Helmintologické metódy. Výskum enterobiázy a teniidózy

Na detekciu fragmentov helmintov sa výkaly pozerajú nahé, potom sa zmiešajú s vodou a skúmajú sa v malých častiach v Petriho miske na tmavom pozadí. Všetky podozrivé častice sa umiestnia na podložné sklíčko do kvapky vody a skúmajú sa pod lupou. Dennú porciu môžete umiestniť do valca s pridaním 5-10-násobného množstva vody. Po premiešaní sa nádoba nechá až do úplnej sedimentácie suspendovaných častíc. Povrchová vrstva kvapaliny sa vypustia a naleje sa čistá voda. Premytá zrazenina sa po malých častiach prezerá voľným okom alebo pod lupou. Na detekciu vajíčok sa používajú mikroskopické vyšetrovacie metódy.

Metóda natívneho rozmazania. nie veľké množstvo výkaly z rôzne miesta testovaná časť sa rozotrie na podložnom sklíčku v kvapke 50 % roztoku glycerolu, izotonického roztoku chloridu sodného alebo vody. Zmes sa prekryje krycím sklíčkom a pozoruje sa pod mikroskopom.

Füllebornova plávajúca metóda. Jedna časť výkalov sa zmieša s 20 časťami nasýteného roztoku chloridu sodného ( špecifická hmotnosť 1.18), pridávané v malých dávkach. Veľké častice, ktoré vyplávali na povrch, sa okamžite odstránia a zmes sa nechá 45 minút. Počas tejto doby vyplávajú na povrch vajíčka helmintov, ktoré majú nižšiu špecifickú hmotnosť ako roztok chloridu sodného. Povrchový film sa odstráni drôtenou slučkou s priemerom asi 1 cm a prenesie sa na podložné sklíčko na vyšetrenie pod mikroskopom.

Kalantariánska metóda. Účinnosť flotačnej metódy sa zvyšuje nahradením chloridu sodného nasýteným roztokom dusičnanu sodného. V tomto prípade sa zmes uchováva 10-15 minút.

Povrchový film vytvorený po usadení zmesi fekálií roztokom chloridu sodného alebo dusičnanu sodného možno odstrániť aj podložným sklíčkom. Na tento účel sa nádoba naplnená až po okraj zmesou výkalov so soľným roztokom prikryje podložným sklom tak, aby jej spodný povrch bol v kontakte s kvapalinou. Po usadení sa sklo vyberie a po rýchlom otočení povrchu, na ktorom sa film nachádza, sa pozrie pod mikroskopom.

Škrabanie špirálovitých záhybov (na identifikáciu vajíčok červov a onkosfér) býčia pásomnica) sa robia ráno pred vykonaním toalety. Na zoškrabanie okolo konečníka sa používa drevená špachtľa ponorená do vody alebo 50% roztoku glycerínu. Výsledný materiál sa prenesie na podložné sklíčko v kvapke vody alebo 50% roztoku glycerolu a prezerá sa pod mikroskopom. Špachtľu je možné nahradiť navlhčeným vatovým tampónom, ktorým sa perianálna oblasť utrie a potom dobre opláchnite vo vode. Voda sa odstredí a zrazenina sa skúma pod mikroskopom.

Bermannova metóda (na detekciu lariev). Kovová sieťka potiahnutá 5-6 g výkalov je upevnená na sklenenom lieviku vloženom do stojana. Na spodný koniec lievika sa nasadí gumená hadička so svorkou. Lievik sa naplní vodou zohriatou na t ° 50 °, takže Spodná časť siete s výkalmi boli v kontakte s vodou. Larvy sa aktívne pohybujú do vody a hromadia sa v spodnej časti gumenej trubice. Po 4 hodinách sa kvapalina spustí do centrifugačných skúmaviek, odstredí sa a zrazenina sa skúma pod mikroskopom.

Analýza spúta, nosového hlienu a vaginálny výtok na detekciu vajíčok pľúcnej trematódy paragonimus, lariev škrkaviek a háčkovitých červov, vajíčok pinworms, fragmentov echinokokového mechúra. Skúmaná časť hlienu (sekrécie) sa rozotrie na sklo a pozoruje sa makroskopicky na čiernobielom pozadí a potom pod mikroskopom. Do testovaného materiálu môžete pridať 25% roztok antiformínu, dôkladne pretrepať a držať 1-1,5 hodiny, aby sa hlien rozpustil. Zmes sa odstredí a zrazenina sa skúma pod mikroskopom.

Analýza duodenálnej a žalúdočnej šťavy na zistenie vajíčok motolice pečene, háčkovitých červov, lariev Strongyloides. Všetky tri časti získaného obsahu dvanástnika sa odstredia a sediment sa skúma pod mikroskopom. Tiež preskúmať a.

Štúdium tkanív. Na identifikáciu lariev Trichinella sa kúsky bioptického svalu opatrne rozdelia na vlákna, stlačia sa medzi sklá kompresora (hrubé sklá so skrutkami) a skúmajú sa pod mikroskopom s tieňovaným svetlom. Na identifikáciu cysticerkov sa svaly rozvrstvia pitevnými ihlami, izolovaná vezikula sa očistí od okolitého tkaniva, vtlačí sa medzi dve podložné sklíčka a vyšetrí sa pod lupou.

Krvný test (na zistenie lariev filárií). Visiaca kvapka sa skúma na krycom sklíčku lemovanom vazelínou. Môžete zmiešať 0,3 ml krvi s 10-násobným množstvom 3% roztoku. Zmes sa odstredí a zrazenina sa skúma pod mikroskopom. Na obohatenie prípravkov na 1 ml žilovej krvi pridajte 3 ml 2 % roztoku formalínu alebo 5-násobok množstva tekutiny pozostávajúcej z 95 ml 5 % roztoku formalínu, 5 ml octová kyselina a 2 ml koncentrovaného alkoholového roztoku hematoxylínu. Zmes sa odstredí, zrazenina sa premyje destilovanou vodou a skúma sa pod mikroskopom. Na odlíšenie odlišné typy filariae skúmajú nátery zafarbené podľa Giemsa-Romanovského metódy.

Metódy imunologická diagnostika. Aplikujte (aglutinácia, fixácia komplementu) a alergické diagnostické testy (pozri) s príslušným typom helmintov.

Helmintologické metódy výskumu. Ryža. Vajcia helmintov. 1-10 vajec škrkavky(háďatká): 1 - 3 - škrkavky (1 - oplodnené vajíčko, 2 - oplodnené vajíčko bez bielkovinového obalu, 3 - neoplodnené vajíčko); 4 - mačací škrkavka; 5 - škrkavky mäsožravce; 5 - pinworms; 7 - bič; 8 - tominx; 9 - háďatka; 10 - tricho-strongylid. 11-15 - vajcia pásomnice(cestódy): 11 - pásomnica hovädzia; 12 - pásomnica trpaslík; 13 - pásomnica potkana; 14 - tekvicová pásomnica; 15 - široká stuha. 16 - 24 - vajíčok motolíc (trematód): 16 - motoliek (schistozómov) japonských; 17 - trematódy (schistozómy) moč - sexuálne; 18 - trematódy (schistozómy) Munson; 19 - trematódy (parogonymus) pľúcne; 20 - trematódy (opisthorchis) sibírske (mačky); 21 - trematódy (klonorchis) čínske; 22 - črevné trematódy (metagonimus); 23 - trematódy (fascioly) pečene; 24 - trematódy (dikrocélium) kopijovité.

Efektívna a pohodlná metóda helmintologického výskumu je štúdium hustého náteru podľa Kato, ktorej podstatou je detekcia vajíčok helmintov v hustom nátere výkalov, vyčírených glycerínom a zafarbených malachitovou zelenou. Zloženie Kato zmesi - 6 ml 3% vodný roztok malachitová zeleň, 500 ml glycerínu, 500 ml 6% roztoku fenolu. Roztok je stabilný a môže sa skladovať pri izbovej teplote. Na prípravu prípravkov sa kúsky výkalov vo veľkosti hrášku nanesú na podložné sklíčko, prikryjú sa filmom hydrofilného celofánu zrejúceho v Kato zmesi počas 24 hodín a pritlačia sa na sklo. Rovnomerné rozdelenie materiál. Nátery vyčírené počas 40-60 minút sa mikroskopicky skúmajú. Zistené vajíčka helmintov sa spočítajú a morfologické znaky určiť ich druh. Metóda umožňuje odhaliť vajíčka ascaris, bičíkovcov, pásomníc, trematód, v menšej miere - ankylostomie a pygmy pásomnice.

Tiež široko používaný metódy obohacovania. Princípom flotačných metód je suspendovanie trusu v soľnom roztoku, ktorý má v porovnaní s vajíčkami hlíst vyššiu relatívnu hustotu, v dôsledku čoho vyplávajú na povrch. Obsah povrchového filmu sa skúma pod mikroskopom. Ako obohacujúce zmesi sa používajú roztoky: kuchynská soľ - 400 g v 1 litri vody (relatívna hustota podľa Fülleborna -1,18); dusičnan sodný - 1 kg v 1 litri vody (relatívna hustota podľa Kalantaryana-1,38); dusičnan sodný - 900 g a dusičnan draselný - 400 g v 1 litri vody (relatívna hustota podľa Brudastova a Krasnonosa - 1,48). uvarené a vychladnuté.
Na výskum sa do pohára alebo fajansového skla zavedie 5 až 10 g výkalov, pridá sa 100 až 200 ml. soľný roztok a dôkladne premiešame. Potom sa veľké častice, ktoré vyplávali na povrch, odstránia drevenou špachtľou alebo naberačkou vyrobenou z papiera alebo lepenky a na povrchový film sa ihneď priloží široké podložné sklíčko tak, aby soľný roztok a podložné sklíčko boli v úplnom kontakte. Po 30 až 40 minútach usadzovania zmesi sa podložné sklíčko vyberie, vloží sa pod mikroskop filmom nahor a celý povrch sa dôkladne preskúma. Aby ste predišli vysychaniu, môžete pridať 2-3 kvapky 50% roztoku glycerínu. Povrchovú fóliu je možné odstrániť aj drôtenou slučkou. Účinnosť flotačných metód sa zvyšuje so zvyšovaním relatívnej hustoty soľných roztokov. Pomocou týchto metód je možné zistiť vajíčka háďatiek, pásomníc a motolíc.

Na detekciu vajíčok vo výkaloch sa používa metóda sedimentácie Krasilnikov.. Fekálie sa zmiešajú s 1% roztokom čistiaceho prostriedku ( prací prášok"Lotus" atď.) v pomere 1:10, kým sa nevytvorí suspenzia. Pod vplyvom pracieho prostriedku sa rozpúšťajú rôzne zložky výkalov (bielkoviny, tuky, tkanivové prvky). Po 30 minútach sa obsah skúmavky pretrepáva 1-2 minúty a potom sa 5 minút odstreďuje. Prípravky sa pripravujú zo sedimentu a sledujú sa pod mikroskopom.
IN terénne podmienky, ako aj pri hromadných prieskumoch populácie na napadnutie hlístami je vhodné použiť metódu hustého náteru Kato. IN stacionárne podmienky pri vyšetrovaní pacientov je vhodnejšie použiť najúčinnejšie flotačné metódy. Pri použití týchto metód pri mikroskopovaní je vhodné spočítať vajíčka nájdené v preparáte. Na základe štandardnej hmotnosti alebo objemu odobratého na štúdium výkalov (napríklad 1 čajová lyžička alebo polievková lyžica) a konštantného jednotlivého objemu soľných roztokov možno približne posúdiť intenzitu invázií. Tento kvantitatívny záznam môže byť užitočný pri zdôvodňovaní predpísanej liečby a hodnotení účinnosti odčervenia. Okrem toho sa na stanovenie intenzity infekcie môžu použiť iné presnejšie kvantitatívne metódy, najmä metóda Stoll.

Na diagnostiku teniarhynchózy a enterobiázy aplikovať metódu výskumu perianálno-rektálnych zoškrabov. Drevenou špachtľou namočenou v 50% roztoku glycerínu sa ráno pred defekáciou v kruhu zoškrabuje perianálne záhyby konečník A nižšie divízie konečníka. Výsledný materiál očistený špachtľou od okraja krycieho sklíčka sa vloží na podložné sklíčko do kvapky 50% roztoku glycerolu, prikryje sa krycím sklíčkom a skúma sa pod mikroskopom. Môžete tiež preskúmať prúžok celulózovej pásky, ktorý sa najskôr pritlačí lepiacou stranou k pernatálnym záhybom, potom sa umiestni na podložné sklíčko a podrobí sa mikroskopii.

Detekcia lariev háďatka vo výkaloch Bermanovou metódou. Metóda je založená na termotropných vlastnostiach lariev. Na výskum sa odoberie 1 polievková lyžica výkalov, vložená do kovovej siete alebo sieťky niekoľkých vrstiev gázy na drôtenom ráme. Mriežka je inštalovaná v lieviku pripevnenom na statíve. K lieviku sa pripája gumená trubica so svorkou. Zdvihnutím pletiva sa lievik naplní vodou (teplota +40°...+50°C) tak, aby spodná časť pletiva bola ponorená do vody. Larvy z trusu aktívne migrujú do teplá voda a usadzujú sa, hromadia sa na dne lievika. Po 2-4 hodinách sa svorka otvorí, voda sa spustí do centrifugačnej skúmavky a odstreďuje sa 2-3 minúty. Potom sa supernatant vypustí, sediment sa prenesie na podložné sklíčko a pozrie sa pod mikroskop, kde sa nachádzajú mobilné larvy patogénu strongyloidózy.

Haradova metóda a Mori umožňuje rozlíšiť larvy hákovcov a nekátorov. Larvy háčikovca sa kultivujú na filtračnom papieri. Na tento účel sa na pásiky filtračného papiera s veľkosťou 12 x 1,5 cm nanesie 0,5 g čerstvého trusu odobraného pacientovi najneskôr 1 hodinu po defekácii, pričom oba konce pásika zostanú čisté. Jeden koniec prúžku je ponorený do skúmavky, ktorej štvrtá časť je naplnená vodou a druhá je upnutá korkom. Rúry sú umiestnené v termostate pri teplote +26 ... + 28°C. Larvy, ktoré sa vyvinuli z vajíčok, zostupujú po filtračnom papieri a usadia sa na dne skúmavky. Po 5-6 dňoch sa prúžok papiera odstráni a kvapalina zostávajúca v skúmavke sa skúma pod lupou alebo sa odstredí. Zrazenina vytvorená počas odstreďovania sa skúma pod svetelným mikroskopom. Pri použití namiesto skúmaviek štvorstenných sklenených nádob (veľkosť 15XYX7 cm), na stenách ktorých sú pripevnené 4 papierové prúžky, sa zvyšuje účinnosť analýz (GM Maruashvili et al., 1966).

Metódy výskumu schistosomiázy . Vyšetrenie výkalov - časť výkalov sa zmieša s 250 ml vody, prefiltruje sa cez 3 vrstvy gázy do kónickej nádoby, ktorá sa po vrch naplní vodou. Po 30 minútach sa tekutá vrstva scedí, k zrazenine sa pridá čerstvá časť vody. Zrazenina sa premýva, kým sa nezíska číry supernatant, a skúma sa mikroskopicky.

Metóda larvoskopie - 20 – 25 g výkalov sa umiestni do Erlenmeyerovej banky so sklenenou trubicou prispájkovanou na boku a premyje sa voda z vodovodu. Potom sa banka prikryje tmavým papierom, spájkovaná sklenená trubica sa nechá na svetle pri teplote +25...+30°C. Vyliahnuté miracidie sú sústredené v menisku v laterálnej trubici, kde ich možno vidieť lupou alebo voľným okom. Vyšetrenie moču - 100 ml moču sa odoberie medzi 10. a 14. hodinou, alebo sa denná časť usadí a následne sa odstredí pri 1500 ot./min. Výsledná zrazenina sa nanesie* na podložné sklíčko a podrobí sa mikroskopii. WHO odporúča metódu filtrovania celej časti moču. Po filtrácii sa filtre ošetria formalínom alebo sa zahrejú (na usmrtenie vajíčok) a potom sa navlhčia vodným roztokom ninhydrínu. V sušených prípravkoch získavajú vaječné embryá fialovú farbu.

Použitie imunologického výskumné metódy na diagnostikovanie schistosomiázy sú zložité, pretože dospelé schistozómy a ich vajíčka obsahujú veľké množstvo antigénov, ktoré spôsobujú imunitné reakcie, ktoré nie sú druhovo špecifické (D. Bradley, 1979).

V našej krajine na formuláciu imunologických reakcií pri helmintových infekciách celý riadokštandardná diagnostika. Praktické využitie mať alergiu kožný test pri echinokokóze a alveokokóze, RLA s echinokokovým antigénom, RSK v chlade, precipitačná reakcia v chlade v rôznych modifikáciách (prstencová precipitácia, precipitácia v skúmavkách alebo kapilárach, ktoré sú umiestnené s antigénmi trichinelózy, cysticerkózy a migroascariózy). Štandardné diagnostické prostriedky na nastavenie vyššie uvedených sérologických reakcií vyrábajú podniky vyrábajúce bakteriálne prípravky. Výrobca prikladá k vyrobeným diagnostikám podrobné pokyny o pravidlách skladovania, dátumoch exspirácie lieku a návode na použitie vhodných antigénov s technikou nastavenia reakcie.

IN posledné roky zoznam sérologických testov používaných na diagnostiku helmintiáz sa výrazne rozšíril. Na tento účel sa používajú tieto reakcie: RIGA, nepriama imunofluorescencia (RIF), gélová imunodifúzia (RID), protiimunoelektroforéza (VIEF), REAMA. Tieto reakcie sa môžu použiť na askariózu, toxokarózu, trichinelózu, ankylostomickú infekciu, filariózu, echinokokózu a alveokokózu, opisthorchiázu, schistosomiázu, paragonimiázu. Pre tieto reakcie sa však u nás štandardné diagnostika nevydávajú a nie je regulovaná technika ich nastavenia. Samostatné laboratóriá, väčšinou vedecké, pripravujú vlastné špecifické antigény a používajú ich v rôznych modifikáciách. Opis týchto metód je široko prezentovaný v literatúre a nie je striktne jednotný. Interpretácia imunologických údajov by mala byť založená na štúdiu dynamiky imunitnej odpovede, berúc do úvahy úroveň špecifickosti a citlivosti každého aplikovaného sérologickej reakcie. Preto je pri stanovení diagnózy, ako aj pri séroepidemiologických prieskumoch populácie vhodné použiť niekoľko najcitlivejších reakcií. Z tohto hľadiska sú reakcie VIEF a REMA, ktoré sa líšia vysoká citlivosť a dostatočne vysoká špecifickosť (P. Ambroise-Thomas, 1978; I. E. Ballad, 1979; G. M. Negryanu, 1980; A. M. Ponomareva, 1981; A. Ya. Lysenko, 1978 atď.). Účinnosť REAMA bola testovaná pri amébiáze, leishmanióze, trypanosomiáze a toxoplazmóze (GA Ermolin, 1980).

Kapitola III. Diagnostika helmintiáz a metódy helmintologického výskumu

Je potrebné vyšetriť na helmintiázy všetkých pacientov, o ktorých sa uchádza zdravotná starostlivosť, a najmä pacienti, ktorí sa obracajú na pediatra, terapeuta a neurológa so sťažnosťami na javy z gastrointestinálny trakt, nervový systém a s anémiou. Ak lekár nemôže vždy aplikovať laboratórne metódy výskumu, potom je každý zdravotnícky pracovník, ktorý poskytuje pomoc v ambulancii alebo nemocnici, povinný pohovoriť s pacientom o uvoľnení helmintov od neho.

Ak sú v príslušných kapitolách uvedené klinické indikácie, diagnóza by mala byť objasnená pomocou laboratórne metódy výskum helmintiázy.

Vzhľadom na prevahu črevné helmintiázy najväčší praktickú hodnotu má štúdium pohybu čriev.

Metódy na štúdium výkalov pre helmintiázy

Výkaly sa dodávajú do laboratória v čistom skle (asi štvrtina šálky výkalov odobratých z rôznych miest v jednej porcii); pri bežnom vyšetrení je povolené dodávanie výkalov do laboratória v zápalkových škatuľkách alebo obľúbených výtlačkoch.

Na kontrolu odčervovania sa dodáva celá časť výkalov zhromaždených po príjme (podľa predpisu lekára). antihelmintikum a preháňadlo (vo veľkých uzavretých sklenených nádobách, vedierkach).

Mikroskopické vyšetrenie výkalov je hlavným pri diagnostike črevných helmintiáz; vždy by mu malo predchádzať celkové makroskopické vyšetrenie trusu na zistenie segmentov veľkých pásomníc, škrkaviek, škrkaviek atď.

Stolica by mala byť čerstvá alebo konzervovaná (v 5% roztoku formalínu), pretože sušenie dramaticky mení štruktúru vajec. Okrem toho, keď sa vyskytujú stojaté výkaly rýchly vývoj vajíčka niektorých helmintov (napríklad ankylostomózy), čo sťažuje diagnostiku.

Podľa pokynov Ministerstva zdravotníctva ZSSR je potrebné súčasne vyšetrovať výkaly pomocou Füllebornovej metódy a natívneho náteru.

natívny náter

Natívny náter: malý kúsok trusu (veľkosť hrášku) odobratý zápalkou, sklenenou alebo drevenou tyčinkou z rôznych miest podávanej porcie sa opatrne rozotrie na podložnom sklíčku v kvapke 50% roztoku glycerolu resp. vo fyziologickom roztoku alebo vo vode. Prikryte krycím sklíčkom, ktoré mierne zatlačte (preparovacou ihlou). Náter by mal byť tenký, priehľadný a jednotný. Používa sa len ako doplnok k iným metódam, ktoré obohacujú liek. Mali by ste vidieť aspoň dva prípravky.

Na detekciu lariev hlíst (ako aj ich vajíčok) sa natívny náter urobí nasledovne (podľa Shulmana): 2-3 g výkalov sa dôkladne premiešajú „zakrútením“ sklenenou tyčinkou do emulzie s päťnásobným množstvo čistej vody alebo fyziologického roztoku. Počas miešania sa larvy hromadia na sklenenej tyčinke, preto sa ihneď po ukončení miešania kvapka emulzie rýchlo prenesie sklenenou tyčinkou na podložné sklíčko, prikryje sa krycím sklíčkom a skúma sa. S. D. Lyubchenko (1936) dokázal, že metóda krútenia je účinnejšia ako metóda náteru, najmä pokiaľ ide o vajíčka ascaris. Na základe práce S. D. Lyubčenka považujeme za vhodné nahradiť metódu rozmazania metódou twist.

Füllebornova metóda

Füllebornova metóda: 5-10 g výkalov odobratých z rôznych miest sa umiestni do nádoby s objemom 50-100 ml a opatrne sa rozotrie sklenenou alebo drevenou tyčinkou v nasýtenom roztoku stolová soľ(400 g tejto soli sa rozpustí v 1 litri vody, zahreje sa do varu a prefiltruje sa cez vrstvu vaty alebo gázy; roztok sa používa za studena: merná hmotnosť 1,2). Roztok sa prilieva postupne, kým sa nedosiahne homogénna suspenzia a celkové množstvo naliateho roztoku by malo byť približne 20-násobné. väčšie množstvo výkaly. Fülleborn odporučil použitie čajových pohárov na miešanie fekálií, ale vhodnejšie je pripraviť suspenziu v 50-100 ml nádobách od masti, pričom na každý rozbor použite dve nádoby (alebo v 100 ml pohároch).

Ihneď po príprave suspenzie sa veľké častice, ktoré vyplávali na povrch, odstránia z povrchu špachtľou, kovovou naberačkou alebo kúskom čistého papiera ( rastlinné útvary, nestrávené zvyšky jedla a pod.), potom sa zmes nechá 1-1,5 hodiny odstáť. Po uplynutí tejto doby sa celý film odstráni z povrchu zmesi dotykom drôtenej alebo platinovej slučky (plochej) s priemerom nie väčším ako 1 cm, ohnutej v pravom uhle; Film sa pretrepe na podložnom sklíčku a prikryje sa krycím sklíčkom. Pod každé krycie sklíčko (18x18 mm) nakvapkajte 3-4 kvapky. Celkovo by sa mali pripraviť aspoň 4 prípravky (pre každý prípravok jedno krycie sklíčko). Slučka sa kalcinuje na ohni a po každej analýze sa premyje vodou.

Podľa Füllebornovej metódy sa vajíčka všetkých háďatiek (s výnimkou vajíčok neoplodnených škrkaviek) a vajíčka trpasličích pásomníc rýchlo a jednoducho zistia.

Metóda Berman sa používa na štúdium výkalov pre larvy helmintov (so strongyloidózou). Táto metóda je nasledovná: 5 g fekálií na kovovej mriežke (na tento účel je vhodné sitko na mlieko) sa umiestni na sklenený lievik pripevnený na statíve. Na spodný koniec lievika sa nasadí gumená hadička so svorkou.

Sieťka s výkalmi sa zdvihne a do lievika sa naleje voda zohriata na približne 50 ° tak, aby spodná časť sieťky s výkalmi bola ponorená do vody. Larvy sa aktívne pohybujú do vody a hromadia sa v spodnej časti gumenej trubice. Po 2-4 hodinách sa svorka otvorí a kvapalina sa spustí do jednej alebo dvoch centrifugačných skúmaviek.

Po odstredení počas 1-2 minút vyššia časť kvapaliny sa rýchlo vypustia a zrazenina sa nanesie po kvapkách na podložné sklíčka a vyšetrí sa pod krycími sklíčkami alebo sa rozdelí tenká vrstva na 2-3 veľké sklá a potom vyšetrovať bez krycích skiel.

Bermanova metóda sa používa aj na vyšetrenie pôdy na prítomnosť lariev machovky.

Stollova metóda

Na určenie intenzity invázie sa používa metóda Stoll. Do špeciálnej sklenenej banky sa naleje desaťnormálny roztok hydroxidu sodného po značku 56 cm3 a potom sa pridávajú výkaly, kým hladina kvapaliny nedosiahne 60 cm3, t.j. 4 cm3. Po pretrepaní sklenenými guľôčkami sa odoberie 0,075 ml zmesi na vyšetrenie a vyšetrí sa pod jedným alebo dvoma obyčajnými krycími sklíčkami. Výsledné množstvo sa vynásobí 200, čím sa získa počet vajíčok obsiahnutých v 1 cm 3 výkalov.

Štúdium obsahu dvanástnika

Dvanástniková šťava a žlčníková žlč, získané obvyklým spôsobom sondovaním (a cystická žlč a po reflexe zo žlčníka), sa dôkladne premiešajú v rovnakom objeme etyléter; zmes sa odstredí a potom sa zrazenina skúma pod mikroskopom. Okrem sedimentu mikroskopické vyšetrenie vločky plávajúce v kvapaline, ktoré môžu obsahovať vajíčka helmintov, sú nevyhnutne vystavené. Pri skúmaní vajíčok helmintov žalúdočnej šťavy a zvratkov môžete použiť rovnakú techniku.

Ak máte podozrenie, treba vykonať vyšetrenie duodenálnej šťavy a obsahu žalúdka helmintické ochorenia pečeň, žlčník (opistorchiáza, fasciolóza, dikrocelióza) a dvanástnik(strongyloidóza).

Vyšetrenie spúta

Spútum sa rozotrie na sklenenú dosku, pevne sa prikryje ďalšou sklenenou doskou a skúma sa voľným okom na svetlom a čiernom pozadí, ako aj pod lupou v prechádzajúcom svetle. Oddelené kúsky spúta („hrdzavé“ nahromadenia, zvyšky tkaniva atď.) sa nanesú v tenkej vrstve na podložné sklíčko, pevne prikryjú krycím sklíčkom a skúmajú sa pri nízkej a veľké zväčšenie mikroskop.

a) Na diagnostiku cysticerkózy kože, podkožného tkaniva alebo svalov, asepticky odrezaný kúsok zodpovedajúceho tkaniva sa najskôr vyšetrí voľným okom. Tkanivové rezy sa oddelia pomocou pitevných ihiel, aby boli viditeľné jednoduchým okom vezikula - cysticercus (foto A); jeho dĺžka je 6-20 mm, šírka je 5-10 mm. Keď sa nájde bublina, ktorá je podozrivá z cysticerku, rozdrví sa medzi dve podložné sklíčka a vyšetrí sa pod mikroskopom. Cysticercus (Cistycercus cellulosae) je určený prítomnosťou skolexu so štyrmi prísavkami a halo háčikov (foto B).

Fotografia. A - cysticerci so scolexami otočenými von; B - Hlava pásomnice bravčovej.

b) Na diagnostiku trichinelózy sa asepticky odrezaný kúsok svalu (biceps alebo gastrocnemius) opatrne rozdrví v 50% roztoku glycerolu na najtenšie vlákna pomocou pitevných ihiel. Rozdrvené svaly sa stlačia medzi dve podložné sklíčka a skúmajú sa pri malom zväčšení mikroskopu v stmavenom zornom poli. Vyšetrenie svalov na trichinelózu sa odporúča vykonať najskôr v 8. deň choroby. Larvy trichinel sú vo svaloch v stočenej polohe: sú uzavreté v tobolkách citrónového tvaru.

Fotografia. A - larvy Trichinella vo svaloch; B - Kalcifikované kapsuly Trichinella.

Fluoroskopia

Najčastejšie sa fluoroskopia používa na diagnostiku echinokokózy a menej často cysticerkózy. Cysticerci sa zisťujú skiaskopiou až po kalcifikácii (v prípadoch dlhotrvajúca choroba). V posledných rokoch sa fluoroskopia používa aj na diagnostiku askariózy v ranom štádiu lariev a čiastočne v črevnom štádiu.

Počas obdobia migrácie lariev ascaris (a ankylostomity) v pľúcach sa zisťujú nestabilné, niekedy viacnásobné zápalové ložiská; súčasne sa v krvi objavuje výrazná eozinofília.

Sexuálne zrelé škrkavky sú jasne viditeľné na fluoroskopii čriev postihnutých jedincov. Táto metóda, napriek svojej zložitosti a ťažkopádnosti, by sa mala používať ako doplnková metóda na diagnostikovanie askariózy v prípadoch s negatívnym skatologickým rozborom. Podľa E. S. Geselevicha zo 180 pacientov s ascaridózou identifikovaných fluoroskopiou sa 54 vajíčok ascaris nenašlo vo výkaloch (pozri).

Helmintologické metódy výskumu. Metódy diagnostiky helmintiáz sú rozdelené na priame, založené na priamej detekcii samotných helmintov alebo ich fragmentov, ako aj lariev a vajíčok helmintov (metódy na vyšetrenie výkalov, moču, obsahu žlče a dvanástnika, spúta, krvi a tkanív, materiál získaný zoškrabaním z perianálnej oblasti a subungválnych priestorov) a nepriame, pomocou ktorých odhalia sekundárne zmeny vznikajúce v ľudskom tele v dôsledku životnej činnosti helmintov (štúdie morfologického zloženia krvi, imunologické metódy diagnostika helmintiáz, röntgenové štúdie atď.). Z priamych metód sú najčastejšie koprologické, ktoré sa delia na makro- a mikrohelmintoskopiu. V niektorých prípadoch sa používajú špeciálne metódy.

Metódy výskumu makrogelmitoskopie zamerané na vyhľadávanie helmintov alebo ich fragmentov (skolex, segmenty, časti strobila cestodónov). Používajú sa na diagnostiku tých helmintiáz, pri ktorých sa vajíčka nevylučujú s exkrementmi pacienta alebo sa vylučujú v malom množstve a nie vždy (napríklad pri enterobiáze sa červy nachádzajú vo výkaloch, s teniidózami, segmentmi).

Na detekciu červov alebo segmentov pásomníc vo výkaloch sa výkaly pozerajú voľným okom. Pre odlišná diagnóza taeniasis sa odporúča prezerať výkaly zriedené vodou v samostatných malých dávkach v čiernych fotografických kyvetách alebo v Petriho miskách na tmavom pozadí. Veľké útvary podozrivé z úlomkov helmintov skúmame pod lupou medzi dvoma podložnými sklíčkami. Ak do klinické indikácie navrhnúť detekciu malých helmintov alebo hlavičiek pásomníc po ošetrení, potom sa podozrivé častice skúmajú pod lupou v kvapke glycerolu a ak je to potrebné, pod mikroskopom.

Metódy výskumu mikrohelmintoskopie(kvalitatívne) sú zamerané na identifikáciu vajíčok a lariev helmintov. Naneste metódu hustého rozmazania s celofánovou krycou doskou podľa Kato. Zmes Kato pozostáva zo 6 ml 3% vodný roztok malachitovej zelene, 500 ml glycerín a 500 ml 6% roztok fenolu. Kato taniere (hydrofilný celofán nakrájaný na kúsky 20´ 40 mm) sú ponorené na 24 h do Kato zmesi tak, aby boli vedľa seba (3-5 ml Katov roztok pre 100 tanierov). 100 mg výkaly sa nanesú na podložné sklíčko, prikryjú sa celofánovou krycou doskou podľa Kata a stlačia sa tak, aby sa výkaly rozmazali na podložnom sklíčku v rámci celofánovej platne. Náter sa nechá pri izbovej teplote na vyčírenie o 40-50 °C min, a potom pozorované pod mikroskopom. V horúcom období, aby sa zabránilo vysychaniu prípravku, sa na tanier pripraveného prípravku položí vlhká špongia.

Na úplnú detekciu všetkých typov helmintov sa musí použiť metóda hrubého rozmazania celofánovej krycej dosky Kato v spojení s jednou z metód obohatenia. Najbežnejšie z nich sú Kalantaryanova metóda a Füllebornova metóda.

Kalantariánska metóda: v bankách so širokým hrdlom 100 ml dôkladne premiešajte sklenenou tyčinkou 5 G výkalmi, postupným pridávaním nasýteného roztoku dusičnanu sodného (1 kg dusičnan sodný na 1 l voda pri vare) po okraj pohára. Veľké častice, ktoré vyplávali na povrch, sa odstránia papierovou naberačkou. Na povrch soľného roztoku sa priloží podložné sklíčko (fyziologický roztok sa pridáva dovtedy, kým zmes nie je v úplnom kontakte so sklíčkom). Po 20-30 min Podložné sklíčko sa vyberie a film sa prezrie pod mikroskopom. Pri absencii tejto soli môžete použiť nasýtený roztok kuchynskej soli podľa Fholleborna (400 G soľ v 1 l vriaca voda).

Vzhľadom na to, že vajíčka s veľkou špecifickou hmotnosťou (neoplodnené vajíčka ascaridov, vajíčka motolic a veľkých pásomníc) neplávajú, je okrem skúmania povrchovej vrstvy tekutiny pri použití Füllebornovej metódy potrebné prezrieť si 2-4 preparáty zo sedimentu pod mikroskopom.

Špeciálne laboratórne metódy výskumu rôznych helmintiáz.

7.7. Metódy stanovenia životaschopnosti vajíčok a lariev helmintov

Životaschopnosť vajíčok helmintov je určená vzhľad, farbením vitálnymi farbivami, kultiváciou v optimálne podmienky a nastavenie biologickej vzorky.

7.7.1. Stanovenie životaschopnosti vajíčok alebo lariev helmintov podľa vzhľadu

Vajíčka helmintov sa mikroskopujú najskôr pri malom zväčšení, potom pri veľkom zväčšení. V deformovaných a mŕtvych vajciach helmintov je škrupina roztrhnutá alebo ohnutá dovnútra, plazma je zakalená, uvoľnená. Segmentované vajíčka majú štiepne guľôčky (blastoméry) nerovnakej veľkosti, nepravidelný tvar, sú často posunuté na jeden pól. Niekedy existujú abnormálne vajíčka, ktoré sa po vonkajších deformáciách vyvíjajú normálne. U živých lariev škrkaviek je jemná zrnitosť prítomná len v strednej časti tela, ako odumierajú, šíri sa po tele, vznikajú veľké lesklé hyalínové vakuoly, takzvané „perličky“.

Ak chcete zistiť životaschopnosť zrelých vajíčok škrkaviek, vreteníc, škrkaviek, mali by ste zavolať aktívne pohyby larvy miernym zahriatím prípravku (na teplotu nepresahujúcu 37 °C). Vhodnejšie je pozorovať životaschopnosť lariev vretenice a vretenice po ich izolovaní z obalu vajíčka stlačením krycieho sklíčka preparátu pitevnou ihlou alebo pinzetou.

U invazívnych lariev ascaridov je často vidieť čiapočku, ktorá sa na hlavovom konci odlupovala, a u lariev bičíkovcov, ktoré ukončili vývoj vo vajíčku, sa na tomto mieste nachádza pri veľkom zväčšení mandrén. Mŕtve larvy helmintov, bez ohľadu na ich umiestnenie (vo vajíčku alebo mimo neho), si všimnú rozpad tela. V tomto prípade sa vnútorná štruktúra larvy stáva hrudkovitou alebo zrnitou a telo sa stáva zakaleným a nepriehľadným. V tele sa nachádzajú vakuoly a na kutikule sa nachádzajú zlomy.

Životaschopnosť teniidných onkosfér (hovädzí, prasacia pásomnica atď.) je určená pohybom embryí, keď sú vystavené tráviace enzýmy. Vajíčka sú umiestnené na hodinovom sklíčku so psou žalúdočnou šťavou alebo umelou duodenálnou šťavou. Zloženie druhého: pankreatín - 0,5 g, hydrogénuhličitan sodný - 0,09 g, destilovaná voda - 5 ml. Hodinkové sklá s vajíčkami sa umiestnia na 4 hodiny do termostatu pri 36 - 38 °C. V tomto prípade sa živé embryá uvoľnia z membrán. Škrupiny živých onkosfér sa rozpúšťajú aj v okyslenom pepsíne a v alkalický roztok trypsínu po 6-8 hodinách v termostate pri 38 °C.

Ak sa vajíčka teniidných vajíčok vložia do 1 % roztoku sulfidu sodného alebo 20 % roztoku chlórnanu sodného, ​​alebo do 1 % roztoku chlórovej vody s teplotou 36 - 38 °C, zrelé a živé embryá sa uvoľnia zo škrupín a neuvoľnia sa. zmena počas 1 dňa. Nezrelé a mŕtve onkosféry sa scvrkávajú alebo napučiavajú a dramaticky zväčšujú a potom sa „rozpustia“ v priebehu 10 minút až 2 hodín. Živé embryá teniidov sa tiež aktívne pohybujú v zmesi 1% roztoku chloridu sodného, ​​0,5% roztoku hydrogénuhličitanu sodného a žlče pri teplote 36 - 38 ° C.

Životaschopnosť fasciolia adolescariae odobratých z rastlín a iných objektov vodných útvarov sa kontroluje ich skúmaním na podložnom sklíčku vo fyziologickom roztoku pod mikroskopom s vyhrievacím stolíkom. Pri zahrievaní sa larvy motolice v cyste začnú pohybovať.

Na určenie životaschopnosti vajíčok pásomnice pygmy je metóda Ionina N.S. najjednoduchšia: v živých vajíčkach je stredný pár embryonálnych háčikov buď rovnobežný s laterálnymi háčikmi, alebo tieto háčiky zvierajú so základňou uhol menší. ako 45° s mediánom. V mŕtvych vajciach bočné páry zvierajú uhol pri základni so stredným párom viac ako 45 ° alebo sú háčiky náhodne rozptýlené (ich párové usporiadanie sa stráca); niekedy dochádza k vráskaniu embrya, tvorbe zrnitosti. Presnejšia metóda je založená na objavení sa pohybov onkosféry počas prudkej zmeny teploty: od 5 - 10 ° do 38 - 40 ° C.

Stanovenie životaschopnosti nezrelých vajíčok háďatka by sa malo študovať vo vlhkej komore (Petriho misky), pričom vajíčka ascaris sa umiestnia do 3 % roztoku formalínu pripraveného v izotonickom roztoku chloridu sodného pri teplote 24 - 30 °C, vajíčka bičíkovcov sa umiestnia do 3% roztoku kyseliny chlorovodíkovej pri teplote 30 - 35 ° C; vajce červov v izotonickom roztoku chloridu sodného pri 37 °C. Petriho misky by ste mali otvárať 1 - 2 krát týždenne pre lepšie prevzdušnenie a znovu navlhčiť filtračný papier čistá voda.

Pozorovania vývoja vajíčok helmintov sa vykonávajú najmenej 2-krát týždenne. Absencia príznakov vývoja v priebehu 2-3 mesiacov naznačuje ich neživotaschopnosť. Známky vývoja vajíčok helmintov sú najskôr štádiá drvenia, rozdelenie obsahu vajíčka na samostatné blastoméry. Počas prvých dní sa vyvinie až 16 blastomér, ktoré prechádzajú do druhého štádia - morula atď.

Vajíčka húsenice sa pestujú v sklenenom valci (50 cm vysoký a 7 cm v priemere) uzavretom zátkou. Zmes z rovnaké objemy sterilný piesok, drevené uhlie a výkaly s vajíčkami machovky, zriedené vodou na polotekutú konzistenciu, opatrne nalejte na dno valca pomocou sklenenej trubice. Počas 1 - 2 dní usadzovania v tme pri teplote 25 - 30 ° C sa z vajíčok vyliahnu rabditoidné larvy, ktoré sa po 5 - 7 dňoch stanú už filariformnými: larvy vyliezajú po stenách valca, kde sa sú viditeľné aj voľným okom.

Vajíčka trematód, ktoré sa prirodzene vyvíjajú vo vode, ako napríklad opisthorchis, diphyllobothriidy, fascioly a iné, sa umiestnia na hodinové sklíčko, Petriho misku alebo do inej nádoby a nalejú sa malou vrstvou obyčajnej vody. Pri pestovaní vajíčok fascioly treba brať do úvahy, že v tme sa rýchlejšie vyvíjajú, pričom miracidium sa tvorí v živých vajíčkach pri teplote 22–24 °C po 9–12 dňoch. Pri mikroskopii vyvíjajúcich sa vajíčok motolice sú jasne viditeľné pohyby miracidia. Fasciola miracidium vystupuje z vaječných škrupín len na svetle.

Fulleborn metóda. Larvy háčikovca a strongylidov sa kultivujú na agare v Petriho miske so živočíšnym uhlím. Po udržaní v termostate pri teplote 25 – 30 °C počas 5 – 6 hodín sa larvy rozšíria po agare a zanechajú za sebou cestu baktérií.

Metóda Harada a Mori. Do skúmaviek umiestnených na stojane sa pridá 7 ml destilovanej vody. Drevenou tyčinkou odoberte 0,5 g výkalov a urobte rozmazanie na filtračný papier (15 x 150 mm) 5 cm od ľavého okraja (táto operácia sa vykonáva na hárku papiera na ochranu povrchu laboratórneho stola). Potom sa prúžok s náterom vloží do skúmavky tak, aby ľavý koniec voľný od náteru dosiahol dno skúmavky. Horný koniec zakryte kúskom celofánu a pevne ho omotajte gumičkou. Na skúmavku napíšte číslo, názov predmetu. V tomto stave sa skúmavky uchovávajú 8-10 dní pri teplote 28 °C. Na štúdium lariev odstráňte a odstráňte celofánový kryt a odstráňte pásik filtračného papiera pomocou pinzety. V tomto prípade treba byť opatrný, pretože malý počet infekčných lariev sa môže presunúť na horný koniec filtračného papiera alebo na stenu skúmavky a preniknúť pod povrch celofánu.

Rúry sa umiestnia do horúceho vodný kúpeľ pri teplote 50 °C počas 15 minút, potom sa obsah pretrepe a rýchlo naleje do 15 ml skúmavky na sedimentáciu lariev. Po odstredení sa supernatant odstráni a zrazenina sa prenesie na podložné sklíčko, prikryje sa krycím sklíčkom a mikroskopuje sa pri malom zväčšení.

Pre odlišná diagnóza filariformné larvy, musíte použiť údaje v tabuľke 3.

Tabuľka 3

DIFERENCIÁLNA DIAGNOSTIKA FILARIOVANÝCH LARVOYOV A. DUODENALE, N. AMERICANUS, S. STERCORALIS, triCHOStrONGYLUS SP.

Larvy	Rozmery	Charakteristické črty
A. duodenale	Dĺžka tela asi 660 mikrónov, uzáver - 720 nm	Pruhovanie uzáveru je menej výrazné, ústny výbežok menej nápadný, predný koniec tela (nie však uzáver) je tupý, priemer črevnej trubice je menší ako bulbus pažeráka, chvostový koniec je tupý
N. americanus	Dĺžka tela asi 590 μm, uzáver - 660 nm	Pošva je nápadne pruhovaná, najmä v kaudálnej časti tela, ústa sa javia ako tmavé, predný koniec tela (nie však puzdro) je zaoblený ako úzky koniec. kuracie vajce, predná časť črevnej trubice takého priemeru, ako je bulbus pažeráka, koniec chvosta je ostro špicatý
S. stercoralis	Dĺžka tela asi 500 µm	Larva bez pošvy, pažerák má asi polovicu dĺžky tela, chvost je tupý alebo rozvetvený
Trichostrongylus sp.	Dĺžka tela asi 750 mikrónov	Črevný lúmen nie je rovný, ale kľukatý, kaudálny koniec je zaoblený a má tvar gombíka

7.7.2. Metódy farbenia vajíčok a lariev helmintov

Mŕtve tkanivá vo väčšine prípadov vnímajú farby rýchlejšie ako živé. Tieto znaky sa používajú v helmintológii na určenie životaschopnosti vajíčok a lariev helmintov. V niektorých prípadoch sú však niektoré farby lepšie vnímané živými tkanivami ako mŕtvymi.

Na diferenciálne stanovenie živých a mŕtvych vajíčok a lariev sa používajú nasledujúce farby a metódy.

Leukobáza metylénovej modrej sa často používa na farbenie živých a mŕtvych tkanív. živá bunka alebo tkanivo redukuje metylénovú modrú na bezfarebnú leukobázu, mŕtve tkanivo túto schopnosť nemá a preto získava farbu.

Kritériom pre stav vajíčka je zafarbenie embrya, ale nie škrupiny. Táto schopnosť súvisí s podmienkami smrti vajíčka. V prípadoch, keď vláknitá škrupina v mŕtvom vajci nestráca svoje polopriepustné vlastnosti, neprejde farbivami, takže mŕtve embryo nebude zafarbené. Farebné embryo vždy naznačuje smrť vajíčka.

Na farbenie vajec Ascaris môžete použiť metylénovú modrú v roztoku kyseliny mliečnej s lúhom (metylénová modrá 0,05 g, lúh sodný 0,5 g, kyselina mliečna - 15 ml). Živé vajcia nevnímajú farbu; sú maľované v Modrá farba embryá mŕtvych vajíčok. Larvy Ascaris sa farbia zásaditým roztokom brilantno-krezylovej modrej farby v koncentrácii 1:10 000 nasledovne: kvapka tekutiny s vajíčkami ascaris a kvapka roztoku základnej farby sa nanesie na podložné sklíčko. Preparát sa prekryje krycím sklíčkom, ktoré sa ľahkým poklepaním pitevnou ihlou tesne pritlačí na podložné sklo. Pod mikroskopom sa sleduje počet vyliahnutých lariev a stupeň ich sfarbenia; potom sa ten istý liek po 2 až 3 hodinách znova prehodnotí. Za živé sa považujú iba nedeformované larvy, ktoré sa nezafarbili 2 hodiny. Mŕtve larvy buď nevychádzajú z vajíčok, alebo sa farbia, keď sa škrupina zlomí (čiastočne alebo úplne).

Pri určovaní životaschopnosti vajíčok vtákov ascaridia je možné zafarbiť prípravky 5 % alkoholový roztok jód. Keď sa aplikuje na liek, embryá mŕtvych vajíčok ascarid na 1 - 3 sekundy. sú zafarbené na oranžovo.

Mŕtve vajíčka opisthorchis a onkosféry pásomnice hovädzieho dobytka sa zafarbia roztokom toluidínovej modrej (1:1000) a mŕtve onkosféry pásomnice hovädzieho dobytka sa zafarbia roztokom brilantnej a krezylovej modrej (1:10000). Súčasne embryá a škrupiny mŕtvych aj živých vajec získavajú farbu. Preto sa po farbení vajíčka a onkosféry umyjú čistá voda a dodatočne ich zafarbíme safranínom (v riedení 1:10 000 alkoholu 10 °C). Alkohol odstraňuje farbivo zo škrupín a safranín farbí do červena. Výsledkom je, že živé vajcia sčervenajú; vajcia s mŕtvymi embryami - v modrej farbe a škrupina zostáva červená. Mŕtve embryá onkosfér pásomnice hovädzieho dobytka sa rýchlo, v priebehu niekoľkých minút, sfarbia do jasne červenej resp ružová farba safranín alebo modrá briliantovo-kresylová modrá v riedení 1:4000, alebo indigokarmínová v riedení 1:1000 - 1:2000. Živé embryá sa vplyvom týchto farieb nemenia ani po 2 - 7 hodinách.

Na určenie životaschopnosti vajíčok pásomnice trpasličej sa odporúča použiť nasledujúce farby:

1. Brilantná kreasylová modrá (1:8000) - po 1 hodine je onkosféra mŕtvych vajíčok obzvlášť jasne sfarbená, čo ostro vyniká na bledom alebo bezfarebnom pozadí zvyšku vajíčka.

2. Safranín (1:8000 na 2 hodiny a 1:5000 na 3 až 5 hodín).

3. 50% roztok kyseliny pyrogalovej v riedení 1:2 - pri vystavení 1 hodine pri teplote 29 - 30 °C (čím nižšia teplota, tým dlhší je proces farbenia).

7.7.3. Luminiscenčná metóda na štúdium vajíčok a lariev helmintov

Fluorescenčná mikroskopia umožňuje rozlíšiť živé a mŕtve predmety bez poškodenia vajíčka. Nepoužíva sa na fluorescenciu ultrafialové lúče a modrofialová časť viditeľného svetla pomocou bežného mikroskopu a podložných sklíčok; pridajte do iluminátora OI-18 špeciálna sada farebné filtre.

Živé a mŕtve vajíčka škrkaviek, škrkaviek, pásomníc, pásomníc hovädzieho dobytka, pásomníc a iných helmintov luminiscujú odlišne. Tento jav je pozorovaný ako počas primárnej luminiscencie bez použitia farbív, tak aj pri farbení fluorochrómmi (akridínová oranž, korifosfín, primulín, aurolín, berlerín sulfát, tripaflavín, rivanol, chinakrín atď.).

Nesfarbené, živé nesegmentované vajíčka škrkavky žiaria jasnozelenou farbou so žltkastým odtieňom; v mŕtvych vajciach škrupina vyžaruje zelené svetlo oveľa jasnejšie ako tmavozelená zárodočná časť; vo vajíčkach škrkavky s larvou sa objavuje iba škrupina, zatiaľ čo u mŕtvych je škrupina aj larva jasne žltá.

Nepigmentované a nesegmentované živé vajíčka červov a trpasličích pásomníc vyžarujú zelenožlté svetlo, v mŕtvych vajíčkach škrupina intenzívne svetielkuje na pozadí tmavozelenej embryonálnej hmoty.

Pri sekundárnej luminiscencii (pri farbení akridínovou oranžou v riedení 1:10 000 a 1:50 000 od 30 minút do 2 hodín) sa škrupina živých a mŕtvych háďatiek, trematód a cestód odlišne rozsvieti.

Škrupina živých a mŕtvych vajíčok askaridov, toxokarov, škrkaviek, pásomníc, pásomníc potkaních, pásomníc býčích, pásomníc sa sfarbuje do oranžovočervena. Embryá živých vajíčok ascaris, toxascaris, potkanej pásomnice, širokej pásomnice a onkosféry hovädzej pásomnice svetielkujú matnou tmavozelenou, resp. sivozelená. Mŕtve embryá vajíčok týchto helmintov vyžarujú „horiacu“ oranžovo-červenú farbu. Živé larvy a toxocary (vaječné škrupiny) vyžarujú matné sivozelené svetlo, keď uhynú, farba sa zmení z hlavového konca na „horiacu“ svetlozelenú, potom žltú, oranžovú a nakoniec na jasne oranžovú.

Pri farbení fluorochrómami - coryfosfyllum, primulín, mŕtve vajíčka ascaridov a bičíkovcov vykazujú žiaru od lila-žltej po medeno-červenú. Životaschopné vajíčka neluminiscujú, ale sú zafarbené tmavozelená farba.

Živé vajíčka motolice (Paragonimus a Clonorchis) po zafarbení akridínovou oranžovou neluminiscujú a z mŕtvych vajíčok pochádza žltozelená farba.

Na stanovenie životaschopnosti lariev helmintov možno použiť aj luminiscenčnú metódu. Takže fluorochromované roztokom akridínovej oranžovej (1:2000) larvy strongylátu, rhabdita žiaria: živé - zelené (s odtieňom), mŕtve - jasne oranžové svetlo.

Živé miracidiá, ktoré sa vynorili zo škrupiny, vyžarujú tlmené modrasté svetlo so sotva viditeľnými svetložltými korunami rias, ale 10-15 minút po smrti sa javia ako jasné „horiace“ svetlo zelené a potom oranžovo-červené svetlo.

7.7.4. biologická testovacia metóda

Napríklad na stanovenie životaschopnosti vajíčok ascaris (prasiatka ascaris, ľudí, toxocara, toxascaris atď.) na zviera (morčatá, myši) je potrebných aspoň 100 - 300 vajíčok s vyvinutou larvou. Vajíčka Ascaris v izotonickom roztoku chloridu sodného sa pipetujú cez ústa myši alebo morčaťa. Po 6-7 dňoch sa zviera porazí, otvorí a jeho pečeň a pľúca sa oddelene vyšetrí na prítomnosť lariev Ascaris. Na tento účel sa pečeň a pľúca rozrežú na malé kúsky nožnicami a vyšetrí sa podľa Bermanovej alebo Supryagovej metódy (časť 6.1.2).

Ak boli zvieratá infikované živými invazívnymi vajíčkami, potom sa pri pitve v pečeni a pľúcach našli migrujúce larvy ascaris.

V prípade infekcie môžu byť vajíčka Fasciola vo výkaloch laboratórnych zvierat zistené u králikov po 2 mesiacoch, v r. morčatá- po 50 dňoch, u myší - po 35 - 40 dňoch.

Pre rýchlejšiu reakciu sa laboratórne zvieratá otvoria po 20-30 dňoch a pečeň sa vyšetrí na prítomnosť mladých fasciolov.

Na stanovenie životaschopnosti vajíčok pásomnice pygmy sa tiež odporúča kŕmiť nimi predtým neinfikované biele myši, po 92–96 hodinách nasleduje pitva zvierat a detekcia cysticerkoidov v črevných klkoch alebo cestodách v črevnom lúmene.

Na stanovenie životaschopnosti vajíčok opisthorchis sa odporúča metóda (German S.M., Beer S.A., 1984), založená na fyzikálno-chemickej aktivácii liahnej žľazy miracidium a stimulácii motorická aktivita lariev, čo vedie k otvoreniu viečka vajíčka a aktívnemu uvoľneniu miracidia v experimentálnych podmienkach.

Suspenzia vajec opisthorchis vo vode sa vopred ochladí na 10 - 12 ° C (všetky nasledujúce operácie sa vykonávajú pri izbovej teplote 19 - 20 ° C). Do centrifugačnej skúmavky sa pridá 1 kvapka suspenzie obsahujúcej 100-150 vajec. Skúmavka sa umiestni na statív na 5-10 minút. Počas tejto doby majú všetky vajíčka čas klesnúť na dno. Potom sa pomocou prúžku filtračného papiera opatrne odsaje prebytočná voda a do skúmavky sa pridajú 2 kvapky špeciálneho média. Médium sa pripraví v 0,005 M Tris-HCl pufri; Do tlmivého roztoku sa pridá 12 - 13% roztok etanolu a farbivo (purpurová, safranín, eozín, metylénová modrá atď.). Skúmavka sa pretrepe, jej obsah sa prenesie pipetou na podložné sklíčko a nechá sa 10 minút za mierneho pretrepávania. Potom pridajte 2 kvapky uvedeného média. Prípravok je pripravený na mikroskopovanie pod bežným svetelným mikroskopom pri 20-násobnom zväčšení.

Počas tejto doby sa viečko životaschopných lariev otvorí a miracidium aktívne vstupuje do uvedeného média. Kvôli prítomnosti etanolu v ňom sú po 2-5 minútach imobilizované a následne zafarbené farbivom. Môžu byť ľahko detekované a spočítané pod mikroskopom.