Sérologické reakcie. zrážacia reakcia

Tento článok bude venovaný fenoménu precipitačnej reakcie. Tu zvážime vlastnosti formulácie tohto javu, fenomén difúzie, všeobecné charakteristiky, úlohu v ľudskom živote a oveľa viac.

Oboznámenie sa s fenoménom

Precipitácia je fenomén sérologického typu, počas ktorého rozpustné antigény interagujú s protilátkami a v dôsledku toho sa pozoruje precipitácia - precipitácia.
Všeobecnou charakteristikou precipitačnej reakcie je forma koordinovaného vplyvu antigénu a protilátky. Tieto typy interakcií umožňujú určiť prítomnosť neznámych antigénov v testovanej látke pridaním známych protilátok a antigénov. Proces zrážania bez prítomnosti solí bude prebiehať horšie a najlepšie optimum leží v rozmedzí od 7,0 do 7,4 pH.

Zložky reakcie

Medzi zložkami zrážacej reakcie sú tri hlavné prvky:

1. Antigén s molekulárnou povahou. Je v jemnom stave, inými slovami, je rozpustný. Takýto antigén sa tiež nazýva precipitogén, čo je lyzát alebo tkanivový extrakt atď. Precipitogén má charakteristický rozdiel od aglutinogénu, ktorý spočíva vo veľkosti častíc, z ktorých pozostáva. Aglutinogén má vlastnú veľkosť buniek a precipitogény zodpovedajú veľkosti molekuly. Roztok antigénu sa vyznačuje priehľadnosťou.
2. Protilátka nachádzajúca sa v ľudskom krvnom sére, ako aj v imunitnom diagnostickom sére, ktoré obsahuje študované protilátky.
3. Elektrolyty sú roztok chloridu sodného, ​​ktorý sa vyznačuje izotonickým stavom.

Príprava precipitogénu

Nastavenie precipitačnej reakcie nie je možné bez precipitogénu, ktorý sa získa mletím materiálov a extrakciou proteínových antigénov z nich. Extrakcia prebieha varením alebo inými metódami.
Pozoruhodným príkladom precipitogénov sú lyzáty, ako aj tkanivové a orgánové extrakty, krvné sérum, rôzne typy filtrátov na báze mikrobiálnych bujónových kultúr, ako aj soľné extrakty mikroorganizmov a autolyzátové látky.

Inscenácia zrážok

Teraz zvážte spôsob nastavenia reakcie zrážania.
Uskutočňuje sa prstencová zrážacia reakcia, ktorá prebieha v špeciálne pripravených skúmavkách. Sérum sa zavádza do dutiny riadu a nalieva sa cez stenu pomocou pipety. Potom sa na vrch opatrne navrství príslušné množstvo precipitátora a potom sa skúmavka uvedie do zvislej polohy z vodorovnej. Nastavenie a zohľadnenie zrážacej reakcie je veľmi starostlivá operácia. Výsledok sa zaznamená po objavení sa bieleho krúžku na hranici medzi antigénom a protilátkou. Ak si reagujúce prvky reakcie navzájom zodpovedajú, sú spojené, čo sa však prejaví po dlhom čase ich interakcie.
Precipitačná reakcia sa tiež uskutočňuje v Petriho miske alebo na podložnom sklíčku, kde sa prenesie agarový gél a nanesie sa v malej vrstve. Po vytvrdnutí v géli sa vyreže malý počet jamiek, do ktorých sa umiestnia antigény a protilátky. Existujú dva spôsoby vykonania tejto akcie: metóda radiálnej imunodifúzie a dvojitej imunodifúzie.

Všeobecné informácie

Mechanika fungovania zrážok je podobná aglutinačnému zariadeniu. Pod vplyvom séra imunitného typu už zreagovaný antigén redukuje svoj vlastný Dôležitou podmienkou je transparentnosť séra aj antigénu.
Je možné zlepšiť registráciu reakcie, ak sú antigény superponované na protilátky. V dôsledku toho je možné pozorovať výskyt zrazenín vo forme krúžku. Tento jav sa nazýva prstencové zrážanie a uskutočňuje sa v špeciálnych rúrach s priemerom 2,5 až 3,5 mm. Jedným z najrozšírenejších príkladov precipitačnej reakcie je diagnóza antraxu.
Precipitácia umožňuje určiť úroveň toxigenity difterickej kultúry v agare.
V priebehu uvažovanej reakcie sa vyzrážajú antigénne komplexy a protilátky. Precipitácia je imunologický jav, ktorý umožňuje určiť množstvo protilátok v krvnom sére chorého alebo očkovaného človeka a zvierat.

Dôsledok titrácie

Je dôležité vedieť, že údaje získané titráciou vyššie uvedenej metódy nie sú kvantifikovateľné. Na vytvorenie a analýzu kvantitatívneho hodnotenia obsiahnutého počtu protilátok vyvinuli M. Heidelberger a E. Kabat špeciálnu reakčnú techniku, ktorá je založená na hľadaní a identifikácii zóny ekvivalencie. Zmiešanie vekového počtu antigénov s konštantným objemom antiséra vedie k zvýšeniu pôvodne vytvoreného precipitátu a potom opäť k jeho zníženiu v dôsledku zvýšenia schopnosti rozpúšťať komplexy antigénov. Stanovením množstva protilátok v supernatantoch obsiahnutých v každej skúmavke môžete zistiť, že v určitom počte misiek s protilátkami bude chýbať tekutina. Tu sa v porovnaní s inými skúmavkami vytvorí najväčšia zrazenina. Vďaka tomu a odčítaniu precipitátu antigénneho proteínu od celkovej hodnoty proteínov je možné získať presnú hodnotu protilátok obsiahnutých v objeme špecificky študovaného séra. Ďalej je množstvo proteínových molekúl zrazeniny určené množstvom dusíka alebo kolorimetrickými metódami.

Odhad hodnôt

Hodnotenie hodnôt precipitácie v diagnostickej metodike by malo brať do úvahy možnosť prítomnosti protilátky, ktorá nemá vlastnosť precipitínu, v imunitnom sére, z čoho vyplýva, že samotná zrazenina sa po reakcii s antigény. Zoznam takýchto molekúl zahŕňa neúplné protilátky a niektoré druhy zo skupiny gama-A globulínov.

Precipitačná reakcia v laboratórnych podmienkach nachádza uplatnenie v rôznych typoch modifikácií. Napríklad termoprecipitačná reakcia sa používa na detekciu bakteriálnych antigénov botulizmu, antraxu atď., ktoré nepodliehajú tepelnej denaturácii. Na rozdiel od kruhového zrážania tento typ reakcie využíva filtráty príslušného materiálu vo varenom stave.
zrážanie v komplexnej zmesi neumožňuje charakterizovať vlastnosti jednotlivých prvkov zmesi. V takýchto prípadoch sa človek uchýli k metóde zrážania v agare a tiež používa imunoelektroferézu.

Difúzne zrážky

V tejto oblasti výskumu existuje koncept difúznej precipitačnej reakcie (RPD). Je založená na schopnosti difundovať v géli protilátky a rozpustné antigény. Difúzia je schopnosť molekuly určitej látky prenikať do molekúl inej, čo je spôsobené tepelným pohybom.
Gél je systém dispergovaného typu, v ktorom je kvapalná fáza distribuovaná rovnomerne v pevnej fáze. Najčastejšie sa na takúto reakciu používa agarový gél.
Po zadaní parametrov, pri ktorých môžu molekuly voči sebe difundovať, bude ich stretnutie sprevádzané tvorbou komplexu antigén + protilátka. Takýto novotvar je schopný difundovať v samotnom géli a vyzráža sa vo forme prúžku, ktorý možno zistiť voľným okom. Ak sú antigén a protilátka homológne, nevytvorí sa žiadny pás.
Vytvorenie podmienok, za ktorých bude difúzia prebiehať v agarovej vrstve, zahŕňa naplnenie komponentov, ale celkový počet jamiek a ich relatívna poloha je určená typom problému, ktorý je potrebné vyriešiť. RPD umožňuje osobe detekovať a identifikovať neznáme izolované vírusy testovaním pomocou známych protilátkových sér.

Aplikácia

Zrážky majú široké využitie nielen pri diagnostike chorôb, ale svoje uplatnenie nachádzajú aj pri súdnolekárskom skúmaní. Je ťažké si predstaviť analýzu, v ktorej je možné určiť druh krvi, časť orgánu alebo tkaniva nájdené na zločineckej zbrani, ktorá nevyužíva zrážaciu reakciu. Pri tomto procese sa používajú zrážacie séra, ktoré sa získavajú imunizáciou rôznych zvierat a vtákov. Je dôležité, aby hladina titra v sére nebola nižšia ako 1:10 000 a tiež musí mať dostatočnú špecifickosť. Z zistenej škvrny krvi alebo jej kôry sa robí extrakt na fyzikálne. roztoku, ktorý bude ďalej vystavený vyzrážaniu séra. Podľa tejto reakcie je možné stanoviť typy tkanivových a orgánových proteínov ľudí aj zvierat. Získanie zakalených extraktov núti človeka uchýliť sa k vyzrážaniu na agare.

závery

Analýzou prečítaných informácií môžeme konštatovať, že zrážacie reakcie sú pre človeka mimoriadne dôležité, pretože umožňujú diagnostikovať rôzne antigény pomocou protilátok, tento jav je tiež široko používaný pri súdnom lekárskom vyšetrení a umožňuje vám identifikovať typ krvi, tkaniva alebo orgánu. vo vzťahu ku konkrétnemu predmetu. Existuje viacero druhov a spôsobov zrážok, ktoré sa využívajú v súlade s vznikajúcimi potrebami riešeného problému.

Precipitačná reakcia (RP) je tvorba a precipitácia komplexu rozpustného molekulárneho antigénu s protilátkami vo forme oblaku nazývaného precipitát. Vzniká zmiešaním antigénov a protilátok v ekvivalentných množstvách; nadbytok jedného z nich znižuje úroveň tvorby imunitného komplexu.

RP sa umiestňuje do skúmaviek (krúžková precipitačná reakcia), do gélov, živných médií atď. Široko sa používajú odrody RP v polotekutom agare alebo agarózovom géli: Ouchterlonyho dvojitá imunodifúzia, radiálna imunodifúzia, imunoelektroforéza atď.

Mechanizmus. Vykonáva sa s transparentnými koloidnými rozpustnými antigénmi extrahovanými z patologického materiálu, predmetov prostredia alebo čistých bakteriálnych kultúr. Reakcia využíva transparentné diagnostické precipitačné séra s vysokými titrami protilátok. Za titer precipitujúceho séra sa považuje najvyššie riedenie antigénu, ktoré pri interakcii s imunitným sérom spôsobuje tvorbu viditeľnej zrazeniny – zákal.

Kruhová precipitačná reakcia sa umiestni do úzkych skúmaviek (priemer 0,5 cm), do ktorých sa pridá 0,2 až 0,3 ml precipitujúceho séra. Potom sa pomocou Pasteurovej pipety pomaly navrství 0,1-0,2 ml roztoku antigénu. Skúmavky sa opatrne prenesú do zvislej polohy Reakcia sa zaznamená po 1-2 minútach V prípade pozitívnej reakcie sa na hranici medzi sérom a skúmaným antigénom objaví zrazenina vo forme bieleho krúžku. V kontrolných skúmavkách sa nevytvára žiadna zrazenina.

15. Reakcia zahŕňajúca komplement: hemolytická reakcia, reakcia fixácie komplementu. Mechanizmus, komponenty, aplikácia.

Reakcia fixácie komplementu (RCC) spočíva v tom, že pri vzájomnej korešpondencii antigénov a protilátok vytvoria imunitný komplex, ku ktorému je prostredníctvom Fc fragmentu protilátok pripojený komplement (C), t.j. komplement je viazaný antigénom- komplex protilátok. Ak sa nevytvorí komplex antigén-protilátka, komplement zostáva voľný.

Špecifická interakcia AG a AT je sprevádzaná adsorpciou (väzbou) komplementu. Keďže proces fixácie komplementu nie je viditeľný vizuálne, J. Bordet a O. Zhangu navrhli použiť hemolytický systém (ovčie erytrocyty + hemolytické sérum) ako indikátor, ktorý ukazuje, či je komplement fixovaný

AG-AT komplex. Ak si AG a AT navzájom zodpovedajú, teda vznikol imunitný komplex, potom sa komplement naviaže na tento komplex a nedochádza k hemolýze. Ak AT nezodpovedá AG, potom sa komplex nevytvorí a komplement, ktorý zostane voľný, sa spojí s druhým systémom a spôsobí hemolýzu.

Komponenty. Komplement fixačný test (RCC) je komplexný sérologický test. Na jeho realizáciu je potrebných 5 zložiek, a to: AG, AT a komplement (prvý systém), ovčie erytrocyty a hemolytické sérum (druhý systém).

Antigénom pre CSC môžu byť kultúry rôznych usmrtených mikroorganizmov, ich lyzáty, zložky baktérií, patologicky zmenené a normálne orgány, tkanivové lipidy, vírusy a materiály obsahujúce vírusy.

Ako doplnok sa používa čerstvé alebo suché sérum pre morčatá.

Mechanizmus. RSK sa uskutočňuje v dvoch fázach: 1. fáza - inkubácia zmesi obsahujúcej tri zložky antigén + protilátka + komplement; 2. fáza (indikátor) - detekcia voľného komplementu v zmesi pridaním hemolytického systému pozostávajúceho z ovčích erytrocytov a hemolytického séra obsahujúceho protilátky proti nim. V 1. fáze reakcie pri tvorbe komplexu antigén-protilátka dochádza k väzbe komplementu a následne v 2. fáze nedôjde k hemolýze erytrocytov senzibilizovaných protilátkami; reakcia je pozitívna. Ak sa antigén a protilátka nezhodujú (v testovanej vzorke nie je antigén alebo protilátka), komplement zostáva voľný a v 2. fáze sa spojí s komplexom erytrocyt-antierytrocytová protilátka, čo spôsobí hemolýzu; reakcia je negatívna.Aplikácia. RSK sa používa na diagnostiku mnohých infekčných chorôb, najmä syfilisu (Wassermanova reakcia)

imunodiagnostické reakcie. Reakcie antigén-protilátka a reakcie s označenými zložkami. Použitie na identifikáciu mikroorganizmov a diagnostiku infekčných chorôb.

Imunitné reakcie sa využívajú v diagnostických a imunologických štúdiách u chorých a zdravých ľudí. Na tento účel použite sérologické metódy(z lat. sérum - sérum a logá - doktrína), t. j. metódy na štúdium protilátok a antigénov pomocou reakcií antigén-protilátka stanovených v krvnom sére a iných tekutinách, ako aj v telesných tkanivách.

Detekcia protilátok proti antigénom patogénu v krvnom sére pacienta umožňuje diagnostikovať ochorenie. Sérologické štúdie sa používajú aj na identifikáciu mikrobiálnych antigénov, rôznych biologicky aktívnych látok, krvných skupín, tkanivových a nádorových antigénov, imunitných komplexov, bunkových receptorov atď.

Keď je mikrób izolovaný od pacienta, patogén sa identifikuje štúdiom jeho antigénnych vlastností pomocou imunodiagnostických sér, t. j. krvných sér hyperimunizovaných zvierat obsahujúcich špecifické protilátky. Tento tzv sérologická identifikácia mikroorganizmy.

V mikrobiológii a imunológii sa široko používa aglutinácia, precipitácia, neutralizačné reakcie, reakcie zahŕňajúce komplement, s použitím značených protilátok a antigénov (rádioimunologické, enzýmové imunostanovenie, imunofluorescenčné metódy). Uvedené reakcie sa líšia zaznamenaným efektom a technikou nastavenia, všetky sú však základné. van na reakciu interakcie antigénu s protilátkou a používajú sa na detekciu protilátok aj antigénov. Imunitné reakcie sa vyznačujú vysokou citlivosťou a špecifickosťou.

Princípy a schémy hlavných imunodiagnostických reakcií sú uvedené nižšie. Podrobná technika nastavenia reakcií je uvedená v. praktické pokyny pre imunodiagnostiku.

Aglutinačná reakcia - RA(z lat. agluti- národa- väzba) - jednoduchá reakcia, pri ktorej protilátky viažu korpuskulárne antigény (baktérie, erytrocyty alebo iné bunky, nerozpustné častice s na nich adsorbovanými antigénmi, ako aj makromolekulové agregáty). Vyskytuje sa v prítomnosti elektrolytov, napríklad keď sa pridá izotonický roztok chloridu sodného.

Používajú sa rôzne varianty aglutinačnej reakcie: expandovaná, približná, nepriama atď. Aglutinačná reakcia sa prejavuje tvorbou vločiek alebo sedimentu

RA sa používa na:

stanovenie protilátok v krvnom sére pacientov, napríklad s brucelózou (Wrightova, Heddelsonova reakcia), týfusom a paratýfusom (Vidalova reakcia) a inými infekčnými chorobami;

stanovenie patogénu izolovaného od pacienta;

stanovenie krvných skupín pomocou monoklonálnych protilátok proti alogénom erytrocytov.

Na stanovenie protilátok pacienta daťrozšírená aglutinačná reakcia: pridať do riedenia pacientovho krvného séra diagnosticum(suspenzia usmrtených mikróbov) a po niekoľkých hodinách inkubácie pri 37 °C je zaznamenané najvyššie zriedenie séra (sérový titer), pri ktorom došlo k aglutinácii, t.j. vytvoreniu zrazeniny.

Povaha a rýchlosť aglutinácie závisia od typu antigénu a protilátok. Príkladom je interakcia diagnostika (O- a R-antigénov) so špecifickými protilátkami. Aglutinačná reakcia s O-diagnostika(baktérie zabité teplom, ktoré si zachovávajú termostabilitu O antigén) vyskytuje sa vo forme jemnozrnnej aglutinácie. Aglutinačná reakcia s H-diagnosticum (baktérie usmrtené formalínom, zadržiavajúce tepelne labilný bičíkový H-antigén) je hrubozrnná a prebieha rýchlejšie.

Ak je potrebné určiť patogén izolovaný od pacienta, dajte orientačná aglutinačná reakcia, pomocou diagnostických protilátok (aglutinačné sérum), t.j. vykonáva sa sérotypizácia patogénu. Približná reakcia sa uskutoční na podložnom sklíčku. Ku kvapke diagnostického aglutinačného séra v riedení 1:10 alebo 1:20 pridajte čistú kultúru patogénu izolovaného od pacienta. V blízkosti je umiestnená kontrola: namiesto séra sa aplikuje kvapka roztoku chloridu sodného. Keď sa vločkovitý sediment objaví v kvapke so sérom a mikróbmi, dajú rozsiahla aglutinačná reakcia v skúmavkách so zvyšujúcim sa riedením aglutinačného séra, do ktorého sa pridajú 2-3 kvapky suspenzie patogénu. Aglutinácia sa zohľadňuje množstvom sedimentu a stupňom vyčírenia kvapaliny. Reakcia sa považuje za pozitívnu, ak je zaznamenaná aglutinácia v riedení blízkom titru diagnostického séra. Súčasne sa berú do úvahy kontroly: sérum zriedené izotonickým roztokom chloridu sodného by malo byť priehľadné, suspenzia mikróbov v tom istom roztoku by mala byť rovnomerne zakalená, bez sedimentu.

Rôzne príbuzné baktérie môžu byť aglutinované rovnakým diagnostickým aglutinačným sérom, čo sťažuje ich identifikáciu. Preto si užívajte adsorbované aglutinačné séra, z ktorých boli skrížene reagujúce protilátky odstránené adsorpciou ich príbuznými baktériami. V takýchto sérach zostávajú protilátky špecifické len pre túto baktériu. Prípravu monoreceptorových diagnostických aglutinačných sér týmto spôsobom navrhol A. Castellani (1902).

Reakcia nepriamej (pasívnej) hemaglutinácie (RNHA, RPHA) je založená na použití erytrocytov s antigénmi alebo protilátkami adsorbovanými na povrchu, ktorých interakcia s príslušnými protilátkami alebo antigénmi krvného séra guľôčky spôsobí, že sa erytrocyty zlepia a padnú na dno skúmavku alebo bunku V forma vrúbkovaného sedimentu (obr. 13.2). S negatívnou reakciou sa erytrocyty usadia vo forme "gombíka". Zvyčajne sa protilátky v RNHA detegujú pomocou antigénneho diagnostického erytrocytu, ktorým sú erytrocyty s adsorbovanými na sú to antigény. Niekedy využívame protilátkovú diagnostiku erytrocytov, na ktorých sa protilátky adsorbujú. Napríklad botulotoxín sa dá zistiť tak, že sa k nemu pridá protilátka erytrocytov botulinum diagnosticum (táto reakcia je tzv. reverzná nepriama hemaglutinačná reakcia- RONGA). RNHA sa používa na diagnostiku infekčných ochorení, stanovenie gonadotropného hormónu V moču, keď sa zistí tehotenstvo, na zistenie precitlivenosti na lieky, hormóny av niektorých ďalších prípadoch.

Koaglutinačná reakcia . Bunky patogénu sa určujú pomocou stafylokokov, vopred ošetrených imunitným diagnostickým sérom. Proteín obsahujúci stafylokoky A, majúci afinitu k Fc -fragment imunoglobulínov, nešpecificky adsorbujú antimikrobiálne protilátky, ktoré následne interagujú s aktívnymi centrami so zodpovedajúcimi mikróbmi izolovanými od pacientov. V dôsledku koagulácie sa vytvárajú vločky pozostávajúce zo stafylokokov, diagnostických sérových protilátok a mikróbu, ktorý sa určuje.

Reakcia inhibície hemaglutinácie (RTGA) je založená na blokáde, supresii antigénov vírusov protilátkami imunitného séra, v dôsledku čoho vírusy strácajú schopnosť aglutinovať červené krvinky (obr. 13.3). RTHA sa používa na diagnostiku mnohých vírusových ochorení, ktorých pôvodcovia (chrípka, osýpky, rubeola, kliešťová encefalitída atď.) môžu aglutinovať erytrocyty rôznych zvierat.

Aglutinačná reakcia na stanovenie krvných skupín používa sa na vytvorenie systému ABO (pozri časť 10.1.4.1) pomocou aglutinácie erytrocytov s protilátkami imunitného séra proti antigénom krvných skupín A (II), B (III). Kontroly sú: sérum bez protilátok, t.j. sérum AB (GU) krvné skupiny; antigény obsiahnuté v erytrocytoch skupín A (II), B (III). Negatívna kontrola neobsahuje žiadne antigény, t.j. používajú sa erytrocyty skupiny 0 (I).

IN aglutinačné reakcie na stanovenie Rh faktora(pozri časť 10.1.4.1) použite anti-Rh séra (najmenej dve rôzne série). V prítomnosti Rh antigénu na membráne študovaných erytrocytov dochádza k aglutinácii týchto buniek. Ako kontroly slúžia štandardné Rh-pozitívne a Rh-negatívne erytrocyty všetkých krvných skupín.

Aglutinačná reakcia na stanovenie protilátok proti Rhesus (nepriama Coombsova reakcia)používa sa u pacientov s intravaskulárnou hemolýzou. U niektorých z týchto pacientov sa nachádzajú protilátky proti Rhesus, ktoré sú neúplné, monovalentné. Špecificky interagujú s Rh-pozitívnymi erytrocytmi, ale nespôsobujú ich aglutináciu. Prítomnosť takýchto neúplných protilátok sa stanovuje v nepriamej Coombsovej reakcii. K tomu sa do systému anti-Rh protilátok + Rh-pozitívnych erytrocytov pridáva antiglobulínové sérum (protilátky proti ľudským imunoglobulínom), ktoré spôsobuje aglutináciu erytrocytov (obr. 13.4). Pomocou Coombsovej reakcie sa diagnostikujú patologické stavy spojené s intravaskulárnou lýzou erytrocytov imunitného pôvodu, napríklad hemolytická choroba novorodenca: erytrocyty Rh pozitívneho plodu sa kombinujú s neúplnými protilátkami proti Rh faktoru cirkulujúcimi v krvi, ktoré sa krížili placenta od Rh-negatívnej matky.

Zrážacie reakcie

zrážacia reakcia - RP (odlat. praeci-pito- precipitát,) je tvorba a vyzrážanie komplexu rozpustného molekulového antigénu s protilátkami vo forme zákalu, tzv. zrazenina. Vzniká zmiešaním antigénov a protilátok v ekvivalentných množstvách; nadbytok jedného z nich znižuje úroveň tvorby imunitného komplexu.

Zrážacie reakcie vložené do skúmaviek (reakcia zrážania prstenca), v géloch, živných médiách atď. Odrody precipitačnej reakcie v polotekutom géli agaru alebo agarózy sú široko používané: dvojitá imunodifúzia podľa Ouchterlonyho. radiálna imunodifúzia, imunoelektroforéza atď.

Reakcia zrážania kruhu . Reakcia prebieha v úzkych precipitačných skúmavkách s imunitným sérom, na ktorom je navrstvený rozpustný antigén. Pri optimálnom pomere antigénu a protilátok sa na hranici týchto dvoch roztokov vytvorí nepriehľadný prstenec precipitátu (obr. 13.5). Nadbytok antigénu neovplyvňuje výsledok reakcie zrážania kruhu v dôsledku postupnej difúzie činidiel na hranicu kvapaliny. Ak sa ako antigény v kruhovej precipitačnej reakcii použijú prevarené a prefiltrované vodné extrakty orgánov alebo tkanív, potom sa takáto reakcia nazýva tzv. termoprecipitačná reakcia-iii (Ascoliho reakcia, s antraxom /

Oukhteruniho dvojitá imunodifúzna reakcia . Na nastavenie reakcie sa roztopený agarový gél naleje v tenkej vrstve na sklenenú platňu a po vytvrdnutí sa do nej vyrežú otvory o veľkosti 2-3 mm. Antigény a imunitné séra sú umiestnené oddelene v týchto jamkách, ktoré difundujú smerom k sebe. V mieste stretnutia v ekvivalentných pomeroch tvoria zrazeninu vo forme bieleho pásu. Vo viaczložkových systémoch sa medzi jamkami s rôznymi antigénmi a sérovými protilátkami objaví niekoľko línií precipitátu; pre identické antigény sa línie precipitátu spájajú; pri neidentických sa prelínajú (obr. 13.6).

Radiálna imunodifúzna reakcia . Imunitné sérum s roztaveným agarovým gélom sa rovnomerne naleje na pohár. Po stuhnutí v géli sa urobia jamky, do ktorých sa vloží antigén v rôznych riedeniach. Antigén difundujúci do gélu vytvára kruhové precipitačné zóny okolo jamiek s protilátkami (obr. 13.7). Priemer precipitačného prstenca je úmerný koncentrácii antigénu. Reakcia sa používa na stanovenie krvných hladín imunoglobulínov rôznych tried, zložiek komplementového systému atď.

Imunoelektroforéza- kombinácia metódy elektroforézy a imunoprecipitácie: zmes antigénov sa zavedie do jamiek gélu a separuje sa v géli pomocou elektroforézy. Potom sa paralelne so zónami elektroforézy zavedie do drážky imúnne sérum, ktorého protilátky sa difundujú do gélu a tvoria sa v mieste stretnutia s antigénom precipitačnej línie.

flokulačná reakcia(podľa Ramona) (z lat. vločka- vlnené vločky) - objavenie sa opalescencie alebo flokulentnej hmoty (imunoprecipitácia) v skúmavke počas reakcie toxín-antitoxín alebo anatoxín-antitoxín. Používa sa na stanovenie aktivity antitoxického séra alebo toxoidu.

Imunitná elektrónová mikroskopia- elektrónová mikroskopia mikróbov, častejšie vírusov, ošetrených vhodnými protilátkami. Vírusy ošetrené imunitným sérom tvoria imunitné agregáty (mikroprecipitáty). Okolo viriónov sa vytvára "korolla" protilátok, na rozdiel od kyseliny fosfowolfrámovej alebo iných elektrónovo-opticky hustých prípravkov.

Reakcie zahŕňajúce komplement

Reakcie zahŕňajúce komplementna základe aktivácie komplementu komplexom antigén-protilátka (reakcia fixácie komplementu, radiálna hemolýza a pod.).

Reakcia fixácie komplementu (RSK) spočíva v tom, že pri vzájomnej korešpondencii tvoria antigény a protilátky imunitný komplex, na ktorý sa cez Fc -fragment protilátok spája komplement (C), t.j. väzba komplementu nastáva s komplexom antigén-protilátka. Ak sa nevytvorí komplex antigén-protilátka, komplement zostáva voľný (obr. 13.8). RSK sa uskutočňuje v dvoch fázach: 1. fáza - inkubácia zmesi obsahujúcej tri zložky antigén + protilátka + komplement; 2. fáza (indikátor) - detekcia voľného komplementu v zmesi pridaním hemolytického systému pozostávajúceho z ovčích erytrocytov a hemolytického séra obsahujúceho protilátky proti nim. V 1. fáze reakcie pri tvorbe komplexu antigén-protilátka dochádza k väzbe komplementu a následne v 2. fáze nedôjde k hemolýze erytrocytov senzibilizovaných protilátkami; reakcia je pozitívna. Ak si antigén a protilátka navzájom nezodpovedajú (v testovanej vzorke nie je antigén alebo protilátka), komplement zostáva voľný a v 2. fáze sa spojí s komplexom erytrocyt-antierytrocytová protilátka, čo spôsobí hemolýzu; reakcia je negatívna.

RSK sa používa na diagnostiku mnohých infekčných chorôb, najmä syfilisu (Wassermanova reakcia).

Reakcia radiálnej hemolýzy (RRH ) umiestnené do jamiek agarového gélu obsahujúceho baranie erytrocyty a komplement. Po pridaní hemolytického séra (protilátky proti baraním erytrocytom) do jamiek gélu sa okolo nich vytvorí hemolytická zóna (ako výsledok radiálnej difúzie protilátok). Tak je možné stanoviť aktivitu komplementu a hemolytického séra, ako aj protilátok v krvnom sére pacientov s chrípkou, rubeolou, kliešťovou encefalitídou. Na tento účel sa na erytrocyty adsorbujú zodpovedajúce antigény vírusu a do jamiek gélu, ktorý tieto erytrocyty obsahuje, sa pridá krvné sérum pacienta. Antivírusové protilátky interagujú s vírusovými antigénmi adsorbovanými na erytrocytoch po

Komponenty komplementu sa pripájajú k tomuto komplexu a spôsobujú hemolýzu.

Imunitná adhézna reakcia (RIP ) je založená na aktivácii komplementového systému korpuskulárnymi antigénmi (baktériami, vírusmi) ošetrenými imunitným sérom. Výsledkom je vytvorenie aktivovanej tretej zložky komplementu (C3b), ktorá sa naviaže na korpuskulárny antigén ako súčasť imunitného komplexu. Na erytrocytoch, krvných doštičkách, makrofágoch sú receptory pre C3b, vďaka ktorým sa tieto bunky zmiešajú s imunitnými komplexmi nesúcimi C3b a zlučujú sa a aglutinujú.

Neutralizačná reakcia

Protilátky imunitného séra sú schopné neutralizovať škodlivý účinok mikróbov alebo ich toxínov na citlivé bunky a tkanivá, ktorý je spojený s blokádou mikrobiálnych antigénov protilátkami, t.j. neutralizácia. Neutralizačná reakcia(RN) sa vykonáva zavedením zmesi antigén-protilátka do zvierat alebo do citlivých testovacích objektov (bunková kultúra, embryá). Pri absencii škodlivého účinku mikroorganizmov alebo ich antigénov, toxínov u zvierat a testovaných predmetov hovoria o neutralizačnom účinku imunitného séra a teda o špecifickosti interakcie komplexu antigén-protilátka (obr. 13.9).

Imunofluorescenčná reakcia - RIF (Koonsova metóda)

Existujú tri hlavné varianty metódy: priama, nepriama (obr. 13.10), s doplnkom. Koonsova reakcia je rýchla diagnostická metóda na detekciu mikrobiálnych antigénov alebo detekciu protilátok.

Priama metóda RIF je založená na skutočnosti, že tkanivové antigény alebo mikróby ošetrené imunitným sérom s protilátkami značenými fluorochrómmi sú schopné žiariť v UV lúčoch fluorescenčného mikroskopu.

Baktérie v nátere ošetrené takýmto luminiscenčným sérom žiaria pozdĺž okraja bunky vo forme zeleného okraja.

Nepriama metóda RIF je identifikovať komplex antigén-protilátka pomocou antiglobulínového (protilátkového) séra označeného fluorochrómom. Na tento účel sa nátery zo suspenzie mikróbov ošetria protilátkami antimikrobiálneho králičieho diagnostického séra. Potom sa protilátky, ktoré nie sú naviazané na mikrobiálne antigény, vymyjú a protilátky zostávajúce na mikróboch sa detegujú ošetrením náteru antiglobulínovým (antikráličím) sérom značeným fluorochrómmi. V dôsledku toho sa vytvorí komplexný mikrób + antimikrobiálne králičie protilátky + anti-králičie protilátky značené fluorochrómom. Tento komplex sa pozoruje vo fluorescenčnom mikroskope, ako pri priamej metóde.

ELISA metóda alebo analýza (ELISA)

ELISA -detekcia antigénov pomocou ich zodpovedajúcich protilátok konjugovaných so značkovacím enzýmom (chrenová peroxidáza, beta-galaktozidáza alebo alkalická fosfatáza). Po spojení antigénu s enzýmom značeným imunitným sérom sa do zmesi pridá substrát/chromogén. Substrát sa štiepi enzýmom a mení sa farba reakčného produktu - intenzita farby je priamo úmerná počtu naviazaných molekúl antigénu a protilátky.

ELISA na pevnej fáze - najbežnejší variant imunologického testu, kedy je jedna zo zložiek imunitnej odpovede (antigén alebo protilátky) adsorbovaná na pevnom nosiči, napríklad v jamkách polystyrénových platní

Pri stanovení protilátok sa krvné sérum pacienta, antiglobulínové sérum značené enzýmom a substrát (chromogén) pre enzým postupne pridávajú do jamiek doštičiek s adsorbovaným antigénom.

Vždy po pridaní ďalšej zložky sa nenaviazané činidlá odstránia z jamiek dôkladným premytím. S pozitívnym výsledkom sa zmení farba roztoku chromogénu. Nosič v tuhej fáze môže byť senzibilizovaný nielen antigénom, ale aj protilátkami. Potom sa požadovaný antigén zavedie do jamiek s adsorbovanými protilátkami, pridá sa imunitné sérum proti antigénu označenému enzýmom a potom sa pridá substrát pre enzým.

Konkurenčná ELISA . cieľový antigén a enzýmom značený antigén navzájom súťažia o väzbu obmedzeného množstva protilátok imunitného séra. Ďalším testom sú protilátky, ktoré hľadáte

a značené protilátky medzi sebou súťažia o antigény.

Rádioimunologická metóda alebo analýza (RIA)

Vysoko citlivá metóda založená na reakcii antigén-protilátka s použitím antigénov alebo protilátok značených rádionuklidom (125 J, 14 C, 3 H, 51 Cr atď.). Po ich interakcii sa výsledný rádioaktívny imunitný komplex oddelí a jeho rádioaktivita sa stanoví v príslušnom počítadle (beta alebo gama žiarenie):

intenzita žiarenia je priamo úmerná počtu naviazaných molekúl antigénu a protilátky.

O verzia RIA na pevnej fáze jedna z reakčných zložiek (antigén alebo protilátky) je adsorbovaná na pevnom nosiči, napríklad v jamkách polystyrénových mikročipov. Ďalšou verziou metódy je konkurenčné RIA. cieľový antigén a rádionuklidom značený antigén si navzájom konkurujú o naviazanie obmedzeného množstva protilátok imunitného séra. Táto možnosť sa používa na určenie množstva antigénu v testovanom materiáli.

RIA sa používa na detekciu antigénov mikróbov, stanovenie hormónov, enzýmov, liečivých látok a imunoglobulínov, ako aj iných látok obsiahnutých v testovanom materiáli v malých koncentráciách - 10 ~ | 0 -I0 ~ 12 g / l. Metóda predstavuje určité nebezpečenstvo pre životné prostredie.

Imunoblotting

Imunoblotting (IB)- vysoko citlivá metóda založená na kombinácii elektroforézy a ELISA alebo RIA.

Antigén sa izoluje pomocou elektroforézy na polyakrylamidovom géli, potom sa prenesie (blotovanie - z angl. škvrna, spot) z gélu na aktivovaný papier alebo nitrocelulózovú membránu a vyvolaný testom ELISA. Firmy vyrábajú takéto pásy s „blotami“

antigény. Na tieto prúžky sa aplikuje pacientovo sérum. Potom sa po inkubácii pacient umyje od nenaviazaných protilátok pacienta a aplikuje sa sérum proti ľudským imunoglobulínom značené enzýmom. Komplex antigén + protilátka pacienta + protilátka proti ľudskému Ig vytvorený na prúžku sa deteguje pridaním substrátu / chromogénu, ktorý pôsobením enzýmu mení farbu (obr. 13.12).

IB sa používa ako diagnostická metóda pri infekcii HIV atď.

13.1. Reakcie antigén-protilátka a ich použitie

Pri injekcii antigénu sa v tele tvoria protilátky. Protilátky sú komplementárne k antigénu, ktorý spôsobil ich syntézu, a sú schopné sa naň viazať. Väzba antigénov na protilátky pozostáva z dvoch fáz. Prvá fáza je špecifická, v ktorej dochádza k rýchlej väzbe antigénneho determinantu na aktívne centrum Fab fragmentu protilátok. Je potrebné poznamenať, že väzba je spôsobená van der Waalsovými silami, vodíkom a hydrofóbnymi interakciami. Sila väzby je určená stupňom priestorovej zhody medzi aktívnym miestom protilátky a epitopom antigénu. Po špecifickej fáze nastupuje pomalšia - nešpecifická, ktorá sa prejavuje viditeľným fyzikálnym javom (napríklad tvorbou vločiek pri aglutinácii a pod.).

Imunitné reakcie sú interakcie medzi protilátkami a antigénmi a tieto reakcie sú špecifické a vysoko citlivé. Sú široko používané v lekárskej praxi. Pomocou imunitných reakcií je možné vyriešiť tieto úlohy:

Stanovenie neznámych protilátok známymi antigénmi (antigenic diagnosticum). Takouto úlohou je, keď je potrebné stanoviť protilátky proti patogénu v krvnom sére pacienta (sérodiagnostika). Nájdenie protilátok vám umožňuje potvrdiť diagnózu;

Stanovenie neznámych antigénov známymi protilátkami (diagnostické sérum). Táto štúdia sa vykonáva pri identifikácii kultúry patogénu izolovaného z materiálu pacienta (sérotypizácia), ako aj pri detekcii

antigény mikróbov a ich toxínov v krvi a iných biologických tekutinách. Existuje mnoho typov imunitných reakcií, ktoré sa líšia technikou nastavenia a zaznamenaným efektom. Sú to aglutinačné reakcie (RA), precipitácia (RP), reakcie zahŕňajúce komplement (RCC), reakcie s použitím značených komponentov (RIF, ELISA, RIA).

13.2. Aglutinačná reakcia

Aglutinačná reakcia (RA) je imunitná reakcia interakcie antigénu s protilátkami za prítomnosti elektrolytov a antigén je v korpuskulárnom stave (erytrocyty, baktérie, latexové častice s adsorbovanými antigénmi). Pri aglutinácii dochádza k zlepovaniu korpuskulárnych antigénov protilátkami, čo sa prejavuje tvorbou flokulentnej zrazeniny. K tvorbe vločiek dochádza vďaka tomu, že protilátky majú dve aktívne centrá, pričom antigény sú polyvalentné, t.j. majú viacero antigénnych determinantov. RA sa používa na identifikáciu patogénu izolovaného z materiálu pacienta, ako aj na detekciu protilátok proti patogénu v krvnom sére pacienta (napríklad Wrightova a Huddlesonova reakcia pri brucelóze, Vidalova reakcia pri brušnom týfuse a paratýfusu ).

Najjednoduchší spôsob nastavenia RA je reakcia na skle, ide o približnú RA, ktorá sa používa na určenie patogénu izolovaného od pacienta. Pri nastavení reakcie na podložné sklíčko sa aplikuje diagnostické aglutinačné sérum (v riedení 1:10 alebo 1:20), následne sa zavedie kultúra od pacienta. Reakcia je pozitívna, ak sa v kvapke objaví vločkovitá zrazenina. V blízkosti je umiestnená kontrola: namiesto séra sa aplikuje kvapka roztoku chloridu sodného. Ak je diagnostické aglutinačné sérum neadsorbované 1, tak sa riedi (na titer - riedenie, na ktoré má dôjsť k aglutinácii), t.j. vložte expandovanú RA do skúmaviek so zvyšujúcou sa hodnotou

1 Neadsorbované aglutinačné sérum môže aglutinovať príbuzné baktérie, ktoré majú bežné (skrížene reagujúce) antigény. Preto si užívajteadsorbované aglutinačné séra, z ktorých boli skrížene reagujúce protilátky odstránené adsorpciou ich príbuznými baktériami. V takýchto sérach zostávajú protilátky špecifické len pre túto baktériu.

riedenia aglutinačného séra, do ktorého sa pridajú 2-3 kvapky suspenzie patogénu izolovaného od pacienta. Aglutinácia sa zohľadňuje podľa množstva sedimentu a stupňa vyčírenia kvapaliny v skúmavkách. Reakcia sa považuje za pozitívnu, ak je zaznamenaná aglutinácia v riedení blízkom titru diagnostického séra. Reakcia je sprevádzaná kontrolami: sérum zriedené izotonickým roztokom chloridu sodného by malo byť priehľadné, suspenzia mikróbov v tom istom roztoku by mala byť rovnomerne zakalená, bez sedimentu.

Na stanovenie protilátok proti patogénu v krvnom sére pacienta sa používa rozšírená RA. Keď sa vloží do skúmaviek, krvné sérum pacienta sa zriedi a do skúmaviek sa pridá rovnaké množstvo suspenzie diagnosticum (suspenzia usmrtených mikróbov). Po inkubácii sa určí najvyššie riedenie séra, pri ktorom došlo k aglutinácii, t.j. vytvorila sa zrazenina (sérový titer). V tomto prípade dochádza k aglutinačnej reakcii s O-diagnosticum (baktérie usmrtené zahrievaním, zachovávajúce si termostabilný O-antigén) vo forme jemnozrnnej aglutinácie. Aglutinačná reakcia s H-diagnosticum (baktérie usmrtené formalínom, zadržiavajúce tepelne labilný bičíkový H-antigén) je hrubozrnná a prebieha rýchlejšie.

Reakcia nepriamej (pasívnej) hemaglutinácie(RNGA alebo RPGA) je typ RA. Táto metóda je vysoko citlivá. Pomocou RNGA možno vyriešiť dve úlohy: stanoviť protilátky v krvnom sére pacienta, ku ktorému sa pridáva antigénne erytrocytové diagnosticum, čo sú erytrocyty, na ktorých sú adsorbované známe antigény; určiť prítomnosť antigénov v testovanom materiáli. V tomto prípade sa reakcia niekedy nazýva reverzná nepriama hemaglutinačná reakcia (RONGA). Pri stagingu sa do testovaného materiálu pridáva protilátkové erytrocytové diagnosticum (erytrocyty s protilátkami adsorbovanými na ich povrchu). Erytrocyty v tejto reakcii pôsobia ako nosiče a pasívne sa podieľajú na tvorbe imunitných agregátov. Pri pozitívnej reakcii pasívne prilepené erytrocyty pokrývajú dno jamky rovnomernou vrstvou s vrúbkovanými okrajmi („dáždnik“); v neprítomnosti aglutinácie sa erytrocyty hromadia v centrálnom vybraní jamky a vytvárajú kompaktný "gombík" s ostro ohraničenými okrajmi.

Koaglutinačná reakcia používa sa na detekciu patogénnych buniek (antigénov) pomocou protilátok adsorbovaných na Staphylococcus aureus, obsahujúci proteín A. Proteín A má afinitu k Fc fragmentu imunoglobulínov. Vďaka tomu sa protilátky viažu na stafylokoka nepriamo cez Fc fragment a Fab fragmenty sú orientované smerom von a sú schopné interagovať so zodpovedajúcimi mikróbmi izolovanými od pacientov. V tomto prípade sa tvoria vločky.

Hemaglutinačná inhibičná reakcia (HITA) používané pri diagnostike vírusových infekcií a iba infekcií spôsobených hemaglutinačnými vírusmi. Tieto vírusy obsahujú na svojom povrchu proteín - hemaglutinín, ktorý je zodpovedný za hemaglutinačnú reakciu (RHA) po pridaní k vírusom erytrocytov. RTGA spočíva v blokovaní vírusových antigénov protilátkami, v dôsledku čoho vírusy strácajú schopnosť aglutinovať červené krvinky.

Coombsova reakcia - RA na detekciu neúplných protilátok. Pri niektorých infekčných ochoreniach, ako je brucelóza, cirkulujú v krvnom sére pacienta neúplné protilátky proti patogénu. Neúplné protilátky sa nazývajú blokujúce, pretože majú jedno väzbové miesto pre antigén a nie dve, ako sú plné protilátky. Preto, keď sa pridá antigénne diagnostické činidlo, neúplné protilátky sa viažu na antigény, ale nezlepujú ich. Na prejavenie reakcie sa pridáva antiglobulínové sérum (protilátky proti ľudským imunoglobulínom), čo povedie k aglutinácii imunitných komplexov (antigénne diagnosticum + neúplné protilátky) vytvorených v prvom štádiu reakcie.

Nepriama Coombsova reakcia sa používa u pacientov s intravaskulárnou hemolýzou. U niektorých z týchto pacientov sa našli neúplné monovalentné protilátky proti Rhesus. Špecificky interagujú s Rh-pozitívnymi erytrocytmi, ale nespôsobujú ich aglutináciu. Preto sa do systému anti-Rh protilátok + Rh-pozitívne erytrocyty pridáva antiglobulínové sérum, ktoré spôsobuje aglutináciu erytrocytov. Pomocou Coombsovej reakcie sa diagnostikujú patologické stavy spojené s intravaskulárnou lýzou erytrocytov imunitného pôvodu, napríklad hemolytická choroba novorodenca v dôsledku Rhesusovho konfliktu.

RA na stanovenie krvných skupín je založená na aglutinácii erytrocytov protilátkami imunitného séra na antigény krvných skupín A (II), B (III). Kontrolou je sérum, ktoré neobsahuje protilátky, t.j. krvné skupiny AB (IV) v sére a antigény erytrocytov skupín A (P) a B (III). Erytrocyty skupiny 0(I) sa používajú ako negatívna kontrola, pretože nemajú antigény.

Na stanovenie Rh faktora sa používajú anti-Rh séra (najmenej dve rôzne série). V prítomnosti Rh antigénu na membráne študovaných erytrocytov dochádza k aglutinácii týchto buniek.

13.3. zrážacia reakcia

RP je imunitná reakcia interakcie protilátok s antigénmi v prítomnosti elektrolytov a antigén je v rozpustnom stave. Pri precipitácii dochádza k vyzrážaniu rozpustných antigénov protilátkami, čo sa prejavuje zákalom vo forme precipitačných pásov. Tvorba viditeľnej zrazeniny sa pozoruje, keď sa obe činidlá zmiešajú v ekvivalentných pomeroch. Nadbytok jedného z nich znižuje množstvo vyzrážaných imunitných komplexov. Existujú rôzne spôsoby, ako nastaviť zrážaciu reakciu.

Reakcia zrážania kruhu umiestnené v zrážacích skúmavkách s malým priemerom. Imunitné sérum sa pridá do skúmavky a opatrne sa navrství rozpustný antigén. S pozitívnym výsledkom sa na hranici dvoch roztokov vytvorí mliečny krúžok. Kruhová precipitačná reakcia, ktorá určuje prítomnosť antigénov v orgánoch a tkanivách, ktorých extrakty sa varia a filtrujú, sa nazýva termoprecipitačná reakcia (Ascoliho reakcia na stanovenie termostabilného antraxového antigénu).

Ouchterlonyho dvojitá imunodifúzna reakcia. Táto reakcia sa uskutočňuje na agarovom géli. Jamky sa vyrežú v gélovej vrstve rovnomernej hrúbky v určitej vzdialenosti od seba a naplnia sa antigénom a imunitným sérom. Potom antigény a protilátky difundujú do gélu, stretávajú sa a vytvárajú imunitné komplexy, ktoré sa vyzrážajú v géli a stávajú sa viditeľnými ako línie precipitácie.

výživa. Táto reakcia sa môže použiť na detekciu neznámych antigénov alebo protilátok, ako aj na kontrolu podobnosti medzi rôznymi antigénmi: ak sú antigény identické, precipitačné línie sa spoja; ak antigény nie sú identické, precipitačné línie sa pretínajú; ak sú antigény čiastočne identické, vzniká ostroha.

Radiálna imunodifúzna reakcia. Do roztopeného agarového gélu sa pridajú protilátky a gél sa nanesie v rovnomernej vrstve na sklíčko. V géli sa vyrežú jamky a zavedie sa do nich štandardný objem roztokov antigénu rôznych koncentrácií. Počas inkubácie antigény radiálne difundujú z jamky a pri stretnutí s protilátkami vytvoria precipitačný kruh. Pokiaľ je v jamke nadbytok antigénu, dochádza k postupnému zväčšovaniu priemeru precipitačného prstenca. Táto metóda sa používa na stanovenie antigénov alebo protilátok v testovacom roztoku (napríklad na stanovenie koncentrácie imunoglobulínov rôznych tried v krvnom sére).

Imunoelektroforéza. Zmes antigénov sa predbežne oddelí elektroforézou, potom sa do drážky v smere pohybu proteínu zavedie zrážacie antisérum. Antigény a protilátky difundujú do gélu smerom k sebe; pri interakcii tvoria oblúkovité línie zrážok.

flokulačná reakcia(podľa Ramona) - druh precipitačnej reakcie, ktorá sa používa na stanovenie aktivity antitoxického séra alebo toxoidu. Reakcia sa uskutočňuje v skúmavkách. V skúmavke, kde sú toxoid a antitoxín v ekvivalentnom pomere, sa pozoruje zákal.

13.4. Reakcia fixácie komplementu

Protilátky, ktoré interagujú so zodpovedajúcim antigénom, viažu pridaný komplement (1. systém). Indikátorom fixácie komplementu sú erytrocyty senzibilizované hemolytickým sérom, t.j. protilátky proti erytrocytom (2. systém). Ak doplnok nie je v 1. systéme fixovaný, t.j. nedochádza k reakcii antigén-protilátka, potom sú senzibilizované červené krvinky úplne lyzované (negatívna reakcia). Keď je komplement viazaný imunitnými komplexmi 1. systému, po pridaní senzibilizovaných erytrocytov hemolýza

chýba (pozitívna reakcia). Reakcia fixácie komplementu sa používa na diagnostiku infekčných ochorení (kvapavka, syfilis, chrípka atď.).

13.5. Neutralizačná reakcia

Mikróby a ich toxíny majú škodlivý účinok na orgány a tkanivá ľudského tela. Protilátky sú schopné naviazať sa na tieto škodlivé látky a blokovať ich, t.j. neutralizovať. Diagnostická neutralizačná reakcia je založená na tejto vlastnosti protilátok. Vykonáva sa zavedením zmesi antigén-protilátka do zvierat alebo do citlivých testovacích objektov (bunková kultúra, embryá). Napríklad na detekciu toxínov v materiáli pacienta sa zvieratám 1. skupiny vstrekne materiál pacienta. Zvieratám z 2. skupiny sa injekčne podá podobný materiál vopred ošetrený vhodným antisérom. Zvieratá 1. skupiny uhynú v prítomnosti toxínu v materiáli. Druhá skupina zvierat prežije, škodlivý účinok toxínu sa neprejaví, pretože je neutralizovaný.

13.6. Reakcie využívajúce značené protilátky alebo antigény

13.6.1. Imunofluorescenčná reakcia (RIF, Koonsova metóda)

Táto metóda sa používa na expresnú diagnostiku. Dokáže detekovať mikrobiálne antigény aj protilátky.

Priama metóda RIF- imunitná reakcia interakcie protilátok s antigénmi a protilátky sú značené fluorochrómom - látkou schopnou vyžarovať svetelné kvantá určitej vlnovej dĺžky pri dopade svetla určitej vlnovej dĺžky. Zvláštnosťou nastavenia tejto metódy je potreba odstrániť nezreagované zložky, aby sa vylúčila detekcia nešpecifickej luminiscencie. Na tento účel vykonajte pranie nezreagovaných protilátok. Výsledky sa vyhodnocujú pomocou fluorescenčného mikroskopu. Baktérie v nátere ošetrenom takýmto luminiscenčným sérom žiaria na tmavom pozadí pozdĺž obvodu bunky.

Nepriama metóda RIF používaná viac ako predchádzajúca. Táto reakcia sa uskutočňuje v dvoch krokoch. V prvej fáze sa antigény navzájom

interagujú so zodpovedajúcimi protilátkami a vytvárajú imunitné komplexy. Všetky zložky, ktoré nezreagovali (t.j. nie sú súčasťou imunitných komplexov), sa musia odstrániť umytím. V druhom štádiu sa vytvorený komplex antigén-protilátka deteguje pomocou fluorochrómového antiglobulínového séra. V dôsledku toho vzniká komplexný mikrób + antimikrobiálne králičie protilátky + protilátky proti králičím imunoglobulínom značené fluorochrómom. Výsledky sa vyhodnocujú pomocou fluorescenčného mikroskopu.

13.6.2. Imunotest alebo test

ELISA je najbežnejšia moderná metóda používaná na diagnostiku vírusových, bakteriálnych, protozoálnych infekcií, najmä na diagnostiku infekcie HIV, vírusovej hepatitídy atď.

Existuje veľa modifikácií ELISA. Široko sa používa nekompetitívna ELISA na pevnej fáze. Uskutočňuje sa v 96-jamkových polystyrénových platniach (tuhá fáza). Počas reakcie je potrebné v každom stupni zmyť nezreagované zložky. Pri určovaní protilátok sa jamky, na ktorých sa adsorbujú antigény, naplnia skúmaným krvným sérom a potom antiglobulínovým sérom označeným enzýmom. Ukážte reakciu pridaním substrátu pre enzým. V prítomnosti enzýmu sa substrát mení a komplex enzým-substrát sa volí tak, aby sa produkt vzniknutý pri reakcii zafarbil. Pri pozitívnej reakcii sa teda pozoruje zmena farby roztoku. Na stanovenie antigénov sa nosič v tuhej fáze senzibilizuje protilátkami, potom sa postupne pridá testovaný materiál (antigény) a enzýmovo značené antigénne sérum. Na prejavenie reakcie sa zavedie substrát pre enzým. Pri pozitívnej reakcii nastáva zmena farby roztoku.

13.6.3. Imunoblotting

Táto metóda je založená na kombinácii elektroforézy a ELISA. Pri vykonávaní imunoblottingu (blotting z angl. škvrna- spot) komplexná zmes antigénov sa najskôr podrobí elektroforéze v polyakrylamidovom géli. Výsledná frakcionovaná anti-

génové peptidy sa prenesú na nitrocelulózovú membránu. Bloty sa potom ošetria enzýmom značenými protilátkami proti špecifickému antigénu, t.j. vykonajte ELISA blot. Imunoblotting sa používa pri diagnostike infekcií, ako je HIV.

13.6.4. Imunitná elektrónová mikroskopia

Metóda spočíva v mikroskopovaní vírusov (zriedkavo iných mikróbov) v elektrónovom mikroskope, ktoré boli predtým ošetrené vhodným imunitným sérom značeným elektrónovo-opticky hustými prípravkami, napríklad feritínom, proteínom obsahujúcim železo.

13.7. prietoková cytometria

Krvné bunky sa diferencujú na základe laserovej cytofluorometrie. Na tento účel sa požadované bunky zafarbia fluorescenčnými monoklonálnymi protilátkami proti CD antigénom. Vzorka krvi po ošetrení značenými protilátkami prechádza cez tenkú skúmavku a cez ňu prechádza laserový lúč, ktorý vybudí luminiscenciu fluorochrómu. Intenzita fluorescencie koreluje s hustotou antigénov na bunkovom povrchu a možno ju kvantifikovať pomocou fotonásobiča. Získané výsledky sa prevedú do histogramu.

Prietoková cytometria sa používa na stanovenie imunitného stavu (obsah hlavných populácií lymfocytov, obsah intracelulárnych a extracelulárnych cytokínov, funkčná aktivita NK buniek, aktivita fagocytózy atď.).

Vo forme zákalu, nazývaného zrazenina. Vzniká zmiešaním antigénov a protilátok v ekvivalentných množstvách; nadbytok jedného z nich znižuje úroveň tvorby imunitného komplexu. Precipitačná reakcia sa vloží do skúmaviek (krúžková precipitačná reakcia), do gélov, živných médií atď. Široko sa používajú rôzne zrážacie reakcie v polotekutom géli agaru alebo agarózy: Ouchterlonyho dvojitá imunodifúzia, radiálna imunodifúzia, imunoelektroforéza atď. .
Reakcia zrážania kruhu. Reakcia sa uskutočňuje v úzkych precipitačných skúmavkách: na imunitné sérum sa navrství rozpustný antigén. Pri optimálnom pomere antigénu a protilátok sa na hranici týchto dvoch roztokov vytvorí nepriehľadný prstenec precipitátu (obr. 7.50). Ak sa pri reakcii ako antigény použijú uvarené a prefiltrované tkanivové extrakty, potom sa takáto reakcia nazýva termoprecipitačná reakcia (Ascoliho reakcia, pri ktorej sa deteguje antraxový haptén).

Ryža. 7,50.

Ouchterlonyho dvojitá imunodifúzna reakcia.

Na nastavenie reakcie sa roztopený agarový gél naleje do tenkej vrstvy na sklenenú platňu a po stuhnutí sa do nej vyrežú otvory. Antigény a imunitné séra sú umiestnené oddelene v jamkách gélu, ktoré difundujú smerom k sebe. V mieste stretnutia v ekvivalentných pomeroch tvoria zrazeninu vo forme bieleho pásu (obr. 7.51). Vo viaczložkových systémoch sa medzi jamkami s antigénmi a protilátkami objaví niekoľko línií precipitátu; pri identických antigénoch sa precipitátové línie spájajú, pri neidentických antigénoch sa pretínajú.

Ryža. 7.51

Imunitné sérum s roztaveným agarovým gélom sa rovnomerne naleje na pohár. Po stuhnutí v géli sa urobia jamky, do ktorých sa v rôznych riedeniach umiestni antigén (Ag). Antigén difundujúci do gélu vytvára okolo jamiek s protilátkami prstencové precipitačné zóny. Priemer precipitačného prstenca je úmerný koncentrácii antigénu (obr. 7.52). Reakcia sa používa na stanovenie imunoglobulínov rôznych tried v krvnom sére, zložiek komplementového systému atď.

Ryža. 7.52.

Kombinácia elektroforézy a imunoprecipitácie: zmes antigénov sa zavedie do jamiek gélu a separuje sa v géli pomocou elektroforézy, potom sa do drážky gélu paralelne so zónami elektroforézy zavedie imúnne sérum. Protilátky imunitného séra difundujú do gélu a vytvárajú precipitačnú líniu v mieste „stretnutia“ s antigénom (obr. 7.53).

Ryža. 7.53.

Flokulačná reakcia (podľa Ramona) (z lat. vločka- vlnené vločky) - objavenie sa opalescencie alebo vločkovej hmoty (imunoprecipitácia) v skúmavke počas reakcie toxín-antitoxín alebo anatoxín-antitoxín (obr. 7.54). Používa sa na stanovenie aktivity antitoxického séra alebo toxoidu.

Ryža. 7.54.

Kmene pôvodcu záškrtu - C. diphtheriae môžu byť toxigénne (produkujúce exotoxín) a netoxické. Tvorba exotoxínu závisí od prítomnosti profága nesúceho tox gén kódujúci tvorbu exotoxínu v baktériách. V prípade ochorenia sa všetky izoláty testujú na toxigenitu - produkciu difterického exotoxínu pomocou precipitačnej reakcie v agare (obr. 7.55).

Ryža. 7,55