Mikroskopické vyšetrenie výkalov. Intravitálna diagnostika helmintiáz

Priame metódy: detekcia samotných helmintov, ich fragmentov, vajíčok, lariev vo výkaloch, moči, sekrécii dvanástnika, spúte, nazálnom a vaginálnom hliene, obsahu subungválnych priestorov, biopsia kúskov tkaniva.

Pri diagnostike nie je možné akoukoľvek metódou identifikovať vajíčka alebo larvy všetkých druhov helmintov, ktoré žijú v ľudskom tráviacom systéme. Pri použití flotačnej metódy teda vajíčka motolice a v niektorých prípadoch neoplodnené vajíčka škrkavky neplávajú do povrchového filmu (kvôli vysokej špecifickej hmotnosti). Vo výkaloch je veľmi zriedkavé nájsť vajíčka červov, teniidné onkosféry, ktoré sa zisťujú špeciálnymi výskumnými metódami: zoškrabanie z perianálnych záhybov pre červy a teniidy, sedimentačné metódy pre motolice (vajcia pistorch atď.). Preto pri cielenom vyšetrení pacienta na helmintiázy by mal lekár v odporúčaní uviesť, ktorým helmintom treba venovať hlavnú pozornosť (diagnostiku), čo umožní laborantovi zvoliť vhodnú techniku ​​na identifikáciu tohto typu helmintov. Výkaly odobraté z rôznych miest výkalov v množstve najmenej 50 gramov (čajová lyžička) v čistej sklenenej miske by mali byť odoslané do laboratória najneskôr jeden deň po defekácii a vyšetrené v deň prijatia.

Ak je potrebné uložiť výkaly do druhého dňa, umiestnite ich na chladné miesto (0-4 ° C) alebo naplňte niektorým z konzervačných látok.

Pred štúdiom sa výkaly zmiešajú s tyčinkou tak, aby boli vajíčka helmintov rovnomerne rozložené v celkovej hmote.

Ak sa v prípravku nájdu vajíčka helmintov, prezeranie sa nezastaví, pretože. môže ísť o dvojitú alebo trojitú inváziu.

Monitorovanie účinnosti liečby helmintiázy sa vykonáva vyšetrením výkalov na vajíčka helmintov 2-3 týždne alebo 2-3 mesiace po liečbe, v závislosti od zisteného helmintu.

Makroskopické metódy sa používajú na odhalenie celých pohlavne dospelých helmintov alebo ich fragmentov vo výkaloch voľným okom alebo ručnou lupou.

Často na povrchu výkalov po defekácii môžete vidieť aktívne lezúce pinworms; vylučuje s výkalmi škrkavka; niekedy si ľudia sami všimnú vypúšťanie helmintov. U pacientov s diphyllobotriázou môžu vyniknúť fragmenty strobily pásomnice (vo forme "rezancov") a u pacientov infikovaných teniidami (bravčová alebo hovädzia pásomnica) segmenty helmintov (vo forme "bielych rezov" ) často opúšťajú výkaly (vo forme „bielych rezov“) alebo aktívne vyliezajú z konečníka.

Makroskopická metóda je hlavnou metódou diferenciálnej diagnostiky teniadózy a teniarhynchózy (v kombinácii s prieskumom).

Zo špeciálnych makroskopických metód sa používa metóda sekvenčného umývania výkalov.

Výkaly sa zmiešajú vo vode, aby sa získala jednotná suspenzia, potom sa pri dobrom osvetlení starostlivo skúmajú v oddelených malých častiach v čiernych fotografických kyvetách alebo na tmavom pozadí v Petriho miskách. Všetky podozrivé biele častice, veľké útvary podozrivé z úlomkov helmintov sa odstránia pomocou pinzety alebo pitevnej ihly a skúmajú sa pod lupou medzi dvoma podložnými sklíčkami. Malé helminty alebo hlavy pásomníc sa skúmajú pod lupou v kvapke glycerínu alebo pod mikroskopom.

Pri použití tejto metódy na diagnostiku segmentov bravčovej, hovädzej pásomnice, širokej pásomnice sa umyté segmenty vložia medzi dva poháre a pri pohľade na svetlo pod lupou alebo pri malom zväčšení mikroskopu sa druh určí podľa stavba maternice (u zrelého segmentu pásomnice bravčovej 8-12 bočných vetiev a u pásomnice býčej 18-32, častejšie 28-32, u širokej pásomnice sú segmenty širšie a maternica je v stred vo forme "rozety"). Ak je maternica zle viditeľná, môže sa najprv nejaký čas držať v 50% roztoku glycerínu, po ktorom sú jasne viditeľné aj opustené maternicové kmene.

Pri určovaní týchto cestód podľa štruktúry odletených hlavičiek sa tieto opatrne vložia hrdlom do kvapky glycerolu medzi podložné sklíčka (alebo sa prekryjú krycím sklíčkom) a bez stláčania sa skúmajú pod mikroskopom pri malom zväčšení.

Mikroskopické metódy rozdelené na jednoduché, zložité a špeciálne.

Medzi jednoduché metódy patrí natívny náter, natívny náter Lugolovým roztokom, hustý náter pod celofánom podľa Kata, krútenie (podľa Shulmana) a perianálne zoškrabovanie.

Komplexné metódy sú efektívnejšie a sú založené na koncentrácii vajec v prípravkoch. Zahŕňajú predbežnú úpravu výkalov tekutými činidlami, v dôsledku čoho sa vajíčka helmintov buď vyzrážajú, alebo plávajú na povrch kvapaliny.

Komplexné metódy zahŕňajú metódy obohatenia:

a) flotácia (keď je špecifická hmotnosť vajec menšia ako špecifická hmotnosť fyziologického roztoku a vajcia plávajú do povrchového filmu);

b) sedimentácia (keď je špecifická hmotnosť vajec väčšia ako špecifická hmotnosť soľných roztokov a vajcia sa usadia v sedimente).

Špeciálnymi metódami na zisťovanie vajíčok a lariev helmintov, cýst a vegetatívnych foriem prvokov sú metódy škrabania, flotácie, sedimentácie, larvoskopia, protozooskopie, štúdium žlče a metódy farbenia náterov výkalov, spúta atď.

Jednoduché metódy na vyšetrenie výkalov

natívny náter. Z rôznych častí podávanej porcie sa drevenou tyčinkou odoberie malá čiastočka exkrementu, dobre sa rozotrie na podložnom sklíčku v kvapke 50% roztoku glycerolu a na 2-3 podložných sklíčkach sa urobí tenký náter. Najmenej 3 preparáty sa skúmajú pod mikroskopom. Nevýhoda metódy: pozerá sa na malé množstvo materiálu, preto sa nepoužíva ako samostatná metóda.

Metóda krútenia(Shulman). 2,0 až 3,0 g výkalov sa umiestni do pohára, dôkladne sa premieša sklenenou tyčinkou s 5-násobným objemom fyziologického roztoku alebo destilovanej vody, pričom sa rýchlo pohybuje 2 až 3 minúty a tyčinka sa rýchlo vyberie zo zmesi. Kvapka zmesi na konci tyčinky sa prenesie na podložné sklíčko a podrobí sa mikroskopii. Princíp odstredivej sily spôsobuje nahromadenie vajíčok a lariev na palici.

Metóda hrubého rozmazania Kato s celofánom. Chemické činidlá: 100% glycerol, 6% roztok fenolu (100 ml vody + 6 g fenolu), 3% roztok malachitovej zelene (2,5 ml destilovanej vody + 75 ml malachitovej zelene).

Príprava pracovného roztoku: 100 ml 6% roztoku fenolu + 100 ml čistého glycerínu + 1,2 ml 3% roztoku malachitovej zelene.

Príprava celofánových prúžkov: narežú sa celofánové prúžky, ktorých veľkosť zodpovedá podložnému sklíčku. Celofán musí byť hydrofilný (vhodný je celofán, ktorý horí, ak sa roztopí, tak je nevhodný). V pracovnom roztoku je možné spracovať až 5 tisíc pásov. Doba expozície celofánových prúžkov, kým sú pripravené na použitie v pracovnom roztoku, je najmenej 24 hodín.

Pokrok vo výskume. 50 mg výkalov (veľkosť veľkého hrášku) sa nanesie na podložné sklíčko, rozotrie sa jednotlivou tyčinkou (sklenená, drevená), prikryje sa celofánovým prúžkom a navrchu sa rozotrie gumenou zátkou, kým sa nedosiahne rovnomerný hustý náter. . Liečivo sa suší pri izbovej teplote hodinu alebo v termostate pri 40°C 20-30 minút a mikroskopicky (dobu expozície možno pri izbovej teplote predĺžiť na 5-6 hodín alebo viac).

Z hľadiska účinnosti sa táto metóda približuje k metóde flotácie, ale odhaľuje intenzívnu a strednú intenzitu invázie.

Používa sa ako nezávislá diagnostická metóda a odporúča sa na hromadné vyšetrenie populácie.

V klinických diagnostických laboratóriách sa používa ako jednotná metóda na diagnostiku helmintov pri absencii špecifických diagnóz v pokynoch lekárov.

Metódy perianálneho škrabania a natívneho náteru Lugolovým roztokom sú popísané v časti o špeciálnych metódach.

Sofistikované metódy obohacovania fekálií

Metódy obohacovania sú založené na rozdiele v špecifickej hmotnosti vajíčok helmintov a použitom soľnom roztoku.

Pri aplikácii flotačnej metódy je možné použiť nasledujúce soľné roztoky:

1. Roztok dusičnanu olovnatého PbNO3 (dusičnan olovnatý) s hustotou 1,5. Pripravené v množstve 650 g látky na 1 liter vody. Soľ sa po častiach rozpustí v horúcej vode v smaltovanej miske, zahrieva sa na sporáku a neustále sa mieša, kým sa úplne nerozpustí. Roztok nie je potrebné filtrovať. Roztok sa pripravuje v deň štúdie, pretože v priebehu času vytvára zrazeninu a jej hustota začína klesať po 24 hodinách. Ak sa roztok pripravuje vo veľkých množstvách, potom sa v nasledujúcich dňoch pred štúdiom zahreje, miešanie zrazeniny. Príprava roztoku sa vykonáva v digestore, pretože dusičnan olovnatý je soľ ťažkých kovov.

2. Roztok dusičnanu amónneho NH4NO3 (granulovaný alebo obyčajný dusičnan amónny) s hustotou 1,3 sa pripraví rovnakým spôsobom ako predchádzajúci, ale v množstve 1500 g látky na 1 liter horúcej vody.

3. Pripraví sa roztok dusičnanu sodného NaNO3 alebo dusičnanu sodného s hustotou 1,38-1,4 v množstve 1000 g látky na 1 liter horúcej vody.

4. Pripraví sa roztok tiosíranu sodného Na2S2O3×5H2O (hyposiričitan sodný) s hustotou 1,4 v množstve 1750 g látky na 1 liter horúcej vody.

5. Pripraví sa roztok síranu sodného Na2SO4 (epsomská soľ) s hustotou 1,26-1,28 v množstve 920 g látky na 1 liter horúcej vody.

6. Pripraví sa roztok chloridu zinočnatého ZnCl2 (chlorid zinočnatý) s hustotou 1,82 v množstve 2000 g látky na 1 liter horúcej vody. Ochladený roztok nekryštalizuje.

7. Nasýtený roztok chloridu sodného NaCl (bežná soľ) s hustotou 1,18-1,2. Na! l vody, po častiach pridajte 400 - 420 g soli do smaltovaného vedra s vriacou vodou za stáleho miešania, kým sa úplne nerozpustí. Ako sa roztok ochladzuje, vyzrážajú sa kryštály chloridu sodného.

Merná hmotnosť flotačných roztokov sa meria aerometrom až po úplnom vychladnutí roztoku pri izbovej teplote.

Flotačné metódy sú najúčinnejšie na detekciu vajíčok pásomnice pygmej, vretenice, hákovca, ascaris a pásomnice širokej.

Povrchovú fóliu je možné odstrániť drôtenou slučkou alebo skleneným sklíčkom.

V nasýtenom roztoku chloridu sodného je možné film skúmať po 30-40 minútach, v roztoku dusičnanu amónneho - po 10-20-30 minútach po usadení.

Pri odstraňovaní filmu pomocou drôtenej slučky sa skúma najmenej 8 kvapiek.

Sklíčka odstránia z filmu viac vajec ako drôtené slučky. Sklo musí byť v kontakte s kvapalinou flotačného roztoku, ktorá sa pridáva do kadičky pomocou pipety. Po usadení sa sklo vyberie, navlhčený povrch sa položí na väčšie sklo a skúma sa pod mikroskopom. Sklíčka musia byť pred použitím odmastené.

Na výskum musíte mať: podložné sklíčka, chemické poháre, drôtené slučky, kyvety, Petriho misky, pipety, hrušky, sklenené alebo drevené varešky.

Pokrok vo výskume. 5 g výkalov sa zaleje 10-násobným množstvom flotačného roztoku (najlepšie so špecifickou hmotnosťou 1,38-1,40), dôkladne sa premieša, nerozpustné veľké častice sa odstránia zhora a suspenzia sa nechá 10-15 minút. Potom sa film odstráni buď pomocou slučky na podložnom sklíčku alebo pomocou podložného skla. Na riedenie výkalov je lepšie vziať poháre s objemom 30-50 ml, naliať roztok zarovnaný s okrajmi (alebo podplniť 2-3 mm) a zmes prikryť podložným sklíčkom a potom pridať flotačný roztok pipetujte, kým sa nedostane do kontaktu so sklíčkom. Po 10-20 minútach sa sklo rýchlo vyberie a film, ktorý na ňom zostane, sa mikroskopicky skenuje bez krycieho skla.

Usadzovacie-sedimentačné metódy

Sedimentačné metódy sa používajú na detekciu vajíčok geohelmintov, biohelmintov vo výkaloch a ako špeciálne metódy výskumu opisthorchiázy.

Goryachev-Zolotukhin metóda(zjednodušená Gorjačovova metóda). Asi 1,5 g výkalov sa rozmieša v chemickom pohári v 3-4 ml vody. Výsledná suspenzia sa prefiltruje cez dve vrstvy gázy do centrifugačnej skúmavky, pričom sa opatrne navrství na vrch 4 až 5 ml nasýteného roztoku chloridu sodného, ​​ktorý je v nej prítomný. Skúmavky sa umiestnia do stojana na 15-20 hodín.Počas tejto doby sa usadia ťažké vajíčka motolice. Získajte dve jasne ohraničené vrstvy. Sediment sa mikroskopicky skúma.

Éter-formalínová metóda. Používa sa na diagnostiku všetkých črevných invázií a ako špeciálna metóda pre vajíčka prvokov a opisthorchií.

Vybavenie: odstredivka pri 3000 ot./min.; odstredivkové odmerné skúmavky, lieviky; kovové sitko (čaj) alebo dvojvrstvový obväz; Podložné sklíčka a krycie sklíčka; drevené (alebo sklenené) palice; bavlna, obväz.

Chemické činidlá: 10 % roztok formalínu (1 diel farmaceutického roztoku formalínu a 4 diely destilovanej vody); etyléter (lekársky).

7 ml 10% roztoku formalínu sa naleje do centrifugačných skúmaviek a umiestni sa 1 g výkalov (také množstvo výkalov, že roztok v skúmavke stúpne na 8 ml). Výkaly sa miešajú s formalínom, kým sa nevytvorí homogénna zmes, a potom sa prelejú cez kovové sitko (alebo dvojvrstvovú gázu, obväz) do ďalšej skúmavky odstredivky (ak na sitku zostanú výkaly, treba sitko prepláchnuť formalínom). Do tejto centrifugačnej skúmavky pridajte 2 ml éteru, zazátkujte a 30 sekúnd intenzívne pretrepávajte.

Zmes sa centrifuguje pri 3000 otáčkach za minútu počas jednej minúty (možné dve minúty pri 1500 otáčkach za minútu). V dôsledku reakcie éter-formalínu dochádza ku koagulácii proteínov vo forme korku na vrchu skúmavky a k vyzrážaniu vajíčok helmintov. Vrstva koagulantu sa odstráni, supernatant sa vypustí, zrazenina sa nanesie na podložné sklíčko priamo zo skúmavky alebo Pasteurovou pipetou, prekryje sa krycím sklíčkom a prezrie sa pod mikroskopom.

Metóda zrážania éterom a octom. Princípom éterovo-octového zrážania vajíčok helmintov je postupné ošetrenie vzoriek výkalov 10 % vodným roztokom kyseliny octovej a éteru. Kyselina octová emulguje vzorku stolice lepšie ako iné chemické zlúčeniny. Preniká do nestrávených častíc, pozostávajúcich hlavne z vlákniny, ktorá pri vysokom obsahu narúša výskum, vyzráža sa po odstredení. Následné pridanie éteru do skúmavky a miešanie vedie k extrakcii kyseliny octovej z obsahu skúmavky spolu s fekálnymi časticami, ktoré sú ňou impregnované. Keďže špecifická hmotnosť zmesi éteru a kyseliny octovej je menšia ako merná hmotnosť vody, vzorky stolice ošetrené týmito látkami sa vznášajú a vajíčka helmintov, ktoré majú veľkú špecifickú hmotnosť, sa usadia.

Množstvo zrazeniny získané po vyzrážaní éterom a octom je 3 až 4-krát menšie ako po vyzrážaní éterom a formalínom. To značne uľahčuje detekciu vajíčok helmintov v ňom a umožňuje študovať sediment ako celok so vzorkou 0,5-1 g Toxicita éterovo-octovej metódy je 5-krát nižšia.

Pokrok vo výskume. 7 ml 10 % roztoku kyseliny octovej sa naleje do odstredivej skúmavky a pridá sa 1 g vzorky stolice (t. j. také množstvo stolice, pri ktorom roztok kyseliny octovej stúpne na 8 ml). Dôkladne premiešajte pohárom alebo drevenou vareškou. Preceďte cez lievik s dvoma vrstvami gázy do inej centrifugačnej skúmavky. K emulzátu sa pridajú 2 ml etyléteru (t.j. do 10 ml). Skúmavky sa uzavrú gumovou zátkou (je možné z injekčnej liekovky s penicilínom) a pretrepávajú sa 15 sekúnd. Po odstránení zátky sa skúmavky odstreďujú jednu minútu pri 3000 otáčkach za minútu počas 2 minút. Supernatant sa zo skúmavky odstráni. V niektorých prípadoch vytvorená fekálna zátka interferuje s výtokom supernatantu. V tomto prípade sa korok oddelí od stien skúmavky sklenenou alebo drevenou tyčou. Celá zrazenina sa napipetuje na podložné sklíčko a pod krycím sklíčkom sa pri malom zväčšení podrobí mikroskopii. Zrazenina je zvyčajne malá a bezfarebná. Vajíčka hlíst, najmä malých motolíc, sú dobre detekované.

Chemická sedimentačná metóda. Princíp štúdie je založený na sedimentácii vajíčok zo vzorky stolice vo fyziologickom roztoku so špecifickou hmotnosťou 1,15. Podstata metódy spočíva v priamom odstreďovaní skúmavky, pri ktorej sa zátka stolice emulgovaná v 1% roztoku kyseliny octovej navrství na roztok dusičnanu sodného (hmotnosť 1,16). Vysoká merná hmotnosť soľného roztoku a bublinky uvoľnené chemickou reakciou, prenikajúce vrstvou homogenizovaných výkalov, zabraňujú jeho sedimentácii. Vajíčka helmintov sa vyzrážajú s malým množstvom vlákniny. Sediment možno vyčistiť od zvyškov detritu tak, že sa naň pôsobí 10 % kyselinou octovou a éterom. V tomto prípade zostáva iba jedno helmintové vajíčko, čo značne uľahčuje ich identifikáciu.

Pokrok vo výskume. 6 ml roztoku dusičnanu sodného so špecifickou hmotnosťou 1,15 sa naleje do odmernej centrifugačnej skúmavky. Do ďalšej skúmavky nalejte 7 ml 1% roztoku kyseliny octovej. Zavedie sa vzorka výkalov (až po značku 7,5 ml pre vzorku 0,5 g a do 8 ml pre vzorku 1,0 g). Vzorku dôkladne premiešajte sklenenou tyčinkou. Precedíme cez lievik s jednou vrstvou gázy a navrstvíme na roztok dusičnanu sodného. Skúmavka s vrstveným filtrátom sa 5 minút odstreďuje pri 1500-2000 ot./min. Zlikvidujte supernatant rýchlym prevrátením skúmavky. Do skúmavky so zrazeninou pridajte 3-4 ml 10% roztoku kyseliny octovej a 0,5 ml éteru, uzatvorte gumovou zátkou a pretrepte. Opakujte centrifugáciu počas 1 minúty. Zlikvidujte supernatant. Zrazenina sa prenesie na podložné sklíčko, prikryje sa krycím sklíčkom a skúma sa pod mikroskopom.

HELMINTOLOGICKÉ ŠTÚDIE ŽĽUČKY, OBSAHU DUODENÁLNEHO, spúta, KRVI, MOČU A SVALOV

Detekcia vajíčok a lariev helmintov v obsahu dvanástnika a žlči. Štúdium obsahu žlče a dvanástnika sa vykonáva s podozrením na helmintiázy pečene a žlčníka (opistorchiáza, klonorchiáza, dikroceliáza) a dvanástnika (strongyloidóza).

Pokrok vo výskume. Duodenálny obsah a žlč (časti A, B, C) sa získajú obvyklým spôsobom pomocou sondovania. Pre časť B sa odporúča získať reflex žlčníka zavedením 33 % roztoku síranu horečnatého cez sondu. Zo skúmanej kvapaliny sa vyberú vločky plávajúce v nej a prezerajú sa pod mikroskopom a potom sa zmiešajú s rovnakým množstvom éteru síry. Zmes sa dôkladne pretrepe a odstredí. Supernatant sa odstráni a celá zrazenina sa skúma pod mikroskopom.

Pri absencii hnisu a hlienu sa obsah žlče a dvanástnika odstredí bez zmiešania s éterom.

Vyšetrenie spúta. V helmintologickej praxi sa vyšetrenie spúta vykonáva na laboratórnu diagnostiku paragonimiázy. Niekedy sa zistia vajíčka schistosome, larvy ascaris, prvky echinokokového močového mechúra.

Zo spúta sa pripraví natívny náter na podložnom sklíčku, ktorý sa skúma pod mikroskopom.

S bohatým obsahom hnisu v spúte sa zmieša s 0,5% roztokom hydroxidu sodného alebo hydroxidu draselného, ​​pretrepáva sa 5 minút a odstredí sa. Sediment sa mikroskopicky skúma.

Štúdia krvi. Krv sa vyšetruje, ak má pacient podozrenie na filariózu.

Vzhľadom na to, že pri niektorých typoch filarióz (loaóza, wuchererióza spôsobená subperiodickým kmeňom) sú larvy (mikrofilárie) v periférnej krvi len počas dňa a pri niektorých (brugiaza, wuchererióza spôsobená periodickým kmeňom) iba v noci, respektíve v tomto čase odobrať krv na rozbor.

Technika odberu krvi, príprava preparátov (tenký náter a hrubá kvapka), ich farbenie (podľa Romanovského) a štúdia sú podobné ako pri laboratórnej diagnostike malárie.

Mikrofilárie rôznych druhov sa vyznačujú dĺžkou, šírkou, zakrivením tela, prítomnosťou alebo absenciou uzáveru, tvarom chvostového konca, umiestnením jadrovej substancie v tele a chvostovou oblasťou lariev.

Pokrok vo výskume. Moč sa usadzuje najmenej 30 minút, potom sa vrchná vrstva scedí, pričom zostane 10 – 15 ml sedimentu, ktorý sa naleje do centrifugačných skúmaviek a odstreďuje 1 – 2 minúty. Po vypustení supernatantu sa zrazenina prenesie na podložné sklíčko a skúma sa pod mikroskopom.

ŠTÚDIA SVALOVEJ BIOPTY

Trichinoskopická metóda. Potreba štúdia bioptických vzoriek svalov pacienta vzniká pri podozrení na trichinelózu.

Biopsia sa vykonáva podľa všeobecných pravidiel. Z deltového svalu sa zvyčajne robí biopsia. Pri patoanatomickom vyšetrení je možné urobiť biopsiu svalov bránice, pažeráka, jazyka, žuvacích a medzirebrových svalov, ohýbačov končatín, svalov očnej buľvy, keďže sú larvami Trichinella najviac postihnuté.

V laboratóriu sa bioptovaný kúsok svalu rozreže na veľmi malé kúsky (mikrotóm), ktoré sa vložia medzi dva poháre, rozdrvia svalové vlákna a vyšetrí sa pod mikroskopom. V súčasnosti sa na tento účel široko používajú špeciálne mikroskopy, trichineloskopy.

V prípade trichinelózy trichinoskopia pozdĺž svalových vlákien odhalí ostro vystupujúce kapsuly trichinelózy oválneho tvaru (podobné citrónu). Priemerná veľkosť ľudských kapsúl je 0,4 x 0,26 mm. Kapsula spravidla obsahuje jednu trichinelu špirálovito zloženú do 2,5 závitu. Pri vysokej intenzite invázie môže jedna kapsula obsahovať 2 alebo 3 larvy. Svalové vlákna susediace s kapsulou strácajú svoje priečne pruhovanie a nadobúdajú homogénny vzhľad.

Rovnakým spôsobom sa skúma mäso alebo mäsové výrobky, ktoré infekciu spôsobili.

Metóda trávenia svalov. Metóda je efektívnejšia.

Pokrok vo výskume. Študované svaly sú jemne nasekané a naplnené umelou žalúdočnou šťavou v pomere 1:15-20. Výsledná zmes sa umiestni na 12-16 hodín do termostatu pri 37°C.Po uplynutí tejto doby sa mikroskopicky skúma sediment, v ktorom sa medzi masou zvyškov natrávených svalových vlákien nachádzajú voľné larvy Trichinella.

Umelá žalúdočná šťava sa dá kúpiť v lekárni alebo pripraviť v laboratóriu. Za týmto účelom pridajte 10 ml koncentrovanej kyseliny chlorovodíkovej do 1 litra destilovanej vody; pred použitím sa do 1 litra zriedenej kys. pridá 30 g pepsínu.

KVANTITATÍVNE VÝSKUMNÉ METÓDY

Kvantitatívne metódy výskumu sa využívajú pri zisťovaní intenzity invázie, hodnotení účinnosti rôznych antihelmintík, zisťovaní kvality odčervenia, sledovaní prebiehajúcich hromadných liečebno-preventívnych opatrení a pod.

Kvantitatívne stanovenie vajíčok helmintov sa uskutočňuje dvoma metódami: metódou Stoll a metódou Krasilnikova a Volkovej (1974).

Stollova metóda. Na vykonanie štúdie musíte mať mikroskop, sklenenú banku s označením 56 a 60 ml, odmerný valec, sklenené guľôčky, gumenú zátku do banky, odmerné pipety, podložné sklíčka a 0,4 % roztok hydroxidu sodného.

Pokrok vo výskume. Do banky s odmerným valcom nalejte desaťnormálny roztok hydroxidu sodného (koncentrácia približne 0,4 %) až po značku 56 ml a pridávajte výkaly, kým hladina tekutiny nedosiahne značku 60 ml (t. j. 4 ml výkalov). Zmes sa dôkladne pretrepáva so sklenenými guľôčkami po dobu 1 minúty, pričom nádoba sa uzatvorí gumovou zátkou (môžete miešať aj tyčinkou). Ihneď po pretrepaní sa 0,075 ml zmesi odoberie odmernou pipetou (obsahuje 0,005 ml výkalov), prenesie sa na podložné sklíčko a pod mikroskopom sa spočíta počet vajíčok v prípravku. Na určenie počtu vajíčok v 1 g výkalov sa nájdený počet vynásobí 200.

Porovnanie počtu vajíčok v prípravku, zistených u pacienta pred a po liečbe, nám umožňuje posúdiť účinnosť odčervenia.

Stollova metóda je jednoduchá, dáva porovnateľné výsledky pri všetkých helmintiázach, ktorých patogény systematicky vylučujú vajíčka do pacientových čriev. Nevýhodou metódy je však jej relatívne nízka citlivosť, najmä pri nízkej intenzite invázie.

Krasilnikov-Volkova metóda. Pri skúmaní tejto metódy sa minimálne 1 g výkalov zmieša v sklenenej banke alebo veľkej skúmavke s 1% roztokom Lotus (alebo 1,5% roztokom Extra) v pomere 1:10. Suspenzia sa dôkladne pretrepáva, kým sa nevytvorí homogénna suspenzia, potom sa rýchlo odoberie 0,1 ml suspenzie (zodpovedá 0,01 g stolice) pomocou odmernej pipety a prenesie sa na podložné sklíčko. Prípravok sa prikryje krycím sklom alebo celofánovou platňou (20 x 30 mm), nechá sa vyzrieť aspoň jeden deň v 50 % vodnom roztoku glycerolu.

Spočítajte počet vajec v celej príprave. Na výpočet počtu vajec v 1 g výkalov je potrebné výsledné číslo vynásobiť 100.

Táto metóda má oproti Stollovej metóde množstvo výhod. Po prvé, je citlivejší a umožňuje odhaliť helminty s nízkym stupňom invázie. Po druhé, je to veľmi výhodné pre hromadné skúšky, pretože roztoky detergentov, ktoré sú konzervačnými látkami pre vajíčka helmintov, umožňujú vykonávať štúdie nie celkom čerstvého materiálu. Predpokladom na to je však zber fekálií priamo do čistiaceho roztoku.

Pre kvantitatívny výskum možno použiť ktorúkoľvek z opísaných jednotných kvalitatívnych metód založených na princípe plávajúcich vajec. Ale v tomto prípade by sa na analýzu malo odobrať rovnaké množstvo výkalov, rovnaký objem flotačného roztoku. Stupeň invázie je možné vypočítať s vedomím počtu vajíčok v 1 g výkalov podľa nižšie uvedenej tabuľky.

Intenzita invázie v závislosti od počtu vajíčok helmintov

v 1 g výkalov

SÉROLOGICKÁ DIAGNOSTIKA

Tieto metódy, založené na detekcii špecifických protilátok v krvnom sére, sa používajú na diagnostické a skríningové účely.

Sérologické metódy zahŕňajú:

kruhová precipitačná reakcia (RCP) (trichinóza, cysticerkóza);

Reakcia zrážania krúžku v skúmavkách v chlade (trichinóza, cysticerkóza);

Reakcia mikroprecipitácie na živých larvách (trichinóza, askarióza);

Reakcia nepriamej hemaglutinácie (RIHA) (trichinóza, echinokokóza, alveokokóza, cysticerkóza atď.);

Latexová aglutinačná reakcia (RAL) (echinokokóza, alveokokóza, trichinelóza, teniarinhoz atď.);

Reakcia fixácie komplementu (RCC) (trichinóza, echinokokóza, cysticerkóza);

Reakcia enzýmom značených protilátok (REMA) (echinokokóza, onchocerciáza, schistosomiáza, trichinelóza, toxokaróza);

ELISA (trichinóza, opisthorchiáza, toxokaróza, toxoplazmóza atď.).

Na nastavenie sérologických reakcií sa vyrábajú štandardné antigény alebo sa pripravujú nezávisle (napr. z echinokokových mechúrov oviec), vyrábajú sa špeciálne testovacie systémy pre ELISA.

Špeciálne metódy výskumu enterobiázy, teniarinhoz, teniázy

Škrabanie z perianálnych záhybov. Na získanie škrabancov z perianálnych záhybov môžete použiť drevenú špachtľu, celofánový pásik, celulózový papier alebo pásku, tyčinky na oči so špeciálnou lepiacou vrstvou:

a) škrabanie drevenou špachtľou (špachtľa je sploštená zápalka alebo palica) navlhčenou 1% roztokom glycerínu (alebo 0,5% roztokom sódy bikarbóny) sa vykonáva ľahkým zoškrabávaním z povrchu perianálnych záhybov okolo celého obvod konečníka. Výsledný zoškrab sa prenesie okrajom krycieho sklíčka z konca špachtle na podložné sklíčko v kvapke 50 % roztoku glycerolu, prekryje sa rovnakým krycím sklíčkom a podrobí sa mikroskopii. Nevýhodou metódy je nedostatok detekcie vajec a dráždivý účinok;

b) podľa Torgushinovej metódy sa premyje vatovým tampónom na drevenej alebo inej špachtli navlhčenej 50 % roztokom glycerínu a na podložnom sklíčku sa pripraví náter v kvapke glycerínu;

c) podľa metódy Kevorkovej sa do centrifugačnej skúmavky naleje asi 5 ml prevarenej vody, do nej sa vloží špachtľa (tyčinka) s vatovým tampónom. Pred odberom materiálu sa tampón mierne pritlačí k vnútornej stene skúmavky, utrie sa ním perianálne záhyby a špachtľa s tampónom sa vloží do skúmavky. Tampón v skúmavke sa dôkladne pretrepe, premývacia kvapalina sa odstreďuje 3 minúty a výsledná zrazenina sa skúma pod mikroskopom;

d) zoškrabanie lepiacou páskou podľa Grahama. Kúsok lepiacej pásky (priehľadná polyetylénová páska s lepiacou vrstvou pre detskú kreativitu, ale je lepšie použiť operačnú fóliu LPO-1, LPO-2) v dĺžke 8-10 cm sa lepiacou vrstvou nalepí na perianálne záhyby kože, držte ju za konce a potom sa preniesli na predmetné sklo lepivou vrstvou nadol (konce pásky, ktoré presahujú okraje skla, sú odrezané), okuliare sú očíslované a údaje o pacientovi a číslo pohára sa zaznamená do denníka. V laboratóriu sa páska na jednom konci na veľkú vzdialenosť odlepí, nakvapká sa pod ňu 1-2 kvapky vazelínového oleja alebo glycerínu (na odstránenie optických defektov) a mikroskopuje sa;

e) škrabanie sklenenými očnými tyčinkami, ktorých povrch je potiahnutý špeciálnou lepiacou kompozíciou. Očné tyčinky sú inštalované v špeciálnom statíve. Materiál sa odoberá kontaktom plochej časti špachtle na kožu perianálneho otvoru. Potom je tyč opäť upevnená v statíve na prepravu. Mikroskopia sa vykonáva priamo na špachtli na oboch stranách (bez sklíčok a krycích sklíčok) s predbežným upevnením v kazetách pri malom zväčšení (okulár x 10, objektív x 8). Na konci práce sa tyčinky dezinfikujú varením v mydlovom roztoku a statív a kazety sa ošetria alkoholom a umyjú sa mydlovým roztokom sódy. Zloženie lepidla: cleol - 10 g, ricínový olej - 2,5 g, etyléter - 5 g, etylalkohol 96% - 2,5 g.

Špachtle sa ponoria do roztoku lepidla a potom sa sušia na vzduchu pri izbovej teplote. Priľnavý film vytvorený na povrchu zostáva niekoľko dní.

Metóda je vhodná na hromadné vyšetrenie detskej populácie na enterobiózu a dospelej populácie na tenidózy.

Okrem metódy škrabania pri teniarhynchóze a teniáze sa používa aj metóda prieskumu a makroskopická metóda opísaná vyššie (pri detekcii segmentov).

Špeciálne metódy výskumu strongyloidózy

Éterovo-octová metóda sa používa na detekciu vajíčok (pozri vyššie) a Bermanova metóda na detekciu lariev v stolici.

Bermanova metóda. Preskúmajte čerstvé výkaly, lepšie po užití preháňadla. Vzorka trusu s hmotnosťou 5 g sa umiestni na kovové sito (sieťka je vo vnútri vystlaná dvoma vrstvami gázy) v sklenenom lieviku upevnenom na statíve. Na spodný koniec lievika sa nasadí gumená hadička so svorkou (Bermanov prístroj).

Sieťka s výkalmi sa zdvihne a do lievika sa naleje voda zohriata na 40-50 °C tak, aby spodná časť sieťky bola ponorená do vody a výkaly boli úplne pokryté vodou. Po 2-4 hodinách sa svorka na gumenej trubici rýchlo otvorí a kvapalina klesne do odstredivkovej trubice. Po odstredení (1-2 min.) sa vrchná časť kvapaliny rýchlo scedí a zrazenina v množstve 1 ml sa nanesie v tenkej vrstve na podložné sklíčko a mikroskopicky pri malom zväčšení mikroskopu.

Metóda IMP a TM. Časť výkalov veľkosti orecha sa umiestni do chemickej kadičky, naleje sa teplým 40 ° C fyziologickým roztokom tak, aby sa výkaly pokryli roztokom, nechá sa 20 minút. Po 20 minútach sa kvapalina naleje do Petriho misky a pozoruje sa pod MBS binokulárnym mikroskopom.

Na diagnostiku strongyloidózy, najmä na sledovanie účinnosti liečby, sa odporúča kombinovať Bermanovu metódu so štúdiom duodenálneho obsahu.

Špeciálne metódy výskumu nematodózy

Nematózy

Ascariáza

V anamnéze sa upriamuje pozornosť na postoj k záhradníctvu, záhradkárstvu. Jesť surovú zeleninu, šaláty z tejto zeleniny.

Klinické prejavy počiatočnej fázy askariózy sú dôsledkom alergických zmien v tele. Skoré alebo migrujúce larválne štádium askariózy sa často vyskytuje v prítomnosti horúčky s telesnou teplotou do 38 ° a vyššou, s komplexom symptómov poškodenia pľúc a s prítomnosťou závažnej krvnej eozinofílie. Vo väčšine prípadov sú u detí prvými príznakmi ochorenia malátnosť, slabosť, opakujúce sa bolesti hlavy, potenie, niekedy aj bolesti svalov a kĺbov. Často sa vyskytuje hojná vyrážka typu urtikárie so závažným alebo stredne závažným svrbením. Diagnózu včasnej fázy potvrdzujú röntgenové štúdie na prítomnosť prchavých eozinofilných Lefflerových infiltrátov v pľúcach. Nátery z čerstvého spúta často ukazujú eozinofilné bunky, červené krvinky, Charcot-Leidenove kryštály a larvy ascaris.

V črevnom imaginárnom štádiu askariózy dochádza ku kombinácii prejavov z gastrointestinálneho a astenického syndrómu, symptómov enterokolitickej bolesti. U detí často dochádza k poklesu hmotnosti, niekedy aj dosť výrazne. Nevoľnosť, zvýšené slinenie, podráždenosť, oneskorený psychomotorický vývoj, znížená inteligencia.

Na laboratórnu diagnostiku črevnej st

Najjednoduchšie sú rozdelené do 4 tried:

Pri encystácii získa mikroorganizmus zaoblený tvar a pokryje sa ochranným plášťom. Vo forme cysty sa prvoky stávajú menej náchylnými na nepriaznivé faktory prostredia.

Výskum môže zahŕňať:

Poznámka:Existuje veľa druhov diagnostiky, zvážime tie typy, ktoré sú najbežnejšie v klinickej laboratórnej praxi.

Súkromné ​​typy diagnostiky

V každom konkrétnom prípade má laborant za úlohu nájsť konkrétny patogén, niekedy sa spolu s hlavným nájdu aj iné.

V ľudskom čreve je schopných žiť 6 druhov tohto mikroorganizmu. Klinický význam má len améba dyzentérie, ktorá sa vyskytuje vo vegetatívnej forme a vo forme cýst.

Okrem toho sa používajú imunologické metódy:

• nepriama imunofluorescencia;
• nepriama aglutinácia (PHA);
• radiálna imunodifúzia.

Poznámka: sérologické metódy sú neinformatívne a používajú sa len ako doplnok k hlavným v pochybných prípadoch.

Diagnóza mihalníc (ciliates)

Patogénnou formou mikroorganizmov tohto rodu je balantidia. Ide o mikrób, ktorý spôsobuje balantidiázu - ochorenie sprevádzané ulceróznym procesom hrubého čreva. Príčinný činiteľ sa nachádza v natívnom nátere vo forme vegetatívnej formy a cysty. Materiál na náter (výkaly a hlien) sa odoberie počas sigmoidoskopického vyšetrenia a vysieva sa na špeciálne médiá.

Diagnostika bičíkovcov (leishmánia, giardia, trypanozómy, trichomonády)

Leishmania, trypanosoma, giardia, trichomonády sú pre človeka nebezpečné.

Leishmania- mikróby, ktoré spôsobujú leishmaniózu, sa vyšetrujú v krvných náteroch, materiáloch kostnej drene, zoškraboch z kožných infiltrátov. V niektorých prípadoch sa pri diagnostike Leishmania používa výsev na živných pôdach.

trypanozómy- Pôvodcovia spavej choroby (americká/africká trypanozomiáza alebo Chagasova choroba).

Africký variant je určený v počiatočnom období pri štúdiu periférnej krvi. Patologické mikróby počas progresie ochorenia sa nachádzajú v materiáli punkcií lymfatických uzlín, v pokročilých štádiách - v cerebrospinálnej tekutine.

Na diagnostiku trypanozómov v prípade podozrenia na Chagasovu chorobu sa testovaný materiál skúma pod mikroskopom pri malom zväčšení. V tomto prípade sú šmuhy a hustá kvapka vopred zafarbené.

Trichomonas(črevné, orálne,) sa zisťujú mikroskopiou materiálov odobratých z postihnutých slizníc.

Identifikácia sporozoanov (malarické plazmodium, pôvodca kokcidózy atď.)

Najbežnejším a najnebezpečnejším druhom pre ľudí je malarické plazmodium, ktoré má 4 hlavné odrody patogénu: pôvodcu trojdňovej malárie, štvordňovej malárie, tropickej malárie a oválnej malárie.

Sexuálny vývoj Plasmodium (sporogónia) prebieha u komárov rodu Anopheles. Asexuálna (schizogónia tkanív a erytrocytov) - v tkanive pečene a ľudských erytrocytoch. Tieto vlastnosti životného cyklu sa musia brať do úvahy pri diagnostike malarického plazmódia.

Takže v krvi čerstvo chorého pacienta možno nájsť zárodočné bunky sporogónneho cyklu. Ale na vrchole malarických záchvatov sa schizonty objavujú vo veľkom počte v krvi.

Okrem toho sa v rôznych fázach malarickej horúčky objavujú rôzne formy plazmódia:

• v období chladu je krv naplnená merozoitmi, akýmsi schizontom;
• vo výške teploty sa v erytrocytoch hromadia prstencové trofozoity;
• pokles teploty je charakterizovaný prevahou améboidných trofozoitov;
• počas obdobia normálneho stavu krv obsahuje dospelé formy schizontov.

Štúdium pôvodcu malárie (malarické plazmodium) sa uskutočňuje v nátere a v hustej kvapke.

Poznámka:diagnóza malárie pri štúdiu náterov a hustých krvných kvapiek je niekedy chybná. Krvné doštičky môžu byť v niektorých prípadoch chybne klasifikované ako malarický patogén. Tiež fragmenty leukocytov a iných buniek niekedy simulujú plazmodium.

Základné metódy výskumu prvokov

Poďme sa v krátkosti pozrieť na najčastejšie metódy výskumu prítomnosti prvokov.

Diagnostika prvokov pomocou natívneho náteru a náteru zafarbeného Lugolovým roztokom (vo výkaloch)

Liečivo sa pripravuje z emulzie výkalov v izotonickom roztoku. Na podložné sklíčko sa nanesú dve kvapky chloridu sodného a Lugolovho roztoku. Testovaný materiál sa pridá k obom kompozíciám drevenou tyčinkou a po prekrytí sklom sa pozoruje pri rôznych rozlíšeniach mikroskopu.

Podľa určitých znakov sú nájdené prvoky registrované. Pre presnosť sú pripravené 2-3 prípravky z jedného materiálu. V pochybných prípadoch sa analýza opakuje niekoľkokrát počas 2-3 týždňov.

Metóda môže odhaliť vegetatívne a cystické formy:

• lamblia;
• balantidia;
• dyzentéria améba.

Spolu s patogénnymi formami sa určujú aj nepatogénne prvoky. Zdraví nosiči majú tiež luminálnu a cystickú formu.

Dôležité:výskum, aby sa predišlo nepresnostiam a chybám, by sa mal vykonávať opakovane.

Výsledok diagnostiky prvokov metódou natívneho a farbeného náteru by mal obsahovať popis formy patogénu (priesvitný, cysta, tkanivo).

Požiadavky na výskum:

• materiál odobratý na analýzu (tekuté výkaly) sa vyšetrí najneskôr 30 minút po defekácii;
• vytvorené výkaly musia byť diagnostikované do 2 hodín po defekácii;
• materiál by nemal obsahovať nečistoty (dezinfekčné prostriedky, voda, moč);
• na prácu s materiálom sa používajú iba drevené palice, sklenené nie sú vhodné kvôli skĺznutiu hlienu;
• Tyčinky je potrebné ihneď po použití spáliť.

Konzervačná metóda (vyšetrenie trusu) pri diagnostike prvokov

Štúdia sa uskutočňuje fixáciou prvokov pomocou konzervačnej látky. Rozdiel medzi touto metódou a predchádzajúcou je v tom, že konzervačné látky vám umožňujú dlhodobo uchovávať liek.

Použité konzervačné látky:

• Barrow. Obsahuje konzervačné zložky: 0,7 ml chloridu sodného, ​​5 ml formalínu, 12,5 ml 96% alkoholu, 2 g fenolu a 100 ml destilovanej vody. Farbiace zloženie: 0,01% roztok tionínu (azúrový).
• Safarlievovo riešenie. Zloženie: 1,65 g síranu zinočnatého, 10 ml formalínu, 2,5 g kryštalického fenolu, 5 ml kyseliny octovej, 0,2 g metylénovej modrej, 100 ml vody. Tento konzervačný prostriedok sa používa v prípadoch, keď sa materiál musí skladovať dlhšie ako mesiac.

Prázdne fľaše sa naplnia konzervačným prostriedkom, materiál sa do nich prenesie v pomere 3: 1, potom sa v prípade potreby pridá farbivo. Vyhodnotenie výsledkov sa uskutočňuje v štúdii 2-3 liekov.

Metóda obohatenia formalínom a éterom (analýza prítomnosti prvokov vo výkaloch)

Táto diagnostická metóda umožňuje oddeliť a koncentrovať cysty prvokov. Na analýzu sú potrebné tieto zložky: formalín (10 ml), 0,85 g izotonického roztoku, destilovaná voda, éter sírový, Lugolov roztok.

Zmes biomateriálu s uvedenými kvapalinami sa zmieša a odstredí. Zrazenina získaná na dne skúmavky sa zafarbí Lugolovým roztokom a skúma sa na prítomnosť cýst a vegetatívnych foriem.

Metóda detekcie Leishmania (náter z kostnej drene)

Na diagnostiku leishmaniózy sa používajú činidlá: zmes Nikiforov (éter síry a etylalkohol), fosfátový pufor, Azur-eozín podľa Romanovského.

Látka kostnej drene sa po špeciálnej príprave veľmi opatrne umiestni na podložné sklo. Používa sa mikroskop s imerzným systémom.

V akútnom období ochorenia sa v punktáte nachádza veľké množstvo Leishmania.

Poznámka:niekedy krvinky môžu pripomínať liečenú leishmániu, preto je veľmi dôležité, aby bol laboratórny technik pozorný a mal dostatok skúseností na samostatné štúdium.

Metóda detekcie leishmánie v nátere z kožného infiltrátu

Požadované činidlá sú podobné predchádzajúcemu testu.

Testovaný materiál sa získa z existujúceho tuberkulózneho alebo ulcerózneho obsahu. Škrabanie s podozrením na leishmaniózu sa robí veľmi opatrne skalpelom, bez krvi. Potom sa prípravok pripraví na sklo. Pre presnosť získaných výsledkov sa súčasne skúma niekoľko prípravkov.

V prítomnosti choroby, medzi makrofágmi, fibroblastmi a lymfoidnými bunkami prítomnými v testovanom materiáli, sa tiež stanoví leishmánia.

Spôsob izolácie čistej kultúry Leishmania získanej zoškrabaním patologických tkanív

Pomocou tejto metódy diagnostiky sa najjednoduchšie tkanivové škrabance umiestnia do špeciálneho živného média, v ktorom sa Leishmania aktívne rozmnožuje.

Pred zoškrabaním sa pokožka opatrne ošetrí alkoholom, potom sa na tuberkulóze urobí rez, z ktorého sa odstráni obsah a umiestni sa do skúmavky s médiom. Materiál sa odoberie niekoľkokrát, potom sa umiestni do rôznych skúmaviek. Potom v termostate pri teplote 22-24 stupňov prebieha kultivácia. Výsledky sa vyhodnocujú pod mikroskopom. Táto metóda sa používa vtedy, keď sú iné, lacnejšie a rýchlejšie metódy diagnostiky prvokov neúčinné.

Ako sa v praxi dešifrujú testy na prítomnosť prvokov kvapkou krvi, si môžete pozrieť vo videorecenzii:

Lotin Alexander, lekársky publicista

Stoličky sa vyšetrujú dvoma spôsobmi:

1. Makroskopický - nájsť helminty, ich hlavy, segmenty, zvyšky strobili. Malé časti výkalov sa zmiešajú s vodou v plochom kúpeli alebo Petriho miske a prezerajú sa v dobrom svetle na tmavom pozadí, ak je to potrebné, pomocou lupy. Všetky podozrivé útvary sa prenesú pinzetou do inej šálky vody alebo na podložné sklíčko v kvapke zriedeného glycerínu.

S metódou udržiavanie skúmaná časť výkalov sa mieša s vodou v sklenenom valci, po usadení sa vrchná vrstva vody scedí. Toto sa opakuje niekoľkokrát. Keď sa kvapalina stane priehľadnou, vypustí sa a sediment sa prezrie v Petriho miske.

2. Mikroskopické - na zistenie vajíčok a lariev helmintov. Existuje mnoho výskumných metód.

jeden). natívny náter - najbežnejšia a technicky dostupná metóda výskumu. Môžete nájsť vajíčka a larvy všetkých helmintov. Pri malom počte vajíčok sa však nie vždy nájdu. Preto sa používa metóda obohacovania.

jeden). Fülleborgova metóda - ide o spôsob obohacovania, založený na vzniku vajíčok helmintióz v nasýtenom roztoku NaCl (1,2 - hustota; 400 g NaCl na 1 liter vody; 40% roztok NaCl). Metóda je účinnejšia ako natívny náter. 2-5 g výkalov sa umiestni do sklenených nádob a naplní sa roztokom NaCl, premieša sa a po 45 minútach sa vytvorený film odstráni kovovou slučkou, kvapka glycerínu sa umiestni na podložné sklíčko. Preskúmajte pod mikroskopom. Nevýhodou metódy je oneskorený výskyt vajíčok rôznych helmintov, pásomnice trpasličej - po 15-20 minútach, škrkavky - 1,5 hodiny, vretenice - 2-3 hodiny.

2) Kalantariánska metóda - tiež metóda obohacovania, ale používa sa nasýtený roztok NaNO 3 (hustota 1,38). Väčšina vajíčok pláva, vyšetrenie sedimentu nie je potrebné. Nevýhodou je, že vajíčka sú dlho držané v roztoku, čo vedie k tomu, že niektoré vajíčka začnú napučiavať a usadzovať sa na dne, pričom miznú z povrchového filmu.

3. Gorjačovova metóda - na princípe ukladania vajíčok, detekcia vajíčok motolice. Ako roztok sa použije nasýtený roztok NaCl a na vrch sa opatrne navrství 3-4 ml roztoku stolice. Po 15-20 hodinách sa vajíčka motolice usadia na dne. Kvapalina sa vypustí, sedimentuje na podložnom sklíčku a pod mikroskopom.

4. Shulmanova metóda krútenia – na detekciu lariev helmintov vo výkaloch. Preskúmajte iba čerstvo izolované výkaly. 2-3 g sa umiestnia do sklenenej nádoby a pridá sa 5-násobné množstvo vody, rýchlo sa premieša tyčinkou, bez toho, aby ste sa dotkli stien nádoby - 20-30 minút, potom sa tyčinka rýchlo vyberie a kvapka kvapalina na konci sa prenesie na podložné sklíčko a podrobí sa mikroskopii.

5. Bermanova metóda - založený na schopnosti lariev helmintov migrovať smerom k teplu a slúži na ich identifikáciu vo výkaloch.

6. Metóda Harada a Mori (spôsob pestovania lariev) a odporúča sa na testovanie ankylostomiázy. Metóda je založená na tom, že v teple a na vlhkom prefiltrovanom papieri sa z vajíčok háďatiek vyvinú filariformné larvy, ktoré sa dajú ľahko odhaliť. Na stred pásu filtrovaného papiera sa nanesie 15 g výkalov, papier s výkalmi sa vloží do nádoby tak, aby spodný koniec bol ponorený do vody a horný koniec sa zafixoval korkom. Nádoba sa uchováva v termostate pri 28 0 C počas 5-6 dní. Počas tejto doby sa vyvíjajú filariformné larvy a zostupujú do vody. Kvapalina sa skúma pod lupou. Ak je ťažké ju zistiť, kvapalina sa po usmrtení lariev zahriatím na 60 0 odstredí. Laboratórny technik musí nosiť rukavice.

7. Metódy pre enterobiázu – identifikácia vajíčok červotoča a pásomnice hovädzieho dobytka.

a) škrabanie z perianálnych záhybov - vatovým tampónom pevne navinutým na drevenej tyčinke a navlhčeným 50% roztokom glycerínu. V laboratóriu sa tampón zmyje 1-2 kvapkami 50% vodného roztoku glycerolu.

b) metóda lepkavých roztočov (Grahamova metóda)

Lepiaca páska sa nanesie na perianálne záhyby, potom sa lepivou vrstvou na podložné sklíčko a podrobí mikroskopii.

C) škrabanie pomocou očných tyčiniek (Rabinovichova metóda). Na perianálne škrabky sa používajú sklenené očné tyčinky, ktorých najširšia časť je pokrytá špeciálnym lepidlom, ktoré umožňuje prichytenie vajíčok červov.

Vyšetrenie krvi, žlče, spúta a svalov

Krvná mikroskopia – zisťujú sa larvy filárií.

Vyšetrenie spúta - vajíčka paragánia, larvy škrkavky, nekátor, strongyloid, prvky echinokokového mechúra.

Vyšetrenie svalov – pri podozrení na trichinelózu sa vyšetrujú svaly pacienta alebo mŕtvoly a tiež mäso, ktoré údajne spôsobilo infekciu človeka. Pre účely trichinoskopie sa sval nareže na malé kúsky a vloží do kompresorov, sú to dve široké hrubé sklá, ktoré rozdrvia svaly a larvy Trichinella sa nachádzajú vo forme kapsúl - kompresná metóda.

Spôsob trávenia - svaly sa nalejú umelou žalúdočnou šťavou (roztok kyseliny chlorovodíkovej a pepsínu). Svaly sú strávené a larvy sú ľahko identifikovateľné. Stanovenie intenzity invázie: počet lariev do 200 na 1 g svalového tkaniva - mierna intenzita invázie; do 500 - intenzívne; nad 500 - superintenzívna invázia.

Sérologické metódy

Kapitola III. Diagnostika helmintiáz a metódy helmintologického výskumu

Na helmintiázy je potrebné vyšetriť všetkých pacientov, ktorí hľadajú lekársku pomoc, a najmä pacientov, ktorí sa obracajú na pediatra, internistu a neurológa so sťažnosťami na javy z tráviaceho traktu, nervového systému a s anémiou. Ak lekár nemôže vždy aplikovať laboratórne metódy výskumu, potom je každý zdravotnícky pracovník, ktorý poskytuje pomoc v ambulancii alebo nemocnici, povinný pohovoriť s pacientom o uvoľnení helmintov od neho.

Ak sú v príslušných kapitolách uvedené klinické indikácie, diagnóza by sa mala objasniť pomocou laboratórnych metód na štúdium helmintiáz.

V súvislosti s prevahou črevných helmintiáz má najväčší praktický význam štúdium výkalov.

Metódy na štúdium výkalov pre helmintiázy

Výkaly sa dodávajú do laboratória v čistom skle (asi štvrtina šálky výkalov odobratých z rôznych miest v jednej porcii); pri bežnom vyšetrení je povolené dodávanie výkalov do laboratória v zápalkových škatuľkách alebo obľúbených výtlačkoch.

Na kontrolu odčervovania sa dodáva celá časť výkalov zozbieraná po užití antihelmintika a preháňadla (vo veľkých uzavretých sklenených nádobách, vedierkach) (podľa predpisu lekára).

Mikroskopické vyšetrenie výkalov je hlavným pri diagnostike črevných helmintiáz; vždy by mu malo predchádzať celkové makroskopické vyšetrenie trusu na zistenie segmentov veľkých pásomníc, škrkaviek, škrkaviek atď.

Stolica by mala byť čerstvá alebo konzervovaná (v 5% roztoku formalínu), pretože sušenie dramaticky mení štruktúru vajec. Navyše, keď stoja výkaly, vajíčka niektorých helmintov (napríklad hákovcov) sa rýchlo vyvíjajú, čo sťažuje diagnostiku.

Podľa pokynov Ministerstva zdravotníctva ZSSR je potrebné súčasne vyšetrovať výkaly pomocou Füllebornovej metódy a natívneho náteru.

natívny náter

Natívny náter: malý kúsok trusu (veľkosť hrášku) odobratý zápalkou, sklenenou alebo drevenou tyčinkou z rôznych miest podávanej porcie sa opatrne rozotrie na podložnom sklíčku v kvapke 50% roztoku glycerolu resp. vo fyziologickom roztoku alebo vo vode. Prikryte krycím sklíčkom, ktoré mierne zatlačte (preparovacou ihlou). Náter by mal byť tenký, priehľadný a jednotný. Používa sa len ako doplnok k iným metódam, ktoré obohacujú liek. Mali by ste vidieť aspoň dva prípravky.

Na detekciu lariev hlíst (ako aj ich vajíčok) sa natívny náter urobí nasledovne (podľa Shulmana): 2-3 g výkalov sa dôkladne premiešajú „zatočením“ sklenenou tyčinkou do emulzie s päťnásobným množstvo čistej vody alebo fyziologického roztoku. Počas miešania sa larvy hromadia na sklenenej tyčinke, preto sa ihneď po ukončení miešania kvapka emulzie rýchlo prenesie sklenenou tyčinkou na podložné sklíčko, prikryje sa krycím sklíčkom a skúma sa. S. D. Lyubchenko (1936) dokázal, že metóda krútenia je účinnejšia ako metóda náteru, najmä pokiaľ ide o vajíčka ascaris. Na základe práce S. D. Lyubčenka považujeme za vhodné nahradiť metódu rozmazania metódou twist.

Füllebornova metóda

Füllebornova metóda: 5-10 g výkalov odobratých z rôznych miest sa vloží do nádoby s objemom 50-100 ml a dôkladne sa rozotrie sklenenou alebo drevenou tyčinkou v nasýtenom roztoku chloridu sodného (400 g tejto soli sa rozpustí v 1 litri vody, zahriata do varu a prefiltrovaná cez vrstvu vaty alebo gázy, roztok sa používa za studena: merná hmotnosť 1,2). Roztok sa prilieva postupne, kým sa nedosiahne homogénna suspenzia a celkové množstvo naliateho roztoku by malo byť približne 20-násobkom množstva výkalov. Fülleborn odporučil použitie čajových pohárov na miešanie fekálií, ale vhodnejšie je pripraviť suspenziu v 50-100 ml nádobách od masti, pričom na každý rozbor použite dve nádoby (alebo v 100 ml pohároch).

Ihneď po príprave suspenzie sa z povrchu odstráni špachtľou, kovovou naberačkou alebo kúskom čistého papiera, veľké častice, ktoré vyplávali na povrch (rastlinné útvary, nestrávené zvyšky potravy a pod.), potom zmes sa nechá stáť 1-1,5 hodiny. Po uplynutí tejto doby sa celý film odstráni z povrchu zmesi dotykom drôtenej alebo platinovej slučky (plochej) s priemerom nie väčším ako 1 cm, ohnutej v pravom uhle; Film sa pretrepe na podložnom sklíčku a prikryje sa krycím sklíčkom. Pod každé krycie sklíčko (18x18 mm) nakvapkajte 3-4 kvapky. Celkovo by sa mali pripraviť aspoň 4 prípravky (pre každý prípravok jedno krycie sklíčko). Slučka sa kalcinuje na ohni a po každej analýze sa premyje vodou.

Podľa Füllebornovej metódy sa vajíčka všetkých háďatiek (s výnimkou vajíčok neoplodnených škrkaviek) a vajíčka trpasličích pásomníc rýchlo a jednoducho zistia.

Metóda Berman sa používa na štúdium výkalov pre larvy helmintov (so strongyloidózou). Táto metóda je nasledovná: 5 g fekálií na kovovej mriežke (na tento účel je vhodné sitko na mlieko) sa umiestni na sklenený lievik pripevnený na statíve. Na spodný koniec lievika sa nasadí gumená hadička so svorkou.

Sieťka s výkalmi sa zdvihne a do lievika sa naleje voda zohriata na približne 50 ° tak, aby spodná časť sieťky s výkalmi bola ponorená do vody. Larvy sa aktívne pohybujú do vody a hromadia sa v spodnej časti gumenej trubice. Po 2-4 hodinách sa svorka otvorí a kvapalina sa spustí do jednej alebo dvoch centrifugačných skúmaviek.

Po odstredení počas 1-2 minút sa horná časť kvapaliny rýchlo scedí a zrazenina sa po kvapkách nanesie na podložné sklíčka a skúma sa pod krycími sklíčkami alebo sa rozdelí v tenkej vrstve na 2-3 veľké podložné sklíčka a potom sa skúma bez krytu pošmyknutia.

Bermanova metóda sa používa aj na vyšetrenie pôdy na prítomnosť lariev machovky.

Stollova metóda

Na určenie intenzity invázie sa používa metóda Stoll. Do špeciálnej sklenenej banky sa naleje desaťnormálny roztok hydroxidu sodného po značku 56 cm3 a potom sa pridávajú výkaly, kým hladina kvapaliny nedosiahne 60 cm3, t.j. 4 cm3. Po pretrepaní sklenenými guľôčkami sa odoberie 0,075 ml zmesi na vyšetrenie a vyšetrí sa pod jedným alebo dvoma obyčajnými krycími sklíčkami. Výsledné množstvo sa vynásobí 200, čím sa získa počet vajíčok obsiahnutých v 1 cm 3 výkalov.

Štúdium obsahu dvanástnika

Dvanástniková šťava a cystická žlč, získané obvyklým spôsobom sondovaním (a cystickou žlčou a po reflexe zo žlčníka), sa dôkladne zmiešajú s rovnakým objemom etyléteru; zmes sa odstredí a potom sa zrazenina skúma pod mikroskopom. Okrem sedimentu sa mikroskopickému vyšetreniu musia podrobiť aj vločky plávajúce v kvapaline, ktoré môžu obsahovať vajíčka helmintov. Pri skúmaní vajíčok helmintov žalúdočnej šťavy a zvratkov môžete použiť rovnakú techniku.

Vyšetrenie duodenálnej šťavy a obsahu žalúdka je potrebné vykonať pri podozrení na helmintické ochorenia pečene, žlčníka (opistorchiáza, fasciolóza, dikroceliáza) a dvanástnika (strongyloidóza).

Vyšetrenie spúta

Spútum sa rozotrie na sklenenú dosku, pevne sa prikryje ďalšou sklenenou doskou a skúma sa voľným okom na svetlom a čiernom pozadí, ako aj pod lupou v prechádzajúcom svetle. Oddelené kúsky spúta („hrdzavé“ nahromadenia, zvyšky tkaniva atď.) sa nanesú v tenkej vrstve na podložné sklíčko, pevne sa prikryjú krycím sklíčkom a skúmajú sa pod mikroskopom s malým a veľkým zväčšením.

a) Na diagnostiku cysticerkózy kože, podkožia alebo svalov sa najprv voľným okom vyšetrí asepticky odrezaný kúsok príslušného tkaniva. Tkanivové rezy sa od seba posúvajú pomocou pitevných ihiel, aby sa zistil voľným okom viditeľný vezikul - cysticercus (foto A); jeho dĺžka je 6-20 mm, šírka je 5-10 mm. Keď sa nájde bublina, ktorá je podozrivá z cysticerku, rozdrví sa medzi dve podložné sklíčka a vyšetrí sa pod mikroskopom. Cysticercus (Cistycercus cellulosae) je určený prítomnosťou skolexu so štyrmi prísavkami a halo háčikov (foto B).

Fotka. A - cysticerci so scolexami otočenými von; B - Hlava pásomnice bravčovej.

b) Na diagnostiku trichinelózy sa asepticky odrezaný kúsok svalu (biceps alebo gastrocnemius) opatrne rozdrví v 50% roztoku glycerolu na najtenšie vlákna pomocou pitevných ihiel. Rozdrvené svaly sa stlačia medzi dve podložné sklíčka a skúmajú sa pri malom zväčšení mikroskopu v stmavenom zornom poli. Vyšetrenie svalov na trichinelózu sa odporúča vykonať najskôr v 8. deň choroby. Larvy trichinel sú vo svaloch v stočenej polohe: sú uzavreté v tobolkách citrónového tvaru.

Fotka. A - larvy Trichinella vo svaloch; B - Kalcifikované kapsuly Trichinella.

Fluoroskopia

Najčastejšie sa fluoroskopia používa na diagnostiku echinokokózy a menej často cysticerkózy. Cysticerci sa na fluoroskopii zistia až po kalcifikácii (v prípadoch dlhotrvajúceho ochorenia). V posledných rokoch sa fluoroskopia používa aj na diagnostiku askariózy v ranom štádiu lariev a čiastočne v črevnom štádiu.

Počas obdobia migrácie lariev ascaris (a ankylostomity) v pľúcach sa zisťujú nestabilné, niekedy viacnásobné zápalové ložiská; súčasne sa v krvi objavuje výrazná eozinofília.

Sexuálne zrelé škrkavky sú jasne viditeľné na fluoroskopii čriev postihnutých jedincov. Táto metóda, napriek svojej zložitosti a ťažkopádnosti, by sa mala používať ako doplnková metóda na diagnostikovanie askariózy v prípadoch s negatívnym skatologickým rozborom. Podľa E. S. Geselevicha zo 180 pacientov s ascaridózou identifikovaných fluoroskopiou sa 54 vajíčok ascaris nenašlo vo výkaloch (pozri).

7.7. Metódy stanovenia životaschopnosti vajíčok a lariev helmintov

Životaschopnosť vajíčok helmintov je určená ich vzhľadom, farbením životne dôležitými farbivami, kultiváciou v optimálnych podmienkach a nastavením biologickej vzorky.

7.7.1. Stanovenie životaschopnosti vajíčok alebo lariev helmintov podľa vzhľadu

Vajíčka helmintov sa mikroskopujú najskôr pri malom zväčšení, potom pri veľkom zväčšení. V deformovaných a mŕtvych vajciach helmintov je škrupina roztrhnutá alebo ohnutá dovnútra, plazma je zakalená, uvoľnená. V segmentovaných vajíčkach sú štiepne guľôčky (blastoméry) nerovnaké veľkosti, nepravidelného tvaru a často posunuté k jednému pólu. Niekedy existujú abnormálne vajíčka, ktoré sa po vonkajších deformáciách vyvíjajú normálne. U živých lariev škrkaviek je jemná zrnitosť prítomná len v strednej časti tela, ako odumierajú, šíri sa po tele, vznikajú veľké lesklé hyalínové vakuoly, takzvané „perličky“.

Na stanovenie životaschopnosti zrelých vajíčok ascaridov, bičíkovcov, červov by sa aktívne pohyby lariev mali vyvolať miernym zahriatím prípravku (na teplotu nepresahujúcu 37 ° C). Vhodnejšie je pozorovať životaschopnosť lariev vretenice a vretenice po ich izolovaní z obalu vajíčka stlačením krycieho sklíčka preparátu pitevnou ihlou alebo pinzetou.

U invazívnych lariev ascaridov je často vidieť čiapočku, ktorá sa na hlavovom konci odlupovala, a u lariev bičíkovcov, ktoré ukončili vývoj vo vajíčku, sa na tomto mieste nachádza pri veľkom zväčšení mandrén. Mŕtve larvy helmintov, bez ohľadu na ich umiestnenie (vo vajíčku alebo mimo neho), si všimnú rozpad tela. V tomto prípade sa vnútorná štruktúra larvy stáva hrudkovitou alebo zrnitou a telo sa stáva zakaleným a nepriehľadným. V tele sa nachádzajú vakuoly a na kutikule sa nachádzajú zlomy.

Životaschopnosť teniidných onkosfér (hovädzí, prasacia pásomnica atď.) je určená pohybom embryí, keď sú vystavené tráviacim enzýmom. Vajíčka sú umiestnené na hodinovom sklíčku so psou žalúdočnou šťavou alebo umelou duodenálnou šťavou. Zloženie druhého: pankreatín - 0,5 g, hydrogénuhličitan sodný - 0,09 g, destilovaná voda - 5 ml. Hodinkové sklá s vajíčkami sa umiestnia na 4 hodiny do termostatu pri 36 - 38 °C. V tomto prípade sa živé embryá uvoľnia z membrán. Škrupiny živých onkosfér sa rozpúšťajú aj v okyslenom pepsíne a v alkalickom roztoku trypsínu po 6-8 hodinách v termostate pri 38 °C.

Ak sa vajíčka teniidných vajíčok vložia do 1 % roztoku sulfidu sodného alebo 20 % roztoku chlórnanu sodného, ​​alebo do 1 % roztoku chlórovej vody s teplotou 36 - 38 °C, zrelé a živé embryá sa uvoľnia zo škrupín a neuvoľnia sa. zmena počas 1 dňa. Nezrelé a mŕtve onkosféry sa scvrkávajú alebo napučiavajú a dramaticky zväčšujú a potom sa „rozpustia“ v priebehu 10 minút až 2 hodín. Živé embryá teniidov sa tiež aktívne pohybujú v zmesi 1% roztoku chloridu sodného, ​​0,5% roztoku hydrogénuhličitanu sodného a žlče pri teplote 36 - 38 ° C.

Životaschopnosť fasciolia adolescariae odobratých z rastlín a iných objektov vodných útvarov sa kontroluje ich skúmaním na podložnom sklíčku vo fyziologickom roztoku pod mikroskopom s vyhrievacím stolíkom. Pri zahrievaní sa larvy motolice v cyste začnú pohybovať.

Na určenie životaschopnosti vajíčok pásomnice pygmy je metóda Ionina N.S. najjednoduchšia: v živých vajíčkach je stredný pár embryonálnych háčikov buď rovnobežný s laterálnymi háčikmi, alebo tieto háčiky zvierajú so základňou uhol menší. ako 45° s mediánom. V mŕtvych vajciach bočné páry zvierajú uhol pri základni so stredným párom viac ako 45 ° alebo sú háčiky náhodne rozptýlené (ich párové usporiadanie sa stráca); niekedy dochádza k vráskaniu embrya, tvorbe zrnitosti. Presnejšia metóda je založená na objavení sa pohybov onkosféry počas prudkej zmeny teploty: od 5 - 10 ° do 38 - 40 ° C.

Stanovenie životaschopnosti nezrelých vajíčok háďatka by sa malo študovať vo vlhkej komore (Petriho misky), vajíčka ascaris v 3% roztoku formalínu pripraveného v izotonickom roztoku chloridu sodného pri teplote 24 - 30 °C, vajíčka bičíkovcov do 3 % roztoku kyseliny chlorovodíkovej pri teplote 30 - 35 °C; vajce červov v izotonickom roztoku chloridu sodného pri 37 °C. Petriho misky otvárajte 1 až 2-krát týždenne pre lepšie prevzdušnenie a filtračný papier opäť navlhčite čistou vodou.

Pozorovania vývoja vajíčok helmintov sa vykonávajú najmenej 2-krát týždenne. Absencia príznakov vývoja v priebehu 2-3 mesiacov naznačuje ich neživotaschopnosť. Známky vývoja vajíčok helmintov sú najskôr štádiá drvenia, rozdelenie obsahu vajíčka na samostatné blastoméry. Počas prvých dní sa vyvinie až 16 blastomér, ktoré prechádzajú do druhého štádia - morula atď.

Vajíčka húsenice sa pestujú v sklenenom valci (50 cm vysoký a 7 cm v priemere) uzavretom zátkou. Na dno valca sa pomocou sklenenej trubice opatrne naleje zmes rovnakých objemov sterilného piesku, dreveného uhlia a výkalov s vajíčkami machovca, zriedená vodou na polotekutú konzistenciu. Počas 1 - 2 dní usadzovania v tme pri teplote 25 - 30 ° C sa z vajíčok vyliahnu larvy podobné rabditom, ktoré sa po 5 - 7 dňoch stanú už filariformnými: larvy lezú po stenách valca, kde sú viditeľné aj voľným okom.

Vajíčka trematód, ktoré sa prirodzene vyvíjajú vo vode, ako napríklad opisthorchis, diphyllobothriidy, fascioly a iné, sa umiestnia na hodinové sklíčko, Petriho misku alebo do inej nádoby a nalejú sa malou vrstvou obyčajnej vody. Pri pestovaní vajíčok fascioly treba brať do úvahy, že v tme sa rýchlejšie vyvíjajú, pričom miracidium sa tvorí v živých vajíčkach pri teplote 22–24 °C po 9–12 dňoch. Pri mikroskopii vyvíjajúcich sa vajíčok motolice sú jasne viditeľné pohyby miracidia. Fasciola miracidium vystupuje z vaječných škrupín len na svetle.

Fulleborn metóda. Larvy háčikovca a strongylidov sa kultivujú na agare v Petriho miske so živočíšnym uhlím. Po udržaní v termostate pri teplote 25 – 30 °C počas 5 – 6 hodín sa larvy rozšíria po agare a zanechajú za sebou cestu baktérií.

Metóda Harada a Mori. Do skúmaviek umiestnených na stojane sa pridá 7 ml destilovanej vody. Drevenou tyčinkou odoberte 0,5 g výkalov a urobte rozmazanie na filtračný papier (15 x 150 mm) 5 cm od ľavého okraja (táto operácia sa vykonáva na hárku papiera na ochranu povrchu laboratórneho stola). Potom sa prúžok s náterom vloží do skúmavky tak, aby ľavý koniec voľný od náteru dosiahol dno skúmavky. Horný koniec zakryte kúskom celofánu a pevne ho omotajte gumičkou. Na skúmavku napíšte číslo, názov predmetu. V tomto stave sa skúmavky uchovávajú 8-10 dní pri teplote 28 °C. Na štúdium lariev odstráňte a odstráňte celofánový kryt a odstráňte pásik filtračného papiera pomocou pinzety. V tomto prípade treba byť opatrný, pretože malý počet infekčných lariev sa môže presunúť na horný koniec filtračného papiera alebo na stenu skúmavky a preniknúť pod povrch celofánu.

Skúmavky sa umiestnia do horúceho vodného kúpeľa s teplotou 50 °C na 15 minút, potom sa obsah pretrepe a rýchlo sa naleje do 15 ml skúmavky na sedimentáciu lariev. Po odstredení sa supernatant odstráni a zrazenina sa prenesie na podložné sklíčko, prikryje sa krycím sklíčkom a mikroskopuje sa pri malom zväčšení.

Pre diferenciálnu diagnostiku filariformných lariev je potrebné použiť údaje v tabuľke 3.

Tabuľka 3

DIFERENCIÁLNA DIAGNOSTIKA FILARIOVANÝCH LARVOYOV A. DUODENALE, N. AMERICANUS, S. STERCORALIS, triCHOStrONGYLUS SP.

Larvy	Rozmery	Charakteristické črty
A. duodenale	Dĺžka tela asi 660 mikrónov, uzáver - 720 nm	Pruhovanie uzáveru je menej výrazné, ústny výbežok menej nápadný, predný koniec tela (nie však uzáver) je tupý, priemer črevnej trubice je menší ako bulbus pažeráka, chvostový koniec je tupý
N. americanus	Dĺžka tela asi 590 μm, uzáver - 660 nm	Plášť je nápadne pruhovaný, najmä v kaudálnej časti tela, výbežok úst sa zdá tmavý, predný koniec tela (ale nie plášť) je zaoblený ako úzky koniec slepačieho vajca, predná časť čreva trubica má taký priemer ako bulbus pažeráka, chvostový koniec je ostro zahrotený
S. stercoralis	Dĺžka tela asi 500 µm	Larva bez pošvy, pažerák má asi polovicu dĺžky tela, chvost je tupý alebo rozvetvený
Trichostrongylus sp.	Dĺžka tela asi 750 mikrónov	Črevný lúmen nie je rovný, ale kľukatý, kaudálny koniec je zaoblený a má tvar gombíka

7.7.2. Metódy farbenia vajíčok a lariev helmintov

Mŕtve tkanivá vo väčšine prípadov vnímajú farby rýchlejšie ako živé. Tieto znaky sa používajú v helmintológii na určenie životaschopnosti vajíčok a lariev helmintov. V niektorých prípadoch sú však niektoré farby lepšie vnímané živými tkanivami ako mŕtvymi.

Na diferenciálne stanovenie živých a mŕtvych vajíčok a lariev sa používajú nasledujúce farby a metódy.

Leukobáza metylénovej modrej sa často používa na farbenie živého a mŕtveho tkaniva. Živá bunka alebo tkanivo redukuje metylénovú modrú na bezfarebnú leukobázu, mŕtve tkanivo túto schopnosť nemá, a preto získava farbu.

Kritériom pre stav vajíčka je zafarbenie embrya, ale nie škrupiny. Táto schopnosť súvisí s podmienkami smrti vajíčka. V prípadoch, keď vláknitá škrupina v mŕtvom vajci nestráca svoje polopriepustné vlastnosti, neprejde farbivami, takže mŕtve embryo nebude zafarbené. Farebné embryo vždy naznačuje smrť vajíčka.

Na farbenie vajec Ascaris môžete použiť metylénovú modrú v roztoku kyseliny mliečnej s lúhom (metylénová modrá 0,05 g, lúh sodný 0,5 g, kyselina mliečna - 15 ml). Živé vajcia nevnímajú farbu; embryá mŕtvych vajíčok zmodrajú. Larvy Ascaris sa farbia zásaditým roztokom brilantno-krezylovej modrej farby v koncentrácii 1:10 000 nasledovne: kvapka tekutiny s vajíčkami ascaris a kvapka roztoku základnej farby sa nanesie na podložné sklíčko. Preparát sa prekryje krycím sklíčkom, ktoré sa ľahkým poklepaním pitevnou ihlou tesne pritlačí na podložné sklo. Pod mikroskopom sa sleduje počet vyliahnutých lariev a stupeň ich sfarbenia; potom sa ten istý liek po 2 až 3 hodinách znova prehodnotí. Za živé sa považujú iba nedeformované larvy, ktoré sa nezafarbili 2 hodiny. Mŕtve larvy buď nevychádzajú z vajíčok, alebo sa farbia, keď sa škrupina zlomí (čiastočne alebo úplne).

Pri určovaní životaschopnosti vajíčok ascaridia vtákov je možné farbiť prípravky 5% alkoholovým roztokom jódu. Keď sa aplikuje na liek, embryá mŕtvych vajíčok ascarid na 1 - 3 sekundy. sú zafarbené na oranžovo.

Mŕtve vajíčka opisthorchis a onkosféry pásomnice hovädzieho dobytka sa zafarbia roztokom toluidínovej modrej (1:1000) a mŕtve onkosféry pásomnice hovädzieho dobytka sa zafarbia roztokom brilantnej a krezylovej modrej (1:10000). Súčasne embryá a škrupiny mŕtvych aj živých vajec získavajú farbu. Preto sa vajíčka a onkosféry po farbení premyjú v čistej vode a dodatočne farbia safranínom (pri riedení 1:10 000 alkohol, 10°C). Alkohol odstraňuje farbivo zo škrupín a safranín farbí do červena. Výsledkom je, že živé vajcia sčervenajú; vajcia s mŕtvymi embryami - v modrej farbe a škrupina zostáva červená. Mŕtve embryá onkosfér pásomnice hovädzieho dobytka sa rýchlo, v priebehu niekoľkých minút, zafarbia jasne červenou alebo ružovou farbou safranínom alebo modrou brilantne-krezylovou modrou v riedení 1:4000 alebo indigokarmínom v riedení 1:1000 - 1 :2000. Živé embryá sa vplyvom týchto farieb nemenia ani po 2 - 7 hodinách.

Na určenie životaschopnosti vajíčok pásomnice trpasličej sa odporúča použiť nasledujúce farby:

1. Brilantná kreasylová modrá (1:8000) - po 1 hodine je onkosféra mŕtvych vajíčok obzvlášť jasne sfarbená, čo ostro vyniká na bledom alebo bezfarebnom pozadí zvyšku vajíčka.

2. Safranín (1:8000 na 2 hodiny a 1:5000 na 3 až 5 hodín).

3. 50% roztok kyseliny pyrogalovej v riedení 1:2 - pri vystavení 1 hodine pri teplote 29 - 30 °C (čím nižšia teplota, tým dlhší je proces farbenia).

7.7.3. Luminiscenčná metóda na štúdium vajíčok a lariev helmintov

Luminiscenčná mikroskopia umožňuje rozlíšiť živé a mŕtve predmety bez poškodenia vajíčka. Na fluorescenciu sa nepoužívajú ultrafialové lúče, ale modrofialová časť viditeľného svetla s konvenčným mikroskopom a podložnými sklíčkami; k iluminátoru OI-18 je pridaná špeciálna sada farebných filtrov.

Živé a mŕtve vajíčka škrkaviek, škrkaviek, pásomníc, pásomníc hovädzieho dobytka, pásomníc a iných helmintov luminiscujú odlišne. Tento jav je pozorovaný ako počas primárnej luminiscencie bez použitia farbív, tak aj pri farbení fluorochrómmi (akridínová oranž, korifosfín, primulín, aurolín, berlerín sulfát, tripaflavín, rivanol, chinakrín atď.).

Nesfarbené, živé nesegmentované vajíčka škrkavky žiaria jasnozelenou farbou so žltkastým odtieňom; v mŕtvych vajciach škrupina vyžaruje zelené svetlo oveľa jasnejšie ako tmavozelená embryonálna časť; vo vajíčkach škrkavky s larvou sa objavuje iba škrupina, zatiaľ čo u mŕtvych je škrupina aj larva jasne žltá.

Nepigmentované a nesegmentované živé vajíčka červov a trpasličích pásomníc vyžarujú zelenožlté svetlo, v mŕtvych vajíčkach škrupina intenzívne luminiscuje na pozadí tmavozelenej embryonálnej hmoty.

Pri sekundárnej luminiscencii (pri farbení akridínovou oranžou pri riedení 1:10 000 a 1:50 000 od 30 minút do 2 hodín) sa škrupina živých a mŕtvych háďatiek, motolíc a cestód rozžiari odlišne.

Škrupina živých a odumretých vajíčok škrkaviek, toxocara, pinworms, pygmy tapeworms, krysa tapeworms, bull tapeworms, tapeworms sa sfarbuje do oranžovočervena. Embryá živých vajíčok ascaris, toxascaris, potkanej pásomnice, širokej pásomnice a onkosféry pásomnice hovädzej luminiscujú matnou tmavozelenou alebo sivozelenou farbou. Mŕtve embryá vajíčok týchto helmintov vyžarujú „horiacu“ oranžovo-červenú farbu. Živé larvy a toxokáry (vaječné škrupiny) vyžarujú matné sivozelené svetlo, keď uhynú, farba sa zmení z hlavového konca na „horiacu“ svetlozelenú, potom žltú, oranžovú a nakoniec na jasne oranžovú.

Pri farbení fluorochrómami - coryfosfyllum, primulín, mŕtve vajíčka ascaridov a bičíkovcov vykazujú žiaru od lila-žltej po medeno-červenú. Životaschopné vajíčka neluminiscujú, ale sfarbujú sa do tmavozelena.

Živé vajíčka motolice (Paragonimus a Clonorchis) po zafarbení akridínovou oranžovou neluminiscujú a z mŕtvych vajíčok pochádza žltozelená farba.

Na stanovenie životaschopnosti lariev helmintov možno použiť aj luminiscenčnú metódu. Takže fluorochromizované roztokom akridínovej oranžovej (1: 2000) larvy strongylátu, rhabdita žiara: živé - zelené (s odtieňom), mŕtve - jasne oranžové svetlo.

Živé miracidia vychádzajúce z ulity vyžarujú tlmené modrasté svetlo so sotva znateľným svetložltým korolom riasiniek, ale 10-15 minút po smrti sa javia ako jasné „horiace“ svetlo zelené a potom oranžovo-červené svetlo.

7.7.4. biologická testovacia metóda

Napríklad na stanovenie životaschopnosti vajíčok ascaris (prasiatka ascaris, ľudí, toxocara, toxascaris atď.) na zviera (morčatá, myši) je potrebných aspoň 100 - 300 vajíčok s vyvinutou larvou. Vajíčka Ascaris v izotonickom roztoku chloridu sodného sa pipetujú cez ústa myši alebo morčaťa. Po 6-7 dňoch sa zviera porazí, otvorí a jeho pečeň a pľúca sa oddelene vyšetrí na prítomnosť lariev Ascaris. Na tento účel sa pečeň a pľúca rozrežú na malé kúsky nožnicami a vyšetrí sa podľa Bermanovej alebo Supryagovej metódy (časť 6.1.2).

Ak boli zvieratá infikované živými invazívnymi vajíčkami, potom sa pri pitve v pečeni a pľúcach našli migrujúce larvy ascaris.

V prípade infekcie môžu byť vajíčka fascioly vo výkaloch laboratórnych zvierat zistené u králikov po 2 mesiacoch, u morčiat - po 50 dňoch, u myší - po 35-40 dňoch.

Pre rýchlejšiu reakciu sa laboratórne zvieratá otvoria po 20-30 dňoch a pečeň sa vyšetrí na prítomnosť mladých fasciolov.

Na stanovenie životaschopnosti vajíčok pásomnice pygmy sa tiež odporúča kŕmiť nimi predtým neinfikované biele myši, po 92–96 hodinách nasleduje pitva zvierat a detekcia cysticerkoidov v črevných klkoch alebo cestodách v lúmene čreva.

Na stanovenie životaschopnosti vajíčok opisthorchis sa odporúča metóda (German S.M., Beer S.A., 1984), založená na fyzikálno-chemickej aktivácii liahnej žľazy miracidium a stimulácii motorickej aktivity larvy, ktorá vedie k otvoreniu vajíčka. viečka a aktívne uvoľňovanie miracídia v experimentálnych podmienkach.

Suspenzia vajec opisthorchis vo vode sa vopred ochladí na 10 - 12 ° C (všetky nasledujúce operácie sa vykonávajú pri izbovej teplote 19 - 20 ° C). Do centrifugačnej skúmavky sa pridá 1 kvapka suspenzie obsahujúcej 100-150 vajec. Skúmavka sa umiestni na statív na 5-10 minút. Počas tejto doby majú všetky vajíčka čas klesnúť na dno. Potom sa pomocou prúžku filtračného papiera opatrne odsaje prebytočná voda a do skúmavky sa pridajú 2 kvapky špeciálneho média. Médium sa pripraví v 0,005 M Tris-HCl pufri; Do tlmivého roztoku sa pridá 12 - 13% roztok etanolu a farbivo (purpurová, safranín, eozín, metylénová modrá atď.). Skúmavka sa pretrepe, jej obsah sa prenesie pipetou na podložné sklíčko a nechá sa 10 minút za mierneho pretrepávania. Potom pridajte 2 kvapky uvedeného média. Prípravok je pripravený na mikroskopovanie pod bežným svetelným mikroskopom pri 20-násobnom zväčšení.

Počas tejto doby sa viečko životaschopných lariev otvorí a miracidium aktívne vstupuje do uvedeného média. Kvôli prítomnosti etanolu v ňom sú po 2-5 minútach imobilizované a následne zafarbené farbivom. Môžu byť ľahko detekované a spočítané pod mikroskopom.