Diagnóstico de laboratorio de helmintiasis. Método para aislar un cultivo puro de Leishmania obtenido mediante raspado de tejidos patológicos.

Métodos simples

Método macroscópico. Al examinar las heces, se pueden encontrar helmintos, sus cabezas, segmentos y fragmentos de estróbilos, liberados de forma independiente o después de la desparasitación. Este método está especialmente recomendado para identificar enterobiasis, teniasis y teniaringosis.

Se mezclan pequeñas porciones de heces con agua en un baño plano o en una placa de Petri y, observando buena iluminacion sobre un fondo oscuro, utilizando una lupa si es necesario, elimine los helmintos y todas las formaciones blancas sospechosas con unas pinzas o una pipeta. El material recolectado se transfiere a otra taza con agua o a un portaobjetos de vidrio en una gota de glicerol diluido o solución isotónica de cloruro de sodio para su posterior estudio.

Con el método de sedimentación, toda la porción de heces que se analiza debe mezclarse con agua en un cilindro de vidrio y luego drenarse con cuidado. capa superior agua. Esto se repite varias veces. Cuando el líquido se aclara, se drena y el sedimento se examina en pequeñas porciones en un baño de vidrio o placa de Petri, como se indicó anteriormente.

Los métodos microscópicos son la principal forma de examinar las heces para detectar huevos o larvas de helmintos. Los diversos métodos de investigación se describen a continuación. Para aumentar la fiabilidad del examen, las pruebas se pueden repetir varias veces al día o con un intervalo de 1 a 3 días.

Método de frotis nativo. El frotis nativo es el más común y técnicamente método disponible estudios fecales. En un frotis nativo se pueden detectar huevos y larvas de helmintos de todo tipo. Sin embargo, si la cantidad de huevos en las heces es pequeña, no siempre se pueden encontrar. Por lo tanto, el examen de heces utilizando únicamente un frotis nativo no es completo y debe complementarse con métodos de enriquecimiento. La eficiencia del examen de un frotis nativo mejora notablemente al ver cuatro portaobjetos preparados a partir de una muestra de heces en dos portaobjetos sin cubreobjetos, lo que permite examinar un total de aproximadamente la misma cantidad de heces que con el método Kato (ver más abajo).

Se unta finamente una pequeña cantidad (del tamaño de la cabeza de una cerilla) de heces mixtas con un palo de madera sobre la superficie de un portaobjetos de vidrio en una gota de solución de glicerina al 50%. Por lo general, se preparan dos frotis en un portaobjetos. El frotis se observa con un microscopio de bajo aumento (vol. 8, aprox. 7). En casos dudosos, se cubre con un cubreobjetos y se examina con gran aumento (40 aumentos).

Para preparar un frotis nativo grande, se muelen 200-300 mg de heces (del tamaño de un guisante grande) en un vidrio de 6x9 cm en 15-20 gotas de una solución acuosa de glicerol al 50%. Observar con un microscopio estereoscópico binocular (obv. 4, aprox. 12,5 u ob. 2, aprox. 17) con luz transmitida y sin cubreobjetos. En casos dudosos, puede cambiar la lente a un aumento mayor. En tales frotis, los huevos de helmintos grandes y coloreados son claramente visibles, mientras que los huevos transparentes de la tenia enana son algo peores. Este método no es adecuado para detectar huevos pequeños. Al mismo tiempo, un gran volumen del material en estudio y un gran campo de visión con una alta profundidad de campo garantizan una efectividad significativa de esta modificación en comparación con un frotis nativo convencional.

El frotis espeso con celofán (método Kato) es más eficaz que el estudio de un frotis nativo, pero también requiere combinación con métodos de enriquecimiento. Se detectan huevos de todo tipo de helmintos, sin embargo, para detectar huevos de tenia enana (huevos transparentes) u opistórquidos (huevos pequeños), el técnico de laboratorio debe tener especial cuidado para no pasarlos por alto (Fig. 21).

El método se basa en la detección de huevos de helmintos en una capa espesa de heces, limpiada con glicerina y teñida de verde malaquita. Se corta celofán prehidrófilo en placas de 20 x 40 mm y se sumerge en una mezcla de Kato (6 ml de una solución acuosa al 3% de verde malaquita, 500 ml de glicerina, 500 ml de una solución de fenol al 6%). 3-5 ml de la mezcla son suficientes para 100 placas, que están listas para usar en un día y se pueden almacenar en la misma mezcla en un recipiente bien cerrado a temperatura ambiente durante 6 meses. En ausencia de verde de malaquita (recomendado para reducir la fatiga ocular del asistente de laboratorio) y fenol (desinfectante), solo se puede usar una solución acuosa de glicerol al 50%, la efectividad del estudio no se reduce.

Arroz. 20. Método para preparar una masa espesa de heces con celofán según Kato

Se aplican 100 mg de heces a un portaobjetos de vidrio, se cubre con una placa de celofán, se procesa como se indica anteriormente y se presiona con un tapón de goma para que las heces no se extiendan por debajo del celofán. La microscopía con un aumento bajo o alto del microscopio se realiza a más tardar 1 hora (en climas cálidos, 30 a 40 minutos) después de preparar el frotis. La causa de la opacidad del medicamento puede ser una capa gruesa de heces, un procesamiento deficiente de la placa en la mezcla Kato o un período insuficiente de exposición del medicamento bajo celofán. El aclarado prolongado con glicerina y el secado excesivo de la preparación también dificultan la detección de los huevos.

Método de torsión según S.S. Shulman. El método se propone para la detección de larvas de helmintos, principalmente strongyloides, en las heces. Solo se examinan las heces recién excretadas, de las cuales se transfieren 2-3 g a un frasco de vidrio, se agitan con una varilla de vidrio con un movimiento circular con una cantidad de solución fisiológica de 3 a 5 veces, sin tocar las paredes del recipiente. En el centro se acumulan huevos y larvas de helmintos. Una vez completada la mezcla, la gota al final de la barra se transfiere rápidamente a un portaobjetos de vidrio, se cubre con un cubreobjetos y se examina con un microscopio.

Métodos de enriquecimiento. Los métodos de enriquecimiento se basan en la diferencia entre el peso específico de los huevos y la solución salina utilizada, lo que permite detectarlos en pequeñas cantidades. Si el peso específico de los huevos es mayor que el peso específico del líquido, entonces los huevos se concentran en un sedimento, que se examina con un microscopio. Este método de sedimentación se utiliza para los huevos de trematodos. Con una gravedad específica más alta de la solución, los huevos flotan hacia la superficie del líquido y luego se examina la película. Estos son métodos de flotación (flotación), son más efectivos para detectar huevos de anquilostomas, tricocéfalos y tenias enanas.

Métodos de flotación. El método Fulleborn se basa en la flotación de huevos de helmintos en una solución saturada de cloruro de sodio, que tiene una densidad relativa alta (1,2), lo que permite detectar huevos en pequeñas cantidades. El método es más eficaz que estudiar un frotis nativo, aunque más complicado. Las ventajas del método son el bajo costo y la accesibilidad. Se recomienda combinar el estudio del frotis nativo y el método Fulleborn.

Se prepara una solución saturada disolviendo 400 g de cloruro de sodio en 1 litro de agua mientras hierve. La densidad relativa de la solución es 1,18-1,22. La solución se almacena en un frasco cerrado. Para realizar el análisis, se colocan 2-3 g de heces en un frasco con un volumen de 30-50 ml y, mientras se agita con un palo, se agrega una solución saturada de cloruro de sodio casi hasta arriba. Se utiliza una tira de papel para eliminar rápidamente partículas flotantes grandes. Después de 45-60 minutos. Después de asentar con un lazo de alambre, retire la película superficial y transfiérala a un portaobjetos de vidrio en una gota de solución acuosa de glicerol al 50%. En lugar de quitar la película con un lazo, puede agregar la solución en el frasco en la parte superior, cubrir con un portaobjetos de vidrio, a cuya superficie se adhieren los huevos flotantes. Se están preparando varios preparativos. Además, se examinan de 2 a 4 preparaciones del sedimento, recogiéndolas con una pipeta ocular en 2 portaobjetos de vidrio. Además de la película superficial, también es necesario examinar el sedimento, ya que los huevos de trematodos, tenidos y huevos de lombrices intestinales no fertilizados no flotan en esta solución. Los huevos de varios helmintos no flotan inmediatamente hacia la superficie en una solución salina. Entonces, si la cantidad máxima de huevos de tenia enana emerge después de 15 a 20 minutos, entonces ascaris, después de 1,5 a 2 horas, tricocéfalo, después de 2 a 3 horas.

Así, las ventajas de este método incluyen su bajo costo y disponibilidad, las desventajas son la necesidad de ver las preparaciones en la película superficial y el sedimento, así como la duración de la sedimentación.

El método de E. V. Kalantaryan también es un método de enriquecimiento, pero es más eficaz y sencillo que el método Fulleborn. Se utiliza una solución saturada de nitrato de sodio con una densidad relativa de 1,38. Por lo tanto, los huevos de la mayoría de los helmintos flotan y se encuentran en la película superficial, no es necesario examinar el sedimento.

Para preparar una solución saturada de nitrato de sodio, se disuelve 1 kg de sal de nitrato de sodio (nitrato de sodio) en 1 litro de agua y se hierve hasta que se disuelva por completo y se forme una película en la superficie. Sin filtrar, verter en una botella seca. En ausencia de nitrato de sodio, se puede sustituir por nitrato de amonio (nitrato de amonio), disolviendo 1,7 kg por 1 litro de agua. La densidad relativa de la solución resultante es 1,3, lo que reduce ligeramente la eficiencia en comparación con una solución de nitrato de sodio.

Ventajas del método: los huevos de la mayoría de los helmintos flotan rápidamente y se encuentran en la película superficial, lo que elimina la necesidad de examinar el sedimento. Las desventajas del método son la deficiencia de nitrato de sodio, así como el hecho de que los huevos de trematodos y las oncosferas de tenidos no flotan y permanecen en el sedimento. Hay que tener en cuenta que cuando las heces se mantienen en solución durante mucho tiempo (más de 1-2 horas), los huevos de algunos helmintos comienzan a hincharse y sedimentarse, desapareciendo de la película superficial.

Métodos de sedimentación

El método de P. P. Goryachev se basa en el principio de sedimentación de los huevos. En este caso, el frotis resulta ligero, sin impurezas gruesas, lo que facilita la detección de pequeños huevos de trematodos (opistórquidos, etc.). La gravedad específica de los huevos de opistorco es alta, por lo que no flotan en soluciones salinas.

Se vierten 70-100 ml de una solución saturada de cloruro de sodio en un cilindro con un diámetro de 2-3 cm. Por separado, mezcle con cuidado 0,5 g de heces en 20-25 ml de agua y filtre con cuidado a través de un embudo con dos capas de gasa en un cilindro para obtener una solución salina, evitando agitar (para que se formen dos capas claramente delimitadas). Después de 2 a 3 horas, la capa superior con heces se aspira con una pipeta y la solución salina restante se deja reposar durante 12 a 20 horas o se centrifuga. El sedimento se pipetea sobre un portaobjetos de vidrio, se cubre con un cubreobjetos y se examina al microscopio.

El método de Goryachev se propuso para detectar huevos de opistórquidos y resultó ser más eficaz que el estudio del frotis nativo y el método de Fulleborn. Actualmente, para el diagnóstico de opistorquiasis (clonorquiasis), los métodos de Kato y Kalantaryan se recomiendan por ser bastante eficaces y técnicamente más sencillos.

El método de Krasilnikov. Bajo la influencia de los tensioactivos incluidos en los detergentes, los huevos de helmintos se liberan de las heces y se concentran en los sedimentos.

Prepare previamente una solución al 1% de detergente en polvo Lotus. Para ello, se disuelven 10 g de polvo en 1 litro de agua del grifo. Si Lotus no está disponible, puedes utilizar otros. detergentes en polvo, pero es necesario tomar de cada uno de ellos la cantidad que se pueda disolver sin formar sedimentos en 1 litro de agua del grifo. Se vierten 20-30 ml de solución de detergente en un recipiente de vidrio con una capacidad de 30-50 ml, se coloca allí una pequeña porción de heces y se mezcla bien. La proporción de heces a solución debe ser de aproximadamente 1:20. Las heces deben permanecer en la solución durante al menos 24 horas. Durante este tiempo, se forma un sedimento de 2-3 capas en el fondo. La capa inferior está formada por partículas gruesas y pesadas, en la capa intermedia se acumulan huevos de helmintos y en la capa superior, escamas de color gris blanquecino. Luego, con una pipeta, tome 2-3 gotas de líquido de la capa intermedia y transfiérala a un portaobjetos de vidrio. Se preparan 2 preparaciones en un portaobjetos, se cubren con un cubreobjetos y se examinan al microscopio.

El método de Krasilnikov permite detectar huevos de todo tipo de helmintos excretados en las heces.

Método de sedimentación con éter-formalina y método de sedimentación química con alta eficiencia Son muy laboriosos, especialmente durante los exámenes masivos, por lo que es más recomendable utilizar el método éter-acético. Permite, después de un tratamiento adicional del sedimento con reactivos químicos, obtener casi solo huevos de helmintos, lo que facilita la identificación de pequeños huevos de trematodos. Este método resultó ser universal, detecta huevos de todos los helmintos intestinales, quistes de protozoos intestinales y también puede usarse para cuantificar la intensidad de la invasión.

Se vierten 7 ml de una solución al 10% en tubos graduados de centrífuga. ácido acético y añadir 1 g de heces hasta la marca de 8 ml. Las heces se mezclan bien con un palo hasta que se forme una mezcla homogénea y luego se filtran a través de dos capas de gasa en otro tubo de centrífuga (de modo que el nuevo tubo de ensayo de la solución colada contenga nuevamente 8 ml; si es menos, también puede enjuague el embudo con una venda con una solución de ácido acético al 10%, a través de quien se filtró la solución fecal). Añadir 2 ml de éter a este tubo de ensayo (hasta la marca de 10 ml), taparlo y agitar vigorosamente durante 30 segundos. La mezcla se centrifuga a 3000 rpm durante 1 minuto (o 2 minutos a 1500 rpm). La capa de coagulante (en forma de tapón en la parte superior del tubo de ensayo) se separa de las paredes del tubo de ensayo con un palito y se drena con cuidado junto con el líquido sobrenadante. El precipitado (generalmente pequeño, incoloro) se pipetea sobre portaobjetos de vidrio, se cubre con un cubreobjetos y se examina microscópicamente.

Los protozoos se dividen en 4 clases:

Cuando se enquista, el microorganismo adquiere una forma redonda y se cubre con una capa protectora. En forma de quiste, los protozoos se vuelven menos susceptibles a factores ambientales desfavorables.

Podrán ser objeto de investigación:

Nota:Hay muchos tipos de diagnósticos, consideraremos aquellos que son más comunes en la práctica del laboratorio clínico.

Tipos privados de diagnóstico.

En cada caso concreto, el asistente de laboratorio tiene la tarea de encontrar un patógeno específico, en ocasiones se descubren otros junto con el principal.

Existen 6 especies de este microorganismo capaces de vivir en el intestino humano. Sólo la ameba disentérica, que se presenta en forma vegetativa y en forma de quistes, tiene importancia clínica.

Además, se utilizan métodos inmunológicos:

inmunofluorescencia indirecta;
aglutinación indirecta (INA);
inmunodifusión radial.

Nota: métodos serológicos no son informativos y se utilizan sólo como complemento de los principales en casos dudosos.

Diagnóstico de ciliados (ciliados)

La forma patógena de microorganismos de este género es balantidium. Este es un microbio que causa la balantidiasis, una enfermedad acompañada de un proceso ulcerativo del intestino grueso. El patógeno se detecta en el frotis nativo en forma vegetativa y quiste. El material para el frotis (heces y moco) se toma durante un examen de sigmoidoscopia y se siembra en un medio especial.

Diagnóstico de flagelados (Leishmania, Giardia, Tripanosomas, Trichomonas)

Leishmania, tripanosomas, lamblia y trichomonas son peligrosos para los humanos.

Leishmania– microbios, causando leishmaniasis, se examinan en frotis de sangre, materiales médula ósea, raspados de infiltrados cutáneos. En algunos casos, para el diagnóstico de leishmania, se utiliza cultivo en medios nutritivos.

tripanosomas– agentes causantes de la enfermedad del sueño (tripanosomiasis americana/africana o enfermedad de Chagas).

La variante africana se determina en el período inicial durante el estudio de sangre periférica. A medida que avanza la enfermedad, se encuentran microbios patológicos en el material de las punciones de los ganglios linfáticos y, en etapas avanzadas, en el líquido cefalorraquídeo.

Para diagnosticar tripanosomas si se sospecha la enfermedad de Chagas, el material que se examina se examina bajo un microscopio con bajo aumento. En este caso, los frotis y la gota espesa se tiñen previamente.

Tricomonas(intestinal, oral) se detectan mediante microscopía de materiales extraídos de las membranas mucosas afectadas.

Identificación de esporozoos (malaria plasmodium, agente causante de la coccidosis, etc.)

La especie más común y peligrosa para los humanos es el plasmodium de la malaria, que tiene 4 tipos principales de patógenos: el agente causante de la malaria de tres días, la malaria de cuatro días, la malaria tropical y la malaria oval.

El desarrollo sexual de Plasmodium (esporogonía) tiene lugar en los mosquitos Anopheles. Asexual (esquizogonia de tejidos y eritrocitos): en tejido hepático y eritrocitos humanos. Estas características ciclo vital debe tenerse en cuenta al diagnosticar la malaria por plasmodium.

Así, en la sangre de un paciente recién enfermo se pueden detectar células germinales del ciclo de esporogonia. Pero en el momento álgido de los ataques de malaria, los esquizontes aparecen en grandes cantidades en la sangre.

Además, en diferentes fases de la fiebre palúdica aparecen diferentes formas de plasmodio:

durante el período de frío, la sangre se llena de merozoítos, un tipo de esquizonte;
a temperaturas elevadas, los trofozoítos en forma de anillo se acumulan en los eritrocitos;
una disminución de la temperatura se caracteriza por un predominio de trofozoítos similares a amebas;
Durante los períodos de condición normal, la sangre contiene formas adultas de esquizontes.

El estudio del agente causante de la malaria (malaria plasmodium) se realiza en un frotis y en una gota espesa.

Nota:El diagnóstico de malaria mediante frotis y gotas espesas de sangre a veces es erróneo. En algunos casos, las plaquetas sanguíneas pueden atribuirse erróneamente al patógeno de la malaria. También a veces fragmentos de leucocitos y otras células simulan el plasmodio.

Métodos básicos para estudiar protozoos.

Veamos brevemente los métodos de investigación más comunes para la presencia de protozoos.

Diagnóstico de protozoos mediante frotis nativo y frotis teñido con solución de Lugol (en heces)

El medicamento se prepara a partir de una emulsión de heces en una solución isotónica. Se aplican dos gotas de cloro sódico y solución de Lugol a un portaobjetos de vidrio. El material de prueba se añade a ambas composiciones con un palo de madera y, después de cubrirlo con vidrio, se observa con diferentes resoluciones de microscopio.

Los protozoos encontrados se registran en función de determinadas características. Para mayor precisión, prepare 2-3 preparaciones del mismo material. En casos dudosos, el análisis se repite varias veces durante 2-3 semanas.

El método puede detectar formas vegetativas y quísticas:

lamblia;
balantidio;
ameba disentérica.

Junto a las formas patógenas, también se identifican protozoos no patógenos. También en los portadores sanos existen formas luminales y quísticas.

Importante:La investigación debe realizarse repetidamente para evitar imprecisiones y errores.

El resultado del diagnóstico de protozoos mediante el método de frotis nativo y teñido debe contener una descripción de la forma del patógeno (luminal, quiste, tejido).

Requisitos de investigación:

el material tomado para el análisis (heces líquidas) se examina a más tardar 30 minutos después de la defecación;
las heces formalizadas deben diagnosticarse dentro de las 2 horas posteriores a la defecación;
el material no debe contener impurezas (desinfectantes, agua, orina);
para trabajar con el material, utilice únicamente palos de madera, los de vidrio no son adecuados debido al deslizamiento de la mucosidad;
Las barras deben quemarse inmediatamente después de su uso.

Método de conservación (examen de heces) para el diagnóstico de protozoos.

El estudio se realiza fijando protozoos con un conservante. La diferencia entre este método y el anterior es que los conservantes permiten conservar el fármaco durante un largo período.

Conservantes utilizados:

Carretilla. Contiene ingredientes conservantes: 0,7 ml de cloruro de sodio, 5 ml de formalina, 12,5 ml de alcohol al 96%, 2 g de fenol y 100 ml de agua destilada. Composición colorante: solución de tionina (azura) al 0,01%.
La solución de Safarliev. Ingredientes: 1,65 g de sulfato de zinc, 10 ml de formalina, 2,5 g de fenol cristalino, 5 ml de ácido acético, 0,2 g de azul de metileno, 100 ml de agua. Este conservante se utiliza en los casos en que el material debe almacenarse por más de un mes.

Las botellas vacías se llenan con un conservante, se transfiere el material a ellas en una proporción de 3:1 y luego se añade colorante si es necesario. Los resultados se evalúan estudiando 2-3 fármacos.

Método de enriquecimiento con formalina-éter (análisis de la presencia de protozoos en las heces)

Este método de diagnóstico le permite separar y concentrar quistes de protozoos. Para el análisis se necesitan los siguientes ingredientes: formaldehído (10 ml), 0,85 g de solución isotónica, agua destilada, éter sulfúrico, la solución de Lugol.

La mezcla de biomaterial con los líquidos enumerados se mezcla y centrifuga. El sedimento obtenido en el fondo del tubo de ensayo se tiñe con solución de Lugol y se examina en busca de quistes y formas vegetativas.

Método para detectar Leishmania (frotis de médula ósea)

Para diagnosticar la leishmaniasis se utilizan los siguientes reactivos: mezcla de Nikiforov (éter sulfúrico y etanol), tampón fosfato, Azur-eosina según Romanovsky.

La sustancia de la médula ósea se coloca con mucho cuidado sobre un portaobjetos de vidrio después de una preparación especial. Se utiliza un microscopio con sistema de inmersión.

Durante el período agudo de la enfermedad, se encuentra una gran cantidad de leishmania en el punteado.

Nota:A veces células de sangre puede parecerse a Leishmania procesada, por lo que es muy importante que el técnico de laboratorio tenga cuidado y tenga suficiente experiencia para realizar investigaciones independientes.

Método para detectar leishmania en un frotis a partir de un infiltrado cutáneo.

Los reactivos requeridos son similares al análisis anterior.

El material de prueba se obtiene del tubérculo existente o del contenido ulcerativo. Si se sospecha leishmaniasis, el raspado se realiza con mucho cuidado con un bisturí, sin sangre. Luego se prepara la preparación sobre vidrio. Para garantizar la exactitud de los resultados obtenidos, se examinan varias preparaciones simultáneamente.

En presencia de la enfermedad, la leishmania también se detecta entre los macrófagos, fibroblastos y células linfoides presentes en el material de prueba.

Método para aislar un cultivo puro de Leishmania obtenido mediante raspado de tejidos patológicos.

Con este método de diagnóstico de protozoos, los raspados de tejido se colocan en un recipiente especial. medio nutritivo, en el que se produce la reproducción activa de Leishmania.

Antes de realizar el raspado, la piel se trata cuidadosamente con alcohol, luego se hace una incisión en el tubérculo, desde cuyo fondo se retira el contenido y se coloca en un tubo de ensayo con medio. El material se toma varias veces y luego se coloca en diferentes tubos de ensayo. Luego, el cultivo se realiza en un termostato a una temperatura de 22 a 24 grados. Los resultados se evalúan bajo un microscopio. Este método se utiliza cuando otros métodos más baratos y rápidos para diagnosticar protozoos resultan ineficaces.

Puede ver cómo se descifran en la práctica las pruebas de presencia de protozoos utilizando una gota de sangre viendo la reseña del video:

Lotin Alexander, columnista médico

Métodos investigación helmintológica se dividen en directos e indirectos. Métodos directos: detección de los propios helmintos, sus fragmentos, huevos, larvas en las heces, orina, secreciones duodenales, esputo, moco nasal y vaginal, contenido de los espacios subungueales, trozos de tejido biopsiados. Métodos indirectos: identificación cambios secundarios, que surge en el cuerpo humano como resultado de la actividad vital del parásito, reacciones serológicas, investigación general sangre, orina. Los métodos más comunes para examinar las heces son helmintoscópicos y protozooscópicos. Al diagnosticar, es imposible identificar huevos o larvas de todo tipo de helmintos que viven en sistema digestivo persona. Por lo tanto, cuando se utiliza el método de flotación, los huevos de trematodos y, en algunos casos, los huevos de lombrices intestinales no fertilizados no flotan en la película superficial (debido a su alta gravedad específica). Es muy raro encontrar huevos de oxiuros y oncosferas de tenidos en las heces, que se detectan mediante métodos de investigación especiales: raspado de los pliegues perianales para oxiuros y tenidos, métodos de sedimentación para trematodos (huevos de opistórquidos, etc.). Por lo tanto, para un examen específico de un paciente en busca de infecciones por helmintos, el médico de referencia debe indicar en qué helmintos debe centrarse (diagnóstico), lo que permitirá al asistente de laboratorio elegir la técnica adecuada para identificar este tipo de helmintos. Heces extraídas de diferentes lugares Las heces en una cantidad de al menos 50 gramos (cucharadita) en un recipiente de vidrio limpio deben enviarse al laboratorio a más tardar 24 horas después de la defecación y examinarse el día de su recepción. Si es necesario conservar las heces hasta Día siguiente se coloca en un lugar frío (0-4°C) o se rellena con uno de los conservantes. Antes del examen, las heces se mezclan con un palito para que los huevos de helmintos se distribuyan uniformemente en masa total. Si se encuentran huevos de cualquier helminto en la preparación, no se detiene la visualización, porque puede haber doble o triple invasión. El seguimiento de la eficacia del tratamiento de las infecciones por helmintos se lleva a cabo examinando las heces en busca de huevos de helmintos 2-3 semanas o 2-3 meses después del tratamiento, dependiendo del helminto detectado. Se utilizan métodos macroscópicos para detectar helmintos maduros enteros o sus fragmentos en las heces a simple vista o con una lupa de mano. A menudo, se pueden ver oxiuros que se arrastran activamente en la superficie de las heces después de la defecación; los nematodos se excretan en las heces; A veces las propias personas notan el paso de los helmintos. En pacientes con difilobotriasis, se pueden excretar fragmentos de estróbilos de tenia (en forma de “fideos”), y en aquellos infectados con tenidos (tenia porcina o bovina), segmentos de helmintos a menudo salen con las heces (en forma de “recortes blancos”). ”) o salen activamente del ano. El método macroscópico es el principal para el diagnóstico diferencial de teniasis y teniaringosis (en combinación con un examen). De los métodos macroscópicos especiales, se utiliza el método de lavado secuencial de heces. Las heces se mezclan en agua para obtener una suspensión uniforme y luego, con buena iluminación, se examinan cuidadosamente en pequeñas porciones separadas en cubetas fotográficas negras o sobre un fondo oscuro en placas de Petri. Con unas pinzas o una aguja de disección, elimine todas las partículas blancas sospechosas y las formaciones grandes sospechosas de fragmentos de helmintos y examínelas con una lupa entre dos portaobjetos. Los pequeños helmintos o cabezas de cestodos se examinan con una lupa en una gota de glicerina o con un microscopio. Cuando se utiliza este método para diagnosticar los segmentos de la tenia porcina, bovina y tenia ancha, los segmentos lavados se colocan entre dos vasos y, mirando a la luz con una lupa o un microscopio de bajo aumento, se determina la especie por la estructura de el útero (en un segmento maduro tenia del cerdo Desde el tronco central se extienden 8-12 ramas laterales, y en la tenia bovina hay 18-32, más a menudo 28-32; en la tenia ancha, los segmentos son más anchos y el útero en el centro tiene la forma de " rosetón"). Si el útero es difícil de ver, primero se puede mantener durante un tiempo en una solución de glicerina al 50%, después de lo cual incluso los troncos vacíos del útero se pueden ver claramente. Al identificar estos cestodos por la estructura de las cabezas desprendidas, se colocan cuidadosamente con el cuello en una gota de glicerina entre portaobjetos (o se cubren con un cubreobjetos) y, sin apretar, se examinan bajo un microscopio con bajo aumento.

Los métodos microscópicos se dividen en simples, complejos y especiales.

Los simples incluyen los métodos de frotis nativo, frotis nativo con solución de Lugol, métodos de frotis espeso bajo celofán según Kato, torsión (según Shulman) y raspado perianal.

Los métodos complejos son más eficaces y se basan en la concentración de huevos en las preparaciones. Implican un tratamiento previo de las heces con reactivos líquidos, como resultado de lo cual los huevos de helmintos precipitan o flotan hacia la superficie del líquido.

A métodos complejos Los métodos de enriquecimiento incluyen:

a) flotación (cuando la gravedad específica de los huevos es menor que la gravedad específica de la solución salina y los huevos flotan en la película superficial);

b) sedimentación (cuando la gravedad específica de los huevos es mayor que la gravedad específica de las soluciones salinas y los huevos se depositan en el sedimento).

Los métodos especiales para detectar huevos y larvas de helmintos, quistes y formas vegetativas de protozoos son métodos de raspado, flotación, sedimentación, larvoscopia, protozooscopia, examen de bilis y métodos de tinción de frotis de heces, esputo, etc.

Muestreo y preservación

Para la investigación, las heces se toman de diferentes lugares en porciones de 50 gy se envían al laboratorio en un recipiente limpio de vidrio o plástico con tapa hermética. Se examinan las heces frescas (de no más de un día) y, en algunos casos (cuando se realizan pruebas de estrongiloidiasis), inmediatamente después de la defecación. Se han propuesto varios conservantes fecales que contienen huevos de helmintos: solución de formalina al 4-10%, que debe calentarse a una temperatura de 50-60° para evitar el desarrollo de huevos de anquilostoma; una mezcla de una solución acuosa al 0,2% de nitrato de sodio (1900 ml), solución de Lugol (5 g de yodo, 10 g de yoduro de potasio, 250 ml de agua), formalina (300 ml) y glicerina (25 ml), en la que se conservan huevos de helmintos 6-8 meses; una mezcla de glicerina (5 ml), formalina (5 ml) y agua (100 ml); soluciones de detergentes al 1-1,5% "Lotos", "Extra", "Barf", "Tide", etc. (en una proporción en peso de heces y solución de detergente 1: 5); una mezcla de mertiolato 1: 1000 (200 ml), formalina (25 ml), glicerina (5 ml), agua destilada (250 ml) con la adición de 0,6 ml de solución de Lugol (a razón de 1 g de heces por 10 ml de mezcla).

Para diagnosticar helmintiasis, se utilizan métodos macro y microhelmintoscópicos para examinar las heces.

Estudios de macrohelmintoscopia.

Método de sedimentación

Una porción diaria de heces se mezcla bien con 5 a 10 veces la cantidad de agua, se vierte en cilindros de vidrio altos (frascos, baldes) y se deja hasta que las partículas en suspensión se hayan asentado por completo. La capa turbia superior se drena con cuidado y se agrega agua limpia en la parte superior (repita varias veces hasta que el agua sobre el sedimento se aclare). Después de drenar la capa superior, transfiera el sedimento a una cubeta o placa de Petri y obsérvelo (contra un fondo oscuro) con una lupa o a simple vista.

Método de detección

Las heces mezcladas con agua se colocan sobre el tamiz superior del dispositivo, que consiste en un sistema de tamices con orificios de diámetro decreciente, el dispositivo se conecta a la red de suministro de agua y, abriendo el grifo de agua, se lava y el flujo el líquido se drena al alcantarillado. Los helmintos grandes permanecen en el tamiz superior, mientras que los más pequeños quedan retenidos en el inferior. Se dan la vuelta a los tamices y, después de lavar el contenido en cubetas oscuras, se examinan a simple vista o con una lupa.

Estudios de microhelmintoscopia.

Se lleva a cabo con el fin de detectar huevos (métodos ovoscópicos de helmintos - color. Fig. 1) o larvas de helmintos (métodos ovoscópicos de helmintos).

Métodos helmintoovoscópicos

Métodos cualitativos sin enriquecimiento.

frotis nativo. Se muele una pequeña cantidad de heces en un portaobjetos de vidrio en una gota de solución de glicerina al 50% o agua hervida. Las partículas grandes se eliminan con cuidado, la mezcla se cubre con un cubreobjetos y se examina bajo un microscopio (se examinan dos frotis). Es más cómodo y sencillo preparar frotis largos entre dos portaobjetos de vidrio. El frotis nativo sólo se utiliza como complemento a métodos de enriquecimiento, ya que no es lo suficientemente eficaz, especialmente en infestaciones débiles.

Frotis grueso con celofán según Kato(K. Kato, 1954) es muy método efectivo investigación. Se remojan trozos de celofán hidrófilo (de 4x2 cm de tamaño) durante 24 horas en una mezcla de glicerina (50 ml), solución de fenol al 6% (500 ml) y solución acuosa al 3% (6 ml) de malaquita verde (esta última es opcional). ). DE ACUERDO. Se untan 100 mg de heces en un portaobjetos de vidrio y, cubierto con un trozo de celofán húmedo, se presiona con un tapón de goma número 5. La preparación se examina después de 30 a 60 minutos, cuando se seca ligeramente y se vuelve transparente, como Como resultado, los huevos de helmintos son fáciles de detectar con un microscopio de bajo aumento.

Métodos cualitativos con enriquecimiento (métodos de flotación y sedimentación)

Los primeros se basan en el uso de soluciones saturadas de diversos productos químicos. Sustancias en las que los huevos flotan debido a diferencias en la gravedad específica.

Método Kofoid-Barbero(Ch.A. Kofoid, M.A. Barber) modificado por Fulleborn (F. Fulleborn, 1920). DE ACUERDO. Se mezclan 5 g de heces en un frasco alto y estrecho (volumen de 100 ml) con un palo de madera en 100 ml de una solución saturada. sal de mesa, derrotar su peso es 1,18 (se disuelven 400 g de sal hirviendo en 1 litro de agua). Las partículas grandes que flotan en la superficie se eliminan rápidamente con un palo o un trozo de papel. Después de reposar la mezcla durante 45-90 minutos. Utilice un bucle de alambre (0,8-1 cm de diámetro) para quitar toda la película de la superficie y transferirla a un portaobjetos de vidrio. Al realizar pruebas para detectar huevos de anquilostoma, la mezcla se deja reposar durante 10 a 15 minutos. Puedes quitar el film directamente con un portaobjetos de vidrio, tapar el frasco para que entre en contacto con el líquido (se agrega una solución saturada de sal en los bordes del frasco). Después de asentarse, se retira el portaobjetos, se le da vuelta rápidamente y se examina al microscopio (sin cubreobjetos) la película con los huevos de helmintos adheridos. Este método es bueno para identificar huevos de todos los nematodos y tenias enanas. Huevos de trematodos pesados; La mayoría de los cestodos y lombrices intestinales no fertilizadas flotan mal, por lo que también se examina el sedimento. Para hacer esto, después de quitar la película, se drena rápidamente el líquido del frasco y se toman unas gotas del sedimento con un asa o pipeta, se transfieren a un portaobjetos de vidrio, se agrega una gota de glicerol para aclarar y se examina bajo un microscopio.

Método E. V. Kalantaryan(1938) Es una modificación más eficaz del método Fulleborn. En él, la solución de sal de mesa se reemplaza por una solución saturada de nitrato de sodio, sp. el peso es 1,39 (un volumen de nitrato de sodio se disuelve en un volumen igual de agua cuando se hierve), la película se retira después de 20-30 minutos.

También se utilizan los métodos de Fausto (E. S. Faust, 1939), Brudastova et al. (1970) y otros.

Se utilizan productos químicos para depositar huevos de helmintos. Sustancias que disuelven grasas y proteínas en las heces.

Método Telemann (W. Telemann, 1908) modificado por Miyagawa (Y. Miyagawa, 1913). DE ACUERDO. Se muelen 5 g de heces en un mortero o jarra, añadiendo 5 ml de éter etílico y solución salina al 50%; la mezcla se filtra a través de un alambre o un tamiz de cabello en un tubo de ensayo y se centrifuga. En el tubo de ensayo se forman 3 capas: en la parte superior hay éter con grasa disuelta, debajo hay ácido clorhídrico con sustancias proteicas disueltas, en el sedimento hay partes insolubles de heces y huevos de helmintos. Se escurren las capas superiores, se añade agua al precipitado y se centrifuga. Se transfieren unas gotas de sedimento a un portaobjetos de vidrio y se examinan al microscopio. Este método puede detectar huevos de todo tipo de helmintos, pero a veces están deformados.

Método Ritchie (L. S. Kitchie, 1948). El formaldehído y el éter se utilizan para disolver grasas y proteínas.

Se pueden utilizar varios detergentes para precipitar los huevos de helmintos. En el extranjero se ha generalizado el método de filtración en dispositivos especiales Bell, que se utiliza para estudiar no solo las heces, sino también la orina, la sangre, etc.

Existen varios métodos que combinan los principios de flotación y sedimentación de huevos. Estos incluyen los métodos de S. A. Lane, D. Rivas, Gorkina y S. T. Darling. Uno de estos métodos de flotación-sedimentación, así como el método de drenaje secuencial, fue propuesto por N.V. Demidov (1963, 1965) para la investigación de la fascioliasis y la dicroceliosis.

Métodos cuantitativos

Método Stoll(N. R. Stoll, 1926). Se vierte una solución decinormal de hidróxido de sodio en un matraz o tubo de ensayo ancho graduado (con dos marcas: 56 y 60 ml) hasta la primera marca, se agregan heces hasta que el nivel del líquido llegue a la segunda marca, se mezcla bien con una varilla de vidrio y, colocando 10 cuentas de vidrio o guijarros pequeños, tapar y agitar durante 1 minuto. Rápidamente, para que la suspensión no se sedimente, tomar 0,075 ml de la mezcla (0,005 g de heces) con una pipeta graduada, transferirlo a un portaobjetos de vidrio al que se le ha aplicado una rejilla, cubrirlo con un cubreobjetos y contar los huevos de helmintos. en la preparación bajo un microscopio; Multiplicando el número resultante por 200 se obtiene el número de huevos en 1 g de heces. Para obtener un resultado más preciso, cuente los huevos en dos o más preparaciones y tome el promedio. El método Stoll es insensible a invasiones leves. Por ello, se recomienda contar el número de huevos en las preparaciones preparadas. varios métodos flotación o sedimentación, sujeto al uso constante de una porción igual de heces y platos del mismo volumen. También se utiliza una extensión espesa de Kato.

método castor(RS Beaver, 1950). Se prepara un frotis estándar, cuyo espesor se determina con un electrofotómetro y luego se cuentan todos los huevos de helmintos que contiene.

Métodos helmintolarvoscópicos

método de behrmann(G. Baermann, 1917). Se colocan de 5 a 10 g de heces recién excretadas sobre una malla metálica en un embudo de vidrio, con un tubo de goma con una abrazadera en el extremo estrecho. Para evitar la contaminación del sedimento con partículas de heces, se recomienda colocar papel (sobre la malla) o agregar carbón animal o harina de maíz a las heces. El embudo se llena con agua tibia (t° 45-50°) hasta que entre en contacto con las heces. Debido al termotropismo, las larvas se mueven activamente hacia agua tibia y se van acumulando poco a poco en la parte inferior del embudo, encima de la pinza. Después de 3 a 4 horas, se abre la pinza, se drena el líquido en 1 o 2 tubos de ensayo, se centrifuga durante 2 a 3 minutos, se drena la capa superior y se examina el sedimento en un portaobjetos de vidrio bajo un microscopio.

Método para identificar miracidios de esquistosoma. Las heces se lavan en la oscuridad a una temperatura de 8-10°, el sedimento se mantiene durante 45 minutos. en luz brillante a t° 28°, luego verter en un matraz oscuro con una pajita a un lado. Los miracidios se concentran en un tubo lateral transparente, desde donde se pueden seleccionar.

Para identificar las larvas de anquilostoma también se utilizan los métodos de Fulleborn et al.

Métodos para estudiar otras secreciones, así como tejidos y órganos.

DE ACUERDO. Se dejan reposar 100 ml de orina de prueba durante 30 minutos. en un cilindro y, después de quitar la capa superior, verter 10-15 ml de sedimento en un tubo de ensayo, centrifugar a 1500 rpm durante 1-2 minutos; Se examina el sedimento. Es recomendable recoger toda la porción diaria de orina.

La esquistosomiasis urogenital se diagnostica mediante la identificación de miracidios. Una porción de orina fresca se centrifuga durante 5 minutos, el sedimento se vierte en un matraz pintado de negro, con un tubo de vidrio transparente soldado en la parte superior. Añadir agua en proporción 1:5, 1:10 y colocar en un termostato a 25-30° durante 2 horas. Los miracidios que emergen de los huevos son visibles a simple vista a través de un tubo transparente en forma de puntos que se mueven rápidamente. En la esquistosomiasis crónica, los pacientes liberan sangre hacia el final de la micción, pero rara vez se encuentran huevos en la orina, por lo que se recomienda recurrir a una biopsia de la vejiga.

Examen de esputo. El esputo puede contener huevos de paragonimus, esquistosomas, tominxes, larvas de nematodos migratorios y fragmentos de vejiga equinocócica. Toda la porción de esputo liberada se examina cuidadosamente a simple vista o con una lupa, se seleccionan y examinan todos los restos de tejido visibles, acumulaciones de color óxido, etc.; luego escanee toda la porción con frotis. Esputo purulento vierta una cantidad igual de solución alcalina cáustica al 0,5%, centrifugue y examine el precipitado.

En algunas helmintiasis, se observa esputo. cambios característicos. En la paragonimiasis, por ejemplo, en el esputo se pueden encontrar acumulaciones de óvulos en forma de grumos amarillentos, así como una gran cantidad de moco, leucocitos, glóbulos rojos, células alveolares, espirales de Kurschmann, fibras elásticas, cristales de Charcot-Leyden. . También se revelaron cristales característicos en forma de diamante con extremos puntiagudos. Disponibilidad gran número Los eosinófilos permiten diferenciar la paragonimiasis de la tuberculosis.

Examen del contenido de abscesos y punteados.. EN secreción purulenta abscesos, así como en tumores y quistes extirpados durante la cirugía, se pueden encontrar helmintos, sus fragmentos, larvas y huevos (equinococo, alveococo, esparganum, cisticerco, dirofilaria, nematodo, toxocara, paragonimus, etc.). La técnica de investigación es habitual; en algunos casos, las secciones histológicas se preparan a partir de tejido tumoral. Los contenidos purulentos se pueden tratar mediante el método de Telemann; El líquido transparente se examina del mismo modo que el contenido duodenal, añadiendo éter sulfúrico. El líquido equinocócico se centrifuga y el sedimento se examina en busca de escólex y ganchos; Los preparados se tiñen con carbolfucsina según Ziehl-Neelsen.

Prueba de sangre. En la sangre se encuentran microfilarias y larvas de nematodos migratorios. Se extrae una gota de sangre de un dedo o del lóbulo de la oreja y se examina en estado fresco o se preparan preparaciones a partir de ella.

Se coloca una gota de sangre en un portaobjetos con un cuadrado de vaselina aplicado y se presiona ligeramente con un cubreobjetos. Bajo un microscopio, las microfilarias son visibles moviéndose entre las células sanguíneas. La sangre se puede colocar entre dos capas de cinta adhesiva de celulosa; las microfilarias permanecen móviles durante 6 horas; en una preparación completamente seca se pueden distinguir al microscopio en 30 días. Las especies de microfilarias sólo pueden identificarse en frotis teñidos o en gotas espesas. Las preparaciones preparadas se secan, se hemolizan y se tiñen según Romanovsky - Giemsa, Wright, Ziehl-Neelsen, Leishman, Papanicolaou (ver Método de tinción de Wright, Método Romanovsky-Giemsa, Método Ziehl-Neelsen). Tras detectar microfilarias en una gota de sangre teñida según Romanovsky-Giemsa, el preparado se tiñe adicionalmente con hematoxilina de Hansen; en 15-60 minutos. lavar durante 2 minutos. en agua corriente. La preparación recoloreada se diferencia en una solución salina al 0,2%; La vaina de la microfilaria es de color violeta pálido y la sustancia nuclear del cuerpo es de color violeta oscuro.

Para infestaciones leves, es necesario examinar de 2 a 10 muestras de sangre con un anticoagulante (por ejemplo, con una solución al 5%). citrato de sodio) utilizando uno de los siguientes métodos.

Método de Knott (J. Knott, 1939), modificado por Markell y Voge (E.K. Markell, M. Voge, 1965). Se mezclan 2 ml de sangre en un tubo de centrífuga con 10 partes de ácido acético al 1% y se centrifuga durante 2 minutos. a 1500 rpm; capa superficial Después de escurrir, el sedimento se distribuye en varios portaobjetos de vidrio y se examina al microscopio. Las preparaciones se pueden teñir con Romanovsky-Giemsa u otros métodos.

Método de filtrado de Bell (D. R. Bell, 1967). En un aparato formado por un embudo de acero inoxidable con orificio rectangular y filtros de membrana de la misma forma, de 19 x 42 mm, con un tamaño de poro de 0,8 a 5 μm, se hemoliza la sangre en una mezcla de 1 ml de detergente tipol y 9 ml de solución de fiziol (para acelerar la filtración, el dispositivo está conectado a una bomba de vacío). El filtro se fija en agua destilada hirviendo y se tiñe con hematoxilina caliente de Romanovsky-Giemsa o Ehrlich. El filtro coloreado se seca en un desecador o en alcohol isopropílico (secuencialmente en 3 tazas), se aclara sobre vidrio con aceite de inmersión y se examina bajo un cubreobjetos. Las preparaciones coloreadas duran varias semanas. El método Bell es más eficaz para el registro cuantitativo de microfilarias en la sangre.

También se utiliza el método de polividona Goldsmid.

Examen de la piel. En la piel se pueden encontrar microfilarias de oncocercos y larvas de helmintos animales que provocan forma cutánea larva migratoria(cm.). Se toman secciones de piel o material obtenido mediante escarificación del muslo, la pantorrilla, las nalgas o el músculo deltoides. Se levanta un trozo de epidermis en forma de cono con un alfiler entomológico y, se corta con una navaja, se examina sobre un vidrio en una gota de solución de fisiol. En resultado negativo una preparación nueva se vuelve a examinar después de 10 minutos; Las larvas suelen localizarse en los bordes del preparado. El material resultante se puede conservar en 2 ml de solución de fiziol durante 1-2 horas. y examinar el sedimento. Se recomienda tomar 5 secciones de piel del paciente.

También se pueden preparar preparaciones a partir de sangre y líquido tisular liberados después de una fuerte compresión de las secciones. Las gotas se tiñen según la hematoxilina de Mayer, Romanovsky-Giemsa o Delafield.

Método estándar para cuantificar las infestaciones. Área de piel biopsiada diám. 3-5 mm y con un peso mínimo de 1-4 mg, pesar, cortar en trozos pequeños y contar las larvas al microscopio en fisiol. solución en un portaobjetos de vidrio; 1-4 larvas en el campo de visión se indican con un signo +, 5-9 larvas con un signo ++, 10-19 con un signo +++, 20 o más con un signo + + + +. Es más conveniente realizar cálculos cuantitativos sobre preparaciones coloreadas.

Pruebas de triquinosis, cisticercosis y esquistosomiasis

Detección de larvas de Trichinella

Método de compresión. Un trozo de doble cabeza o músculo de la pantorrilla(cerca del tendón), tomado quirúrgicamente con asepsia, se divide en fibras delgadas separadas con agujas de disección, se aprieta entre dos portaobjetos de vidrio en una gota de glicerina para que la preparación sea delgada y transparente. Bajo un microscopio con un campo de visión oscuro, las larvas de Trichinella son claramente visibles. Es eficaz estudiar varias piezas de músculo en compresores utilizados en medicina veterinaria. práctica, especialmente en triquineloscopios especiales.

El método de digestión de Bechman.(GW Bachman, 1928). 1 y los músculos triturados se vierten con 60 ml de jugo gástrico artificial (0,5 g de pepsina; 0,7 ml de ácido clorhídrico concentrado; 100 ml de agua) y se dejan durante 18 horas. en un termostato a t° 37°; se drena la capa superior de líquido, se añade agua tibia (t° 37-45°) al sedimento y se vierte en un aparato Behrmann. Después de una hora, el líquido se drena en un tubo de ensayo, se centrifuga y se examina el sedimento. Si las larvas están encerradas en cápsulas calcificadas, primero se descalcifican en una solución de ácido clorhídrico, nitrógeno o sulfúrico.

Bioensayo. Se alimentan ratones o ratas blancas con trozos de los músculos que se están estudiando. Después de 2 a 3 días, se pueden encontrar Trichinella sexualmente maduras en el contenido duodenal, y después de 2 a 3 semanas, se pueden encontrar larvas en los músculos del diafragma y la lengua.

Secciones histológicas. Las piezas musculares se fijan en líquido de Bouin, Zenker u otro líquido; de la manera habitual Las secciones se preparan en un micrótomo y se tiñen con hematoxilina de Delafield.

Detección de cisticercos

Se examina a simple vista un trozo de músculo extirpado, tejido conectivo, etc., se aísla cuidadosamente el cisticerco: una vesícula blanquecina translúcida de 1-2 cm de tamaño, triturada entre dos portaobjetos de vidrio en una gota de glicerina y examinada al microscopio. . Para determinar la viabilidad de los cisticercos aislados de los tejidos, se mantienen en una solución de bilis al 50% para fisiol. solución en termostato a t° 37°; en 10-60 minutos. la cabeza del cisticerco viable gira hacia afuera. Los cisticercos calcificados se descalcifican preliminarmente con una solución de ácido nítrico al 4% durante una hora.

Detección de huevos de esquistosoma.

En las formas hron de esquistosomiasis, cuando la formación de granulomas impide la liberación de huevos de los tejidos a la luz intestinal o al tracto urinario, se utiliza una biopsia de la mucosa rectal, que se realiza con una cuchara especial utilizando un rectoscopio. Seleccionar un área con una lesión visible. La pieza de la biopsia se tritura entre dos portaobjetos de vidrio y se examina con un microscopio. Si el resultado es negativo, las piezas se clarifican en una solución al 4% de álcali cáustico y a partir de ellas se prepara histol. rebanadas. Se realiza una biopsia de la mucosa yeyunal por vía oral y el material resultante se examina mediante el método de compresión o se preparan secciones de histol a partir de él. En algunos casos de esquistosomiasis genitourinaria, el diagnóstico sólo puede realizarse mediante una biopsia endovesical. En la forma hepatolienal de esquistosomiasis, se realiza una biopsia por punción del hígado; A partir del material resultante, se preparan histol y secciones y se examinan bajo un microscopio fluorescente. El microscopio de fluorescencia con campo oscuro también se utiliza para examinar el tejido hepático en busca de huevos de esquistosoma. Si el tracto genital femenino se ve afectado por esquistosomas, la secreción se recoge con un espéculo vaginal o se toman trozos de la mucosa del cuello uterino con una cuchara afilada; El material resultante se examina bajo un microscopio sobre vidrio en una gota de solución de fiziol.

Pruebas de enterobiasis y teniasis.

Raspado perianal (se recomienda tomarlo por la noche, 1 - 1,5 horas después de que el paciente se haya acostado, o por la mañana antes de ir al baño). Con una cerilla, cortada oblicuamente y humedecida en una gota de líquido (fisiol, solución, agua hervida o solución de bicarbonato de sodio al 2%), aplicada sobre un portaobjetos de vidrio, ¿lo hago con cuidado? raspado de la mucosa del ano y los pliegues que lo rodean (desde el centro hacia afuera). La mucosidad recogida al final del partido se raspa con el borde de un cubreobjetos en una gota de líquido sobre un portaobjetos de vidrio y, cubierto con el mismo cubreobjetos, se examina. Durante los exámenes masivos, cuando se toman raspados en instituciones infantiles o de otro tipo, la cerilla usada se coloca en una gota de líquido sobre un portaobjetos de vidrio; después de que la gota se haya secado, se cubre con otro portaobjetos de vidrio y se entrega al laboratorio, envuelto en papel y asegurado con una banda elástica. Para estudiar el moco rectal, utilizan un dispositivo especial: un tubo Shakhmatov o Ziemann, con el que extraen el moco del recto y examinan los frotis con un microscopio.

Método del bastoncillo de algodón. A los pacientes se les entrega un tubo de ensayo con un hisopo de algodón sobre un palo de vidrio o de madera para que se lo lleven a casa; por la mañana, el paciente limpia los pliegues perianales con un hisopo humedecido agua hervida, y lo coloca en un tubo de ensayo con una pequeña cantidad de agua. En el laboratorio, los hisopos se enjuagan en el mismo tubo de ensayo con una nueva porción de agua y el sedimento se examina después de la centrifugación.

Método del celofán de Hall (M. S. Hall, 1937). Un trozo cuadrado de celofán se fija con una banda elástica a una varilla de vidrio. El raspado se realiza con celofán seco y se coloca en un tubo de ensayo. En el laboratorio, se separa ligeramente el celofán del palo y, después de cortarle la punta con unas tijeras, se endereza sobre un portaobjetos de vidrio; humedecido con solución decinormal de hidróxido de sodio, cubierto con un cubreobjetos y examinado al microscopio.

Método de la cinta de celulosa de Graham (S. F. Graham, 1941). Se presiona una tira de cinta de celulosa con el lado adhesivo sobre los pliegues perianales del sujeto, luego con el mismo lado sobre un portaobjetos de vidrio y se examina sin cubreobjetos; Puedes agregar una gota de tolueno. V. V. Kaledin (1972) propuso para estos fines utilizar discos de celuloide cortados de una película radiológica lavada y humedecidos con glicerina; Los discos se examinan sobre un portaobjetos de vidrio sumergidos en una gota de cola de silicato. El método de la cinta de celulosa también se puede utilizar para examinar la ropa interior de los niños.

Raspado subungueal. Los bordes de la uña, el lecho ungueal y los espacios subungueales se humedecen con una solución de álcali cáustico al 0,5-1% y se limpian con hisopos de algodón húmedos. Los hisopos se colocan en tubos de centrífuga con la misma solución, se centrifugan y se examina el sedimento.

Métodos para estudiar objetos. ambiente para huevos y larvas de helmintos (estudios sanitarios y helmintológicos)

Se llevan a cabo investigaciones para determinar el grado de contaminación de objetos con huevos y larvas de helmintos. ambiente externo. Los datos obtenidos se utilizan para evaluar la dignidad. el estado de las instituciones y empresas y la eficacia de las medidas adoptadas para combatir las helmintiasis.

Al estudiar el grado de contaminación de diversos objetos ambientales con huevos y larvas de helmintos y evaluar su papel en la epidemiología de las infecciones por helmintos, es importante establecer no solo la cantidad de huevos encontrados, sino también su viabilidad e invasividad, que se determinan. : a) por apariencia, al microscopio; b) teñir con diversos tintes, incluidos los luminiscentes; como regla general, los huevos y larvas vivos no se tiñen; c) cultivo en condiciones óptimas hasta la etapa invasiva; d) infección de animales de laboratorio (bioensayo).

Estudios de agua y alcantarillado. Para un estudio, se utilizan de 10 a 25 litros de agua (ríos, mares, estanques, piscinas, suministro de agua) y de 1 a 2 a 5 litros de aguas residuales.

Método 3. G. Vasilkova (1941). El agua o las aguas residuales se filtran a través de ultrafiltros de membrana en un aparato Goldmann, que consta de un embudo de vidrio o metal con filtros conectados mediante una boquilla anular a un matraz Bunsen. Para acelerar el proceso de filtración, se conecta una bomba de vacío al dispositivo. Después de la filtración, los filtros de membrana se examinan al microscopio y se aclaran con una solución de glicerol al 50%; el sedimento acumulado se limpia y se examina por separado en forma de frotis. También se utilizan dispositivos filtrantes de otros diseños.

Método de G. Sh. Gudzhabidze y G. A. Yudin (1963) para estudiar fluidos de alcantarillado. Se deja 1 litro de líquido durante 2 horas en un cilindro Lisenko; el sedimento resultante (5-9 ml) se procesa como en las pruebas de suelo (ver más abajo).

Método N. A. Romanenko (1967). A 1 litro de líquido residual, colocado en un cilindro de vidrio con una capacidad de 1200-1500 ml, se le añaden 0,4-0,6 g de sulfato de aluminio o cloruro férrico (para coagular, acelerando el proceso de sedimentación de las partículas en suspensión) y después de 40 minutos. la mezcla se centrifuga durante 3 minutos. a 1000 rpm; Se escurre la capa superior y, para disolver las escamas, se añaden 1-2 ml de una solución de ácido clorhídrico al 3% y luego 150 ml de una solución saturada de nitrato de sodio. El sedimento se examina como suelo.

investigación de suelos

La contaminación del suelo con huevos de helmintos se determina para identificar focos de helmintiasis y evaluar la efectividad del trabajo para mejorarlos.

Método 3. G. Vasilkova y V. A. Gefter (1948). Se mezclan 12,5 g de tierra en tubos de ensayo (volumen de 100 ml) de acero inoxidable o latón con 20 ml de una solución al 5% de álcali cáustico, añadiendo 10 cuentas de vidrio o pequeños guijarros. Los tubos se sellan con tapones de goma y se agitan durante 20 minutos. en un aparato agitador o manualmente. Después de quitar los tapones, los tubos se centrifugan durante 3-5 minutos, se drena el líquido de la superficie, se añaden al sedimento 60-80 ml de una solución saturada de nitrato de sodio y, después de mezclar bien, se centrifuga nuevamente durante 3-5 minutos. Esta película superficial con huevos flotantes se elimina tocando la superficie de la mezcla con un bucle complejo (5-6 bucles conectados en una varilla común) y se transfiere a un vaso de agua; mezclar con la misma solución, centrifugar; Todo el procedimiento se repite al menos 3 veces. El contenido del vaso al que se transfiere la película se diluye con agua y se filtra a través de filtros de membrana, que se examinan al microscopio en una gota de glicerina.

Método 3. G. Vasilkova y V. A. Gefter, modificado por A. A. Namitokov (1961), se diferencia del método principal en que en lugar de examinar las preparaciones de películas, se utiliza la mitad del contenido del tubo de ensayo (cada vez se agrega una nueva porción de un solución saturada de nitrato de sodio), filtrar y examinar los filtros.

N. A. Romanenko (1968) recomienda examinar muestras de suelo y lodos de depuradora en busca de huevos de helmintos utilizando el aparato propuesto por G. Sh. Gudzhabidze. Se mezclan bien 50 g de tierra durante 1 minuto. en 150 ml de agua en tubos de centrífuga (250 ml de capacidad) con paletas especiales accionadas por un motor eléctrico. La mezcla se centrifuga durante 3 minutos. a 1000 rpm, escurrir el agua y añadir 150 ml de solución saturada de nitrato de sodio, mezclar y centrifugar nuevamente durante 3 minutos. Los tubos de ensayo con muestras se colocan en un soporte, se agrega una solución de nitrato de sodio hasta que se forme un menisco convexo, se cubren con portaobjetos de vidrio (10 x 6 cm) y se dejan durante 10-15 minutos, luego se retiran los vasos y se examinan; el procedimiento se repite al menos 4 veces.

Investigación sobre larvas de helmintos según el método de Behrmann (1917). Se colocan 200-400 g de tierra en un trozo de gasa sobre una malla metálica (con orificios de 1-2 mm de diámetro) colocada en la parte ancha de un embudo de vidrio montado sobre un trípode. Se estira un tubo de goma con una abrazadera sobre el extremo estrecho del embudo. El embudo se llena con agua tibia (t° 50°) para que la parte inferior de la malla con la tierra entre en contacto con el agua. Debido al termotropismo, las larvas se arrastran activamente hacia agua tibia y, al asentarse, se acumulan en la parte inferior del tubo de goma sobre la abrazadera. Después de 3-4 horas, se vierten 50 ml del contenido del embudo en un tubo de ensayo, se centrifuga y se examina el sedimento.

Investigación de verduras, frutas y bayas.

Estudian principalmente verduras, bayas y frutas que se comen sin tratamiento térmico. Método 3. G. Vasilkova (1948). Se vierten con agua durante varias horas 5-10 trozos de verdura o fruta (aprox. 0,5 kg) o 100-200 g de verduras (lechuga, cebolla verde) en frascos de vidrio de cuello ancho con tapón molido y se agitan durante 10-20 minutos. . en un aparato agitador o manualmente. Se drena el agua, se enjuagan los objetos en estudio. agua limpia y toda el agua de descarga se filtra en un aparato Goldmann; Los filtros se examinan limpiándolos con glicerina. Puedes teñir los filtros con solución de Lugol en glicerina al 25%; en este caso, los huevos de helmintos están teñidos color marrón y se reconocen fácilmente entre los granos de almidón, coloreados en Color azul. Los sedimentos grandes se tratan como suelo.

Estudio de lavados de artículos del hogar y manos. Se pasa repetidamente un cepillo de pegamento (o un hisopo de algodón envuelto en un trozo de tela de nailon) empapado en una solución de bicarbonato de sodio al 2% sobre el objeto o las manos que se examinan y luego se enjuaga con la misma solución vertida en un tubo de ensayo. En el laboratorio, los cepillos y los hisopos se enjuagan con agua limpia; Toda el agua de lavado se centrifuga y se examina el sedimento.

Método V. A. Gefter (1960). Es más eficaz recoger el polvo de los equipos blandos utilizando una aspiradora conectada a un embudo; los bordes constan de 2 partes desmontables: se coloca un filtro de membrana en la superficie de la parte inferior, se cubre con una malla de metal o plástico y se refuerza. poniéndolo parte superior embudos. El embudo ensamblado se conecta a la manguera de la aspiradora mediante un tubo de goma. Se recoge el polvo del objeto durante 3 minutos, después de lo cual se retira el filtro y se reemplaza por uno nuevo. En el laboratorio, los filtros se examinan al microscopio y se limpian con glicerina. Si la capa de polvo en el filtro es grande, se raspa y se ve en forma de manchas o se trata como tierra.

Métodos de diagnóstico inmunológico.

Posibilidad de utilizar inmunol. Los métodos para diagnosticar la helmintiasis se deben a la capacidad de los helmintos para producir antígenos activos que afectan las células inmunocompetentes del huésped y estimulan la producción de anticuerpos. Los métodos de inmunodiagnóstico más eficaces son los de las helmintiasis intestinales, cuando las secreciones y excrementos de los helmintos, que tienen actividad antigénica, entran directamente en la sangre del huésped. Las reacciones de inmunol se utilizan para el diagnóstico de ascariasis, triquinosis, filariasis, esquistosomiasis, equinococosis y alveococosis, cisticercosis, paragonimiasis, complejo sintomático de larva migrans (toxocariasis, angiostrongilosis), etc. Se utilizan diversas pruebas de serol (reacciones de precipitación, reacciones de aglutinación, fijación del complemento). , anticuerpos fluorescentes ) y pruebas de alergia intradérmicas. Los antígenos se preparan a partir de larvas y helmintos maduros utilizando extractos salinos de homogeneizados de tejidos frescos congelados o liofilizados, así como diversos líquidos biológicamente activos (líquido de ampollas de equinococos, líquido abdominal de lombrices intestinales, etc.). Debido al hecho de que los helmintos tienen una estructura antigénica muy compleja y su mosaico antigénico contiene componentes y determinantes individuales que reaccionan de forma cruzada con otros tipos de helmintos, bacterias y antígenos del huésped, se están desarrollando métodos para limpiarlos de componentes inespecíficos. Se realiza el fraccionamiento. diferentes metodos: filtración en gel en columnas con Sephadex, cromatografía de intercambio iónico en DEAE-Sephadex, tratamiento con ácidos, etc. Los antígenos fraccionados suelen tener mayor especificidad que los extractos completos, pero su actividad es aproximadamente la misma. Los métodos de inmunodiagnóstico lo encuentran todo. mayor aplicación. Las reacciones se utilizan no solo para la identificación más completa y temprana de pacientes, sino también para estudiar focos y estudiar la epidemiología de las helmintiasis.

Reacciones serológicas. La reacción de microprecipitación en larvas vivas se utiliza para diagnosticar nematodos: la fase preimaginal de la ascariasis, la anquilostoma y la triquinosis. La reacción se vuelve positiva entre 5 y 10 días después de la infección (ascariasis, anquilostoma) y persiste durante 90 a 100 días. El antígeno son larvas vivas de nematodos aisladas de tejidos de animales de laboratorio infectados experimentalmente. Las larvas aisladas se lavan a fondo de las proteínas del huésped con fisiol estéril, una solución y agua destilada y de 10 a 15 copias cada una. Se coloca con una pipeta Pasteur sobre un portaobjetos de vidrio esterilizado con pocillo. Aplicar 2-3 gotas del suero problema, cubrir con un cubreobjetos esterilizado, colocarlo en una cámara húmeda (placa de Petri revestida con papel de filtro humedecido) y dejar actuar durante 24-48 horas. en un termostato a t° 37°. Si la reacción es positiva, bajo un microscopio de bajo aumento, visible alrededor de la boca y agujeros anales las larvas son masas de precipitados esféricos o en forma de zigzag, de color blanco grisáceo, ligeramente opalescentes. La eficiencia de la reacción alcanza el 85-95%.

La reacción de precipitación en anillo fue desarrollada por V.P. Pashuk (1957) para el diagnóstico de la triquinosis. La reacción se vuelve positiva a las 2-3 semanas de enfermedad. Su efectividad alcanza el 80-90%. El antígeno es un extracto en polvo de larvas secadas a 35°, aisladas de músculos de animales infectados. En tubos de ensayo de diámetro. 0,5 cm, vierta 0,1 ml de cada dilución del antígeno y coloque con cuidado (o bájelo hasta el fondo) una cantidad igual de suero problema para que los líquidos no se mezclen. Los tubos de ensayo se mantienen durante 30 minutos. en un termostato a t° 37°, y luego 30-60 minutos. a temperatura ambiente. En caso de reacción positiva, aparece un anillo blanquecino delicado en la interfaz entre el antígeno y el suero, que se desintegra fácilmente cuando se agita.

La reacción de precipitación en gel según Ouchterlony (O. Ouchterlony, 1949) en micromodificación por A. I. Gusev y V. S. Tsvetkov fue propuesta por I. A. Ginovker, E. A. Zabozlaeva, A. V. Doronin (1970) para el diagnóstico de las fases tempranas de la opistorquiasis. Según datos preliminares, su eficacia es del 87%. El antígeno es un extracto de un homogeneizado de opisthorchis sexualmente maduros frescos congelados aislado del hígado de gatos.

Se ha desarrollado la reacción de hemaglutinación indirecta (ver) con diagnosticum, una suspensión de eritrocitos de oveja formalinizados y tanizados, sensibilizados con líquido equinocócico.

L.N. Stepankovskaya (1972) para el diagnóstico de equinococosis y alveococosis.

RNGA con un diagnóstico de eritrocitos de oveja formalinizados, sensibilizados con un extracto de homogeneizado de cisticercos frescos congelados de tenia porcina, fue propuesto por L. M. Konovalova (1973) para el diagnóstico de cisticercosis cerebral; es eficaz en el 85% de los casos.

Se propone RNGA con ascaris diagnosticum para diagnosticar la fase preimaginal de la ascariasis.

La reacción de fijación del complemento (ver) se realiza según el método habitual y se utiliza para el diagnóstico de triquinosis y cisticercosis.

Método de anticuerpos luminiscentes (método indirecto). Este método, que utiliza un homogeneizado seco desgrasado de cisticercos de tenia porcina como antígeno fijado en un portaobjetos de vidrio, fue desarrollado por JI. M. Konovalova (1973) para el diagnóstico de la cisticercosis humana. La misma reacción con histol, secciones de larvas de Trichinella como antígeno, se desarrolló para el diagnóstico de la triquinosis.

E. S. Leikina, V. A. Gefter.

Cuando se detectan huevos de helmintos en diversos objetos ambientales (suelo, agua, vegetales, etc.), siempre es necesario determinar su viabilidad por su apariencia, teñirlos con tintes vitales, cultivarlos en condiciones óptimas y realizar una prueba biológica, es decir,

Alimentación de animales de laboratorio.

Determinación de la viabilidad de huevos o larvas de helmintos por apariencia. Los huevos de helmintos se examinan al microscopio primero con un aumento bajo y luego con un aumento alto. En los huevos de helmintos deformados y muertos, la cáscara está rota o doblada hacia adentro, el plasma está turbio y suelto. En los huevos segmentados, las bolas aplastantes (blastómeros) son de tamaño desigual, de forma irregular y, a menudo, desplazadas hacia un polo. En ocasiones se encuentran óvulos anormales que, a pesar de deformidades externas, se desarrollan con normalidad. En las larvas vivas de ascárides, la granularidad fina está presente sólo en la parte media del cuerpo; a medida que mueren, la granularidad se extiende por todo el cuerpo y aparecen grandes vacuolas hialinas brillantes, los llamados hilos de perlas.

Para determinar la viabilidad de los huevos maduros de lombrices intestinales, tricocéfalos y oxiuros, se deben provocar movimientos activos de las larvas calentando ligeramente el fármaco (a una temperatura que no exceda los 37 ° C). Es más conveniente observar la viabilidad de las larvas de lombrices intestinales y tricocéfalos después de aislarlas de la cáscara del huevo presionando el cubreobjetos de la preparación con una aguja de disección o unas pinzas.

En las larvas de lombrices intestinales invasoras, a menudo se ve una vaina que se desprende en el extremo de la cabeza, y en las larvas de tricocéfalos que han completado su desarrollo en el huevo, se encuentra un estilete en este lugar con un gran aumento. En las larvas de helmintos muertas, independientemente de su ubicación (en el huevo o fuera de él), se nota la descomposición del cuerpo. Donde estructura interna La larva se vuelve grumosa o granular y el cuerpo se vuelve turbio y opaco. Las vacuolas se encuentran en el cuerpo y las roturas se encuentran en la cutícula.

La viabilidad de las oncosferas de tenidos (bovina, tenia porcina, etc.) está determinada por el movimiento de los embriones cuando se exponen a ellas. Enzimas digestivas. Los huevos se colocan sobre un cristal de reloj con el jugo gástrico del perro o el jugo duodenal artificial. La composición de este último: pancreatina 0,5 g, bicarbonato de sodio 0,09 g, agua destilada 5 ml. Los vasos de reloj con huevos se colocan en un termostato a 36-38 "C durante 4 horas. Al mismo tiempo, se liberan los embriones vivos de sus cáscaras. Las capas de las oncosferas vivas también se disuelven en pepsina acidificada y en Solución alcalina tripsina después de 6-8 horas en un termostato a 38 °C.

Si coloca huevos de tenida en una solución de sulfuro de sodio al 1%, o en una solución de hipocloruro de sodio al 20%, o en una solución de agua con cloro al 1% a 36-38 ° C, los embriones maduros y vivos se liberan de las membranas y no no cambiar dentro de 1 día. Las oncosferas inmaduras y muertas se encogen o se hinchan y aumentan bruscamente, y luego se "disuelven" en 10 minutos - 2 horas. Los embriones vivos de tenidos también se mueven activamente en una mezcla de solución de cloruro de sodio al 1%, solución de bicarbonato de sodio al 0,5% y bilis en 36-38 °C.

La viabilidad del escólex de los equinococos se determina con un calentamiento lento. Para ello, se colocan cápsulas de escólex o de cría lavadas en agua en una gota de agua sobre un portaobjetos de vidrio con un orificio, se cubren con un cubreobjetos y se examinan al microscopio con una etapa de calentamiento a una temperatura de 38-39 °C. Si no hay mesa calefactora, el medicamento se calienta utilizando cualquier fuente de calor. Al mismo tiempo, el escólex viable se mueve activamente, contrayendo o relajando las ventosas, alargando y acortando la trompa. Si colocas el escólex al 0,5-1% solución de agua filicileno a temperatura ambiente, entonces todos los escólex viables se desprenderán rápidamente y morirán. Los escólex no viables no se evierten.

La viabilidad de Adolescaria fascioli recolectada en plantas y otros objetos de cuerpos de agua se verifica examinándolos en un portaobjetos de vidrio en solución fisiológica bajo un microscopio con etapa de calentamiento. Cuando las larvas de trematodos se calientan, comienzan a moverse.

La viabilidad de los huevos de tenia enana está determinada por la ubicación de los ganchos en el embrión.

En los huevos vivos de la tenia enana, se producen lentos movimientos pendulares del protoplasma y casi imperceptibles separaciones y movimientos de los extremos puntiagudos del par lateral de ganchos hacia los lados del par medio.

Las contracciones del protoplasma del embrión y los ganchos embrionarios ayudan al embrión a liberarse primero de las membranas de la oncosfera y luego de la cáscara exterior del huevo.

En un huevo vivo, el par mediano y los pares laterales de anzuelos están ubicados paralelos; en algunos huevos, las láminas de los pares laterales están muy juntas y ubicadas en un ángulo de menos de 45° con respecto al par de anzuelos medio.

El embrión moribundo se contrae convulsivamente y separa lentamente los ganchos. En un embrión muerto, el movimiento de los ganchos se detiene y se ubican en desorden, a veces los ganchos laterales al par adyacente se separan en ángulo recto, obtuso o agudo.

A veces se observa arrugamiento del embrión y formación de granulación. Un método más preciso se basa en la aparición de movimientos de la oncosfera durante un cambio brusco de temperatura: de 5-10 a 38-40 ° C.

La determinación de la viabilidad de nematodos inmaduros debe estudiarse en cámara húmeda (placas de Petri), colocando huevos de lombrices intestinales en una solución de formaldehído al 3% preparada en una solución isotónica de cloruro de sodio a una temperatura de 24-30 ° C, huevos de tricocéfalos en una cámara de 3 % solución de ácido clorhídrico a una temperatura de 30-35 °C, los huevos de oxiuros se introducen en una solución isotónica de cloruro de sodio a una temperatura de 37 °C. Las placas de Petri deben abrirse de 1 a 3 veces por semana para una mejor aireación y el papel de filtro debe volverse a humedecer con agua limpia.

Las observaciones del desarrollo de huevos de helmintos se realizan al menos 2 veces por semana. La ausencia de signos de desarrollo dentro de 2-3 meses indica su inviabilidad. Los signos del desarrollo de huevos de helmintos son, en primer lugar, las etapas de trituración, dividiendo el contenido del huevo en blastómeros separados. Durante el primer día se desarrollan hasta 16 blastómeros, que pasan a la segunda etapa: mórula, etc.

Los huevos de anquilostoma se cultivan en un cilindro de vidrio (50 cm de alto y 7 cm de diámetro) cerrado con un tapón. Una mezcla de volúmenes iguales de arena estéril, carbón y las heces con huevos de anquilostoma, diluidas con agua hasta obtener una consistencia semilíquida, se vierten cuidadosamente en el fondo del cilindro utilizando un tubo de vidrio. Durante 1-2 días de asentamiento en la oscuridad a una temperatura de 25-30 ° C, las larvas rabditiformes eclosionan de los huevos y después de 5-7 días se vuelven filariformes: las larvas trepan por las paredes del cilindro, donde se encuentran. visible incluso a simple vista. Los huevos de trematodos, como opistorquiidos, difilobotríidos, fasciolas, etc., que se desarrollan naturalmente en el agua, se colocan sobre un vidrio de reloj, una placa de Petri o en otro recipiente, y se vierte una pequeña capa de agua corriente. Al cultivar huevos de Fasciola hay que tener en cuenta que se desarrollan más rápido en la oscuridad, mientras que el miracidio se forma en huevos vivos a una temperatura de 22-24 °C después de 9-12 días. Al microscopizar huevos de trematodos en desarrollo, los movimientos del miracidio son claramente visibles. Miracidium fasciola emerge de la cáscara del huevo sólo con la luz. Durante el cultivo, el agua se cambia después de 2-3 días.

Las larvas de anquilostoma y estrongiloide se cultivan en agar en una placa de Petri con carbón animal. Después de estar en un termostato a una temperatura de 26-30 °C durante 5-6 días, las larvas se arrastran por el agar, dejando tras de sí un camino de bacterias (método Fulleborn).

Método de Harada y Mori (1955). Agregue 7 ml de agua destilada a los tubos de ensayo colocados en una gradilla. Con un palito de madera, tomar 0,5 g de heces y extender sobre papel de filtro (15X150 mm) a 5 cm del borde izquierdo (esta operación se realiza sobre una hoja de papel para proteger la superficie de la mesa del laboratorio). Luego se inserta la tira con el frotis en el tubo de ensayo de manera que el extremo izquierdo libre del frotis llegue al fondo del tubo de ensayo. El extremo superior se cubre con un trozo de celofán y se envuelve bien con una banda elástica. En el tubo de ensayo está escrito el número y apellido de la persona examinada. En este estado, los tubos se almacenan durante 8-10 días a una temperatura de 28 °C. Para estudiar el cultivo, retire la funda de celofán y retire una tira de papel de filtro con unas pinzas. Se debe tener cuidado al hacer esto, ya que un pequeño número de larvas infecciosas pueden desplazarse hacia el extremo superior del papel de filtro o hacia el costado del tubo y penetrar debajo de la superficie del celofán.

Los tubos se colocan en un baño de agua caliente a una temperatura de 50 °C durante 15 minutos, después de lo cual se agita su contenido y se vierte rápidamente en un tubo de ensayo de 15 ml para sedimentar las larvas. Después de la centrifugación, se retira el sobrenadante y el sedimento se transfiere a un portaobjetos de vidrio, se cubre con un cubreobjetos y se examina microscópicamente con bajo aumento.

Para el diagnóstico diferencial de larvas filariformes, es necesario utilizar los datos presentados en la Tabla. 13.

Métodos para teñir huevos y larvas de helmintos. En la mayoría de los casos, los tejidos muertos perciben las pinturas más rápido que los vivos. Estas características se utilizan en helmintología para determinar la viabilidad de los huevos y larvas de helmintos. Sin embargo, en algunos casos, algunas pinturas son mejor percibidas por los tejidos vivos que por los muertos.

Tabla 13. Diagnóstico diferencial larvas en forma de filar de A.duodenale, N.americanus, Strongyloides stercoralis, Trichostrongylus spp.

Para el reconocimiento diferencial de huevos y larvas vivos y muertos, se utilizan las siguientes pinturas y métodos.

Leukobase azul de metileno se utiliza para teñir tejidos vivos y muertos. Una célula o tejido vivo reduce el azul de metileno a una leucobase incolora; el tejido muerto no tiene esta capacidad, por lo que adquiere color.

Para colorear los huevos de lombrices intestinales, puede utilizar azul de metileno en una solución de ácido láctico con álcali cáustico (0,05 g de azul de metileno, 0,5 g de hidróxido de sodio, 15 ml de ácido láctico). Los huevos vivos no perciben el color; los embriones de huevos muertos se vuelven azules.

El método de tinción no es aplicable a huevos inmaduros de lombrices intestinales y tricocéfalos; la cáscara pigmentada está teñida y, por lo tanto, no es visible si la célula germinal dentro del huevo está coloreada.

Las larvas de Ascaris se tiñen con una solución básica de pintura azul cresilo brillante en una concentración de 1:10 000. de la siguiente manera: Se aplica una gota de líquido con huevos de lombrices intestinales y una gota de la solución de pintura principal a un portaobjetos de vidrio. La preparación se cubre con un cubreobjetos, que se presiona firmemente contra la muestra mientras se golpea ligeramente con una aguja de disección. El número de larvas emergentes y el grado de tinción se observan al microscopio, después de lo cual se examina nuevamente la misma preparación después de 2 a 3 horas. Sólo se consideran vivas las larvas no deformadas que no se han teñido durante 2 horas. Las larvas muertas se tiñen cuando la cáscara se rompe (parcial o completamente).

La posibilidad de teñir las preparaciones con una solución de yodo está indicada para determinar la viabilidad de los huevos de lombrices aviares. En este caso, se utiliza como tinte una solución alcohólica de yodo al 5%. Cuando se aplica a la preparación, los embriones de los huevos muertos de Ascaridia se vuelven anaranjados en 1-3 s. Los huevos muertos de opisthorchis y las oncosferas de tenia bovina se tiñen con una solución de azul de toluidina (1:1000), y las oncosferas muertas de tenia bovina se tiñen con una solución de azul de cresilo brillante (1:10.000). Al mismo tiempo, los embriones y las cáscaras de los huevos vivos y muertos adquieren color. Por lo tanto, después de la tinción, los huevos y las oncosferas se lavan en agua limpia y además se tiñe con safranina (diluida 1:10.000 en una solución de alcohol al 10%). El alcohol quita el color de las cáscaras y la safranina les da un color rojo. Como resultado, los huevos vivos se vuelven rojos, el embrión de los muertos se vuelve azul y la cáscara permanece roja. Los embriones muertos de oncosferas de tenia bovina se tiñen rápidamente, en pocos minutos, de rojo brillante o rosa con safranina o de azul con azul de cresilo brillante en una dilución de 1:4000 o con índigo carmín en una dilución de 1:1000-1:2000.

Los embriones vivos no cambian bajo la influencia de estos tintes incluso después de 2 a 7 horas.

Para determinar la viabilidad de los huevos de tenia enana, se recomienda utilizar las siguientes pinturas: 1) azul cresilo brillante (1:8000): después de 1 hora, la oncosfera de los huevos muertos adquiere un color especialmente brillante, que se destaca claramente sobre el fondo pálido. o fondo incoloro del resto del huevo; 2) safranina: diluida 1:8000 con exposición durante 2 horas y 1:5000 durante 3-5 horas; 3) Solución de ácido pirogálico al 50% en una dilución de 1:2 - cuando se expone durante 1 hora a una temperatura de 29-30 “C (cuanto más baja es la temperatura, más largo es el proceso de teñido).

Los plerocercoides vivos de la tenia se tiñen muy bien con una solución acuosa (1:1000) de pudrición neutra durante 5 a 20 minutos. Para obtener un color rosado persistente que no desaparezca en 5 días y que no afecte la motilidad de los plerocercoides, suele ser suficiente 10 minutos. El grado de coloración se controla observando las larvas en una solución isotónica pura de cloruro de sodio, para lo cual se eliminan periódicamente los plerocercoides de la pintura. Es recomendable utilizar azul de metileno para teñir los plerocercoides muertos.

R. E. Chobanov y otros (1986) propusieron un método para determinar la viabilidad de huevos y larvas de helmintos utilizando como tinte el pigmento “rubrina”, obtenido cultivando el moho Peniciliium rubrum. Para hacer esto, use una solución de tinte acuosa al 3%.

El proceso de coloración de huevos y larvas se completa después de 1,5 horas. Los huevos no viables de oxiuros, tenias bovinas y enanas, anquilostomas y tricostrongílidos adquieren un color rosa intenso, los anquilostomas y las larvas de tricostrongílidos se vuelven rojos. Se observa un color menos brillante en los huevos de lombrices intestinales y tricocéfalos, ya que, cuando se liberan de los intestinos, ya tienen un color marrón oscuro: los huevos y larvas viables no están coloreados.

Métodos fisicoquímicos para estimular la liberación de miraculid de huevos de trematodos. SM German y S.A. Beer (1984) desarrollaron métodos para determinar la viabilidad de huevos de opistórquidos y dicrocelio exponiéndolos a un medio de reacción. Si están vivos, se libera el miracidio. Los métodos se basan en la activación fisicoquímica de la glándula de eclosión de miracidio y la estimulación. actividad del motor larvas. La estimulación se logra exponiendo los huevos de trematodo a un medio de reacción especial en combinación con técnicas secuenciales: creando una diferencia de temperatura, secando una suspensión de huevos, exponiendo un flujo débil de líquido en la gota de prueba, lo que contribuye a la liberación masiva de miracidios de los huevos.

Determinación de la viabilidad de huevos de opistórquidos mediante el método de Herman y Beer. Se preenfría una suspensión de huevos en agua (del grifo, sedimentada) a 10-12 °C. Todas las operaciones posteriores se realizan a temperatura ambiente (18-22 °C). Se añade una gota (aproximadamente 0,05 ml) de una suspensión que contiene entre 100 y 400 huevos a un tubo de centrífuga. Los tubos se colocan en una rejilla durante 5 a 10 minutos para sedimentar los huevos. Entonces franja estrecha Con papel de filtro, succione con cuidado el exceso de agua hasta eliminarlo por completo. Agregue 2 gotas de medio al tubo de ensayo, agite, transfiera el contenido con una pipeta a un portaobjetos de vidrio y déjelo durante 5 a 10 minutos, agitando ligeramente (o colóquelo debajo de un secador de pelo) para crear corrientes líquidas débiles en la gota de suspensión de prueba. . Esta operación, que imita el peristaltismo del intestino del molusco, permite activar la liberación de miracidios. Después de esto, se añaden 2 gotas más del medio a la suspensión y luego se observa la preparación usando un microscopio óptico convencional (X200). Durante este tiempo, la tapa de los huevos con un miracidio viable debería abrirse y la larva emerge activamente al medio ambiente. Gracias a la presencia de etanol, el miracidio se inmoviliza después de 3 a 5 minutos y luego se tiñe con un tinte que se encuentra en el medio. Como resultado, los miracidios se detectan y cuentan fácilmente.

Preparación del medio de reacción. El medio se prepara en tampón Tris-HCi 0,05 M en condiciones óptimas de pH de 8,0 a 9,5. Al tampón se le añade etanol al 10-13% y un colorante (safranina, azul de metileno y otros que funcionan dentro del rango de pH) para tinción débil líquido (por ejemplo, para la safranina su concentración final será 1:50.000). Puede utilizar otro tampón que funcione en límites de pH alcalinos, por ejemplo fosfato 0,05 M (pH 8,5). Por tanto, el medio contiene 96% de etanol - 12 partes; tinte (solución madre) - 1-10 partes; ¡0,05 M Tris-NS! tampón (pH 8,5-9,5): hasta 100 partes. Ejemplo de medio: 12 partes de etanol al 96%, 1 parte de una solución saturada de safranina, el resto hasta 100 partes - tampón Tris-HCl 0,05 M, pH 9,5.

Determinación de la viabilidad de huevos de dicrocelio mediante el método de Herman, Beer, Stratan. Se coloca una gota de suspensión que contiene entre 100 y 150 huevos de trematodo en un tubo de centrífuga durante 1 a 2 minutos para sedimentar los huevos. A continuación se seca cuidadosamente el líquido utilizando una tira de papel de filtro. Añadir 1-2 gotas del medio de reacción utilizando una pipeta Pasteur e incubar en un baño de agua a 28-30 °C durante 2-3 minutos. Composición del medio: 6 partes de butanol, 94 partes de solución de cloruro de sodio al 0,4% o solución de cloruro de potasio al 0,3% en agua destilada. Los huevos en el medio se transfieren con una pipeta a un portaobjetos de vidrio y se dejan durante 1,5 a 2 horas a temperatura ambiente (18-22 °C), añadiendo 1 a 2 gotas (0,05) cada 25 a 30 minutos (a medida que se secan). ).ml) de solución de butanol en agua destilada. Después de esto, la preparación se examina bajo un microscopio con un aumento de 100-200x. La viabilidad está determinada por la cantidad de óvulos abiertos con miracidios liberados. El butanol penetra por los poros de la cáscara del huevo, llega a los miracidios y los activa. La incubación a la temperatura indicada mejora este proceso. El butanol en una concentración del 3-7% es perjudicial para el miracidio que emerge del huevo. La transferencia de una suspensión de huevos de un tubo de ensayo a un portaobjetos de vidrio permite, cuando se libera el miracidio (después de 30-40 minutos), reducir la concentración de butanol debido a la volatilización a un nivel seguro (1,5-0,5%). La presencia de cloruro de sodio en el medio en una concentración de 0,1-0,5% (o cloruro de potasio en una concentración de 0,05-0,4%) determina la actividad del miracidio liberado. A diferencia de los pequeños huevos transparentes del opisthorco, los huevos de dicrocelio tienen una cáscara de color oscuro y una tapa claramente visible que se abre después de que emerge el miracidio. Por lo tanto, es más conveniente evaluar la viabilidad de los huevos de dicrocelio contando los huevos abiertos, en lugar de teñir y contar los miracidios.

Método luminiscente para estudiar huevos y larvas de helmintos.

Por primera vez en la práctica helmintológica se utilizaron métodos de microscopía fluorescente en 1955. Se informó que la microscopía fluorescente permite diferenciar objetos vivos y muertos sin dañar el huevo. Para la fluorescencia no se utilizaron rayos UV, sino la parte azul-violeta de la luz visible, con un microscopio convencional y portaobjetos de vidrio; aplicado al iluminador OI-18 conjunto especial filtros de color.

Se ha descubierto que los huevos vivos y muertos de lombrices intestinales, oxiuros, tenia enana, tenia bovina, tenia ancha y otros helmintos emiten fluorescencia de forma diferente. Este fenómeno se observa tanto durante la luminiscencia primaria sin el uso de colorantes como cuando se tiñe con fluorocromos (naranja de acridina, corifosfina, primulina, aurolina, sulfato de berlerina, tripaflavina, rivanol, quinina, etc.).

Los huevos de lombrices intestinales, vivos, incoloros y no segmentados, brillan de color verde brillante con un tinte amarillento; en los huevos muertos la cáscara irradia luz verde mucho más brillante que el germinal de color verde oscuro; En los huevos de lombrices intestinales con larva, solo aparece la cáscara, y en los huevos muertos, tanto la cáscara como la larva son de color amarillo brillante.

Los huevos vivos no pigmentados ni segmentados de oxiuros y tenias enanas emiten una luz de color amarillo verdoso; En los huevos muertos, la cáscara brilla intensamente sobre el fondo de una masa embrionaria de color verde oscuro. Con luminiscencia secundaria (cuando se tiñe con naranja de acridina en una dilución de 1:10.000 y 1:50.000 de 30 minutos a 2 horas), la cáscara de nematodos, trematodos y cestodos vivos y muertos brilla de manera diferente.

El caparazón de Ascaris lumbricoides, Toxocara leonina, Enterobius vermicularis, Hymenolepis nana, H.fraterna, H. diminuta, T.saginatus, D.latum vivos y muertos es de color rojo anaranjado. Embriones de Asc vivos. lumbricoides, T.leonina, H.diminuta, D.latum y las oncosferas de la tenia bovina emiten fluorescencia en un color verde oscuro opaco o verde grisáceo. Los embriones muertos de estos huevos de helmintos emiten una luz roja anaranjada "ardiente". Las larvas vivas de oxiuros y toxocara (cáscaras de huevo liberadas) emiten una tenue luz gris verdosa; cuando mueren, el color cambia desde la punta de la cabeza a un verde claro "ardiente", luego amarillo, naranja y, finalmente, naranja brillante.

Cuando se tiñen con fluorocromos (coryphosphilus, primulina), los huevos muertos de lombrices intestinales y tricocéfalos exhiben un brillo que va del amarillo lila al rojo cobrizo. Los huevos viables no son luminiscentes, sino que están pintados de verde oscuro. Los huevos vivos de los trematodos Paragonimus westermani y Clonorchis sinensis no brillan cuando se tiñen con naranja de acridina, pero los huevos muertos emiten una luz verde amarillenta.

El método de luminiscencia también se puede utilizar para determinar la viabilidad de las larvas de helmintos. Así, las larvas de estrongilato y rhabditatus fluorocromadas con una solución de naranja de acridina (1:2000) brillan: las vivas, verdes (con un tinte), las muertas, con una luz naranja brillante. Las larvas vivas de Trichinella no brillan o dan un brillo débil cuando se tratan durante 10 minutos con soluciones de isotiocianato de fluoresceína, auramina, etc. Las larvas muertas fluorocromadas (en una concentración de 1:5000) dan un brillo brillante.

Los miracidios vivos que emergen del caparazón emiten una luz tenue y azulada con una corola de cilios de color amarillo claro apenas perceptible, pero 10-15 minutos después de la muerte aparecen con una luz brillante "ardiente" de color verde claro y luego de color rojo anaranjado.

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