iar hemolizina BL (HBL) este produsă de aproximativ 55% dintre tulpinile studiate. Se crede că HBL și NHE se formează în intestinele pacientului după consumul de alimente contaminate cu celule vegetative sau spori de Bacillus cereus. Pe lângă aceste două toxine, unele tulpini de Bacillus cereus produc o enterotoxină emetică stabilă la căldură (ETE). Se crede că enterotoxina ETE se acumulează inițial în alimente, cel mai adesea în alimente bogate în amidon, cum ar fi orezul și pastele. Din aceste motive, monitorizarea acestor produse pentru conținutul de enterotoxine folosind metode de testare accelerată fiabile devine din ce în ce mai importantă.

Patogenitatea, extinderea bolii

Bacillus cereus - Agar dextroză cazeină-peptonă

Bacillus cereus este un microorganism oportunist care provoacă otrăviri alimentare sporadice la oameni. Bacillus cereus este omniprezent în natură.Rolul etiologic al Bacillus cereus în toxiinfecțiile alimentare a fost studiat și descris inițial de Hauge în 1950. Sursa toxiinfecțiilor alimentare cauzate de Bacillus cereus a fost considerată pentru prima dată a fi produse culinare care conțin amidon din cartofi. Apoi au fost descrise focare de otrăviri similare cauzate de plante, carne, pește și alte produse alimentare. Bacillus cereus se înmulțește cel mai repede în produsele zdrobite (carne tocată, cotlet, cârnați, creme). Nu sunt permise mai mult de 100 de celule/g în materiile prime; prezența Bacillus cereus în alimentele conservate nu este permisă. În carnea conservată sterilizată, în condițiile tehnologice stabilite, nu există celule ale acestei bacterii. Atunci când sporii viabili rămân într-un produs conservat, agentul patogen se poate multiplica în condiții de depozitare a alimentelor conservate la 20 o C. În același timp, pe suprafața produsului apare o acoperire gri, mirosul și consistența acestuia se schimbă. Bacillus cereus poate provoca, de asemenea, sindromul diareic la animale, păsări și insecte la 6-18 ore după consumul de alimente contaminate. Acest lucru se datorează în primul rând mai multor tipuri de toxine (NHE, HBL, bc-D-ENT) conținute în alimentele contaminate și, ulterior, din cauza proliferării bacteriilor în intestine. Acest complex de toxine Bacillus cereus provoacă un efect citotoxic și secreție de lichide în intestin. Când se efectuează un biotest pe șoareci, animalele experimentează necroză cutanată la locul injectării și moartea ulterioară.

În prezent, medicamentele biologice înregistrate oficial bazate pe tulpini slăbite ale microflorei intestinale normale sunt utilizate pe scară largă în practica medicală.

1. Preparate precum bactisubtil. Preparate care contin o cultura pura de Bacillus tulpina IP 5832 cu spori vegetativi in ​​cantitate de minim 1 miliard Normalizeaza echilibrul fiziologic al microflorei intestinale. Sporii bacterieni conținuți în preparate sunt rezistenți la acțiunea sucului gastric și germinează în forme vegetative în intestine. Formele vegetative de bacterii produc enzime care descompun carbohidrații, grăsimile și proteinele, ducând la formarea unui mediu acid care previne procesele de degradare. Medicamentele promovează sinteza normală a vitaminelor B și P în intestine. Disponibil în capsule.

2. Preparatele de tip flonivin BS conțin o cultură pură a tulpinii de bacil 1P5832 (109) cu spori vegetativi. Tulpinile de Bacillus IP5832 sunt imune genetic la toate tipurile de sulfonamide, nistatina și majoritatea antibioticelor cu spectru larg. Disponibil în capsule.

3. Preparatele de tip biosporină conțin Bacillus subtilis, Bacillus lichineformis. Disponibil în capsule.

4. Preparatele de tip bifidumbacterin sunt o masă microbiană de bifidobacteri vii liofilizate într-un mediu de cultură. Sunt cei mai importanți simbioți umani, dominând microflora intestinală sănătoasă atât a copiilor, cât și a adulților. O doză conține cel puțin 108 bifidobacterii vii. Disponibil în tablete, capsule, pungi și sticle.

Eficacitatea bifidobacterinelor lichide este în prezent studiată. Cercetările oamenilor de știință ruși au demonstrat că eficacitatea acestor medicamente împotriva disbacteriozei depășește eficiența bifidobacterinelor uscate. În același timp, efectul terapeutic în timpul terapiei cu bifidobacterine lichide s-a dezvoltat după 1-2 luni, în timp ce utilizarea bifidobacterinelor uscate a condus la ameliorarea simptomelor clinice și de laborator abia după 3-6 luni. Acest lucru se datorează faptului că produsele biologice lichide, în primul rând, conțin un număr mai mare de corpuri microbiene (1011-1015 în 1 ml de volum față de 108 în preparatele uscate), în al doilea rând, nu conțin microfloră străină și, în al treilea rând, viabilitatea microorganismelor preparatelor lichide s-a dovedit a fi semnificativ mai mare. Adică, bifidobacteriile vii își păstrează complet proprietățile fiziologice, drept urmare au un efect terapeutic în perioade scurte de timp. Preparate precum bifiliz dry și bifiform au fost, de asemenea, create pe baza de bifidobacterii vii. Compoziția medicamentelor precum bifiliz include lizozim, datorită căruia are activitate antiinflamatoare, în plus, stimulează procesele metabolice și eritropoieza. În caz contrar, în ceea ce privește proprietățile farmacologice și indicațiile de utilizare, aceste medicamente sunt similare cu medicamentele de tip bifidumbacterin.

5. Preparate precum probioticele lifepack - conțin Bifidobacterium bifidum (5x107 corpuri microbiene în 1 capsulă).

6. Preparatele de tip Bificol sunt preparate biologice complexe uscate bicomponente din microflora bacteriană anaerobă și aerobă vii a intestinului uman, tulpini de bifidobacterii (Bifidobacterium bifidum I) și Escherichia coli (Escherichia coli M-17). Sunt o cultură liofilizată de bacterii co-crescute din tulpinile specificate. 1 doză de medicament conține cel puțin 107 bifidobacterii vii și cel puțin 107 Escherichia coli M-17. Disponibil în sticle.

7. Preparatele precum colibacterina sunt un liofilizat de bacterii vii ale tulpinii active antagonic de Escherichia coli M-17, au activitate antagonistă împotriva unei game largi de microorganisme patogene și condiționat patogene, normalizând astfel echilibrul fiziologic al microflorei intestinale. Disponibil în fiole și tablete.

8. Preparatele de tip lactobacterin sunt un liofilizat de lactobacili vii. Lactobacilii fac parte din microflora normală. Mediul acid creat de lactobacili promovează dezvoltarea florei bifide și a altor microflore normale în intestin, deoarece este optim pentru aceste bacterii și, prin urmare, menține și reglează echilibrul fiziologic al microflorei intestinale. Disponibil în fiole, tablete și supozitoare.

9. Preparatele precum acipolul sunt un amestec de lactobacili vii acidophilus și boabe de chefir încălzite. Medicamentele au o activitate biochimică mare de formare a acidului și antagonistă. Boabele de chefir încălzite sunt un imunomodulator care stimulează apărarea organismului. Disponibil în sticle și tablete.

10. Preparatele de tip acylact sunt un liofilizat de lactobacili acidofili vii. Disponibil în sticle.

11. Preparatele tipalinex sunt una dintre cele mai echilibrate eubiotice, care contine bacterii vii liofilizate: Lactobacillus acidophilus, Bifidumbakterium infantis v.liberorum, Streptococcus faecium. Aceste bacterii sunt reprezentative ale microflorei intestinale normale și sunt rezistente la antibiotice și agenți chimioterapeutici. Bacteriile lactice, producătoare de acizi organici (lactic, acetic, propilenă), creează un mediu acid în intestin, care este nefavorabil pentru dezvoltarea microorganismelor patogene și condiționat patogene. Ca urmare, echilibrul fiziologic al microflorei intestinale este normalizat. În plus, bacteriile lactice stabilizează membranele celulelor epiteliale intestinale, participă la procesarea monozaharidelor și reglează echilibrul electrolitic în intestin. Pe lângă efectul eubiotic, combinația de microorganisme incluse în medicament oferă și efecte bactericide și antidiareice. Disponibil în capsule.

12. Preparatele de tip Nutrolin B conțin lactobacili sporogeni și vitaminele B, B2, B6, PP. Disponibil sub formă de capsule, tablete și sirop.

13. Preparatele de tip Travis contin Lactobacillus Acidophilus, Lactobacillus Bulgaricus, Bacillus Bifidum, Streptococcus thermophilus. Disponibil în capsule.

14. Preparatele de tip hilak sunt preparate sub formă de picături pentru administrare orală, care conțin un concentrat steril de produse metabolice ale substanțelor pentru formarea acidului lactic cu produse metabolice ale simbioților gram-pozitivi și gram-negativi ai microflorei intestinale, precum și aminoacizi, acizi grași volatili cu lanț scurt, acid lactic biosintetic, tampon lapte-salin, lactoză. Medicamentele ajută la menținerea acidității în intestine în cadrul normei fiziologice, ceea ce duce la normalizarea florei intestinale saprofite și creează condiții nefavorabile pentru viața microorganismelor patogene. Sub influența medicamentelor, sinteza naturală a vitaminelor B și K este normalizată. Acizii grași volatili cu lanț scurt conținuti în medicamente asigură restabilirea microflorei intestinale deteriorate în bolile infecțioase ale tractului gastrointestinal, cresc capacitatea de regenerare a celulele țesutului tegumentar al peretelui intestinal și restabilirea echilibrului apă-electrolitic perturbat în lumenul intestinal.

15. Preparatele de tip enterol contin Saccharomyces boulardii (drojdie medicinala) liofilizata. Au efect antimicrobian, sunt antagoniști ai microorganismelor patogene și condiționat patogene: clostridii, stafilococi, candida și lamblia. Creșterea apărării imune locale ca urmare a creșterii imunoglobulinelor. Au efect antitoxic și îmbunătățesc trofismul mucoasei intestinale. Disponibil sub formă de pulbere, în plicuri și capsule.

Cuprinsul subiectului „Agent cauzal de antrax. Manifestări clinice ale infecției cu antrax. Bacillus cereus.”:

Bacilul cereus. Morfologia bacilului cereus. Proprietățile culturale ale bacilului cereus. Clinica de otrăvire cu bacil cereus. Principiile diagnosticului microbiologic al bacilului cereus. Identificarea bacilului cereus.

Bacilul cereus- o bacterie saprofită a solului, răspândită în natură. Bacteriile contaminează adesea produsele alimentare, provocând toxiinfecții alimentare. Fenomenele de intoxicație sunt mediate de enterotoxină. Este format din bacterii care cresc din spori rezistenti la anumite conditii de prelucrare termica a produselor alimentare (de obicei legume). Bacteriile produc toxine numai in vivo, în timpul germinării sporilor. În ultimii ani, s-au remarcat și infecții spitalicești cauzate sporadic de B. cereus - bacteriemie, endocardită și meningită la persoanele cu organe protetice, catetere, la pacienții cu tulburări hemodinamice, precum și la cei care au primit timp de o perioadă citostatice și imunosupresoare. perioadă lungă de timp. Leziunile sunt severe și adesea fatale.

Morfologia și proprietățile culturale ale bacilului cereus

Morfologic Bacillus cereus seamănă cu un bacil de antrax; principalele diferenţe sunt mobilitatea şi activitatea hemolitică. În frotiuri, bacteriile sunt aranjate într-un model de gard. Temperatura optimă pentru creștere este de 30 °C; pH optim 7-9,5. Pe agar, agentul patogen formează colonii „răspândite” cu margini zimțate; pe CA, coloniile sunt înconjurate de o zonă largă de hemoliză (vezi Fig. 4 insert). În timp, coloniile capătă un aspect ceros caracteristic [din lat. acum, ceară, lumânare]. În mediile lichide, ele formează o peliculă delicată la suprafață, un sediment alb de fulgi și tulbureala bulionului. Bacteriile prezintă activitate proteolitică ridicată și lichefiază gelatina în 1-4 zile; toate tulpinile produc lecitinaza si acetoina. Ele formează acid în mediile care conțin glucoză și maltoză.

Manifestări clinice ale intoxicației cu bacil cereus

Bacilul cereus provoacă două tipuri de intoxicații alimentare (gastroenterita).

Intoxicatia cu Bacillus cereus primul tip se caracterizează printr-o perioadă scurtă de incubație (aproximativ 4-5 ore); Caracterizat prin diaree și vărsături debilitante. Boala se dezvoltă la consumul de alimente contaminate cu un număr mare de microorganisme.

Intoxicatia cu Bacillus cereus Al doilea tip de otrăvire are o perioadă de incubație mai lungă (aproximativ 17 ore). Pacienții se plâng de crampe, dureri abdominale și diaree. Acest set de simptome este adesea confundat cu o intoxicație alimentară cauzată de clostridii.

Principiile diagnosticului microbiologic al bacilului cereus

Semn de diagnostic al bacilului cereus luați în considerare detectarea în produsele alimentare suspecte a mai mult de 10 5 bacterii în 1 g/ml de produs sau 10 2 -10 3 bacterii în 1 g/ml de fecale și vărsături sau apă de spălat. Principalele diferențe dintre B. cereus și B. anthracis sunt activitatea hemolitică, motilitatea, rezistența la penicilină, lichefierea rapidă a gelatinei și nepatogenitatea la șoarecii albi.

Invenţia se referă la domeniul medicinei, şi anume microbiologie, şi poate fi utilizată în laboratoarele bacteriologice pentru a detecta activitatea antagonistă a tulpinii Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893). Co-incubarea se efectuează într-o soluție fiziologică a tulpinii izolate de Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) într-o cultură pură și cultura pură izolată a unui microorganism patogen oportunist (OPM) din fecalele pacientului. Amestecul rezultat este semănat folosind Gold pe agar nutritiv cu și fără penicilină la o concentrație de 0,01 U/ml și dacă se detectează o scădere a cantității de UPM pe mediul cu penicilină în comparație cu cantitatea de UPM pe mediu fără acesta. , prezența activității antagoniste a tulpinii de Bacillus cereus IP 5832 este determinată (ATCC 14893) împotriva tulpinii UPM, în timp ce eubioticul este evaluat ca eficient împotriva tulpinii UPM izolată de la pacient în timpul testării pentru disbioza intestinală. Invenţia asigură suprimarea tulpinii de Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) fără a compromite germinarea culturilor de testare UPM. 3 mese

Invenția se referă la domeniul medicinei și anume microbiologie și poate fi utilizată în laboratoarele bacteriologice pentru identificarea activității antagoniste a tulpinii Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) în scopul evaluării individuale a eficacității eubioticelor, principalul activ. principiul căruia este tulpina de Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893), în raport cu microorganismele oportuniste izolate de la un pacient în timpul unui studiu pentru disbioza intestinală. Invenția poate fi utilizată și în gastroenterologie pentru selecția individuală a eubioticelor, al căror ingredient activ principal este tulpina de Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893), în tratamentul disbiozei intestinale.

Printre medicamentele pentru corectarea microbiocenozei intestinale alterate, eubioticele, destinate suprimarii microorganismelor patogene și oportuniste, ocupă un loc important. Cel mai adesea, eubioticele includ reprezentanți ai genului Bacillus, care nu sunt reprezentanți ai microflorei intestinale normale, sunt eliminate imediat după retragere și sunt antagoniști puternici ai microorganismelor neînrudite datorită producției de lizozim, enzime proteolitice și bacteriocine. Se știe că bacilii suprimă cel mai eficient enterobacterii patogene și unele microorganisme oportuniste care colonizează biotopul intestinal: S. aureus, Candida spp., E. coli, P. aeruginosa, K. pneumoniae și alte enterobacterii oportuniste.

Unul dintre cele mai utilizate medicamente eubiotice în multe țări este medicamentul „Baktisubtil” (Franța), al cărui ingredient activ principal este tulpina de Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893). Este cunoscut și eubioticul „Flonivin”, al cărui ingredient activ principal este și tulpina de Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893), BS Producător: Galenika, A.D., Serbia.

Tulpinile industriale din genul Bacillus nu formează biofilme, deoarece proprietățile lor adezive la celulele epiteliale intestinale sunt slabe. Pe baza faptului că activitatea tulpinii Bacillus cereus are loc în lumenul intestinal și este asociată în primul rând cu activitatea antagonistă ridicată a acestei tulpini, și nu cu relații competitive pentru locurile de atașare la mucoasă, atunci eficacitatea eubioticelor, principalul principiu activ al căruia este tulpina de Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893), în raport cu microorganismele oportuniste izolate de la un pacient în timpul diagnosticului de disbioză intestinală, poate fi judecat după prezența sau absența activității antagoniste a tulpinii Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893).

Bacteriocinele sau substanțele asemănătoare bacteriocinei sunt produse de bacili în principal extracelular și sunt capabile să se acumuleze în mediul nutritiv. Datorită acestui fapt, teoretic, activitatea antagonistă a bacililor poate fi detectată utilizând diverse modificări ale metodelor de antagonism direct sau întârziat, utilizate în mod tradițional doar pentru a detecta antagonismul lacto- și bifidobacteriilor probiotice: metoda striurilor, metoda antagonismului întârziat Frederick cu uciderea intermediară a tulpina producătoare cu cloroform, metoda cu agar dublu strat .

Pentru a identifica activitatea antagonistă a tulpinii Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893), am folosit metodele de mai sus.

Pentru a evalua activitatea antagonistă a bacililor prin metoda antagonismului direct, o suspensie dintr-o cultură zilnică de B.cereus a fost întinsă pe diametrul unei plăci Petri cu agar nutritiv la o concentrație de 1×109 conform standardului de turbiditate optică GISC. numit după. L.A. Tarasevici. Culturile de microorganisme oportuniste izolate în timpul diagnosticului de disbioză intestinală au fost semănate perpendicular. Incubat la 37°C timp de 24 de ore. Prezența activității antagoniste a fost luată în considerare de prezența întârzierii creșterii în tulpinile de testat.

La evaluarea activității antagoniste a bacililor folosind metoda antagonismului întârziat, culturile test de microorganisme oportuniste au fost inoculate la 24 și 48 de ore după inocularea bacililor.

În opțiunile luate în considerare pentru evaluarea antagonismului tulpinii Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893), conform propriilor noastre date, tulpina nu a prezentat activitate antagonistă împotriva culturilor test de microorganisme oportuniste (80 de tulpini). Unele tulpini active mobile de microorganisme oportuniste (P. aeruginosa, E. coli) au crescut pe suprafața coloniilor bacilare.

Se crede că metaboliții bacililor au un efect antagonist mai puternic decât culturile vii. Prin urmare, am folosit și metoda antagonismului întârziat cu uciderea intermediară a tulpinii producătoare cu cloroform. Tulpina de Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) a fost inoculată în agar solidificat cu 1,5% nutrient turnat în vase Petri și crescută timp de 48 de ore la 37°C. După incubare, cultura rezultată a fost ucisă cu vapori de cloroform și a fost stratificată o suspensie a culturii de testare a microorganismului oportunist. Pentru a face acest lucru, se amestecă 0,1 ml de cultură într-o concentrație finală de 108 celule conform standardului de turbiditate optică cu 2,5-3 ml de agar semi-lichid 0,7% topit și răcit la o temperatură de 46-48°C. Dacă există capacitatea de a produce bacteriocine, trebuie observată o zonă de inhibare a creșterii tulpinii de testat în jurul coloniei tulpinii de Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893). Activitatea antagonistă a bacililor nu a fost detectată, deoarece s-a observat creșterea culturilor de testare de „gazon” UPM pe suprafața mediului cu bacteriocine presupuse.

Am obținut date similare utilizând o metodă modificată cu agar dublu strat cu inoculare de bacili cu un gazon, urmată de uciderea și stratificarea culturii de testare UPM.

Cea mai apropiată în esență tehnică de metoda revendicată este metoda cu agar inversat, care este descrisă pentru identificarea activității antagoniste a probioticelor care conțin Bacillus subtilis și Escherichia coli împotriva drojdiei oportuniste. Pentru a face acest lucru, tulpini de Bacillus subtilis și Escherichia coli sunt semănate pe un mediu nutritiv solid, după 2 zile agarul este răsturnat și o doză de semințe pretitrată de drojdie este semănată pe reversul acesteia. Se incubează timp de 24 de ore în condiții aerobe la 37°C. Prezența antagonismului este detectată cantitativ prin suprimarea creșterii drojdiei în comparație cu o inoculare similară fără tulpini probiotice.

Metoda cu agar inversat este descrisă și testată pentru a evalua efectele antifungice ale probioticelor care conțin Bacillus subtilis și Escherichia coli. Dar efectul antagonist asupra altor microorganisme oportuniste (nu drojdii oportuniste) nu a fost evaluat. În plus, metoda originală implică selectarea unei doze de semințe de drojdie la care nu ar crește mai mult de 70 de colonii pe agar. Acest lucru necesită titrare și cercetări suplimentare atunci când se testează fiecare tulpină. Testarea acestei metode folosind tulpina producătoare de eubiotice Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) și 80 de culturi de testare de microorganisme oportuniste izolate în timpul diagnosticului de disbioză intestinală nu ne-a permis să identificăm un singur caz de activitate antagonistă a tulpinii Bacillus cereus IP 5832 ( ATCC 14893).

Pentru a evalua activitatea antagonistă a probioticelor care conțin lacto și bifido, sunt descrise și metode de co-cultivare într-un mediu lichid cu diferite metode de evaluare indirectă care nu implică însămânțarea ulterioară pe un mediu nutritiv solid pentru a determina numărul de UPM suprimate.

Astfel, nici una dintre metodele cunoscute pentru detectarea activității antagoniste a lacto- și bifidobacteriilor probiotice, conform autorilor, nu ne-a permis să detectăm activitatea antagonistă a tulpinii Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) împotriva microorganismelor oportuniste izolate de la un pacient în timpul un studiu pentru disbioza intestinală.

În literatura de specialitate, nu am găsit nici o modalitate de a evalua individual eficacitatea medicamentului „Baktisubtil” sau a altor medicamente eubiotice, al cărui ingredient activ principal este tulpina de Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893), împotriva microorganismelor oportuniste izolate dintr-un pacient specific în timpul unui studiu pentru disbacterioza intestinelor.

Obiectivul invenţiei este de a identifica activitatea antagonistă a tulpinii Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) împotriva microorganismelor oportuniste izolate de la un anumit pacient în timpul unui studiu pentru disbioza intestinală.

Rezultatul tehnic al invenţiei este suprimarea tulpinii eubiotice Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) fără a compromite germinarea culturilor de testat.

Rezultatul tehnic se obține prin izolarea unei culturi pure de microorganisme oportuniste din fecalele subiectului, apoi izolarea tulpinii de Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) într-o cultură pură, după care tulpina de Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) este co. -incubat cu fiecare dintre tulpinile de microorganisme oportuniste in solutie fiziologica, urmata de insamantarea Gold pe agar nutritiv cu penicilina in concentratie de 0,01 U/ml si fara aceasta, si la identificarea unei scaderi a numarului de microorganisme oportuniste pe un mediu cu penicilină în comparație cu numărul de microorganisme oportuniste pe un mediu fără penicilină, se determină prezența activității antagoniste a tulpinii Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) împotriva unei tulpini a unui microorganism oportunist, în timp ce eubioticul este evaluat ca eficient împotriva unui tulpină a unui microorganism oportunist izolat de la un anumit pacient într-un studiu pentru disbioza intestinală.

Metoda se realizează după cum urmează:

Folosind metode standard, o cultură pură de microorganisme oportuniste este izolată din fecalele pacientului și din tulpina de Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) într-o cultură pură, care este principalul principiu activ al eubioticului. Am izolat o cultură pură de tulpina Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) din eubioticul „Baktisubtil”. 1 ml dintr-o suspensie dintr-o cultură de testare a unui microorganism oportunist în soluție fiziologică într-o concentrație finală de 10 9 celule conform standardului de turbiditate optică se amestecă cu 1 ml dintr-o suspensie de Bacillus cereus în aceeași concentrație. Amestecul este incubat timp de 48 de ore la 37°C. Apoi semănatul se efectuează conform Gold. Pentru aceasta, însămânțarea cantitativă se efectuează folosind o buclă de măsurare cu diametrul de 3 mm și capacitatea de 2 μl pe agar nutritiv cu penicilină la o concentrație de 0,01 U/ml pentru suprimarea bacililor și pe un mediu fără antibiotice pentru controlul creșterea ambelor tipuri de culturi. Pentru a exclude alți posibili factori care suprimă creșterea UPM și a bacililor (lipsa unei baze nutritive), însămânțarea de control a monoculturii se efectuează în paralel după incubare în condiții similare. Numărul de microorganisme crescute se calculează conform tabelului 1 - Tabel de calcul pentru determinarea numărului de bacterii în 1 ml lichid. Dacă din fecalele pacientului sunt detectate mai multe UPM, procedura descrisă este efectuată cu fiecare dintre UPM. Dacă pe mediul cu penicilină se detectează o scădere a numărului de microorganisme oportuniste comparativ cu însămânțarea martor, se determină prezența activității antagoniste a tulpinii Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) față de tulpina microorganismului oportunist izolat din pacient în timpul studiului pentru disbioză intestinală. Prezența sau absența activității antagoniste a tulpinii Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) este un criteriu de evaluare pentru determinarea eficacității eubioticelor, al căror principiu activ principal este tulpina Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893), împotriva unei tulpini de un microorganism oportunist izolat de la un anumit pacient în timpul studiului pentru disbioza intestinală. În prezența activității antagoniste a tulpinii Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893), eubioticul este evaluat ca eficient împotriva tulpinii unui microorganism oportunist izolat de la acest pacient în timpul unui test pentru disbioza intestinală.

Caracteristicile distinctive esențiale ale metodei propuse sunt:

Izolați o cultură pură de microorganisme oportuniste din fecalele subiectului;

Se izolează o cultură pură a tulpinii Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893), care este principalul principiu activ al eubioticului;

Apoi tulpina de Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) este co-incubată cu fiecare dintre tulpinile de microorganisme oportuniste în soluție fiziologică;

Semănarea ulterioară a amestecului pe un mediu nutritiv conform Gold;

Semănatul se efectuează pe agar nutritiv cu și fără penicilină la o concentrație de 0,01 U/ml;

Dacă se detectează o scădere a numărului de microorganisme oportuniste pe un mediu cu penicilină în comparație cu numărul de microorganisme oportuniste pe un mediu fără penicilină, prezența activității antagoniste a tulpinii Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) împotriva tulpinilor de microorganisme oportuniste. este determinat;

În prezența activității antagoniste a tulpinii de Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) împotriva tulpinilor de microorganisme oportuniste, eubioticul este evaluat ca eficient împotriva unei tulpini de microorganisme oportuniste izolate de la un anumit pacient în timpul testării pentru disbioza intestinală.

Relația cauză-efect dintre trăsăturile distinctive esențiale și rezultatul obținut:

Individualitatea identificării activității antagoniste a tulpinii Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) împotriva microorganismelor oportuniste și, la rândul său, individualitatea evaluării eficacității eubioticelor, al căror principiu activ principal este tulpina Bacillus cereus IP 5832 (ATCC). 14893) împotriva microorganismelor oportuniste microorganismele izolate de la un pacient în timpul unui studiu pentru disbioza intestinală sunt asigurate prin izolarea microorganismelor oportuniste într-o cultură pură din fecalele subiectului și izolarea unei culturi pure de tulpina Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893), urmată de incubare comună în soluție salină și placare conform Gold pe un mediu nutritiv.

Semănatul conform Aurului pe un mediu nutritiv este necesar pentru a determina numărul de UPM suprimate.

Agar nutritiv cu penicilină la o concentrație de 0,01 U/ml vă permite să suprimați tulpina eubiotică de Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893), fără a compromite germinarea culturilor de testat, ceea ce face posibilă detectarea activității antagoniste a B. cereus împotriva microorganismelor oportuniste.

Ca culturi de testare, am studiat tulpini de microorganisme oportuniste izolate de la pacienții cu disbioză intestinală - câte 20 izolate de S. aureus, S. epidermidis, Klebsiella spp., E. coli cu proprietăți tipice, E. coli cu activitate enzimatică alterată, Enterobacter spp. ., Citrobacter spp., P. aeruginosa.

1 ml dintr-o suspensie de culturi test UPM în soluţie fiziologică la o concentraţie finală de 109 celule conform standardului de turbiditate optică a fost amestecat cu 1 ml dintr-o suspensie de tulpina Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893), la aceeaşi concentraţie. Pentru a evita proliferarea bacililor sau a bacteriilor oportuniste, utilizarea oricăror medii de cultură lichide pentru incubarea comună a fost considerată inadecvată. Amestecul a fost incubat timp de 48 de ore la 37°C. S-a presupus că în acest timp UPM s-a stins sub influența metaboliților bacililor. Semănarea cantitativă a fost efectuată folosind o buclă de măsurare cu un diametru de 3 mm și o capacitate de 2 μl conform Gold. Au fost semănate pe agar nutritiv cu antibiotice pentru suprimarea bacililor și pe mediu fără antibiotice pentru a controla creșterea ambelor tipuri de culturi. Pentru a exclude alți posibili factori care suprimă creșterea UPM și a bacililor (lipsa unei baze nutritive), însămânțarea de control a monoculturii a fost efectuată în paralel după incubare în condiții similare. Numărul de microorganisme crescute a fost calculat conform tabelului 1 - Tabel de calcul pentru determinarea numărului de bacterii în 1 ml lichid 1.

Pentru a suprima creșterea bacililor pe mediul de însămânțare, a fost selectat anterior un aditiv selectiv - un antibiotic într-o concentrație care suprimă bacilii, dar nu inhibă creșterea microorganismelor, pe baza datelor privind rezistența pe scară largă la penicilină și streptomicina. bacterii oportuniste testate (în special enterobacterii). S-au adăugat diferite concentrații de antibiotice la agar nutritiv topit și răcit la 46-48°C. La testarea mediului cu streptomicina, medicamentul a fost adăugat la concentrații de 1,0 U/ml, 0,5 U/ml, 0,25 U/ml de mediu. 25 de culturi de UPM și tulpina de Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) au fost inoculate la o concentrație de 109 celule/ml pe medii cu și fără antibiotice. Cu toate acestea, creșterea bacililor nu a fost complet suprimată - de la 109 la 104 celule/ml la o concentrație maximă de streptomicină de 1,0 U/ml de mediu. În același timp, culturile UPM (Klebsiella spp., Enterobacter spp., E. coli atipice, Citrobacter spp., S. aureus) izolate în timpul diagnosticului de disbioză au fost suprimate în diferite grade de streptomicina în 74 (96%) teste ( Tabelul 2 - Antibiotic de selecție pentru suprimarea tulpinii Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) și creșterea simultană a microorganismelor oportuniste).

La testarea mediului cu penicilină, medicamentul a fost adăugat la concentrații de 0,001 U/ml, 0,01 U/ml, 0,1 U/ml, 1,0 U/ml de mediu. Semănatul și înregistrarea rezultatelor au fost efectuate în mod similar. Enterobacteriile oportuniste nu au fost suprimate nici măcar printr-o concentrație maximă de penicilină de 1,0 U/ml de mediu. S-a observat o suprimare mai intensă a S. aureus. Un nivel acceptabil de germinare a bacteriilor oportuniste, inclusiv S. aureus, cu suprimarea completă simultană a tulpinii Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) a fost observat la o concentrație de penicilină de 0,01 U/ml de mediu nutritiv (Tabelul 2 - Selectarea antibioticului pentru suprimarea tulpinii Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) și creșterea simultană a microorganismelor oportuniste).

În prezența activității antagoniste a tulpinii Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) împotriva microorganismelor oportuniste, eubioticul este evaluat ca eficient împotriva unei tulpini de microorganisme oportuniste izolate de la un anumit pacient în timpul testării pentru disbioza intestinală.

Am selectat activitatea antagonistă a tulpinii Bacillus cereus IP 5832 ca criteriu de evaluare pentru evaluarea individuală a eficacității eubioticelor, al cărui principiu activ principal este tulpina Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893), în legătură cu o tulpină de microorganism oportunist. izolat de la acest pacient în timpul unui studiu pentru disbioza intestinală.(ATCC 14893). Acest lucru se explică prin faptul că activitatea tulpinii Bacillus cereus are loc în lumenul intestinal și este asociată în primul rând cu activitatea antagonistă ridicată a acestei tulpini, și nu cu relații competitive pentru locurile de atașare la mucoasă.

Setul de caracteristici distinctive esențiale ale metodei propuse este nou și face posibilă suprimarea tulpinii eubiotice de Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) fără a compromite germinarea culturilor de testat, ceea ce, la rândul său, asigură identificarea activității antagoniste a tulpina eubiotică Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) în legătură cu microorganismele oportuniste izolate în timpul unui studiu pentru disbioza intestinală de la un pacient, care poate fi utilizată pentru evaluarea individuală a eficacității eubioticelor, al cărui principiu activ principal este Bacillus cereus tulpina IP 5832 (ATCC 14893), în legătură cu microorganismele oportuniste izolate de la un pacient la examinarea pentru disbioză intestinală.

Exemple de implementare specifică:

Un examen bacteriologic al scaunului pentru disbioza intestinală (Nr. 247) a evidențiat Citrobacter freundii în cantitate de 5×10 6 UFC/g.

1 ml dintr-o suspensie dintr-o cultură pură de Citrobacter freundii, izolată din fecalele pacientului, în soluție fiziologică la o concentrație finală de 10 celule conform standardului de turbiditate optică a fost amestecat cu 1 ml dintr-o suspensie dintr-o cultură pură de Bacillus cereus tulpina IP 5832 (ATCC 14893), izolată din eubioticul „Bactistatin”, în aceeași concentrație. Amestecul a fost incubat timp de 48 de ore la 37°C. Apoi însămânțarea cantitativă a fost efectuată folosind o buclă de măsurare cu un diametru de 3 mm și o capacitate de 2 μl în aur pe agar nutritiv cu penicilină la o concentrație de 0,01 U/ml pentru suprimarea bacililor și pe un mediu fără antibiotice pentru a controla creșterea. a ambelor tipuri de culturi. Numărul de microorganisme crescute a fost calculat conform Tabelului 1 - Tabel de calcul pentru determinarea numărului de bacterii în 1 ml de lichid.

În varianta martor, concentrația de Citrobacter freundii a fost de 10 8 UFC/g, în varianta experimentală 5 × 10 UFC/g. Activitatea antagonistă a tulpinii Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) împotriva tulpinii Citrobacter freundii (Nr. 247) a fost dezvăluită. Medicamentul „Baktisubtil” este determinat a fi eficient împotriva tulpinii de Citrobacter freundii izolată de la un pacient în timpul unui studiu pentru disbioza intestinală.

Un examen bacteriologic al scaunului pentru disbioza intestinală (nr. 512) a evidențiat S aureus în cantitate de 10 6 CFU/g.

1 ml dintr-o suspensie dintr-o cultură pură de S aureus izolată din fecalele pacientului în soluție fiziologică la o concentrație finală de 109 celule/ml conform standardului de turbiditate optică a fost amestecat cu 1 ml dintr-o suspensie dintr-o cultură pură de Bacillus. cereus tulpină IP 5832 (ATCC 14893), izolată din eubioticul „Baktisubtil”, în aceeași concentrație. Amestecul a fost incubat timp de 48 de ore la 37°C. Apoi însămânțarea cantitativă a fost efectuată folosind o buclă de măsurare cu un diametru de 3 mm și o capacitate de 2 μl în aur pe agar nutritiv cu penicilină la o concentrație de 0,01 U/ml pentru suprimarea bacililor și pe un mediu fără antibiotice pentru a controla creșterea. a ambelor tipuri de culturi. Numărul de microorganisme crescute a fost calculat conform Tabelului 1 - Tabel de calcul pentru determinarea numărului de bacterii în 1 ml de lichid.

În varianta martor, concentrația de S aureus a fost de 5×10 6 CFU/g, în varianta experimentală - 10 6 CFU/g. Activitatea antagonistă a tulpinii Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) împotriva tulpinii S aureus nu a fost detectată (nr. 512). Medicamentul „Baktisubtil” este determinat a fi ineficient împotriva tulpinii S aureus izolată de la un pacient în timpul unui test pentru disbioza intestinală.

Un examen bacteriologic al scaunului pentru disbioza intestinală (Nr. 429) a relevat Klebsiella pneumoniae în cantitate de 10 4 UFC/g, Enterobacter agglomerans în cantitate de 10 6 UFC/g, Citrobacter freundii în cantitate de 10 6 UFC/g, Staphylococcus aureus în cantitate de 10 4 CFU/g. G.

1 ml dintr-o suspensie dintr-o cultură pură din fiecare dintre tulpinile de microorganisme oportuniste izolate de la un pacient, în soluție fiziologică la o concentrație finală de 109 celule conform standardului de turbiditate optică, a fost amestecat cu 1 ml dintr-o suspensie de un cultura pură a tulpinii de Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893), izolată dintr-un eubiotic „Baktisubtil” în aceeași concentrație. Astfel, s-au obţinut 4 amestecuri de tulpini de microorganisme oportuniste şi bacili. Amestecuri au fost incubate timp de 48 de ore la 37°C. Apoi, însămânțarea cantitativă a fost efectuată folosind o buclă de măsurare cu un diametru de 3 mm și o capacitate de 2 μl în aur pe agar nutritiv cu penicilină la o concentrație de 0,01 U/ml pentru suprimarea bacililor și pe un mediu fără antibiotice pentru a controla creșterea fiecărei culturi izolate. Numărul de microorganisme crescute a fost calculat conform Tabelului 1 - Tabel de calcul pentru determinarea numărului de bacterii în 1 ml de lichid.

În varianta martor, concentrația de Klebsiella pneumoniae a fost de 10 8 UFC/g, în varianta experimentală de 10 6 UFC/g. În varianta martor, concentraţia de Enterobacter agglomerans a fost de 10 7 UFC/g, în varianta experimentală de 10 5 UFC/g. În varianta martor, concentrația de Staphylococcus aureus a fost de 10 8 CFU/g, în varianta experimentală 5×10 6 CFU/g. În varianta martor, concentrația de Citrobacter freundii a fost de 10 7 UFC/g, în varianta experimentală de 10 6 UFC/g.

A fost dezvăluită activitatea antagonistă a tulpinii Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) împotriva tulpinilor de Klebsiella pneumoniae, Enterobacter agglomerans, Staphylococcus aureus, Citrobacter freundii. Medicamentul „Baktisubtil” este determinat a fi eficient împotriva acestor tulpini izolate de la un anumit pacient în timpul unui studiu pentru disbacterioză.

Un examen bacteriologic al scaunului pentru disbioza intestinală (nr. 449) a evidențiat Enterobacter agglomerans în cantitate de 10 6 UFC/g, Klebsiella pneumoniae în cantitate de 5×10 4 UFC/g, Citrobacter freundii în cantitate de 10 6 UFC/g. g.

1 ml dintr-o suspensie dintr-o cultură pură din fiecare dintre tulpinile izolate de microorganisme oportuniste în soluție fiziologică la o concentrație finală de 109 celule conform standardului de turbiditate optică a fost amestecat cu 1 ml dintr-o suspensie dintr-o cultură pură de Bacillus cereus tulpina IP 5832 (ATCC 14893), izolată din eubioticul „Baktisubtil”, în aceeași concentrație. Astfel, s-au obţinut 3 amestecuri de tulpini de microorganisme oportuniste şi bacili. Amestecuri au fost incubate timp de 48 de ore la 37°C. Apoi, însămânțarea cantitativă a fost efectuată cu o buclă de măsurare cu un diametru de 3 mm și o capacitate de 2 μl în aur pe agar nutritiv cu penicilină la o concentrație de 0,01 U/ml pentru suprimarea bacililor și pe un mediu fără antibiotice pentru a controla creșterea fiecărei culturi izolate. Numărul de microorganisme crescute a fost calculat conform Tabelului 1 - Tabel de calcul pentru determinarea numărului de bacterii în 1 ml de lichid.

În varianta martor, concentraţia de Enterobacter agglomerans a fost de 108 UFC/g, în varianta experimentală 5×107 UFC/g. În varianta martor, concentrația de Klebsiella pneumoniae a fost de 10 7 UFC/g, în varianta experimentală 5×10 6 UFC/g. În varianta martor, concentrația de Citrobacter freundii a fost de 10 7 CFU/g, în varianta experimentală 5×10 5 CFU/g.

Activitatea antagonistă a tulpinii Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) împotriva tulpinii Citrobacter freundii a fost dezvăluită; activitatea antagonistă a tulpinii Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) împotriva tulpinii Enterobacter agglomerans și a pneumoniei Klebsiella nu a fost detectată. Medicamentul „Baktisubtil” este determinat a fi eficient împotriva tulpinii de Citrobacter freundii și ineficient împotriva tulpinilor de Enterobacter agglomerans și Klebsiella pneumoniae izolate de la acest pacient în timpul unui studiu pentru disbacterioză.

Un examen bacteriologic al scaunului pentru disbioza intestinală (Nr. 461) a evidențiat Klebsiella pneumoniae în cantitate de 10 6 UFC/g și Citrobacter freundii în cantitate de 10 6 UFC/g.

1 ml dintr-o suspensie dintr-o cultură pură din fiecare dintre tulpinile izolate de microorganisme oportuniste în soluție fiziologică la o concentrație finală de 109 celule conform standardului de turbiditate optică a fost amestecat cu 1 ml dintr-o suspensie dintr-o cultură pură de Bacillus cereus tulpina IP 5832 (ATCC 14893), izolată din eubioticul „Baktisubtil”, în aceeași concentrație. Astfel, am obtinut 2 amestecuri de tulpini de microorganisme oportuniste si bacili. Amestecuri au fost incubate timp de 48 de ore la 37°C. Apoi însămânțarea cantitativă a fost efectuată folosind o buclă de măsurare cu un diametru de 3 mm și o capacitate de 2 μl în aur pe agar nutritiv cu penicilină la o concentrație de 0,01 U/ml pentru suprimarea bacililor și pe un mediu fără antibiotice pentru a controla creșterea. a tuturor culturilor izolate. Numărul de microorganisme crescute a fost calculat conform Tabelului 1 - Tabel de calcul pentru determinarea numărului de bacterii în 1 ml de lichid.

În varianta martor, concentrația de Klebsiella pneumoniae a fost de 10 7 UFC/g, în varianta experimentală 5×10 5 UFC/g. În varianta martor, concentrația de Citrobacter freundii a fost de 10 8 CFU/g, în varianta experimentală 5×10 7 CFU/g.

Activitatea antagonistă a tulpinii Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) împotriva tulpinii Klebsiella pneumoniae a fost dezvăluită, iar activitatea antagonistă a tulpinii Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) împotriva tulpinii Citrobacter freundii nu a fost detectată. Medicamentul „Baktisubtil” este determinat a fi eficient împotriva tulpinii Klebsiella pneumoniae și ineficient împotriva tulpinii Citrobacter freundii izolată de la acest pacient în timpul unui studiu pentru disbacterioză.

Folosind mediul dezvoltat cu penicilina la o concentratie de 0,01 U/ml s-a studiat antagonismul tulpinii Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) si 96 de culturi UPM izolate in cantitati semnificative in timpul studiului pentru disbioza intestinala: Citrobacter spp. (16 tulpini), Klebsiella spp. (17), S. aureus (18), Enterobacter spp. (15), E. coli tipic (15), E. coli cu proprietăți atipice (15). Activitatea antagonistă a eubioticului a fost evaluată prin numărul de tulpini de microorganisme testate pe care le-a suprimat (în %) (Tabelul 3 - Antagonismul tulpinii Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) și microorganisme oportuniste).

Studiile au arătat că tulpina studiată de Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) suprimă 17,7% (17 izolate) din tulpinile UPM testate.

Cu toate acestea, scăderea numărului de microorganisme oportuniste a fost nesemnificativă - cu 0,5-2 lg. 79,0% (81 izolate) dintre tulpinile testate s-au dovedit a fi rezistente și chiar capabile de reproducere în prezența unui eubiotic.

Metoda inventiva face posibila suprimarea tulpinii eubiotice Bacillus cereus tulpina IP 5832 (ATCC 14893) fara a compromite germinarea culturilor de testat, care, la randul sau, asigura identificarea activitatii antagoniste a tulpinii eubiotice Bacillus cereus IP 5832 (ATCC). 14893) împotriva unei tulpini de microorganisme oportuniste, izolate în timpul diagnosticului de disbioză intestinală la un pacient, care poate fi utilizată pentru evaluarea individuală a eficacității eubioticelor, al cărui principiu activ principal este tulpina de Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893), împotriva microorganismelor oportuniste izolate de la pacient în timpul unui studiu pentru disbioza intestinală.

tabelul 1
Tabel de calcul pentru determinarea numărului de bacterii în 1 ml de lichid
A	eu	II	III	Cantitate in 1 ml
1-6	-	-		<1000
8-20	-	-	-	3000
20-30	-	-	-	5000
30-60	-	-	-	10000
70-80	-	-	-	50000
100-150	5-10	-	-	100000
nu se pune	20-30	-	-	500000
-"-	40-60	-	-	1 milion
-"-	100-150	10-20	-	5 milioane
-"-	nu se pune	30-40	-	10 milioane
-"-	-"-	60-80	Colonii unice	100 de milioane
masa 2
Selectarea unui antibiotic pentru suprimarea tulpinii Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) și creșterea simultană a microorganismelor oportuniste
Creșterea UMR la o concentrație dată de antibiotic, CFU/ml	Numărul de tulpini UPM crescute la o anumită concentrație de antibiotic, abs (%)
Streptomicina, unități/ml mediu	Penicilina, unitati/ml mediu
1,0	0,5	0,25	1,0	0,01	0,01	0,001
10 8 (identic cu controlul)	1 (4)	8 (32)	10 (40)	16 (64)	19 (76)	22 (88)	23 (92)
10 6	4 (16)	2 (8)	0	4 (16)	3 (12)	3 (12)	2 (8)
10 5	15 (60)	12 (48)	15 (60)	5 (20)	3 (12)	0	0
10 4	3 (12)	3(12)	0	0	0	0	0
<10 4	2 (8)	0	0	0	0	0	0
Creșterea Bacillus cereus la o concentrație dată de antibiotic, CFU/ml	10 4	10 4	10 4	Ots.	Ots.	Ots.	10 4

Tabelul 3
Antagonismul tulpinii Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) și microorganismele oportuniste
Testarea culturilor UPM	Numărul de tulpini	tulpini susceptibile abdominale (%)	Tensiuni rezistente abdominale (%)*
Reducere cu 1 lg	Scade cu 2 lg	Tulpini rezistente totale	Dintre acestea, sunt capabile să crească în prezența unui eubiotic**
Klebsiella spp.	17	1 (5,9)	0	16(94,1)	1 (6.25)
Enterobacter spp.	15	4 (26,7)	1 (6,6)	10 (66,7)	1(10)
Citrobacter spp.	16	5(31,3)	0	11 (68,7)	1 (9,1)
tipic E. coli	15	1 (6,7)	0	14 (93,3)	0
E. coli atipice	15	2(13,3)	0	13 (86,7)	1 (7,7)
S. aureus	20	3 (15,0)	0	17 (85,0)	6 (35,3)
* - numărul de UPM nu s-a modificat în comparație cu controlul sau s-a modificat cu cel mult 0,5 lg ** - numărul de UPM-uri a crescut comparativ cu controlul

Surse de informare

1. Osipova I.G., Mikhailova R.A., Sorokulova I.B., Vasilyeva E.A., Gaiderov A.A. Probiotice cu spori // Jurnal de microbiologie, virologie și imunologie. - 2003. - Nr 3. - P.113-119.

2. Blinkova L.P., Semenova S.A., Butova L.G. şi altele.Activitatea antagonistă a tulpinilor proaspăt izolate de bacterii din genul Bacillus // Jurnal de microbiologie, virologie şi imunologie. - 1994. - Nr 5. - P.71-75.

3. Tulpini de bacterii Bacillus subtilis și Bacillus licheniformis, utilizate ca componente ale unui medicament împotriva infecțiilor virale și bacteriene, și un medicament bazat pe aceste tulpini. / Brevet RU 2142287, publ. 12/10/99. - Taur. N20.

4. O tulpină de bacterii Bacillus subtilis cu un spectru larg de activitate antagonistă. / Brevet RU N2182172, publ. 05/10/02.

5. Gataullin A.G., Mikhailova N.A., Blinkova L.P., Romanenko E.E., Elkina S.I., Gaiderov A.A., Kalina N.G. Proprietățile tulpinilor izolate de Bacillus subtilis și efectul lor asupra microflorei intestinale a șoarecilor experimentali // Journal of Microbiology, Virology and Immunology. - 2004. - Nr 2. - P.91-94.

6. Davydov D.S., Mefed K.M., Osipova I.G., Vasilyeva E.A. Utilizarea la nivel mondial a probioticelor cu spori în practica medicală // Nutriția clinică. - 2007. - Nr. 1-2. - S.A36.

7. Sorokulova I.B. Influența probioticelor din bacili asupra activității funcționale a macrofagelor // Antibiotice și chimioterapie. - 1998. - Nr 2. - P.20-23.

8. Blinkova L.P. Bacteriocine: criterii, clasificare, proprietăți, metode de detectare // Journal of Microbiology, Virology and Immunology. - 2003. - Nr 3. - P.109-113.

9. Postnikova E.A., Efimov B.A., Volodin N.N., Kafarskaya L.I. Căutare tulpini promițătoare de bifidobacterii și lactobacili pentru dezvoltarea de noi produse biologice // Jurnal de microbiologie, epidemiologie și imunologie. - 2004. - Nr 2. P.64-69.

10. Gratia A., Fredericq P. Deversite des souches antibiotiques de Escherichia coli et étendue varibile de leur champ d'action.Ibid: 1031-1033.

11. Fredericq P. Actions antibiotiques reciproques chez les Enterobacteriaceae. REV. Belge Pathol. Med. Exp. 1948, 19 (Supl. 4): 1-107.

12. Ermolenko E.I., Isakov V.A., Zhdan-Pushkina S.Kh., Tets V.V. Evaluarea cantitativă a activității antagoniste a lactobacililor // Jurnal de microbiologie, virologie și imunologie. - 2004. - Nr 5. - P.94-98.

13.Ushakova N.A., Chernukha B.A. Influența șocului de temperatură asupra eficacității biologice a probioticului Bacillus subtilis 8130 // Nutriție clinică. - 2007. - Nr. 1-2. - S.A70.

14. Arzumanyan V.G., Mikhailova N.A., Gaiderov A.A., Basnakyan I.A., Osipova I.G. O metodă cantitativă pentru evaluarea antagonismului întârziat al culturilor de probiotice împotriva drojdiilor oportuniste // Diagnosticare clinică de laborator. - 2005. - Nr 5. P.53-54.

15. Metodă de determinare a activității antagoniste a probioticelor. / Brevet RU Nr. 2187801, publ. 20.08.2002.

16. Zykova N.A., Molokeeva N.V. Nou medicament probiotic „Trilact” // Nutriție clinică. - 2007. - Nr. 1-2. - S.A42.

17. Ghid de utilizare a metodelor unificate de cercetare microbiologică (bacteriologică) în laboratoarele de diagnostic clinic: Anexa 1 la ordinul Ministerului Sănătății al URSS nr. 535. - 1986.

18. Sanford Jay P., Gilbert David N., Moeliering Robert C. Jr., Sande Merle A. Ediția a douăzeci și nouă The Sanford Guide to antimicrobian therapy, 1999.

REVENDICARE

O metodă de evaluare individuală a eficacității eubioticelor, al cărui principiu activ principal este tulpina de Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893), împotriva microorganismelor oportuniste izolate de la un pacient în timpul unui studiu pentru disbioza intestinală, care constă în izolarea microorganismelor oportuniste în stare pură. cultura din fecalele subiectului, apoi Bacillus cereus STRAIN IP 5832 (ATCC 14893) este izolata in cultura pura, dupa care tulpina Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) este co-incubata cu fiecare dintre tulpinile de microorganisme oportuniste in fiziologic. soluție, urmată de însămânțare conform Gold pe agar nutritiv cu și fără penicilină la o concentrație de 0,01 U/ml, și dacă se detectează o scădere a numărului de microorganisme oportuniste pe un mediu cu penicilină față de numărul de microorganisme oportuniste pe un mediu fără penicilină, se determină prezența activității antagoniste a tulpinii Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) împotriva unei tulpini a unui microorganism oportunist, în care eubioticul este evaluat ca eficient împotriva unei tulpini a unui microorganism oportunist izolat de la un anumit pacient atunci când testat pentru disbioza intestinală.

Ca manuscris

Gataullin Airat Gafuanovici

PROPRIETĂȚI BIOLOGICE ALE TULINILOR DE BACILLUS SUBTILIS PROMĂȚĂTOR PENTRU CREAREA DE NOI PROBIOTICE

dizertaţie pentru gradul de candidat în ştiinţe biologice

Moscova - 2005

Lucrarea a fost efectuată la Institutul de Stat de Cercetare Științifică a Vaccinurilor și Serurilor, care poartă numele. AI. Mechnikov RAMS, Moscova.

Supraveghetori științifici: doctor în științe medicale,

Profesorul Mihailova N.A. Doctor în științe biologice Blinkova L.P.

Oponenți oficiali: doctor în științe medicale,

Profesorul Baturo A.P. Doctor în științe medicale, profesorul Likhoded V.G.

Organizație lider: Serviciul Federal de Supraveghere a Protecției Drepturilor Consumatorului și Bunăstarea Umanului Organismul național de control Instituția Științifică de Stat Federală GosNII pentru Standardizarea și Controlul Preparatelor Biologice Medicale numită după. LA. Tarasevici

Apărarea va avea loc ¿3" și 2005 la ora 14, la o ședință a consiliului de disertație D 001.035.01 la Institutul de Cercetare de Stat al Vaccinurilor și Serurilor, numit după I.I. Mechnikov RAMS la adresa: 105064, Moscova, Maly Kazenny banda., nr.5a.

Lucrarea se găsește în biblioteca Institutului de Stat de Cercetare a Vaccinurilor și Serurilor care poartă numele I.I. Mechnikov RAMS.

secretar științific

consiliu de disertație

Candidat la Științe Biologice

DESCRIEREA GENERALĂ A LUCRĂRII

Relevanța problemei

În microbiologia medicală, s-au acumulat date care justifică utilizarea microflorei saprofite pentru corectarea tulburărilor disbiotice, microorganisme ale cărora, în cursul activității lor vitale, produc substanțe biologic active (BAS) care suprimă creșterea microorganismelor patogene [Mikhailova N.A. şi colab., 1993; Mazankova L.N. şi colab., 1997; Osipova I.G. et al., 2003].

Medicamentele terapeutice și profilactice pe bază de microbi vii nepatogeni, capabile să asigure, printr-o metodă naturală de administrare, efecte benefice asupra funcțiilor fiziologice și biochimice ale organismului gazdă prin optimizarea stării sale microbiologice, sunt clasificate drept medicamente probiotice [Shenderov B.A. , 1997].

Pentru prevenirea și tratamentul bolilor tractului gastrointestinal, sunt utilizate pe scară largă produse biologice bazate pe culturi microbiene vii de bacterii formatoare de spori [Slabospitskaya A.T. şi colab., 1990; Nikitenko V.I., 1991; Nikitenko L.I., Nikitenko V.I., 1992; Smirnov V.V. şi colab., 1995; Shenderov B.A. şi colab., 1997; Pobery IA. et al., 1998].

Genul Bacillus a atras atenția cercetătorilor încă din cele mai vechi timpuri. Informațiile obținute în domeniul microbiologiei, biochimiei, fiziologiei și geneticii bacteriilor indică avantajele Bacillus ca producători de substanțe biologic active: enzime, antibiotice, insecticide [Smirnov V.V. și colab., 1982; Parshina S.N. şi colab., 1990; Harwood K., 1992; Blinkova L.P. et al, 1994].

Diversitatea proceselor metabolice, variabilitatea genetică și biochimică și rezistența la enzimele litice și digestive au servit drept justificare pentru utilizarea bacililor în diferite domenii ale medicinei. Administrația SUA pentru Alimente și Medicamente a atribuit B. subtilis statutul GRAS (în general considerat sigur), care este o condiție prealabilă pentru utilizarea lor în producția de medicamente [Harwood K., 1992; Nikitenko L.I., 1992; Kandybin N.V. şi colab., 1995; Ivanovsky A.A., 1996, 1997; Boyko N.V. şi colab., 1997; Payne J. M, 1992; Kubo K, 1994; Tsuge K. şi colab., 1995; Rychen G. şi colab., 1995, Donovan W.P. et al., 1995].

Activitatea multor reprezentanți ai genului Bacillus este pronunțată și se manifestă împotriva unei game largi de microorganisme patogene și condiționat patogene.Datorită sintezei diferitelor enzime și alte substanțe, ele reglează și stimulează digestia, au un efect anti-alergenic și antitoxic. . Utilizarea bacililor crește semnificativ rezistența nespecifică a macroorganismului.În plus, aceste microorganisme sunt de producție avansată tehnologic, stabile în timpul depozitării și, important, ecologice [Soroku Yu-va IB, 1996]

De cel mai mare interes pentru biotehnologie este specia B sub lilts, pentru care a fost creată o bancă de date de genetică moleculară, SubtiList, în care sunt introduse toate informațiile despre genomul bacterian.

Bacteriile B subtilis sunt utilizate pe scară largă în tehnologia producerii unui număr de preparate bacteriene și enzimatice [Shablinskas AI, 1990, Gulko MA, 1994, Gastro GR, 1992, Dercova K și colab., 1992, Kudrya VA, 1994, Lin S-C și colab. , 1994, Cromwick AM și colab., 1996, Buchell M E și colab., 1997, Oh M K și colab., 1995]

Pe baza lor, au fost create preparate - probiotice, caracterizate printr-o gamă largă de efecte terapeutice și profilactice și siguranța mediului [Nakhabin IM, Perelygin VV, 1996] Probioticele cu spori sunt utilizate în mod eficient pentru tratamentul bolilor gastrointestinale la oameni și animale de fermă [MPTopchiy, 1997, VGuida , 1978, Kharchenko, 1980, Nikitenko V I, 1992]

Cele mai cunoscute medicamente în prezent sunt următoarele medicamente: bactisu btil, sporobacterin, biosporin, bactisporin, subalin, cereobiogen, enterogermin și altele [Smirnov VV et al. 1988, 1992, 1995,1997, Nikitenko V I, 1998, 1991 1992, Gracheva N M et al, 1996, Vinnik Yu Si et al, 1998, Sorokulova I B, 1996, 1997, St gard H, 1989, Maruta K, 1996, Su Li et al, 1996, Adami A et al, 1997]

Eficacitatea terapeutică a probioticelor din spori este asigurată de proprietățile biologice ale tulpinilor utilizate pentru producerea lor.O importanță decisivă este spectrul activității lor antagoniste față de microorganismele patogene și condiționat patogene, care sunt una dintre cauzele anomaliilor.

dezvoltări ale microecologiei în diverse biotopi ai corpului uman sau animal.În plus, nu se poate ignora capacitatea bacililor de a produce diverse substanțe biologic active, precum antibiotice polipeptidice, enzime, bacteriocine etc., precum și rezistența la antibiotice a acestora.

Scopul lucrării:

Pentru a studia proprietățile biologice ale tulpinilor izolate de B.subtilis și a evalua posibilitatea utilizării lor pentru dezvoltarea unui probiotic spori original

Obiectivele cercetării:

Noutate științifică.

Pe baza studiului proprietăților morfologice, fiziologic-biochimice, genetice și a altor proprietăți biologice ale tulpinilor izolate, a fost selectată o tulpină fără plasmide B. subtilis 1719, care prezintă antagonism față de microorganismele oportuniste și patogene din diferite grupe taxonomice, are un adeziv scăzut. activitate și este rezistent la gentamicină, polimixină și eritromicină.

Au fost fundamentate experimental abordări ale creării tehnologiei de producție, inclusiv studiul proprietăților de creștere ale tulpinii B.subilhs 1719 pe medii nutritive originale, condițiile de stabilizare a viabilității acesteia și activitatea antagonistă ca etape în obținerea unui nou medicament probiotic.

A fost depusă o cerere de invenție (nr. 2005111301 din 19 aprilie 2005): „Tulpina bacteriană Bacillus subtllll.4 1719 este un producător de biomasă activă antagonic împotriva microorganismelor patogene, precum și a enzimelor proteolitice, amilolitice și lipolitice.”

Semnificație practică.

Tulpina izolată și identificată B.SllbtlllS 1719 a fost depusă în Colecția de Stat de Culturi GISC numită după. LA. Tarasevich sub nr. 277 și poate fi recomandat pentru dezvoltarea tehnologiei industriale pentru producerea unui medicament probiotic bioterapeutic original.

1. Cele trei tulpini identificate de culturi bacteriene corespund speciilor B. suhlllts din punct de vedere morfologic, fiziologic, biochimic și alte proprietăți. Nu conțin plasmide, sunt active antagonic împotriva bacteriilor oportuniste și patogene din diferite grupe taxonomice și au un nivel scăzut sau mediu de aderență.

2. Tulpina B.subtlhs 1719 are proprietăți probiotice, manifestate prin eliminarea microorganismelor oportuniste și patogene cu restabilirea compoziției cantitative și calitative a microflorei normale în disbioza experimentală și are, de asemenea, un efect imunomodulator asupra macroorganismului.

Aprobarea lucrării

Materiale prezentate la conferința „Nutriția funcțională, siguranța alimentară și sănătatea umană într-o metropolă” (Moscova, 2003); la concursul tinerilor oameni de știință al Institutului de Stat de Cercetare a Instituțiilor care poartă numele. I.I. Mechnikov (Moscova, 2004); asupra societatii

VOEMP (Moscova, 2004); la cea de-a 8-a Conferință Internațională a Școlii Putin a tinerilor oameni de știință „Biologie - știința secolului 21” (Pushchino, 2004); la cel de-al 5-lea Congres al Societății Științifice a Gastroenterologilor (Moscova 2005).

Aprobarea disertației a avut loc la conferința științifică a departamentului de microbiologie a NIIWS numită după. I.I. Mechnikov RAMS (Moscova, mai 2005).

Domeniul și structura lucrării de disertație

Teza este prezentată pe 131 de pagini. Constă dintr-o introducere, o revizuire a literaturii (2 capitole), rezultate proprii (5 capitole), concluzie și concluzii. Lista referințelor include: 236 surse (169 interne și 67 străine). Lucrarea conține 10 figuri și 19 tabele.

Obiecte de cercetare

Tulpini: Bacillus subtilis izolat din diverse surse de mediu.

Culturi de microorganisme izolate de la șoareci cu disbioză experimentală.

Test - culturi utilizate pentru determinarea activității antagoniste, din colecția GISK numită după. LA. Tarasevici

Medii nutritive:

Meat Peptone Agar (MPA), Meat Peptone Broth (MPB), mediu Gause modificat nr. 2, agar nutritiv cu adaos de 7% NaCl - pentru culturi în creștere, 5% agar sânge pentru determinarea proprietăților hemolitice, bulion de ou pentru testarea activității lecitinazei , agar de cazeină și cartofi pentru a determina proprietăți enzimatice, AGV - pentru a evalua rezistența la antibiotice.

Proprietățile biochimice ale bacililor au fost determinate pe mediul Omelyansky cu indicatorul albastru de bromotimol și carbohidrați - glucoză, xiloză, manitol, lactoză, zaharoză, maltoză, salicină și esculină. Pentru culturile fără spori, au fost utilizate medii Hiss care conțin carbohidrați și medii cu aminoacizi.

Utilizarea citratului și propionatului a fost testată pe mediu Coser, iar capacitatea de reducere a nitraților a fost testată pe un bulion cu nitrați. Determinarea acetoinei într-un mediu

(reacția Voges-Proskauer) a fost efectuată pe mediu Clark. Capacitatea de a produce hidrogen sulfurat a fost studiată pe mediul lui Kligler; activitatea catalazei a fost detectată într-o reacție cu H2O2, capacitatea culturilor de a produce indol a fost detectată într-un bulion nutritiv cu hârtie indicator; enzima ureaza - pe mediu Christensen cu uree.

În plus, pentru a studia structura microflorei șoarecilor, am folosit bulion de zer rece și soluția Hanks, medii de diagnostic diferențial: Endo, CI-agar, Ploskireva, agar stafilococic și enterococic, 88-agar, mediu Mac-Sopkay, cetrimidă. agar, mediu Blaurock, tioglicolat Wednesday, Wilson Blair Wednesday și altele.

Pentru a evalua proprietățile de creștere, au fost utilizate următoarele medii:

Mediu semisintetic cu adaos de hidrolizat de cartof-glicerină [Mikhailova N.A. 1995].

Mediu nr. 5 (g/l): fosfat de potasiu disubstituit 3-apă - 0,3; sulfat de amoniu disubstituit - 2; citrat de sodiu 5,5-apos - 2; sulfat de cupru 5-apă - 0,005; sulfat de zinc 7-apă - 0,004; sulfat de fier (II) 7-apă - 0,0005; clorură de calciu - 0,165; sulfat de mangan (II) 5-apă - 0,05; sulfat de magneziu 7-apă - 0,3; peptonă enzimatică uscată în scop bacteriologic - 5.

Mediu nr. 9 (g/l): sulfat de fier (II) 7-apă - 0,01; sulfat de magneziu 7-apă - 0,1; clorură de calciu - 0,08; peptonă enzimatică uscată în scop bacteriologic - 5,0; glucoză - 10,0, extract de drojdie - 3.

Mediu VK-2 (g/l): clorură de mangan - 0,01; clorură de calciu - 0,05; clorură de sodiu - 5,0; fosfat de sodiu disubstituit 12-apă - 2,0; fosfat de potasiu disubstituit 3-apă - 2,0; glucoză - 10,0, peptonă enzimatică uscată în scop bacteriologic - 10,0.

Mediu SPAS-2 (g/l): fosfat de potasiu disubstituit 3-apă - 2,5; clorură de sodiu - 5,0; amidon - 2,5; Hidrolizat de soia modificat - 10,0; peptonă enzimatică uscată în scop bacteriologic - 10,0.

Mediu SPAS-4 (g/l): clorură de sodiu - 5,0, Hidrolizat de soia modificat - 10,0; extract de drojdie furajeră - 1,0; hidrolizat acid de cazeină - 5,0.

Mediu SPAS-6 (g/l), fosfat de potasiu 3-apă disubstituit - 2,5; clorură de sodiu - 5,0, acizi casamino 5,0; Hidrolizat de soia nemodificat - 10,0, amidon - 2,5.

Metode de cercetare

Izolarea și identificarea tulpinilor de microorganisme au fost realizate prin placare pe medii nutritive de diagnostic diferențial în vase Petri sau eprubete. Culturile au fost plasate într-un termostat la 37 ° C timp de 18-24 ore.După numărarea culturilor, frotiurile au fost preparate, colorate cu Gram, microscopate și au fost selectate culturi de bacterii formatoare de spori [Smirnov V.V., 1983, Murray P.R., 1999 ]

Studiul morfologiei coloniilor bacteriene.

Pentru a studia morfologia coloniilor din populația microbiană, s-au preparat diluții de 10 ori ale culturii originale în soluție fiziologică 0,9% și au fost însămânțate pe mediu MPA [Smirnov V.V., 1983, Murray P.R., 1999].

Studiul concentrației de biomasă.

Concentrația de celule microbiene în lichidul de cultură a fost determinată utilizând proba de turbiditate standard industrială GISC numită după. LA. Tarasevich pentru 10 unități.

Determinarea sensibilității tulpinii la antibiotice

Sensibilitatea tulpinilor la antibiotice a fost studiată prin metoda difuziei pe disc, folosind discuri standard impregnate cu antibiotice în mediu AGV [Birger M.O., 1982; Reshedko G.K., 2003; MUK 4.2.1980-04, 2004]

Proprietățile fiziologice și biochimice au fost studiate prin capacitatea de a utiliza diverși carbohidrați: glucoză, xiloză, manitol, zaharoză, maltoză și esculină, lactoză și salicină; prin formarea de gaz în timpul descompunerii glucozei; prin capacitatea sa de a crește pe medii în prezența a 7% NaCl, reduce nitrații, produce indol, hidrogen sulfurat, sintetiza enzime: urază, protează, amilază și lipază. A fost de asemenea evaluată motilitatea tulpinilor.

Toxicitatea, toxicitatea și virulența tulpinilor izolate au fost determinate pe șoareci albi care cântăresc 14-16 g, în conformitate cu metodele recomandate [Smirnov V.V., 1983, Murray P.R., 1999].

Activitatea adezivă a tulpinilor de B. sub tills a fost determinată folosind metoda Brilis B. la evaluarea indicelui de aderență al microorganismelor (MAI), aderența a fost considerată scăzută când MAI a fost 1,00 - 2,49, medie când IAM a fost 2,5 - 3,99, mare când IAM > 4,0 [Brilis V I., 1982,1990]

Activitatea antagonistă a fost testată prin metoda antagonismului întârziat în raport cu cele obținute din colecția GISC numită după. Testul L.A. Tarasevich - tulpini utilizate în evaluarea indicatorilor de calitate ai preparatelor probiotice, [Boiko N.V., 1989; Blinkova L.P. 1994].

Test citotoxic pentru determinarea concentraţiei de TNF-a Concentraţia de TNF-a a fost determinată de efectul citotoxic al serului de şoarece asupra celulelor ţintă ale liniei L929.

Activitatea fagocitară a neutrofilelor a fost studiată în testul citochimic pentru reducerea tetrazoliului nitroblue (testul NBT) cu fagocite de șoarece și folosind chemiluminiscența dependentă de luminol [Zinkin V.Yu., 2004]

Nivelul de citokine (IL-1P, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-I2, IFN-γ) din serul animal a fost determinat utilizând testul imunosorbent legat de enzime (ELISA) folosind sisteme de testare din Biosource » (Belgia)

Disbioza experimentală a fost modelată pe șoareci albi care cântăresc 14-16 g, în care decontaminarea microflorei normale a fost efectuată utilizând antibioticul clorhidrat de doxiciclină (JSC Belmedpreparaty) sau decontaminarea selectivă a microflorei parietale condițional patogene a colonului folosind fluorochinolonă (medicamentul ciprofsifranloxacină). , Reddy's Lab., India).

Studiile microflorei luminale și parietale au fost efectuate prin analiza materiilor fecale și a secțiunilor de colon prelevate aseptic de la șoareci [Zudenkov A.E., 2001; Vorobyov A.A., 2001,2003].

Pentru a determina activitatea adezivă a enterocitelor, a fost utilizată o modificare a metodei „mănușilor” și a fost calculat indicele mediu de adeziune (AIA) [Gorskaya N.M., 1994, Brilis V.I., 1982, 1990]

Analiza ADN-ului plasmidic a fost efectuată utilizând o procedură standard concepută pentru purificarea ADN-ului plasmidic utilizând liză alcalină [Osterman LD, 1981; Maniatis T. şi colab., 1984].

Evaluarea proprietăților de creștere ale mediilor nutritive în timpul cultivării a fost efectuată folosind stația de lucru automată a unui microbiolog și chimioterapeut „Mikrob-Avtomat” bazată pe un fotometru de tabletă „Multiskan-Ascent” (Termo-Labsystems, Finlanda), echipat cu un termostat. şi un agitator.Metode statistice

Prelucrarea statistică a rezultatelor a fost efectuată conform metodelor general acceptate (Ashmarin I P, Vorobyov A.A., 1962) Rezultatele au fost considerate de încredere la p<0,05. Достоверность различий между средними значениями (X) экспериментальных данных оценивали по критерию Стьюдента

REZULTATELE CERCETĂRII În primele etape ale lucrării, au fost izolate 15 culturi bacteriene. S-a dezvăluit că doar 3 tulpini nu au avut activitate hemolitică și lecitinazică (factori de patogenitate), așa că au fost selectate pentru studii ulterioare.

Examinarea microscopică a frotiurilor a arătat că tulpinile sunt gram-pozitive, caracterizate prin localizarea paracentrală și centrală a endosporilor.

La studierea culturilor pe mediu Gause Nr. 2 modificat cu agar, trei variante de colonii caracteristice

Toate tulpinile aveau proprietăți morfologice și fiziologic-biochimice tipice reprezentanților bacteriilor, erau mobile, creșteau pe mediu în prezența a 7% NaCl și erau caracterizate printr-un set de diverse enzime care descompun substraturi precum glucoza, zaharoza. , maltoză, xiloză, esculină, gelatină, amidon, cazeină, nitrați redusi, nu au format hidrogen sulfurat

Se știe că culturile de B subtilis au proprietăți antagoniste pronunțate împotriva unei game largi de microorganisme patogene și condiționat patogene. În munca noastră, această proprietate a fost evaluată folosind metoda antagonismului întârziat, folosind tulpini de cultură de testare din colecția GISC numită după. LA. Tarasevici (Tabelul 1).

Tabelul 1. Activitatea antagonistă a tulpinilor de Bacillus subtilis

Zone de inhibare a creșterii tulpinilor de testare (mm) _iX±m)___

Tulpinile studiate de B.subtilis o g- yi g-fi f) C ^ aureus FDA 209Р S aureus 29213 f, sch Tf GCh £ a o a 0 in s s 1 S I X. aureus "Filliov" a gch 1 G "s<3 о чО "о ГЧ Г4 О С (N 00 оо гц Гч| M1 "nJ

domnule O<Л _ VI m IT) (N о п ГЧ гч +1 fl

Nr. 1719 N + g- G4 f, +1 f! +i

în O VI O f o oo _ o o O

№ 1594 <Ч| CJ +1 +1 «-I С сч; п!

O O O O o 00 ft 00 o

Nr. 1318 Ni g", +1" +1 o! с> !Nj еч fl +1 О fj +1 fi + m + i + о + Г> f + о ГЧ + О CN ГЧ* +1 О + Гч ГЧ f. +1 (N

Datele obținute au indicat că nivelul activității antagoniste a tulpinilor diferă în funcție de tulpina de testare utilizată. Toate cele trei tulpini au avut activitate antagonistă pronunțată împotriva a două specii de Shigella (Sflexncri 337 și s.sonnei 170), S.aureus FDA 209P, S. aureus "Nikiforov", P.mirabilis 24a, P.vulgans 177, C.albicans 690, E.coli 1882, P.aeruginosa 9022 și E.coh 212 (O157:H7), cu cele mai mari rate detectate în tulpina B.subtilis 1719, care a prezentat și antagonism față de S.aureus 29213, S.aureus 25423.

De remarcat mai ales că tulpinile studiate au prezentat un antagonism destul de pronunțat față de tulpina enteropatogenă E. coli 212 (0157:H7), capabilă să sintetizeze toxina de tip Shiga (citovertoxina), iar tulpina de B. subtilis Nr. a avut activitate maximă. (30 + 2,0) mm. 1719.

Trei tulpini originale de B subtilis au fost studiate pentru capacitatea lor de a adera, care este una dintre cele mai importante proprietăți ale culturilor probiotice (Tabelul 2).

Tabelul 2. Activitatea adezivă a tulpinilor de Bacillus subtilis.

Tulpinile studiate Activitate adezivă

Indicele de aderență al microorganismelor (MAI) (X±w) Nivel de aderență

B. subtilis 1719 1,53+0,08 Scăzut

B. subtilis 1594 2,84±0,47 Medie

B. subtilis 1318 3,08±0,33 Medie

S-a dezvăluit că tulpina B.subtilis 1719 a avut o activitate adezivă medie, iar tulpina B.subtilis 1594 şi 1318.

Rezistența la antibiotice a tulpinii, candidată pentru medicamentele probiotice, este, de asemenea, o proprietate importantă care determină posibilitatea utilizării acesteia împreună cu medicamentele antibacteriene. În acest sens, a fost realizat un studiu al rezistenței la antibiotice a tulpinilor de B. subtilis la 14 antibiotice cel mai des utilizate în clinică. Tulpina B.subtilis 1719 a fost rezistentă la gentamicină, polimixină și eritromicină, în timp ce tulpinile B.subtilis 1594 și B.subtilis 1318 au fost rezistente doar la gentamicină.

A fost interesant să se afle dacă rezistența la antibiotice este asociată cu localizarea cromozomială a determinantului genetic al acestei trăsături sau cu prezența id-ului plasmatic.

Analiza transportului plasmidei de către tulpinile de B. subtilis ar putea oferi informații despre natura rezistenței la antibiotice. Într-un gel de agaroză 0,9%, după electroforeză, a fost identificată o fracție care corespunde mărimii ADN-ului plasmidic într-un număr de probe de ADN analizate (pisele 2, 4 și 6) (Fig. 1). Cu toate acestea, modelul de distribuție al acestor mărci în gelul de agaroză va diferi de cel al ADN-ului plasmid de control.

Pentru a determina în final dacă ADN-ul rezultat a fost o plasmidă sau dacă a fost vorba de fragmente cromozomiale, materialul izolat a fost tratat cu endonucleaze tăiate mici de al doilea tip (enzima de restricție Pst I). Atunci când se analizează produsele de restricție într-un gel de agaroză (Fig. 1), a fost izolată fracția de ADN cu greutate moleculară mică.

extrase din tulpinile studiate, s-au dezintegrat fără formarea de fragmente clare, ceea ce a indicat absența moleculelor de ADN plasmidic în probe

Orez. 1. Date de electroforeză a preparatelor de ADN izolate din tulpini

Explicația desemnării

Aparent, rezistența la antibiotice identificată se referă la rezistența naturală și este probabil controlată de gene localizate pe cromozom.

În experimentele in vivo, tulpina B subtilis 1719 s-a dovedit a fi netoxică, netoxigenă și avirulentă.

Administrarea antibioticului clorhidrat de doxiciclină în doză de 5 mg la șoareci (cu o greutate de 14-16 g) a făcut posibilă crearea unui model de disbioză în care intestinele animalelor au fost contaminate cu microfloră condiționat patogenă și patogenă.

Introducerea culturii B subtilis 1719 în doză de 0,5x10% 1,0x109 m/șoarece timp de 7 zile a contribuit la normalizarea compoziției și numărului de luminale și

№1 №2 №3 №4 №5 №6 №7 №8 №9 № 10 №11

marker de proces

ADN-ul nativ al tulpinii B sulish 1719 ADN-ul clivat al tulpinii B sulish 1719 ADN-ul nativ al tulpinii B sulish 1594 ADN-ul divizat al tulpinii B sillish 1594 ADN-ul nativ al tulpinii B sulish 1318 ADN-ul divizat al tulpinii B sulish (8 1318 ADN-ul nativ al tulpinii B 8 Plasmidă nativă NHL 534 tulpina ADN B 8db 534 divizată

plasmida divizată pPETpB^et

microflora nocturnă, precum și eliminarea microorganismelor oportuniste (Tabelul 3).

Tabelul 3. Microfloră la șoareci cu disbioză experimentală și după corectare cu cultura de B. mutilum (Bs) 1719 în diferite doze

D Indicator numărul Ig de CFU/ml la șoareci (1 g fecale LII 11

1 cm de intestin) (X±t)

Control (intact) După administrare După tratament cu doza Bs (celule microbiene)

doxiciclină 0,5x10" 1,0x109

Microorganisme i a Stratul parietal al intestinului i a o i Stratul parietal al intestinului h i "X Stratul parietal al intestinului I * s s = S c 5 H

e e e & S « ! s g a 3 C

E. coli: 7+0,42 7+0,7 7,3+0,64 6,5+1,4 710,7 6,5+0,48 811,4 5+0,43

1ac\ % 94 100 64 84 100 100 100 mo

lac, % b 0 36 16 * 0 0 0 0

hemolizant 0 0 0 0 0 0 0 0 1

R. vulgaris 0 0 710,26* 0 0 0 * 0 0

P. mirabilis * (1 0 6±0,42* 4,3І.7* 0* * 0 0 0

S. freundii 610,42* 0 0 0 0 0 0 0

Enterococcus spp. 7±<).21 7+0.64 6±0,59 5.5Ю.84 7±0,42 5.5+0.84 710.48 510.47

S. epidermidis o 0 0 0 0 0 0 0

S. aureus 5±0,21 0 4±1,2* 4+0,21* * 0 0 * 0 "II

Staphylococcus spp. 4+0,43* * 0 0 410,48* 0 0 0 «

Candida spp. 6i0,64 0 4,5±0,21 6+0,92* * 0 * 0 1 0* 0

Lactobacillus spp. ¡9.510,42 7.610,43 1 5.510,4* 1 4+0,23* 910,44 7+0,34 1 910,21 7,5+0,84

1 Bifidobacterium spp. 2±0.1 2±0.1 1 2+0.1 2+0.1 1 2+0.1 2+0.1 2Yu.1 I 210.1

Clostridium spp. 5±0,22 3,1±0,21 1 510,21 4,5+0,24 1 5+0,59 1 4.510,73 1 5M.21 1 4,65+0,24

Notă: *p<0,05

Rezultate similare au fost obținute în timpul decontaminării selective a microflorei parietale condițional patogene a colonului șoarecilor obținute folosind medicamentul fluorochinolon ciprofloxacin, care păstrează numărul de bifidobacterii și lactobacili. Cultura lui B. subnhs 1719,

administrat în doze similare, a condus la o scădere semnificativă) a numărului de stafilococi (de 8,3 ori) comparativ cu lotul martor de animale care nu au primit o cultură probiotică.Administrarea Citran la animale a dus la o schimbare bruscă a raportului dintre stafilococi: bacterii, iar introducerea culturii \ 1719 a schimbat acest raport la nivelul șoarecilor intacți

În etapa următoare, am studiat efectul culturii de B ublin 1719 asupra capacității de aderență a celulelor epitecale intestinale (enterocite) în timpul disbiozei experimentale induse de administrarea antibioticului clorhidrat de doxiciclină.

Desemnarea grupurilor de șoareci:

Grupuri de șoareci

Despre Clean in

la începutul experimentului O Doxiciclina

Ш Doxiciclină

fără egalizare B Doxiciclină + B cYi 0,5 0 Doxiciclină h-BvcYi 1,0 □ Pură +

VbYk 0,5 ■ Curățare +

V. eiYiL 0,5X109mk V diYiSi 1,0 x ] O"m k

Orez. Fig. 2. Indicele mediu de aderență (AIA) al tulpinii de testare 8.xy1oek 25 pe enterocite într-un model de disbioză experimentală și când este corectat prin cultura de B. subtilis 1719.

Când disbioza a fost corectată cu cultura B 8uNSh 1719 la diferite doze, s-a observat o scădere a capacității de aderență a enterocitelor (Fig. 2)

Într-o serie de experimente pentru a studia influența tulpinii B. 1719 capacitatea acestor bacili de a fi sigur

modificați activitatea metabolică a neutrofților conform testului NBT (Figura 3)

Grupuri de animale

Orez. 3. Efectul culturii B SllbtlllS 1719 asupra activității neutrofilelor (test NST) în disbioza experimentală

Folosind metoda chemiluminiscenței dependente de luminol, s-au obținut rezultate similare asupra activității funcționale a neutrofilelor.

Cea mai mare creștere a nivelului său a avut loc în perioada de maximă manifestare a disbiozei induse de administrarea de doxiciclină

Sub influenta K)LT)ra in subilla 1719 are loc o scadere a productiei

IFNF-a Introducerea culturii la animale intacte nu a afectat nivelul producției

Doxiciclina

Grupuri de șoareci

Orez. 4. Studiul influenței culturii de B. niblith 1719 asupra nivelului de producție a factorului de necroză tumorală a (TNF-a) în timpul disbiozei experimentale

Determinarea acumulării de citokine (1L-1P, 1L-2, 1L-4, 1L-6, [L-10, 1H2, 1PL-y)

dinamica în serurile de sânge ale șoarecilor după o singură injecție a culturii B^tsynHu 1719 a relevat următoarele modele.

În primele 12 ore de la introducerea culturii bacteriene nu au existat modificări ale nivelului de citokine, cu excepția Ib-1(5).Conținutul altor citokine studiate în comparație cu animalele intacte a crescut semnificativ doar cu 24 de ore. : I-1P (13,7 ori) și I-4 (14,6 ori), 1b-2 (5,2 ori), 1b-6 (7 ori), 1N0 (1,5 ori), 1N2 (5,2 ori), 1RI- y (9,7 ori) ori).

În producția de preparate probiotice, un indicator tehnologic important este randamentul de biomasă în timpul cultivării microorganismelor. Acest indicator depinde direct de proprietățile de creștere ale mediilor nutritive utilizate. Ne

Au fost studiate principalele caracteristici ale proceselor de cultivare a Bisquid 1719 pe șapte medii nutritive de diferite compoziții.

Datele obținute sunt prezentate în Tabelul 4. Mediile nr. 5, SPAS-6 și mediu de cartof-glicerină au asigurat creșterea tulpinii cu un indice de densitate optică

(OP), egal cu 0,24±0,01 (u=0,03 h"1), 0,22+0,01 (iKKOZZch1) și respectiv 0,3+0,01 (u=0,025 h"1). Pe mediile SPAS-2, SPAS-4, nr. 9, valoarea maximă a OP a fost 0,42+0,03 (u=0,067 h"1), 0,38+0,02 (u=0,05h"") și 0,58+0,03 (u =0,037 h"1), respectiv, și pe mediul VK-2 - 0,85±0,6 (u=0,068 h""). E timpul să ajungi

concentrația maximă de biomasă pe aceste medii a variat de la

9±0,7 ore (SPAS-2) până la 18±1,3 ore (KGG).

Tabelul 4. Acumularea biomasei tulpinilor de B. nibiHn 1719 pe medii de diferite compoziții în timpul cultivării timp de 20 de ore (X±t)

Mediu Timpul mediu al fazei ^ (h) Durata fazei exponențiale (h) Timpul până la atingerea concentrației de biomasă (h) Randamentul maxim de biomasă (densitate optică) Rata de creștere (i)

Nr. 5 2 8+0,67 13±1,05 0,24+0,01 0,03

Nr.9 2 11 ±0,8 13+0,99 0,5810,03 0,037

KGG 2 2±0,12 18+1,3 0,3+0,01 0,025

SPAS-2 2 4+0,36 9±0,7 0,42+0,03 0,067

SPAS-4 2 4±0,34 11+1,1 0,38±0,02 0,05

SPAS-6 1,5 3+0,23 18+1,6 0,22±0,01 0,033

VK-2 1,5 8±0,72 14±1,0 0,85+0,6 0,068

Randamentul maxim de biomasă (BY) a fost detectat pe mediul VK-2 cu o rată de creștere, iar cel mai scăzut pe mediul SPAS-6 cu o rată de creștere

Se știe că glucoza, maltoza, zaharoza și lactoza sunt cel mai adesea folosite ca sursă de carbohidrați în mediile de cultură. În experimentele noastre, s-a obținut un randament ridicat de biomasă pe mediu VK-2 cu adăugarea de glucoză sau zaharoză; indicatorii OD corespundeau cu

La utilizarea maltozei, cea mai mare OP a fost înregistrată la

mediu Nr. 9 0,695 ± 0,025 (u = 0,058 h "), cu toate acestea, s-a dovedit a fi mai mic decât valorile obținute pe mediu VK-2 cu includerea lactozei, zaharozei și glucozei ca surse de carbohidrați.

S-a stabilit că compoziția mediilor nutritive nu a avut niciun efect asupra proprietăților antagoniste ale tulpinii.

În etapa următoare, au fost evaluate condițiile pentru stabilizarea viabilității și proprietăților antagoniste ale tulpinii B. lumbago 1719 atunci când este depozitată în stare liofilizată și lichidă la o temperatură de 5±3 °C (Tabelul 5).

Într-o stare liofilizată cu un stabilizator galben de zaharoză, cultura de Lybly 1719 și-a păstrat viabilitatea și proprietățile antagoniste timp de cel puțin 4 ani (perioada de observație). În tabel În figura 5 sunt prezentate și rezultatele studierii proprietăților culturilor depozitate timp de 3 ani sub formă lichidă cu adaos de diverși stabilizatori.

Tabelul 5. Viabilitatea celulelor din tulpina B. mlinth 1719 atunci când sunt depozitate în prezența diverșilor stabilizatori

Din datele din tabelul 5 rezultă că stabilizatorul lichid optim este o soluție de NaCl 7%, care vă permite să mențineți viabilitatea tulpinii 1719 timp de 2 ani.Pentru a păstra proprietățile culturii timp de 1 an, este, de asemenea, posibil să folosiți apă distilată și o soluție de glicerol 10%.

Când este depozitat în prezența diferiților stabilizatori, nu au existat modificări semnificative statistic în proprietățile antagoniste ale tulpinii B subtihs 1719

Analiza comparativă a tulpinii 1719 pentru antagonist și adeziv

proprietăți cu preparate probiotice comerciale Sporobak-

terin, Rusia (B subtihs 534), Cereobiogen, China (B cereus DM423), Subtil, Vietnam (Biemis var vietnamí), Baktisubtil, Franța (B cereus IP5832), Nutrolin, India (B toagulans) (Tabelul 6), permis să obține următoarele rezultate

Cel mai înalt nivel de activitate antagonistă a B subi/lis 1719 s-a manifestat împotriva tulpinilor S flex neri 337 (30±3,0), S aureus „Nikiforov” (30+2,5), P uilgam 177 (30±2,0) P aeruginosa 9022 (27). ±1,5) și E coli 212 (0157 H7) (30±1,5) A fost detectat un antagonism puțin mai slab la această tulpină cu culturi de testare Ecoh 1882 (26±1,2), Saw eus 25423 (21±1,5), S sonet 170 (20±1,2). 2,0), 5 aureus „Phillipov” (20±1,5),

Întârzierea creșterii mai puțin semnificativă a fost detectată pentru culturile de testare Saurem FDA 209P (15±1,5), S aureus 29213 (15±3,0), P mirabilis 24a (12±1,2)

Dintre culturile de probiotice studiate, cea mai apropiată, dar inferioară tulpinii 1719 în activitate antagonistă, a fost tulpina

Coagulantul 534 „Indian*” tulpina B s-a dovedit a fi un antagonist slab, inferior în acest sens tuturor tulpinilor utilizate în experiment

O comparație a proprietăților adezive a arătat că, în general, tulpinile preparatelor comerciale au avut un nivel mediu de aderență, în timp ce IAM a variat între 3,08 și 3,8, cu excepția tulpinii „indiene” (IAM = 5,36 ± 0,56 pentru tulpina B subtllis 1719 acest lucru). indicatorul s-a dovedit a fi cel mai scăzut (IAM = 1,53 ± 0,08)

Tabelul 6. Caracteristici comparative ale activității antagoniste a tulpinii B. mlinth 1719 și culturi de preparate probiotice comerciale în experiment

Zonele de inhibare a creșterii tulpinilor de testat (mm) (X+t)

Tulpinile studiate de Bacil o G-- vi Pi s, 3 s n yi s. o sch< с bu S ГЛ (Ч О сч 5 Vi S.aureus 25423 Л", aureus «Никифоров» S 0 5 <=; s 1 ÍÜ 5 1". пи rabil is 24а 0 г-- ¡с 1 о W4 о 3 о сч (Ч о ^ 5 § ^ сч ОС оо "с го ^ г» ■П" о сч Ñ

V. subtihs No. 1719 Г-(cm "+1 N о с +1 о ГЛ ж +i t (Ч +i n 1П (N +1 о f, în +i С СЧ СЧ +¡ deci în + Pó о, сч " +1 în сч în +i Г-- (N +Í vo p despre Сч" + о с.

B.subtihs 534 Sporobacterina (Rusia) (-; SCh +1 CS o +1 o SCh O GL +1 O g +1 g o. +1 00 +i SCh (Ch

B. cereus DM423 Cereobiogen (China) SP +i h- (N o o<4 О +1 о СЧ +1 <4 in +1 О о (Чг +1 о о о о о с +1

B. cereus var. vietnamí Subtil (Vietnam) 1P + O o<4 + СЧ О о + (N о" +1 СЧ О, +i О о о + CI + о о О о о

V. cereus IP 5832 Baktisubtil (Franța) Ш оо + in о О g- + о +1 (N in +i in о CN + g"- ■h- + t o + g" o o o o + g ■p +¡ o

B. coagulans Nutrolin (India) s o O o + SCH "Í. O +1 p SCh o" -H (N O + o o o o o o

Astfel, tulpina B. bubik 1719, pe care am izolat-o, a avut avantaje calitative față de alte culturi testate de preparate comerciale în ceea ce privește proprietățile studiate, ceea ce ne permite să o considerăm promițătoare pentru utilizare în dezvoltarea unui nou preparat probiotic.

1. Pe baza proprietăților morfologice și fiziologico-biochimice, tulpinile izolate au fost identificate ca B Raulym. Nu s-au găsit plasmide în preparatele de ADN ale tulpinilor B.mth/bx, ceea ce aparent indică controlul cromozomial al rezistenței la antibiotice.

2. Folosind un model de disbioză la șoareci albi s-a demonstrat activitatea probiotică a tulpinii B. thylish 1719, manifestată prin eliminarea microorganismelor oportuniste și patogene cu refacerea compoziției calitative și cantitative a microflorei normale.

3. Mediu optim pentru acumularea de biomasă în timpul cultivării tulpinilor

1719 este un mediu BK-2 cu adaos de glucoză sau zaharoză ca sursă de carbohidrați.

4. S-a stabilit ca tulpina B. lialisia 1719 isi pastreaza viabilitatea si activitatea antagonista in stare liofilizata cu stabilizator zaharoza-gelatina timp de cel putin 4 ani (perioada de observatie), in forma lichida stabilizata cu solutie 7% Nr.01 - 2 ani, și 1 an în prezența apei distilate sau a soluției de glicerină 10%.

5. Tulpina B. naylisha 1719, activă antagonic, fără adeziv, fără plasmide, netoxică, care are activitate probiotică și imunomodulatoare, este depusă în Colecția de Culturi de Stat GISC numită după. LA. Tarasevici.

6. Tulpina V.zyysh 1719 (277) este promițătoare pentru utilizare în dezvoltarea de noi preparate probiotice datorită proprietăților sale biologice și caracteristicilor tehnologice de bază.

1 Gataullin A G, Gaiderov A A Mikhailova N A, Osipova I G, Romanen-ko E E Proprietăți biologice ale tulpinilor de subtill BaaNi de diverse origini Co „Probleme actuale ale dezvoltării vaccinului-ser în secolul 21” Perm 2003, pp. 329-331

2 Gataullin A G, Mikhaitova N A, Btinkova L P, Elkina S I, Gorobets OB, Gaiderov A A, Kalina NG Studiul microflorei parietale a tractului intestinal la șoareci folosind medii de diagnostic diferențial Colecția „Dezvoltarea și standardizarea mediilor nutritive microbiologice și a sistemelor de testare” Makhachkala , 2003 p. 48

3 Gataullin A G, Btinkova L P, Mikhaitova N A, Elkina S I, Gaiderov A A, Kalina N G, Gorobets O B Modificări în compoziția microflorei parietale în timpul disbiozei experimentale ca indicator al efectului medicamentelor terapeutice asupra macroorganismului Anapi Mechniivsky Institute Kharyv, 22003, , nr. 4-5, pp. 123-124

4 Mikhailova N A, Blinkova L P, Elkina S I, Gataullin A G, Gorobets O B, Gaiderov A A, Kalina N G Disbioza ca indicator integral al efectelor secundare ale medicamentelor Mesaj 1 Culegere de rapoarte „Nutriția funcțională, siguranța alimentară și sănătatea oamenilor în condiții metropolitane " M, 2003, p. 38-39

5 Mikhailova N A, Blinkova L P, Elkina S I, Gataullin A G, Gorobets O B, Gaiderov A A, Kalina N G Disbioza ca indicator integral al efectelor secundare ale medicamentelor Mesaj 2 Materiale ale celui de-al II-lea Congres Internațional de la Moscova „Starea biotehnologiei și perspectivele de dezvoltare” Moscova , 2003, p. 162

6 Gataullin AG, Blinkova LP, Mikhailova NA, Elkina SI, Gaiderov A A, Kalina N G, Gorobets O B Schimbarea compoziției microflorei parietale ca indicator al eficacității utilizării medicamentelor în disbioza experimentală Analiza Institutul Mechniyvsky Kharyv, 2004 , nr. 6, p. 10- 13

7 Gaiderov A A, Gataullin A G, Vasilyeva E A, Mikhailova N A, Osipova I G Studiu al efectului preparatelor probiotice asupra legăturii macrofage a imunității nespecifice. ” M, 2004, p. 21-22

8 Blinkova L P, Mikhailova N A, Elkina S I, Gataullin A G, Kalina N G, Tokarskaya M M Influența „Milife” și combinațiile sale cu un probiotic cu spori asupra rezistenței șoarecilor albi în timpul infecțiilor experimentale. Colecția de materiale a Conferinței internaționale „Probiotice, Prebiotice” , sibiotice și alimente funcționale Starea actuală și perspectivele” M, 2004, p. 4041

9 Blinkova L P, Mikhailova N A, Shmygaleva T P, Gataullin A G, Novikov V Yu, Shmygalev P A Proprietățile adezive ale celulelor și sporilor În subtilis Colecția de materiale a conferinței internaționale „Probiotice, prebiotice, sibiotice și alimente funcționale Starea actuală și perspectivele „ M, 2004, p. 41-42

M , 2004, p. 204-205

11 Gataullin A G, Mikhailova N A, Blinkova L P, Romanenko E E, Elkina S I, Gaiderov A A, Kalina N G Proprietăți ale tulpinilor izolate de Bacillus subtilis și efectul lor asupra microflorei intestinale a animalelor de experiment Zh mik-robiol, 2004, nr. 2, din 91 -94

12 Gataullin AG, Zinkin YuV, Vetoshkin AI, Godkov MA, Gaiderov A A, Kharitonova A V Studiu al efectului medicamentului B subtilis în disbioză folosind analize chemiluminiscente. Pushchino, 2004, s 256

13 Blinkova L P, Mikhailova N A, Gorobets O B, Elkina S I, Gataullin A G Kalina N G, Gaiderov A A Studiu experimental al efectului medicamentelor biologic active asupra C albicans Advances in medical micology, 2004, volumul III, pp. 48-49

14 Gataullin A G, Mikhailova N A, Khvatov V B, Blinkova L P, Zinkin Yu V, Kharitonova A V Aplicarea analizei chemiluminiscente pentru evaluarea anti-

activitatea bacteriană și antifungică a medicamentului B subtil este. Progrese în micologia medicală, 2004, volumul III. p.50-51.

15. Mikhailova N., Blinkova L. P.. Gataullin A.G. Studiul parametrilor de cultivare a tulpinilor probiotice de Bacillus subtihs pe diverse medii nutritive. Materiale ale celui de-al III-lea Congres Internațional de la Moscova „Biotehnologie: statut și perspective de dezvoltare”. Moscova, 2005, p. 124.

16. Gataullin A.G., Blinkova L.P., Mikhailova N.A. Acumularea de biomasă a tulpinilor probiotice de B. subtihs în medii nutritive de diferite compoziții. sat. materiale ale conferinței științifice din întreaga Rusie cu participare internațională: „Preparate medicale imunobiologice în secolul 21: dezvoltare, producție și aplicare” Ufa. 2005, partea 1.e. 134-136

Publicat la 19 mai 2005. Volum tipărit 1 p.l. Ordin Nr. 615. Tiraj 100 exemplare. Tipărit de: Sprint-Print LLC, Moscova, st. Krasnobogatyrskaya, 92 tel.: 963-41-11, 964-31-39

-»« g.i» j» "-" Ж J

REVIZUIRE DE LITERATURA

Capitolul 1. Antagonismul microbian - baza pentru crearea de medicamente bioterapeutice pentru corectarea stărilor disbiotice

Capitolul 2. Probioticele cu spori și efectele lor asupra macroorganismului

2.1. Preparate din bacterii din genul Bacillus

2.2. Idei moderne despre mecanismele de acțiune terapeutică și profilactică a probioticelor din bacterii din genul Bacillus

2.3. Substanțe biologic active produse de bacteriile aerobe care formează spori

2.4. Factori patogeni ai bacteriilor din genul Bacillus 34 CERCETARE PROPRIE

Capitolul 3. Obiecte și metode de cercetare

3.1. Obiecte de cercetare

3.2. Metode de cercetare 43 3.2.1. Echipamente și tehnici

Capitolul 4. Caracteristicile tulpinilor izolate

4.1. Studiul proprietăților morfologice și fiziologico-biochimice ale tulpinilor

4.2. Activitatea antagonistă și adezivă a tulpinilor de B. subtilis în experimente in vitro

4.3. Determinarea rezistenței la antibiotice și a profilului plasmidic al tulpinilor de B.subtilis

Capitolul 5. Efectul tulpinii B.subtilis 1719 asupra macroorganismului

5.1. Studiul toxicității, toxicității, virulenței și activității probiotice a tulpinii B. subtilis 1719 în experimente in vivo

5.2. Studierea influenței tulpinii B. subtilis 1719 asupra parametrilor de imunitate în experimente in vivo cu disbioză experimentală

Capitolul 6. Caracteristicile tehnologice ale tulpinii B.subtilis 1719 ca bază a unui preparat probiotic

6.1. Evaluarea proprietăților de creștere pe diferite medii nutritive lichide

6.2. Studiul viabilității și activității antagoniste a tulpinii B.subtilis 1719 în timpul depozitării

Capitolul 7. Caracteristici comparative ale proprietăților tulpinii B.subtilis\l\9 și ale tulpinilor care stau la baza unor preparate probiotice comerciale. CONCLUZIE

Introducere Dizertație de biologie pe tema „Proprietățile biologice ale tulpinilor de Bacillus subtilis promițătoare pentru crearea de noi probiotice”

Relevanța problemei

În stadiul actual în microbiologia medicală, au apărut noi date care susțin utilizarea microflorei saprofite, care este capabilă să producă substanțe biologic active (BAS) în timpul proceselor de viață care suprimă creșterea microorganismelor patogene, a tumorilor maligne și normalizează diverse patologii și procesele biochimice din corpul uman.

În ultimul deceniu, produsele biologice bazate pe culturi microbiene vii de bacterii formatoare de spori au fost utilizate pe scară largă pentru prevenirea și tratamentul bolilor tractului gastrointestinal.

Bacteriile din genul Bacillus, unul dintre cele mai diverse și răspândite grupuri de microorganisme, sunt componente importante ale florei exogene a oamenilor și animalelor.

Genul Bacillus a atras atenția cercetătorilor încă din cele mai vechi timpuri. Cunoștințele acumulate în domeniul microbiologiei, fiziologiei, biochimiei și geneticii bacteriene indică avantajele Bacillus ca producători de substanțe biologic active: enzime, antibiotice, insecticide. Adaptabilitate ridicată la diferite condiții de viață (prezența sau absența oxigenului, creșterea și dezvoltarea într-o gamă largă de temperaturi, utilizarea diferiților compuși organici sau anorganici ca surse de hrană etc.) contribuie la răspândirea bacililor în sol, apă, aer, produse alimentare și alte obiecte ale mediului extern, precum și în corpul oamenilor și al animalelor.

Diversitatea proceselor metabolice, variabilitatea genetică și biochimică, rezistența la enzimele litice și digestive au servit drept justificare pentru utilizarea bacililor în diferite domenii ale medicinei. Administrația SUA pentru Alimente și Medicamente a atribuit lui Bacillus subtilis statutul de GRAS (în general considerat sigur) - organisme complet sigure, care este o condiție prealabilă pentru utilizarea acestor bacterii în producția de medicamente.

Activitatea bacililor se manifestă împotriva unei game largi de microorganisme patogene și condiționat patogene. Datorită sintezei diferitelor enzime și a altor substanțe, acestea reglează și stimulează digestia și au efecte anti-alergenice și anti-toxice. La utilizarea bacililor, rezistența nespecifică a macroorganismului crește semnificativ. Aceste microorganisme sunt ușor de fabricat, stabile la raft și, cel mai important, ecologice.

Medicamentele terapeutice și profilactice pe bază de microbi vii nepatogeni, capabile să asigure, printr-o metodă naturală de administrare, efecte benefice asupra funcțiilor fiziologice și biochimice ale organismului gazdă prin optimizarea stării sale microbiologice, sunt în prezent clasificate drept medicamente probiotice.

Dintre bacili, tulpinile de B. subtilis prezintă cel mai mare interes. În ceea ce privește cunoașterea proprietăților genetice și fiziologice, acestea ocupă locul al doilea după E. coli. Potențialul mare al B. subtilis în biotehnologie este evidențiat de crearea unei bănci de date privind genetica moleculară a acestei tulpini - SubtiList, în care sunt introduse toate informațiile despre genomul bacterian.

Pe baza bacteriilor vii din genul Bacillus, au fost create preparate probiotice care sunt inofensive pentru macroorganism, au o gamă largă de efecte terapeutice și profilactice și sunt sigure pentru mediu. Rezultatele privind utilizarea culturilor microbiene vii din genul Bacillus pentru tratamentul bolilor gastrointestinale la oameni și animale de fermă sunt de mare importanță științifică și practică.

În prezent, medicamentele probiotice bine-cunoscute sunt utilizate pe scară largă în asistența medicală practică: bactisubtil, sporobacterin, biosporin, bactisporin, subalin, cereobiogen, enterogermin și altele.

Indicațiile pentru utilizare terapeutică și eficacitatea terapeutică a acestor medicamente sunt limitate de proprietățile tulpinilor utilizate pentru producerea lor. Spectrul activității antagoniste împotriva microorganismelor patogene și oportuniste care provoacă tulburări microecologice în diferite biotopuri ale corpului uman sau animal are o importanță decisivă. În plus, nu se poate ignora capacitatea bacililor de a produce substanțe biologic active (antibiotice polipeptidice, enzime etc.) și rezistența lor la antibiotice.

Diversitatea și rezistența la antibiotice emergente a microorganismelor implicate în dezvoltarea tulburărilor disbiotice, pe de o parte, precum și variabilitatea capacităților de biosinteză ale diferitelor tulpini de B. subtilis, pe de altă parte, fac recomandabilă monitorizarea constantă a tulpinilor care au vizat activitate probiotică și/sau sunt producători de diferite substanțe biologic active.

Scopul lucrării:

Pentru a studia proprietățile biologice ale tulpinilor izolate de B. subtilis și a evalua posibilitatea utilizării acestora pentru dezvoltarea unui probiotic spori original.

Obiectivele cercetării:

1. Studiați proprietățile morfologice, fiziologic-biochimice, antagoniste, adezive și alte proprietăți ale culturilor izolate de B. subtilis în experimente in vitro și selectați tulpina cea mai promițătoare pentru cercetări ulterioare.

2. Evaluați activitatea probiotică a tulpinii selectate de B. subtilis în experimente in vivo.

3. Selectați un mediu nutritiv optim pentru acumularea de biomasă a tulpinii de B.subtilis studiate.

4. Determinați viabilitatea și activitatea antagonistă a tulpinii selectate de B. subtilis în timpul depozitării.

5. Comparați proprietățile tulpinii originale de B. subtilis și culturile utilizate pentru producerea preparatelor probiotice comerciale.

Noutate științifică.

Pe baza studiului proprietăților morfologice, fiziologic-biochimice, genetice și a altor proprietăți biologice ale tulpinilor izolate, a fost selectată o tulpină fără plasmide B. subtilis 1719, care prezintă antagonism față de microorganismele oportuniste și patogene din diferite grupe taxonomice, are un adeziv scăzut. activitate, este rezistent la gentamicina, polimixină și eritromicină.

Au fost fundamentate experimental abordările de creare a tehnologiei de producție, inclusiv studierea proprietăților de creștere ale tulpinii B. subtilis 1719 pe medii nutritive originale, a condițiilor de stabilizare a viabilității acesteia și a activității antagoniste ca etape în obținerea unui nou medicament probiotic.

A fost depusă o cerere de invenție (nr. 2005111301 din 19 aprilie 2005): „Tulpina bacteriană Bacillus subtilis 1719 este un producător de biomasă activă antagonic împotriva microorganismelor patogene, precum și a enzimelor proteolitice, amilolitice și lipolitice.”

Semnificație practică.

Tulpina izolată și identificată B.subtilis 1719 a fost depusă în Colecția de Stat de Culturi GISC numită după. J.I.A. Tarasevich sub nr. 277 și poate fi recomandat pentru dezvoltarea tehnologiei industriale pentru producerea unui medicament probiotic bioterapeutic original.

Principalele dispoziții depuse pentru apărare:

1. Cele trei tulpini identificate de culturi bacteriene corespund speciei B. subtilis ca proprietăți morfologice, fiziologice, biochimice și alte proprietăți. Nu conțin plasmide, sunt active antagonic împotriva bacteriilor oportuniste și patogene din diferite grupe taxonomice și au un nivel scăzut sau mediu de aderență.

2. Tulpina B.subtilis 1719 are proprietati probiotice, manifestate prin eliminarea microorganismelor oportuniste si patogene cu refacerea compozitiei cantitative si calitative a microflorei normale in disbioza experimentala, si are si efect imunomodulator asupra macroorganismului.

3. Pe baza caracteristicilor sale tehnologice, tulpina B.subtilis 1719 poate fi recomandată ca candidat pentru crearea unui medicament probiotic original.

REVIZUIRE DE LITERATURA

Concluzie Disertație pe tema „Microbiologie”, Gataullin, Airat Gafuanovich

1. Pe baza proprietăților morfologice și fiziologico-biochimice, tulpinile izolate au fost identificate ca B. subtilis. Nu s-au găsit plasmide în preparatele ADN ale tulpinilor de B. subtilis, ceea ce aparent indică controlul cromozomial al rezistenței la antibiotice.

2. Folosind un model de disbioză la șoareci albi s-a demonstrat activitatea probiotică a tulpinii B.subtilis 1719, manifestată prin eliminarea microorganismelor oportuniste și patogene cu refacerea compoziției calitative și cantitative a microflorei normale.

3. Mediul optim pentru acumularea de biomasă la cultivarea tulpinii B. subtilis 1719 este mediul VK-2 cu adaos de glucoză sau zaharoză ca sursă de carbohidrați.

4. S-a stabilit ca tulpina B.subtilis 1719 isi pastreaza viabilitatea si activitatea antagonista in stare liofilizata cu stabilizator zaharoza-gelatina timp de cel putin 4 ani (perioada de observatie), in forma lichida stabilizata cu solutie NaCl 7% - 2 ani și 1 an în prezența apei distilate sau a soluției de glicerină 10%.

5. Tulpina B.subtilis 1719, netoxică, activă antagonic, cu adeziv scăzut, fără plasmide, care are activitate probiotică și imunomodulatoare, este depusă în Colecția de Culturi de Stat GISC numită după. J1.A. Tarasevici.

6. Tulpina B. subtilis 1719 (277), pe baza proprietăților sale biologice și a caracteristicilor tehnologice de bază, este promițătoare pentru utilizare în dezvoltarea de noi preparate probiotice.

CONCLUZIE

Descoperirile și realizările științei biologice și medicale moderne au făcut posibilă dezvoltarea și punerea în practică a noilor produse biologice - probioticele. Aceste medicamente se bazează pe culturi microbiene vii. Efectul terapeutic al acestor medicamente se bazează pe un antagonism microbian pronunțat împotriva tulpinilor patogene și condiționat patogene - agenți patogeni. În procesul de tratament, activitatea imunomodulatoare a probioticelor nu este mai puțin importantă. Avantajele incontestabile ale medicamentelor obținute din bacterii vii față de medicamentele sintetizate chimic sunt inofensiunea lor, proprietățile lor fiziologice pentru organismul uman și absența reacțiilor alergice. Deja, probioticele au ocupat poziții de frunte în corectarea microflorei gastrointestinale, a tulburărilor metabolice și în tratamentul consecințelor antibacteriene, chimioterapiei, hormonale și radioterapiei. Un studiu al fenomenului de translocare bacteriană a arătat că probioticele pot înlocui cu succes antibioticele și enzimele proteolitice în prevenirea și tratamentul diferitelor infecții chirurgicale.

În ultimul deceniu, produsele biologice bazate pe culturi microbiene vii de bacterii formatoare de spori au fost utilizate pe scară largă pentru prevenirea și tratamentul bolilor tractului gastrointestinal.

Diversitatea proceselor metabolice, variabilitatea genetică și biochimică, rezistența la enzimele litice și digestive au servit drept justificare pentru utilizarea bacililor în diferite domenii ale medicinei. Aceste microorganisme sunt ușor de fabricat, stabile în timpul depozitării și, cel mai important, ecologice.

Activitatea ridicată a tulpinilor împotriva unui set de culturi testate nu garantează activitatea acestuia împotriva altora. În acest sens, utilizarea probioticelor din spori este limitată la scopuri terapeutice specifice. Variabilitatea formelor nosologice de boli purulent-septice și diversitatea microorganismelor semnificative din punct de vedere etiologic pentru dezvoltarea tulburărilor disbiotice determină cerințele pentru produsul biologic utilizat. Acest lucru încurajează cercetătorii să analizeze continuu tulpinile antagoniste cu proprietățile dorite.

Tulpinile pe care le-am studiat aveau proprietăți morfologice și fiziologico-biochimice tipice reprezentanților B. subtilis și erau caracterizate printr-un set de enzime care descompun diferite substraturi.

Conform literaturii de specialitate, B.subtilis au proprietăți antagoniste pronunțate împotriva unei game largi de microorganisme patogene și activitate enzimatică ridicată, datorită căreia normalizează procesele digestive și oferă, de asemenea, un efect antitoxic și antialergic.

Tulpinile de B. subtilis studiate au avut o gamă largă de activitate antagonistă, nivel scăzut de aderență (B. subtilis nr. 1719) sau mediu (B. subtilis nr. 1594, B. subtilis nr. 1318).

Astfel, tulpinile pe care le-am studiat s-au caracterizat printr-o activitate probiotică ridicată. Cu toate acestea, studiul proprietăților biochimice a arătat că tulpina B. subtilis 1719 a avut o activitate enzimatică mai mare (protează, amilază, lipază), care a fost exprimată în cea mai mare zonă de hidroliză a substraturilor studiate. În plus, nivelul scăzut de activitate adezivă a tulpinii B. subtilis 1719 și, aparent, rezistența sa naturală la antibiotice, controlată de cromozom, ne-au permis să concluzionăm că studiul ulterioar al acestei culturi este promițător.

În opinia noastră, perspectivele de extindere a producției industriale de medicamente bazate pe genul Bacillus sunt foarte mari.

Bacilii sunt capabili să secrete multe enzime în fluidul de cultură. Acestea servesc ca un important sit industrial pentru producerea de enzime proteolitice și amilolitice utilizate în producția de produse alimentare, detergenți și substanțe biomedicale. În ultimul deceniu, cu participarea lor, au fost obținute o serie de noi antibiotice, insecticide bacteriene și alte substanțe biologic active.

În ciuda faptului că B. subtilis are statut GRAS, există rapoarte izolate în literatură despre prezența factorilor de patogenitate la unele tulpini de B. subtilis. Se indică faptul că acesta nu este un semn permanent, deoarece dispare în timpul reînsămânțării. S-a sugerat că proprietățile patogene ale bacteriilor sunt legate de prezența plasmidelor. De exemplu, Le N. și Anagnostopoulos S. au izolat plasmide din 8 tulpini de B. subtilis de la 83 de subiecți examinați. ADN-ul plasmidic a fost determinat numai în celulele tulpinilor toxigenice ale B. subtilis și nu a fost găsit în celulele altor tulpini ale aceleiași specii care nu sunt toxigenice. Eliminarea plasmidelor din tulpinile toxigenice sub influența agenților eliminatori a condus la eliminarea proprietăților toxigenice ale filtratelor de cultură. Cu toate acestea, rolul genetic al plasmidelor nu a fost suficient studiat.

În studiile noastre, nu au fost găsite plasmide în preparatele izolate de ADN ale celor trei tulpini de B. subtilis studiate.

Autorii care au studiat efectul bacililor asupra organismului animalelor cu sânge cald au ajuns la concluzia că tulpinile de B. subtilis sunt complet inofensive pentru oameni și animale. Dovada inofensivității macroorganismului este oferită de datele experimentale că în câteva zile după administrarea parenterală, B.subtilis este eliminat din organism. Mecanismele efectului terapeutic al acestor culturi au fost studiate la animale. În prezent, se crede că efectul terapeutic al probioticelor din spori este determinat de un complex de factori, printre care: producția de bacteriocine de către culturile de B. subtilis, care suprimă creșterea microorganismelor patogene și condiționat patogene; sinteza de enzime foarte active: proteaze, ribonucleaze, transaminaze etc.; producerea de substanțe care neutralizează toxinele bacteriene.

Un studiu al proprietăților tulpinii selectate la șoareci a arătat că este avirulentă și nu are toxicitate sau toxicitate.

Factorii efectului pozitiv al probioticelor asupra macroorganismului sunt diferite produse ale sintezei microbiene: aminoacizi, antibiotice polipeptidice, enzime hidrolitice și o serie de alte substanțe biologic active care au o importanță mai mică. Prin urmare, studiul și izolarea substanțelor de protecție produse de microorganismele din genul Bacillus și crearea de medicamente biomedicale pe baza acestora este o nevoie urgentă.

În tractul gastrointestinal, se manifestă un efect antagonist direct al bacililor, care este predominant selectiv în raport cu microorganismele patogene și condiționat patogene. În același timp, ele se caracterizează prin absența antagonismului față de reprezentanții microflorei normale.

În studiile noastre, în timpul corectării disbiozei experimentale induse de administrarea antibioticului doxiciclină, cultura de B. subtilis 1719 a contribuit la normalizarea compoziției și a numărului microflorei intestinale, precum și la eliminarea microorganismelor patogene condiționat în microflora parietala si luminala.

Din literatura de specialitate rezultă că tulpinile industriale din genul Bacillus au un indice scăzut de activitate adezivă la eritrocite și adezivitate slabă sau moderată la celulele epiteliale intestinale. Tulpinile B. subtilis 534 și ZN au mai multe adezine la receptorii enterocitelor, tulpina B. licheniformis - la colonocite, adică. Diferite tulpini par să aibă adezine la receptorii de pe diferite celule intestinale.

Activitatea lor are loc în lumenul intestinal și este îndreptată împotriva microorganismelor patogene, fără a exercita un efect antagonist asupra reprezentanților microflorei normale. La administrarea de probiotice din spori, se realizează posibilitatea restabilirii autoflorei în diferite loci intestinali, iar după 3-5 zile numărul de lactobacili, bifidobacteri, E. coli etc. crește, iar apoi se restabilește la niveluri normale.

Rezultatele studiilor noastre privind aderența microorganismelor pe enterocite fac mai probabil să se afirme că capacitatea de aderență a celulelor intestinale depinde de compoziția cantitativă și calitativă a microflorei normale. În condiții disbiotice, receptorii sunt deschiși pe suprafața enterocitelor, de care se atașează microorganismele patogene și patogene condiționat, iar când disbioza este corectată, intestinul este colonizat de microflora normală și de numărul de receptori de enterocite capabili să adere la suprafața sa de non- microorganismele indigene scade.

Se știe că microflora normală joacă un rol declanșator important în mecanismul de formare a imunității și reacții de protecție specifice în dezvoltarea postnatală a macroorganismului.

Rolul microflorei în dezvoltarea răspunsului imun se datorează proprietăților sale imunomodulatoare universale, care includ imunostimularea și imunosupresia. S-a stabilit că lipopolizaharidele bacteriene (LPS) au un efect imunoreglator asupra răspunsului imun Ig A și joacă rolul de adjuvanți. Microflora asigură dezvoltarea unui complex de reacții imunologice nespecifice și specifice, formând mecanisme de adaptare și de protecție.

Indiferent cât de mare este activitatea antimicrobiană a unui medicament, acesta joacă un rol decisiv în eliminarea stării patologice infecțioase. Crearea de medicamente care sunt eficiente în proprietățile antimicrobiene și care stimulează răspunsurile imune pare a fi o sarcină importantă. Prin urmare, un număr mare de studii vizează studierea efectului medicamentelor probiotice asupra diferitelor părți ale sistemului imunitar al oamenilor și animalelor.

Administrarea de culturi vii de bacili aerobi stimulează în mod semnificativ producția in vivo de interferon seric și interferon indus in vitro de virusul bolii Newcastle.

O serie de studii indică faptul că medicamentele probiotice au un efect imunomodulator, restabilind starea imunitară afectată de patologie, crescând producția de interferon endogen, sporind activitatea funcțională a celulelor macrofage, crescând activitatea fagocitară a leucocitelor din sânge - monocite și neutrofile.

Studiile noastre au arătat că cultura B. subtilis 1719 a schimbat semnificativ activitatea metabolică a neutrofilelor în timpul corectării disbiozei și nu a provocat modificări ale activității funcționale a neutrofilelor în starea normală a microflorei indigene. În plus, s-a constatat că disbioza a fost însoțită de o creștere a nivelului de TNF-a, ceea ce a indicat o activitate fagocitară, citotoxică, adezivă pronunțată a macrofagelor, limfocitelor, precum și a celulelor endoteliale și epiteliale ale intestinului subțire.

Secreția crescută de citokine proinflamatorii la șoarecii cu disbioză reflectă probabil activarea celulelor imunocompetente (limfocite T, monocite/macrofage). Sub influența culturii B.subtilis 1719* s-a observat o scădere a producției de TNF-a. Introducerea culturii la animalele intacte nu a provocat modificări ale nivelului producției de TNF-a.

Având în vedere că TNF-a este un marker al reacțiilor inflamatorii, s-a ajuns la concluzia că probioticul joacă un rol important în creșterea activității antiinflamatorii a celulelor imunocompetente la animale.

Studiile efectuate pentru a studia dinamica producției de citokine sub influența tulpinii B. subtilis 1719 au arătat că cultura nu a avut niciun efect asupra producției de citokine în primele ore după administrare, cu excepția IL-lp, a cărei cantitate s-a acumulat treptat. . Nivelul altor citokine studiate (IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IFN-y) a crescut semnificativ în intervalul de la 12 la 24 de ore.

Astfel, modularea celulelor sistemului imunitar și modificările potențialului de citokine pot fi unul dintre mecanismele prin care cultura de B. subtilis 1719 contribuie la corectarea disbiozei.

Analiza rezultatelor cercetărilor științifice efectuate în țara noastră și în străinătate indică amploarea utilizării bacteriilor din genul Bacillus pentru obținerea de produse din biomasa bacteriană sau metaboliții acestora. Metodele cunoscute de cultivare a bacteriilor din genul Bacillus stau la baza tehnologiei de producere a unui număr de preparate bacteriene și enzimatice. .

La studierea proprietăților de creștere ale culturii B. subtilis 1719 pe diverse medii nutritive lichide, s-a constatat că pentru acumularea maximă de biomasă, substratul cel mai adecvat pentru cultivarea tulpinii poate fi considerat mediu BK-2 cu adaos de glucoză sau zaharoza

În prezent, la selectarea și caracterizarea culturilor de producție de microorganisme se iau în considerare în principal următorii indicatori ai caracteristicilor biologice: spectrul și nivelul activității antagoniste, fabricabilitatea, i.e. capacitatea de a acumula rapid bio* masă, rezistență la liofilizare, viabilitate în timpul depozitării. O atenție deosebită este acordată criteriilor pentru gradul de siguranță a microorganismelor utilizate pentru sănătatea umană.

În studiile efectuate pentru a evalua viabilitatea celulelor microbiene de B.subtilis 1719 atunci când sunt depozitate în prezența stabilizatorilor lichizi, s-a dezvăluit că stabilizatorul optim a fost o soluție de NaCl 7%, ceea ce a permis menținerea viabilității și proprietăților antagoniste ale tulpinii pentru 2 ani. Pentru a păstra proprietățile culturii timp de 1,5 ani, este posibil să se utilizeze o soluție de glicerol 10%, 1 an - apă distilată și s-a constatat că aceste umpluturi nu au avut un efect semnificativ statistic asupra proprietăților antagoniste ale B. tulpina subtilis 1719. Trebuie remarcat faptul că un fapt important este capacitatea tulpinii B.subtilis 1719 de a menține activitatea antagonistă împotriva S.sonnei și S.aureus în stabilizatori lichizi pentru o perioadă lungă de 36 de luni. (perioada de observație).

Liofilizarea cu un stabilizator de zaharoză-gelatină a păstrat viabilitatea și activitatea antagonistă a tulpinii B. subtilis 1719 timp de 4 ani (perioada de observație).

În prezent, medicamentele probiotice bine-cunoscute sunt utilizate pe scară largă în asistența medicală practică: bactisubtil, sporobacterin, biosporin, bactisporin, subalin, cereobiogen, enterogermin și altele

Studiu comparativ al tulpinii B. subtilis 1719 pentru activitatea antagonistă și adezivă cu culturi comerciale ale următoarelor preparate probiotice: Sporobacterina, Rusia (B. subtilis 534), Cereobiogen, China (B. cereus DM423), Subtil, Vietnam (B. cereus var. .vietnami), Baktisubtil, Franța (B.cereus IP5832), Nutrolin, India (B.coagulans), au arătat că tulpina izolată este originală și poate fi recomandată ca una de producție la obținerea unui nou medicament probiotic.

Astfel, în ceea ce privește proprietățile fiziologice și biochimice, tulpina de B. subtilis 1719 are caracteristici individuale clar distinse, care sunt incluse în pașaportul de cultură atunci când este depusă în colecția de culturi a GISC numită după. J.I.A. Tarasevici. În plus, poziția dominantă a tulpinii izolate de B. subtilis 1719 în ceea ce privește activitatea antagonistă indică perspectivele utilizării acestei culturi pentru dezvoltarea unui preparat probiotic pe baza acesteia.

Bibliografie Dizertație în biologie, candidat la științe biologice, Gataullin, Airat Gafuanovich, Moscova

1. Ashmarin I.P., Vorobyov A.A. Metode statistice în cercetarea microbiologică. Medizd, 1962, 180 p.

2. Baibakov V.I., Karikh T.L., Borukaeva L.A. si altele.Normalizarea microflorei intestinale si starea generala a soarecilor JCR sub influenta concentratului de bifidobacterii.//Antibiotice si chimioterapie. 1997. - T. 42, nr. 3. - P. 20-24.

3. Baida G.E., Budarina Zh.I. Structura primară și analiza genei hemolizinei II a Bacillus cereus // 2 Rev. munţi științific conf. ei spun Oameni de știință, Pushchino, 23-25 ​​aprilie. 1997: Rezumat. raport Pushchino. - 1997 - p. 45-46.

4. Baida G.E., Kuzmin N.P. Gena HLY-III a Bacillus cereus, donată în Escherichia coli, codifică o nouă hemolizină care formează pori. conf. dedicat în memoria academicianului A.A. Baeva: Rezumate de rapoarte, Moscova, 20-22 mai 1996. M. - 1996. - P. 108, 291.

5. Baranovsky A.Yu., Kondrashina E.A. Disbacterioza si disbioza intestinala // Sankt Petersburg. "Petru". -2000. -209 p.

6. Bakhanova E.M., Nikolaev S.M., Nikolaeva I.G., și colab. Rast. resurse. 2001. T. 37, nr. 1. p. 70-76. Efectul unui extract din lăstari de Pentaphylloides fruticosa asupra evoluției disbiozei intestinale experimentale cauzate de sulfadimetoxină și izoniazidă

7. Belyavskaya V.A., Sorokulova I.B., Ilyichev A.A. Perspective pentru proiectarea imunopreparatelor pe bază de bacili recombinanți // Noi direcții de biotehnologie: Proc. doc. YI Conf. RF, 24-26 mai 1994. Pushchino. -1994.-S. 68.

8. Belyavskaya V.A., Sorokulova I.B., Masycheva V.A. Probiotice recombinante: probleme și perspective de utilizare în medicină și medicina veterinară // Disbacterioza și eubiotice: Rezumate ale Conf. științifică și practică din întreaga Rusie. M. - 1996. - P. 7.

9. Belyavskaya V.A., Cherdyntseva N.V., Bondarenko V.M. și colab.. Efectele biologice ale interferonului produs de bacteriile recombinante ale medicamentului probiotic Subalin. Jurnal microbiol., 2003, nr. 2, p. 102-109.

10. Belyaev E.I. Modalități de îmbunătățire a medicamentelor care normalizează microflora intestinală / Rep. colecție de lucrări științifice: „Autoflora umană în condiții normale și patologice. Amar. - 1988. - P. 74-78.

11. Bilibin A.F. // Ter. arc. -1967. Nr. 11. - p. 21-28.

12. Bilibin A.F. // Klin. Medicament. 1970. - Nr. 2. - P. 7-12.

13. Birger M.O. Manual de metode de examinare microbiologică și virologică. Determinarea sensibilității microorganismelor la antibiotice. M.: Medicină, 1982. - P. 180.

14. Blinkova L.P., Semenov S.A., Butova L.G. şi altele.Activitatea antagonistă a tulpinilor proaspăt izolate de bacterii din genul Bacillus // JMEI. 1994. -N5.-S. 71-72.

15. Boyko N.V., Turyanitsa A.I., Popovich E.P., Vyunitskaya V.A. Efectul antagonist al culturilor de Bacillus subtilis asupra bacteriilor din genul Klebsiella / Microbiol. și. 1989. - T. 51, N 1. - P. 87-91.

16. Boyko N.V., Lisetska M.V. Rozrobka probutiyuv vib1rkovostn: Protiskle-romna efektivshst dyakikh tulpini V. subtilis // Nauk. Vyun. Ujgor. un-tu. Ser. Taur. 1997. - N 4. - P. 194-198.

17. Bondarenko V.M., Petrovskaya V.G. Stadiile incipiente ale dezvoltării procesului infecțios și rolul dublu al microflorei normale // Buletinul Academiei Ruse de Științe Medicale. -M.- 1997.-N3.-C. 7-10.

18. Bondarenko V.M., Chuprinina R.P., Aladysheva Zh.I., Matsulevich T.V. Probioticele și mecanismele acțiunii lor terapeutice // Experiment. și pană, gastroenterol. 2004. Nr 3. P. 83-87.

19. Bochkareva N.G., Belogortsev Yu.A., Udalova E.V. si altele.Tulpina bacteriana Bacillus subtilis este producatoare a unui complex de enzime hidrolitice imbogatite cu b-glucanaza // Pat. N 2046141 Rusia, C12 N 9/42, Publ. 20.10.95. - Taur. N 29.

20. Brilis V.I. Proprietățile adezive ale lactobacililor // Rezumat. dis. Ph.D. Miere. Sci. Tartu. -1990. - 25 s.

21. Brilis V.I., Briline T.A., Lenzner H.P., Lenzner A.A. Proprietățile adezive și hemaglutinante ale lactobacililor. Jurnal Microbiol., 1982, 9: 7578.

22. Vasilyeva V.L., Tatskaya V.N., Reznik S.R. Experiență de utilizare a adjuvanților vegetali și microbieni în obținerea fluidelor de ascită imună la animale de laborator // Mzhrobyul. revistă 1974. T. 36, N 3. - P. 358-360.

23. Vershigora A.E. Fundamentele imunologiei // Kiev: școala Vishcha. 1975. - 319 p.

24. Vinnik Yu.S., Peryanova O.P., Yakimov S.V. et al., Metoda de tratament a rănilor purulente folosind antagonişti / Jurnalul internaţional de imunoreabilitare. 1998. - N 4., p. 143.

25. Vinogradov E.Ya., Shichkina V.P. Tulpina bacteriană B. mucilaginosus ca producător de biostimulator al imunității nespecifice la viței // A.S. 1210452, URSS -1/00. Publ. 27/04/96. - Taur. N 12.

26. Vladimirov Yu.A., Sherstnev M.P. Rezultatele științei și tehnologiei: Biofizică 1989; 24:172.

27. Vorobyov A.A., Abramov N.A., Bondarenko V.M., Shenderov B.A. Disbacterioza este o problemă urgentă în medicină // Buletinul Academiei de Științe Medicale. -1997. - Nr 3. -P.3-9.

28. Vorobyov A.A., Nesvizhsky Yu.V., Zudenkova A.E., Budanova E.V. Studiu comparativ al microflorei parietale și luminale a colonului în experimente pe șoareci. Jurnal microbiol., 2001, 1: 62-67.

29. Vorobyov A.A., Nesvizhsky Yu.V., Lipnitsky E.M. si altele.Studiul microflorei parietale a intestinului uman. Jurnal microbiol., 2003, 1: 6063.

30. Vyunitskaya V.A., Boyko N.V., Spivak N.Ya., Ganova L.A./ Câteva mecanisme de acțiune ale noilor microbiotice // Fundamente microbiologice și biotehnologice ale intensificării producției de culturi și producției de furaje: Colecția de rezumate Alma-Ata, 1990. - P .17.

31. Galaev Yu.V. Enzime patogene ale bacteriilor // M.: Medicină. 1968. - 115 p.

32. Goncharova G.I., Semenova A.P., Lyannaya A.M., et al. Nivelul cantitativ al florei bifide în intestin și relația sa corelativă cu sănătatea umană. // Antibioticele și microecologia oamenilor și animalelor. -1988.-P.118-123

33. Gorskaia E.M. Mecanisme de dezvoltare a tulburărilor microecologice în intestine și noi abordări ale corectării acestora.//Disertație sub formă de științific

34. Gracheva N.M., Goncharova G.I. si altele.Utilizarea preparatelor biologice bacteriene in practica tratarii pacientilor cu infectii intestinale. Diagnosticul și tratamentul disbiozei intestinale. Instrucțiuni. 1986, p. 23

35. Gracheva N.M., Gavrilov A.F., Avakov A.A. etc. - Medicamente noi. 1994, nr. 1, p. 3-12

36. Gracheva N.M., Gavrilov A.F., Solovyova A.I. si altele.Eficacitatea noului medicament bacterian biosporina in tratamentul infectiilor intestinale acute // Journal. microbiol. 1996. - N 1. - P. 75-77.

37. Grebneva A.J1., Myagkova L.P. Disbacterioza intestinală // Ghid de gastroenterologie în 3 volume.M., 1996. -T.Z. -P.324-334

38. Grigorieva T.M., Kuznetsova N.I., Shagov E.M. Tulpina de Bacillus thuringiensis 4KN, care sintetizează o exotoxină cu activitate specifică împotriva gândacului de Colorado // Biotehnologie. 1994. - N 9-10. - P. 7-10.

39. Gulko M.A., Kazarinova JI.A., Pozdnyakova T.M. Metodă de producere a inozinei // Brevet. N 175583, C12P 19/32. Publ. 30/08/94. - Taur. N 16.

40. Demyanov A.V., Kotov A.Yu., Simbirtsev A.S., Valoarea diagnostică a studierii nivelurilor de citokine în practica clinică. Journal of Cytokines and Inflammation, 2003, Vol. 2, Nr. 3, p. 20-35

41. Egorov N.S., Zarubina A.P., Vybornykh S.N., Landau N.S. Mediu sintetic * pentru creșterea bacteriilor din genul Bacillus // Buletinul Universității de Stat din Moscova. 1989. N 4.1. p. 52.

42. Ermakova L.M., Smirnova T.A., Alikhanyan S.I. et al., Incluziuni de cristal într-un mutant Bacillus subtilis cu un spectru modificat de proteinaze // Dokl. Academia de Științe a URSS. 1977. - T. 236, N 4. - P. 1001-1003.

43. Jirkov I.N., Bratukhin I.I. Utilizarea probioticului RAS pentru corectarea disbacteriozei la viței // Medicină veterinară. 1999. N 4. - p. 40-42.

44. Zgonnik V.V., Furtat I.M., Vasilevskaya I.A. şi altele.Proprietăţi antagoniste ale bacteriilor formatoare de spori care contaminează procesul de producere a lizinei // Microbiol. și. 1993. -T.55, N4. - pp. 53-58.

45. Zinkin V.Yu. Test fotometric NBT cu neutrofile din sânge uman și semnificația sa clinică și imunologică la pacienții cu traumatisme musculo-scheletice. Rezumatul autorului. dis. Ph.D. Miere. Științe. - Moscova, 2004.

46. ​​​​Zudenkov A.E. Microflora și compoziția celulelor imunocompetente ale mucinei parietale ale colonului în condiții normale și în unele stări patologice. Rezumatul autorului. dis. Ph.D. Miere. Științe, Moscova, 2001.

47. Ivanovsky A.A., Noua bactocelolactină probiotică pentru diverse patologii la animale // Medicină veterinară. 1996 - N11. - pp. 34-35.

48. Ivanovsky A.A., Vepreva N.S., Zimireva V.V., Lagunova O.P. Metoda de producere a probioticelor pentru medicina veterinara / Brevet RU N 2084233, publ. 20.07.97. Taur. N 20.

49. Kandybin N.V., Ermolova V.P., Smirnov O.V. Rezultate și perspective de utilizare a bacterioculicidului // Sovrem. realizare biotehn.: Mater. 1 Conf. Caucazul de Nord regiune, Stavropol, sept. 1995. Stavropol. - 1995. - p. 14-15.

50. Kashirskaya N.Yu. Importanța probioticelor și a prebioticelor în reglarea microflorei intestinale.//Russian Medical Journal. 2000. - T. 8, Nr. 13-14. - p. 572-575.

51. Kovalchuk L.V., Gankovskaya L.V., Rubakova E.I. Sistemul citokinelor. M., 2000.

52. Kozachko I.A., Vyunitskaya V.A., Berezhnizkaya T.G. si altele.Bacterii din genul 4 Bacillus sunt culturi promitatoare pentru crearea mijloacelor biologice de protejare a plantelor de boli.// Mshrobyul. și. - 1995.- T.57, N 5. - P. 69-78.

53. Krasnogolovets V.N. Disbioza intestinală. M., 1979. -198 p.

54. Kudryavtsev V.A., Safronova J.I.A., Osadchaya A.I. si altele.Influenta culturilor vii de Bacillus subtilis asupra rezistentei nespecifice a organismului // Microbiol. și. 1996 - T.58, N 2. - P. 46-53.

55. Kuznetsova N.I., Smirnova T.A., Shamshina T.N. şi altele.Tulpina de Bacillus thuringiensis, toxică pentru muştele casnice // Biotehnologie. 1995. -N3-4.-S. 11-14.

56. Lapchinskaya A.V., Shenderov B.A. Corectarea disbacteriozei cauzate de cefalexină și unii imunomodulatori.//Aspecte medicale ale ecologiei microbiene. M., 1991. -P.70-79

57. Lenzner A.A., Lenzner H.T., Michelsaar M.E. et al. Lactoflora și rezistența la colonizare.//Antibiotice și miere. biotehnologie. -1987. -32. -Numarul 3. -CU. 173-180.

58. Leshcenko V.M. Clinica, diagnosticul si tratamentul candidozei viscerale. Instrucțiuni. M., 19871.

59. Lisetska M.V. Studiu experimental al activității antagoniste a tulpinii 1b de Bacillus subtilis și Klebsiella rhinoscleromatis // Nauk. Vyun. Ujgor. un-tu. Ser. Taur. 1997. - N 4. - P. 207-212

60. Lopatina T.K. et al. Efectul imunomodulator al medicamentelor eubiotice* // Buletinul Academiei Ruse de Științe Medicale. M., „Medicina”. -1997. Numarul 3. -P.30-34

61. Lukin A.A. Formarea și sporularea antibioticelor în microorganismele fără plasmide și plasmide // Pushchino. 1978. - p. 25-28.

62. Mazankova JI.H., Mikhailova N.A., Kurokhtina I.S. si altele.Bactisporin este un nou probiotic pentru tratamentul infectiilor intestinale acute la copii // Om si Medicina: Proc. raport V Congres Național Rus, Moscova, 8-12 aprilie 1997. - M. - P. 199.

63. Mazankova L.N., Vaulina O.V. Medicamente noi pentru corectarea tulburărilor disbiotice.//Children's Doctor. 2000. Nr. 3. - P. 51-53.

64. Maniatis T., French E., Sambrook J. Metode de inginerie genetică. Clonarea moleculară, 1984.

65. Markov I.I., Jdanov I.P., Markov A.I. Tulpina Bacillus subtilis MZh-6 antagonist al Mycobacterium tuberculosis // Pat. N 2120992, C 12N 1/20. - Publ. 27.10.98.-Bul.N30.

68. Mikshis N.I., Shevchenko O.V., Eremin S.A. et al., Eterogenitatea populaţiei tulpinilor de Bacillus anthracis II Dep. la VINITI 06/04/98. Saratov. -1998.-7 p.

69. Mitrokhin S.D. // Antibiotice și chimioterapie. 1991. - Nr 8. - P.46 - 50.

70. Mitrokhin S.D. Metaboliții microflorei umane normale în diagnosticarea expresă și monitorizarea tratamentului disbiozei de colon: Rezumat al tezei. Dr. med. Științe, M., 1998. 37 p.

71. Mitrokhin S.D., Ardatskaya M.D., Nikushkin E.V., Ivanikov I.O. şi alţii - M., 1997. 45 p. Diagnosticul, tratamentul și prevenirea cuprinzătoare a disbacteriozei intestinale (disbiozei) în clinica bolilor interne (Orientări).

72. Mitrokhin S.D., Shenderov B.A. Indicatori microbiologici și biochimici ai schimbărilor în ecologia microbiană a intestinului gros al șobolanilor sub influența rifampicinei. Antibiotice și chimioterapie - 1999, T. 34 Nr. 6 (482-4).

73. Molchanov O.JL, Poznyak A.JI. Utilizarea biosporinei în terapia complexă a vaginozei bacteriene // Proc. Dokl: Tehnologii moderne pentru diagnosticarea și terapia bolilor infecțioase. Sf. P. - 1999, p. 187.

74. Muzychenko JI.A., Senatorova V.N., Alkhovskaya JI.JI. si altele.Analiza morfometrica a dezvoltarii microorganismelor / Biotehnologie. 1990. - N 3. - P. 3-6.

75. Müller G., Litz P., Munch G. Microbiologia produselor alimentare de origine vegetală// M.: B.I..- 1977.- P.343 347

76. Nikitenko V.I. Medicament bacterian pentru prevenirea și tratamentul inflamației. procese de ardere și boli alergice // Aplicație internațională. N 89/09607, WO, publ. 19.10.1989.

77. Nikitenko V.I. În loc de medicamente, bacterii // Știința în URSS. - 1991. - N 4. -S. 116-121.

78. Nikitenko V.I. O tulpină de bacterie Bacillus subtilis utilizată pentru obținerea unui produs lactat destinat tratamentului diatezei, disbacteriozei și infecțiilor bacteriene // A.S. N 1648975, S.U. publicat pe 15.05. 91.

79. Nikitenko V.I., Nikitenko I.K. O tulpină de bacterii Bacillus pulvifaciens utilizată pentru fabricarea unui medicament terapeutic și profilactic împotriva infecțiilor bacteriene la animale // A.S. N 1723117, S.U. publ. 12. 1992.

80. Nikitenko V.I., Nikitenko I.K. O tulpină de bacterii Bacillus subtilis utilizată pentru obținerea unui medicament pentru prevenirea și tratarea proceselor antiinflamatorii și a bolilor alergice // A.S. N 1723116, S.U. publ. 12. 1992.

81. Nikitenko L.I., Nikitenko V.I. Tulpina bacteriană Bacillus sp. componentă a unui medicament terapeutic și profilactic împotriva disbacteriozei și alergiilor // A.S. N 1710575, S.U. - publ. 5. 1992.

82. Nikitenko V.I., Gorbunova N.N., Zhigailov A.V. Sporobacterina este un nou medicament pentru tratamentul disbacteriozei și proceselor purulent-inflamatorii // Disbacterioza și eubioticele: rezumate ale rapoartelor All-Russian. științific-practic conf. -M.- 1996.-S. 26.

83. Nikolicheva T.A., Tarakanov B.V., Golinkevici E.K., Komkova E.E. Modificări ale biocenozei tractului digestiv al purceilor când Bacillus micilaginosis este inclus în alimentație // Buletin. Institutul de Cercetare în Fiziol., Biochimie și Nutriție a Animalelor de Fermă din Rusia. 1989.-N 2. - P. 31-35.

84. Obukhova O.V., Soboleva N.N. Despre prezența unui factor de distribuție în culturile de bacterii cu spori saprofiti // Journal. microbiol. 1950. - N 12. P. 482-485.

85. Determinarea sensibilității microorganismelor la medicamentele antibacteriene. Recomandări metodologice MUK 4.2.1980-04, 2004.

86. Osadchaya A.I., Kudryavtsev V.A., Safronova JI.A. Influența acidității și temperaturii medii asupra creșterii și excreției polizaharidelor de Bacillus subtilis în timpul cultivării submersibile // Misrobyul. revistă 1998. - T. 60., N 4. - P. 25-32.

87. Osipova I.G. Câteva aspecte ale mecanismului acțiunii protectoare a colibacterinei și a sporilor eubiotice și noi metode de control al acestora // Rezumatul autorului. Teză de doctorat în biologie - M., 1997. - 25 p.

88. Osipova I.G., Sorokulova I.B., Tereshkina N.V., Grigorieva JI.B. Studiul siguranței bacteriilor din genul Bacillus, care stau la baza unor probiotice // Jurnal. microbiol. 1998. - N 6. - P. 68-70.

89. Osipova I.G., Mikhailova N.A., Sorokulova I.G., Vasilyeva E.A., Gaiderov A.A. Probiotice cu spori. Jurnal microbiol. - 2003. Nr. 3. Cu. 113-119.

90. Osterman L.D. Metode pentru studiul proteinelor și acizilor nucleici. 1981.

91. Panin A.N., Serykh N.I., Malik E.V. şi altele.Creşterea eficacităţii terapiei cu probiotice la purcei / Medicină Veterinară, 1996. - N 3. - P. 17.

92. Panchishina M.V., Oleinik S.F. Disbioza intestinală. Kiev, 1983

93. Parshina S.N., Imshenetsky A.A., Nesterova N.G. si altele.Tulpina bacteriana Bacillus segesh este producatoare de enzime proteolitice cu efecte trombolitice // A. C. N 1615177, C 12N 1/20. Publicat 23/12/90.- Buletinul N 4. 1988.

94. Perth S. D. Fundamentele cultivării microorganismelor și celulelor. M. Mir, 1978, 332 p.

95. Petrov L.N., Verbitskaya N.B., Vakhitov T.Ya. Proiectarea medicamentelor pentru tratamentul și prevenirea disbiozei bazate pe idei despre endo-ecologia umană // Rus. și. HIV/SIDA și înrudite problemă 1997.- T. 1, N 1. P. 161-162.

96. Petrovskaya V.G., Marko O.P. Microflora umană în condiții normale și patologice. M.: Medicină. -1976. -217 C.

97. Poberiy I.A., Kharechko A.T., Sadovoy N.V., Litusov N.V. Noua „biosporină” eubiotică complexă pentru copii și adulți / Asistența medicală din Bashkortostan. 1998. -N 1. - P. 97-99.

98. Pogosyan G.P., Nadirova A.B., Kaliev A.B., Karabaev M.K. Plasmida pCLl și activitatea antimicrobiană a Bacillus sp. 62 II Genetica moleculară, microbiol. și virologie. 1999. - N 1. - P. 37-38.

99. Podberezny V.V., Parikov V.A. Mediu pentru cultivarea bacteriilor simbionte Bacillus pulvifaciens sau Bacillus subtilis - producator de probiotice // Brevet RU Nr. 2100029, publ. 27/12/97. Buletinul nr. 36.

100. Podberezny V.V., Polyantsev N.I., Ropaeva L.V. Cultivarea tulpinilor de producție de Bacillus subtilis în zerul de brânză // Medicină Veterinară.- 1996.-N 1.-S. 21-29.

101. Podorigora G.I. Mecanisme imunitare și nespecifice ale rezistenței la colonizare.//Antibiotice și rezistență la colonizare/Heaps of the All-Russia Research Institute of Antibiotics.- M. -1990. - problema X1X. -CU. 15-25.

102. Polkhovsky V.A., Bulanov P.A. Despre decarboxilazele aminoacizilor din Bacillus cereus //Microbiologie. 1968. - T. 37, N 4. - P. 600-604.

103. Pospelova V.V., Gracheva N.M., Antonova L.V. și colab. Preparate microbiene biologice, formele lor de dozare și domeniile de aplicare // Medicamente noi: Informații exprese. -1990. -Vol. 5. - p. 1-8.

104. Pospelova V.V., Rakhimova N.G., Khaleneva M.P. si altele.Noi domenii de aplicare a produselor biologice microbiene pentru corectarea bacteriocenozei organismului uman.//Imunobiol. droguri. M. -1989. -CU. 142-152.

105. Reznik S.R. O metodă pentru tratamentul și prevenirea bolilor virale și bacteriene ale animalelor // SU, A.s. N 1311243, publ. 1982.

106. Reznik S.R., Sorokulova I.B., Vyunitskaya V.A. si altele.Produs biologic preventiv sporolact // Brevet N 2035186. RU. - A 61 K 35/66, publ. 20.05.95, buletin. N 14.

107. Reznik S.R., Shust I.I. Parametrii hematologici și citochimici ai vițeilor la administrarea medicamentului Bacteria-SL // Biochimia animalelor agricole și programul alimentar: Proc. raport Atot-Unirea simpozion -Kiev, 1989. P. 25.

108. Reshedko G.K., Stetsyuk O.U. Caracteristici de determinare a sensibilității microorganismelor prin metoda difuziei pe disc. Metode moderne de microbiologie clinică, numărul 1. Smolensk, 2003.

109. Ryapis JI.A., Lipnitsky A.V. Aspecte microbiologice și genetice ale populației ale patogenității bacteriene // Journal. microbiol. 1998. - N 6. P. 109-112.

110. Savitskaya K.I. Tulburări ale microecologiei tractului gastrointestinal și boli intestinale cronice // Terra medica. - 1998. N 2. - p. 13-15.

111. Svechnikova E.B., Maksyutova L.F., Khunafin S.N. et al., Experiența utilizării bactisporinei în tratamentul complex al copiilor cu leziuni termice // Proc. Dokl: Tehnologii moderne pentru diagnosticarea și terapia bolilor infecțioase. Sf. P. - 1999 - p. 268.

112. Sinev M.A., Budarina Zh.I., Gavrilenko I.V. et al., Dovada existenței Bacillus cereus hemolysin II: clonarea determinantului genetic al hemolizinei II // Molek. biol. 1993. - T. 27, N 6. - P. 1218-1229.

113. Slabospitskaya A.T., Krymovskaya S.S., Reznik S.R. Activitatea enzimatică a bacililor care sunt promițătoare pentru includerea în produsele biologice // Microbiol. și. 1990. - N2. - P. 9-14.

114. Smirnov V.V., Reznik S.R., Vasilevskaya I.A. Bacteriile aerobe care formează spori sunt producători de substanțe biologic active. - Kiev, 1982 - 280 p.

116. Smirnov V.V., Reznik S.R., Vasilevskaya I.A. Bacteriile aerobe care formează spori - producători de substanțe biologic active // ​​Kiev. Naukova Duma.- 1983.- 278 p.

117. Smirnov V.V., Reznik S.R., Sorokulova I.B. si altele.Despre unele mecanisme ale aparitiei bacteriemiei asimptomatice // Microbiol. revistă 1988 -T. 50, N6.-S. 56-59.

118. Smirnov V.V., Reznik S.R., Sorokulova I.B. si altele.Metoda de tratare a bolilor purulente-septice postpartum cu o suspensie de culturi vii // A. p. N 1398868 S.U. - A 61 K 35/74. - publ. 30.05.88, buletin. N 20.

119. Smirnov V.V., Reznik S.R., Sorokulova I.B. și altele.Medicamentul biosporină pentru prevenirea și tratamentul bolilor gastrointestinale umane // A. p. N 1722502. S.U. - A 61 K. 39/02, publ. 30/03/92.

120. Smirnov V.V., Reznik S.R., Sorokulova I.B., Vyunitskaya V.A. Probleme controversate ale creării și utilizării preparatelor bacteriene pentru corectarea microflorei animalelor cu sânge cald // Microbiol. revistă 1992. - T.54, N 6.- P. 82-92.

121. Smirnov V.V., Reznik S.R., Vyunitskaya V.A., et al. Idei moderne despre mecanismele de acțiune terapeutică și profilactică a probioticelor din bacterii din genul Bacillus II Microbiol. jurnal - 1993. - 55, - Nr. 4. P. 92-112

122. Smirnov V.V., Osadchaya A.I., Kudryavtsev V.A., Safronova JI.A. Creșterea și sporularea Bacillus subtilis în diferite condiții de aerare // Microbiol. revistă 1993. - T. 55, N 3. - P. 38-44.

123. Smirnov V.V., Reznik S.R., Sorokulova I.B. și altele.Produs biologic preventiv subalin // Patent N 2035185, RU. A 61 K 35/66, publ. 20.05.95, buletin. N 14.

124. Smirnov V.V., Sorokulova I.B., Osipova I.G. Produs biologic subticol pentru prevenirea și tratarea bolilor infecțioase // Brevet N 2129432. -A. 61 K 35/74. - Taur. N 12, publ. 27/04/99.

125. Smirnov V.V., Reva O.N., Vyunitskaya V.A. Crearea și aplicarea practică a unui model matematic al acțiunii antagoniste a bacililor în proiectarea probioticelor // Mshrobyulopchnyi zhurn. 1995. -T. 64, N 5. -S. 661-667.

126. Smirnov V.V., Kosyuk I.V. Proprietățile adezive ale bacteriilor din genul Bacillus - componente ale drobioticului // Mshrobyulopchnyi zhurnal. 1997. - T. 69, N 6. - P. 36-43.

127. Sorokulova I.B. Perspective de utilizare a bacteriilor din genul Bacillus pentru proiectarea de noi produse biologice // Antibiotice și chimioterapie. -1996. T.41, N 10. - p. 13-15.

128. Sorokulova I.B. Studiu comparativ al proprietăților biologice ale biosporinei și ale altor preparate comerciale pe bază de bacili // Jurnalul Mshrobyu-lopchny. 1997. - T. 69, N 6. - P. 43-49.

129. Sorokulova I.B. Influența probioticelor din bacili asupra activității funcționale a macrofagelor / Antibiotice și chimioterapie. 1998. - T. 43, N 2. - P. 20-23.

130. Storozhuk P.G., Bykov I.M., Storozhuk A.P. Orientarea patogenetică a nutriției proteice și a terapiei de substituție enzimatică în stările de imunodeficiență ale corpului // Jurnal internațional de imunoreabilitare. 1998. - N 10., p. 110-115.

131. Tabolin V.A., Belmer S.V., Gasilina T.V. si altele.Terapia rationala a disbiozei intestinale la copii. Instrucțiuni. M., 1998. -11 p.

132. Topchy M.P. Utilizarea medicamentelor din culturi vii de Bacillus subtilis pentru disbacterioza la viței: Rezumat al tezei. dis. Ph.D. biol. Sci. Minsk, 1997. -21 p.

133. Trishina N.V. Relația dintre dezvoltarea disbiozei intestinale și starea imunității antiendotoxine. Rezumatul autorului. dis. Ph.D. Miere. Sci. -Moscova, 2003., 24 p.

134. Profesorul I.Ya. Macrofagele din sistemul imunitar. M 1978; 175.).

135. Fazylova A.A. Rațiune clinică și imunologică pentru utilizarea sporobacterinei și bactisporinei pentru disbioza intestinală la copiii mici // Autor. poate sa. dis. Ufa. - 1998. - 24 p.

136. Harwood K. Bacil. Genetica si biotehnologia. M., 1992. - P. 52.

137. Kharchenko S.N., Reznik S.R., Litvin V.P. Metoda de combatere a mucegaiului pentru furaje // A.S. N 751382, URSS, publ. în B.I., 1980, nr. 28.

138. Khmel I.A., Chernin L.S., Levanova N.B. si altele.Tulpina de bacterii Bacillus pumilus pentru obtinerea unui medicament impotriva microorganismelor fitopatogenice // Brevete 1817875 Rusia F01N 63/00, C12N 1/20. publ. 20.05.95. - Taur. N 14.

139. Chernyakova V.I., Bereza N.M., Selezneva S.I. Eficacitatea bacteriologică și imunologică a biosporinei medicamentului în colita ulceroasă nespecifică // Mikrobiol.zh. 1993. - T. 55, N 3. - P. 63-67.

140. Chkhaidze I.G., V.G. Likhoded, et al. Efectul corector al anticorpilor în disbacterioza experimentală // Journal. Microbiol. 1998, nr.4: 12-14.

141. Sharp R., Skaven M., Atkinson T. Bacillus: Genetics and biotechnology. -M. 1992. - 398 p.

142. Sheveleva S.A. Probiotice, prebiotice și produse probiotice. Starea actuală a problemei // Probleme de nutriție. -1999. -T.68. -Nr 2. -P.32

143. Shenderov B. A. Ecologie microbiană medicală și nutriție funcțională - M., 1998, T. I, P. 287.

144. Shenderov B.A. Rezistența la colonizare și medicamente chimioterapeutice și antibacteriene. // Antibiotice și rezistență la colonizare: Proceedings of the All-Russia Research Institute of Antibiotics. M. -1990. - problema X1X. -P.5-16.

145. Shenderov B.A., Manvelova M.A., Stepanchuk Yu.B., Skiba N.E. Probiotice și nutriție funcțională // Antibiotice și chimioterapie. 1997. - T. 42, N 7. - P. 30-34.

146. Shenderov B.A. Ecologie microbiană medicală și nutriție funcțională.-M., 1998, T. II, P. 413

147. Yampolskaya T.A., Velikzhanina G.A., Zhdanova N.I. etc.Tulpina bacteriana Bacillus subtilis producatoare de L-fenilalanina: A.s. N 1693056, C 12 R 13/22, publ. 23.11.91. Taur. N 43.

148. Adami A., Sandrucci A., Cavazzoni V. Purcei hrăniți de la naștere cu probiotic Bacillus coagulans ca aditiv: Aspecte zootehnice și microbiologice // Ann. microbiol. ed enzimol. 1997. - V. 47, N 1. - P. 139-149.

149. Azuma I., Sugimura C., Iton S. Activitatea adjuvantă a glicolipidelor bacteriene // Jap. J. Microbiol. 1977. - V. 20, N 5. - P. 465-468.

150. Benedettini J. et al. Imunomodularea prin spori de Bacillus subtilis // Boll. 1, Sierote Milano. 1983.-V. 62.,N6.-P. 509-516.

151. Berkel H., Hadlok R. Lecithinase-und Toxinbildung durch Stamme der Gat-tung Bacillus // Lebensmittelhygiene. 1976. - V. 27, N 2. - str. 63-65.

152. Bernheimer A., ​​​​Avigad L. Natura și proprietățile agentului citolitic produs de Bacillus subtilis // J. Gen. Microb. - 1970. V. 61, N 2. - P. 361-369.

153. Blaznic J, Kumel I.M., Salamum B. et al. Sdravljenje kronicne granulomotozne bolezni z acidofilnem mlecom // Zdrav.Vesth. 1976. N 45. - P. 77-79.

154. Boer A.S., Preot F., Diderichsen B. Despre utilizarea industrială a Bacillus licheniformis: A review // Appl. Microbiol și Biotehnologia. 1994. - V. 40, N 5. - P. 595-598.

155. Buchell M.E., Smith J., Lynch H.C. Un model fiziologic pentru controlul producției de eritromicină în cultură discontinuă și alimentată ciclic // Microbiologie. -1997. V. 143, N 2. - P. 475-480.

156. Cipradi G. et al. Efectele unui tratament adjuvant cu Bacillus subtilis pentru alergii alimentare // Chemioterapia. -1986. 5, N6. -P.408-410

157. Cromwick A.M., Birrer G.A., Gross R.A. Efectele pH-ului și aerării asupra formării y-poli (acidului glutamic) de către bacilul licheniformis în culturi controlate cu fermentare în loturi // Biotechnol. și Bioing. 1996. - V. 50, N 2. - P. 222-227.

158. Danchin A., Glasser P., Kunst F. et al. Bacillus subtilis devoile ses genes // Biofutur. 1998. - N 174. - P. 14-17.

159. Devin K.M. Proiectul genomului Bacillus subtilis: Obiective și progres // Trends Biotechnol. 1995. - V. 13, N 6. - P. 210-216.

160. Donovan W.P., Rupar M.J., Slanei A.C. Bacillus thuringiensis crytic, proteină toxică pentru insectele de coleoptere // Patent N 5378625 USA A61K 31/00. Publ. 01/03/95.

161. Dubos R. Factori toxici în enzimele utilizate în produsele de spălătorie // Știință. 1971. - N 3993. - P. 259-260.

162. Edlund C., Nord C.E. Efectul chinolonelor asupra ecologiei intestinale. Drugs, 1998, 58(2): 65-70.

163. Boala Flindt M. Pulmonare datorată inhalării derivaților de Bacillus subtilis care conțin enzimă proteolitică // Lancet.- 1969. V. 1, N 7607. - P. 1177-1181.

164. Fox M. Filogenia procariotelor // Știință. -1980. V. 209, N 4455. P. 457-463.

165. Fuller R. J Appl Bacteriol 1989; 66:5:365-378.

166. Gastro G.R., Ferrero M.A., Abate C.M. et al. Producerea simultană de alfa și beta amilaze de către Bacillus subtilis Mir-5 în cultură discontinuă și continuă // Biotechnol. Lett. 1992. - V. 14, N 1. - P. 49-54.

167. Glatz B.A., Spira W.M., Goepfert J.M. Modificarea permeabilității vasculare la iepuri prin filtrate de cultură ale Bacillus cereus și specii înrudite // Infectează și Immunol. 1974. V. 10, N 2. - P. 299-303.

168. Guida V., Guida R. Importansia dos Bacillos esporulados aerobios em gastroenterologia e nutricao // Rev. Brazilia. med. 1978. - V. 35, N 12. - P. 702707.

169. Haenel H., Bending J. Flora intestinală în sănătate și boală // Progr. Mâncare și nutriție sci.- 1975.-V. 21, N l.-P. 64.

170. Himanen J.-P., Pyhala L., Olander R.-M. et al. Activitățile biologice ale acidului lipo-teicoic și acidului peptidoglican teicoic al Bacillus subtilis 168 // J. Gen. Microbiol. - 1993.-V. 139,N 11.-P. 2659-2665.

171. Hirano Y., Matsudo M., Kameyama T. Electroforeza în gel de poliacrilamidă bidimensională a proteinelor sintetizate în timpul germinării timpurii a Bacillus subtilis 168 în prezența actinomicinei D // J. Basic Microbiol. 1991. - V. 31, N 6. - P. 429-436.

172. Humbert Florence Les probiotigues: un sujet d" actualite // Bull. inf. Stat. exp. auicult. Ploufragan. 1988. - V. 28, No. 3. - P. 128-130.

173. Inouye S., Kondo S. Amicoumacin și SF-2370, agenți farmacologic activi de origine microbiolă // Novel Microbial Prod. Med. și Agr. Amsterdam. -1989.-P. 179-193.

174. Johnson S. E. Toxina letală a Bacillus cereus 1. Relații și natura toxinei, hemolizinei și fosfolipazei // J. Bacterid. 1967. V. 94, N 2. - P. 306316.

175. Kakinuma A., Hori M., Isono M. Determinarea acidului gras în surfactin și elucidarea structurii totale a surfactinei // Agric. și Biol. Chim. 1969. - V. 33. - P. 973-976.

176. Kaneko J., Matsushima H. ​​​​Structură asemănătoare cristalului în celulele de sporulare ale Bacillus subtilis 168 // J. Electron. Microsc. - 1973. V. 22, N 2. - P. 217-219.

177. Kaneko J., Matsushima H. ​​Incluziuni cristaline în celulele sporulante de Bacillus subtilis // În: Spores YI. Selectați. Pap. al 6-lea Int. Spore Conf. Washington. - 1975. -P. 580-585.

178. Kitazawa H, Nomura M, Itoh T. J Dairy Sci 1991; 74:7:2082 2088.

179. Kubo Kazuhiro. Cultură pură de Bacillus subtilis FERM BP-3418 // Pat. N 5364738. SUA. MKI A01N 25//00. - publ. 15/11/94.

180. Kudrya V.A., Simonenko L.A. Izolarea serinelor alcaline și a lectinei din fluidul de cultură al Bacillus subtilis // Appl. Microbiol și Biotehnologia. -1994.-V. 41,N5.-P. 505-509.

181. Le H., Anagnostopoulos C. Detection and characterization of naturally occurrence plasmides // Molec. Gen. Genet. 1977. - V. 157. - P. 167-174.

182. Legakis N.J., Papavassilion J. Tehnica cromatografică în strat subțire pentru detectarea rapidă a fosfolipazelor bacteriene // J. Clin. Microbiol. - 1975. V.2, N 5. - P. 373-376.

183. Leviveld H.L.M., Bachmayer H., Boon B. et al. Biotehnologie sigură. Partea 6. Evaluarea siguranței, în ceea ce privește sănătatea umană, a microorganismelor utilizate în biotehnologie // Apl. Microbiol și Biotehnologia. 1995. V. 43, N 3. - P. 389-393.

184. Lin S.-C., Carswell K.S., Sharma M.M., Georgiou G. Producerea continuă a biosurfactantului lipopeptidic al Bacillus licheniformis JF-2 // Appl. Microbiol și Biotehnologia. 1994. - V. 41, N 3. - P. 281-285.

185. Lovett P., Bramucci M. Plasmid DNA in bacilli // În: Microbiology-Washington. 1976. - P. 388-393.

186. Markham R., Wilkie B. Influența detergentului asupra sensibilizării alergice la aerosoli cu enzime ale dumneavoastră. subtilis // Int. Arc. Alergie și Appl. Imunol. 1976.-V. 51, N 5. - P. 529-543.

187. Maruta Kiyoshi Excluderea agenților patogeni intestinali prin hrănire continuă cu Bacillus subtilis C-3102 și influența acesteia asupra microflorei intestinale la puii de carne // Anim. Sci. și Technol. 1996. - V. 67, N 3. - P. 273-280.

188. Moszer I., Glaser P., Danchin A. SubtiList: O bază de date relațională pentru genomul Bacillus subtilis // Microbiology. 1995. - V. 141, N 2. - P. 261-268.

189. Murray P.R., Baron E.J., Pfaller M.A., Tenover F.C., Jolken R.H., Manual of Clinical Microbiology, Ediția a 7-a, Washington D.C., ASM Press, 1999

190. Nozari-Renard J. Induction d 5, OInterferon par Bacillus subtilis // Ann. Microbiol. 1978. - V. 129a. - N 4. - P. 525-542.

191. Oh M.K., Kim B.G., Park S.H. Importanța mutanților de spori pentru fermentația alimentată și continuă a Bacillus subtilis // Biotechnol. și Bioing. 1995.-V. 47, N 6. - P. 696-702.

192. Payne Jewel M. Izolatele de Bacillus thuringiensis Hist sunt nematozi activi ayanist / Brevet N 5151363, C12 N 1/20, A 01 N 63/00, apl. 27/07/90, publ. 29.09.92.

193. Pepys J., Hargreave F., Longbotton Y. Reacții alergice ale plămânilor la enzimele Bacillus subtilis // Lancet. 1969. - V. 1, N 44 - 7607. - P. 1181-1184.

194. Peterson W.L., Mackrowiak Ph.A., Barnett C.C. et al. Bariera bactericidă gastrică umană: mecanisme de acțiune, activitate antibacteriană relativă și influențe alimentare.//J. infecţie Boli. -1989. -159 nr 5. -p.978-985.

195. Prasad S.S.V., Shethna G.J. Activitățile biologice de biochimie ale cristalului proteic de Bacillus thuringiensis // J. Sci. şi Ind. Res. 1976. - V. 35, N 10. - P. 626-632.

196. Rocchietta I. Utilizarea Bacillus subtilis în tratamentul bolilor/Minerva Med. -1969. -60. N3/4. -P. 117-123.

197. Rosenthal G.J., Corsini E. // Metode Immunotoxicol. 1995. V 1, P 327-343

198. Rychen G., Simoes Nunes C. Effets des flores lactigues des produits laitiers fermentes: Une base scientifigue pour l "etude des probiotiques microbiens dans l"espece porcine // Prod. anim. 1995. - V. 8, N 2. - P. 97-104.

199. Salminen Seppo Aspecte clinice ale probioticelor //Ecol. sănătate și Boală.-1999.- 11.-N4.-P. 251-252

200. Shore N., Greene R., Kezeni H. Lung disfuction in worcers exposed to Bacillus subtilis // Environm. Res. 1971. - V. 4, N 6. - P. 512-519.

201. Slein M., Logan G., Characterization of the phospholipases of you. cereus și efectele lor asupra eritrocitelor, celulelor osoase și renale // J. Bacteriol. 1965. - V. 90, Nl.-P. 69-81.

202. Somerville H.J. Endotoxina insecticida a Bacillus thuringiensis // În: Sem. etude theme Prod, natur. et prot. plantă. 1977. - P. 253-268.

203. Spira W., Goepfert J. Caracteristicile biologice ale unei enterotoxine produse de Bacillus cereus // Can. J. Microbiol. 1975. - V. 21, N 8. - P. 1236-1246.

204. Stgard Henri Microbielle v kstfremmer til svin. Teori og prasksis/ Dan veterinaertidsskr. 1989. - V. 72, N 15. - P. 855-864.

205. Su Li, Zhang Zhihong, Xiao Xianzhi, Wang Xiaomin Wuhan daxue xuebao. Ziran kexue ban // J. Wuhan Univ. Natur. Sci. Ed. 1996. - V. 42, N 4. - C. 516518.

206. Sumi H. Funcția fiziologică a natto-ului // J. Brew. Soc. Jap. 1990. - V. 85, N 8.-P. 518-524.

207. Tihole F. Fizioloski pomer backteriemije z geiunalo microflora // Zdravstv vestn 1982. - V. 51, N 1. P. 3-5.

208. Towalski Z., Rothman H. Enzyme technology //in: The Biotechnological Challenge. Cambridge University Press. Cambridge, 1986 - P. 37 -76.

209. Tsuge Kenji, Ano Takashi, Shoda Makoto. Caracterizarea Bacillus subtilis YB8, coproducător de lipopeptide surfactină și plipastatină B1 //J. Gen. și Appl. Microbiol. 1995.- 41, N 6. P. 541-545.

210. Van der Waaij D. Rezistența la colonizare a tractului digestiv: mecanism și consecințe clinice.//Nahrung. -1987. -31 nr 5. -p.507-524.

211. Vollaard E.J., Clasener H.A.L., Janssen J.H.M. Contribuția Escherichia coli la rezistența la colonizarea microbiană.//.!, a chimioterapiei antimicrobiene. -1990.- 26. -p.411-418