Diagnosticul de laborator al helmintiazelor. Metodă de izolare a unei culturi pure de Leishmania obţinută prin răzuirea ţesuturilor patologice

Metode simple

Metoda macroscopică. La examinarea fecalelor, puteți găsi helminți, capete, segmente și fragmente de strobila, eliberate independent sau după deparazitare. Această metodă este recomandată în special pentru identificarea enterobiazei, taeniazei și taeniarynchozei.

Porțiuni mici de fecale se amestecă cu apă într-o baie plată sau într-o cutie Petri și, vizionare iluminare buna pe un fundal întunecat, folosind o lupă dacă este necesar, îndepărtați helminții și toate formațiunile albe suspecte cu o pensetă sau o pipetă. Materialul colectat este transferat într-o altă ceașcă cu apă sau pe o lamă de sticlă într-o picătură de glicerol diluat sau soluție izotonică de clorură de sodiu pentru studii suplimentare.

Cu metoda de decantare, întreaga porțiune de fecale testată trebuie amestecată cu apă într-un cilindru de sticlă, apoi scursă cu grijă. strat superior apă. Acest lucru se repetă de mai multe ori. Când lichidul devine limpede, acesta este scurs, iar sedimentul este examinat în porții mici într-o baie de sticlă sau vas Petri, așa cum este indicat mai sus.

Metodele microscopice sunt principala modalitate de a examina fecalele pentru a detecta ouăle sau larvele de helminți. Diferitele metode de cercetare sunt descrise mai jos. Pentru a crește fiabilitatea examinării, testele pot fi repetate de mai multe ori pe zi sau cu un interval de 1-3 zile.

Metoda frotiului nativ. Frotiul nativ este cel mai frecvent și tehnic metoda disponibila studii fecale. Într-un frotiu nativ puteți detecta ouă și larve de helminți de toate tipurile. Cu toate acestea, dacă numărul de ouă din scaun este mic, acestea nu pot fi întotdeauna găsite. Prin urmare, examinarea scaunului folosind doar un frotiu nativ nu este completă și ar trebui completată cu metode de îmbogățire. Eficiența examinării unui frotiu nativ este îmbunătățită considerabil prin vizualizarea a patru lame preparate dintr-o probă de scaun pe două lame fără lame de acoperire, permițând examinarea unui total de aproximativ aceeași cantitate de scaun ca și în cazul metodei Kato (vezi mai jos).

O cantitate mică (de mărimea unui cap de chibrit) de fecale amestecate este unsă subțire cu un băț de lemn pe suprafața unei lame de sticlă într-o picătură de soluție de glicerină 50%. De obicei se prepară două frotiuri pe o singură lamă. Frotiul este vizualizat la un microscop cu mărire redusă (vol. 8, aprox. 7). În cazuri îndoielnice, acesta este acoperit cu o sticlă de acoperire și examinat la mărire mare (mărire 40).

Pentru a pregăti un frotiu nativ mare, 200-300 mg de fecale (de mărimea unui bob de mazăre mare) sunt măcinate pe sticlă de 6x9 cm în 15-20 picături dintr-o soluție apoasă 50% de glicerol. Vizualizare sub un microscop stereoscopic binocular (obv. 4, aprox. 12,5 sau ob. 2, aprox. 17) în lumină transmisă fără ochelari de protecție. În cazuri îndoielnice, puteți comuta obiectivul la o mărire mai mare. În astfel de frotiuri, ouăle mari colorate de helminți sunt clar vizibile, în timp ce ouăle transparente ale tenia pitic sunt oarecum mai rele. Această metodă nu este potrivită pentru detectarea ouălor mici. În același timp, un volum mare de material studiat și un câmp vizual mare cu o adâncime mare de câmp asigură o eficacitate semnificativă a acestei modificări în comparație cu un frotiu nativ convențional.

Frotiul gros cu celofan (metoda Kato) este mai eficient decât studiul unui frotiu nativ, dar necesită și combinarea cu metode de îmbogățire. Se depistează ouă de toate tipurile de helminți, totuși, pentru a depista ouă de tenia pitică (ouă transparente) sau opistorhide (ouă mici), tehnicianul de laborator trebuie să fie deosebit de atent să nu le rateze (Fig. 21).

Metoda se bazează pe detectarea ouălor de helminți într-un frotiu gros de fecale, curățate cu glicerină și colorate cu verde malachit. Celofanul prehidrofil este tăiat în plăci de 20 x 40 mm și scufundat în amestec Kato (6 ml de soluție apoasă 3% de verde de malachit, 500 ml de glicerină, 500 ml de soluție de fenol 6%). 3-5 ml de amestec sunt suficiente pentru 100 de farfurii, care sunt gata de utilizare într-o zi și pot fi păstrate în același amestec într-un recipient bine sigilat la temperatura camerei timp de 6 luni. În absența verdelui de malachit (recomandat pentru reducerea oboselii oculare a asistentului de laborator) și a fenolului (dezinfectant), puteți utiliza doar o soluție apoasă de glicerol 50%, eficacitatea studiului nu este redusă.

Orez. 20. Metoda de preparare a unui frotiu gros de scaun cu celofan conform lui Kato

Se aplică 100 mg de fecale pe o lamă de sticlă, acoperită cu o placă de celofan tratată conform indicațiilor de mai sus și presată cu un dop de cauciuc, astfel încât fecalele să nu se răspândească de sub celofan. Microscopia la mărire mică sau mare a microscopului se efectuează nu mai târziu de 1 oră (pe vreme caldă - 30-40 de minute) după pregătirea frotiului. Motivul opacității medicamentului poate fi un strat gros de fecale, procesarea slabă a plăcii în amestecul Kato sau perioada insuficientă de expunere a medicamentului sub celofan. Curățarea prelungită cu glicerină și uscarea excesivă a preparatului fac, de asemenea, dificilă detectarea ouălor.

Metoda de răsucire conform S.S. Shulman. Metoda este propusă pentru detectarea larvelor de helminți, în primul rând strongyloides, în fecale. Se examinează doar fecalele proaspăt excretate, dintre care 2-3 g sunt transferate într-un borcan de sticlă, agitate cu o baghetă de sticlă într-o mișcare circulară cu o cantitate de 3-5 ori de soluție fiziologică, fără a atinge pereții vasului. Ouăle și larvele de helminți se acumulează în centru. După ce amestecarea este completă, picătura de la capătul batonului este transferată rapid pe o lamă de sticlă, acoperită cu o lamă și examinată la microscop.

Metode de îmbogățire. Metodele de îmbogățire se bazează pe diferența dintre greutatea specifică a ouălor și soluția salină utilizată, ceea ce permite detectarea acestora în cantități mici. Dacă greutatea specifică a ouălor este mai mare decât greutatea specifică a lichidului, atunci ouăle sunt concentrate într-un sediment, care este examinat la microscop. Această metodă de sedimentare este utilizată pentru ouăle de trematode. Cu o greutate specifică mai mare a soluției, ouăle plutesc la suprafața lichidului și apoi filmul este examinat. Acestea sunt metode de flotație (plutitoare), ele sunt cele mai eficiente pentru detectarea ouălor de viermi anchilostome, tropici și tenii pitici.

Metode de flotare. Metoda Fulleborn se bazează pe plutirea ouălor de helminți într-o soluție saturată de clorură de sodiu, care are o densitate relativă mare (1,2), ceea ce face posibilă detectarea ouălor în cantități mici. Metoda este mai eficientă decât studierea unui frotiu nativ, deși este mai complicată. Avantajele metodei sunt costul redus și accesibilitatea. Se recomandă combinarea studiului frotiului nativ cu metoda Fulleborn.

O soluție saturată se prepară prin dizolvarea a 400 g de clorură de sodiu în 1 litru de apă în timp ce se fierbe. Densitatea relativă a soluției este 1,18-1,22. Soluția se păstrează într-o sticlă închisă. Pentru a efectua analiza, se pun 2-3 g de fecale într-un borcan cu un volum de 30-50 ml și, în timp ce se agită cu un bețișor, se adaugă aproape deasupra o soluție saturată de clorură de sodiu. O bandă de hârtie este folosită pentru a îndepărta rapid particulele mari plutitoare. După 45-60 de minute. După depunerea cu o buclă de sârmă, îndepărtați pelicula de suprafață și transferați-o pe o lamă de sticlă într-o picătură de soluție apoasă de glicerol 50%. În loc să îndepărtați filmul cu o buclă, puteți adăuga soluția din borcan în partea de sus, acoperiți cu o lamă de sticlă, pe suprafața căreia se lipesc ouăle plutitoare. Se pregătesc mai multe pregătiri. În plus, se examinează 2-4 preparate din sediment, colectându-le cu o pipetă oculară pe 2 lame de sticlă. Pe lângă pelicula de suprafață, este, de asemenea, necesar să se examineze sedimentul, deoarece ouăle de trematode, taeniide și ouă de viermi rotunzi nefertilizate nu plutesc în această soluție. Ouăle unui număr de helminți nu plutesc imediat la suprafață într-o soluție de sare. Deci, dacă numărul maxim de ouă de tenie pitic iese după 15-20 de minute, atunci ascaris - după 1,5-2 ore, vierme - după 2-3 ore.

Astfel, avantajele acestei metode includ costul redus și disponibilitatea ei, dezavantajele sunt necesitatea de a vizualiza preparatele pe pelicula de suprafață și sediment, precum și durata de decantare.

Metoda lui E.V.Kalantaryan este, de asemenea, o metodă de îmbogățire, dar este mai eficientă și mai simplă decât metoda Fulleborn. Se folosește o soluție saturată de azotat de sodiu cu o densitate relativă de 1,38. Prin urmare, ouăle majorității helminților plutesc și se găsesc în pelicula de suprafață; examinarea sedimentului nu este necesară.

Pentru a prepara o soluție saturată de azotat de sodiu, 1 kg de sare de azotat de sodiu (nitrat de sodiu) se dizolvă în 1 litru de apă și se fierbe până când se dizolvă complet și se formează o peliculă la suprafață. Fără a filtra, se toarnă într-o sticlă uscată. În absența azotatului de sodiu, acesta poate fi înlocuit cu azotat de amoniu (nitrat de amoniu), dizolvând 1,7 kg la 1 litru de apă. Densitatea relativă a soluției rezultate este de 1,3, ceea ce reduce ușor eficiența în comparație cu o soluție de azotat de sodiu.

Avantajele metodei: ouăle majorității helminților plutesc rapid și se găsesc în pelicula de suprafață, ceea ce elimină necesitatea examinării sedimentului. Dezavantajele metodei sunt deficiența azotatului de sodiu, precum și faptul că ouăle trematode și oncosferele taeniide nu plutesc și rămân în sediment. Trebuie avut în vedere că atunci când fecalele sunt ținute în soluție pentru o perioadă lungă de timp (mai mult de 1-2 ore), ouăle unor helminți încep să se umfle și să se așeze, dispărând din pelicula de suprafață.

Metode de sedimentare

Metoda lui P. P. Goryachev se bazează pe principiul sedimentării ouălor. În acest caz, frotiul se dovedește a fi ușor, fără impurități grosiere, ceea ce facilitează detectarea ouălor mici de trematode (opistorhide etc.). Greutatea specifică a ouălor de opistorc este mare, astfel încât acestea nu plutesc în soluții saline.

Într-un cilindru cu diametrul de 2-3 cm se toarnă 70-100 ml de soluție saturată de clorură de sodiu. Separat, se amestecă cu grijă 0,5 g de fecale în 20-25 ml apă și se filtrează cu grijă printr-o pâlnie cu două straturi de tifon într-un cilindru pentru o soluție salină, evitând amestecarea (astfel încât să se formeze două straturi clar delimitate). După 2-3 ore, stratul superior cu fecale este aspirat cu o pipetă, iar soluția salină rămasă este lăsată să stea timp de 12-20 ore sau centrifugata. Sedimentul este pipetat pe o lamă de sticlă, acoperit cu o lamă și examinat la microscop.

Metoda lui Goryachev a fost propusă pentru detectarea ouălor de opistorhide și s-a dovedit a fi mai eficientă decât studiul unui frotiu nativ și metoda Fulleborn. În prezent, pentru diagnosticul opistorhiei (clonorchiazei), metodele Kato și Kalantaryan sunt recomandate ca fiind destul de eficiente și mai simple din punct de vedere tehnic.

metoda lui Krasilnikov. Sub influența agenților tensioactivi incluși în detergenți, ouăle de helminți sunt eliberate din fecale și concentrate în sediment.

Pregătiți o soluție 1% de pudră de spălat Lotus. Pentru a face acest lucru, 10 g de pulbere se dizolvă în 1 litru de apă de la robinet. Dacă Lotus nu este disponibil, puteți folosi altele praf de spălat, dar trebuie să luați cât mai mult din fiecare dintre ele cât se va dizolva fără a forma sediment în 1 litru de apă de la robinet. 20-30 ml de soluție de detergent se toarnă într-un vas de sticlă cu o capacitate de 30-50 ml, o porție mică de fecale se pune acolo și se amestecă bine. Raportul dintre fecale și soluție ar trebui să fie de aproximativ 1:20. Fecalele trebuie să fie în soluție timp de cel puțin 24 de ore. În acest timp se formează în fund un sediment de 2-3 straturi. Stratul inferior este format din particule grosiere, grele, ouăle de helminți se adună în stratul mijlociu, iar stratul superior este fulgi gri-albicios. Apoi, folosind o pipetă, luați 2-3 picături de lichid din stratul mijlociu și transferați-l pe o lamă de sticlă. Se prepară 2 preparate pe o lamă, se acoperă cu o lamă și se examinează la microscop.

Metoda lui Krasilnikov face posibilă detectarea ouălor de toate tipurile de helminți excretați în fecale.

Metoda de sedimentare eter-formalină și metoda de sedimentare chimică cu Eficiență ridicată sunt foarte laborioase, în special în timpul examinărilor de masă; prin urmare, este mai recomandabil să se folosească metoda eter-acetică. Permite, după tratarea suplimentară a sedimentului cu reactivi chimici, obținerea aproape numai a ouălor de helminți, ceea ce facilitează identificarea ouălor mici de trematode. Această metodă s-a dovedit a fi universală, detectând ouăle tuturor helminților intestinali, chisturile protozoarelor intestinale și poate fi folosită și pentru a cuantifica intensitatea invaziei.

7 ml dintr-o soluție 10% se toarnă în tuburi gradate de centrifugă acid aceticși adăugați 1 g de fecale până la semnul de 8 ml. Fecalele sunt bine amestecate cu un bețișor până când se formează un amestec omogen și apoi filtrate prin două straturi de tifon într-un alt tub de centrifugă (astfel încât noua eprubetă a soluției strecurate să conțină din nou 8 ml; dacă este mai puțin, atunci puteți suplimentar clătiți pâlnia cu un bandaj cu o soluție de acid acetic 10%, prin care a filtrat soluția de fecale). Se adaugă 2 ml de eter în această eprubetă (până la marcajul de 10 ml), se oprește și se agită energic timp de 30 de secunde. Amestecul este centrifugat la 3000 rpm timp de 1 minut (sau 2 minute la 1500 rpm). Stratul de coagulant (sub formă de dop în partea superioară a eprubetei) este separat de pereții eprubetei cu un băț și scurs cu grijă împreună cu lichidul supernatant. Precipitatul (de obicei mic, incolor) este pipetat pe lame de sticlă, acoperit cu o lamă și examinat microscopic.

Protozoarele sunt împărțite în 4 clase:

Când este enchistat, microorganismul capătă o formă rotundă și este acoperit cu o înveliș protector. Sub formă de chist, protozoarele devin mai puțin susceptibile la factorii de mediu nefavorabili.

Următoarele pot face obiectul cercetării:

Notă:Există multe tipuri de diagnostice; vom lua în considerare acele tipuri care sunt cele mai comune în practica clinică de laborator.

Tipuri private de diagnosticare

În fiecare caz specific, asistentul de laborator are sarcina de a găsi un anumit agent patogen; uneori, alții sunt descoperiți împreună cu cel principal.

Există 6 specii ale acestui microorganism capabile să trăiască în intestinul uman. Numai ameba dizenterică, care apare sub formă vegetativă și sub formă de chisturi, are semnificație clinică.

În plus, se folosesc metode imunologice:

imunofluorescență indirectă;
aglutinare indirectă (INA);
imunodifuzie radială.

Notă: metode serologice sunt neinformative și sunt folosite doar ca adaos la cele principale în cazuri îndoielnice.

Diagnosticarea ciliatelor (ciliatelor)

Forma patogenă a microorganismelor din acest gen este balantidium. Acesta este un microb care provoacă balantidiaza, o boală însoțită de un proces ulcerativ al intestinului gros. Agentul patogen este detectat în frotiul nativ sub forma unei forme vegetative și a unui chist. Materialul pentru frotiu (fecale și mucus) este prelevat în timpul unui examen sigmoidoscopic și semănat pe medii speciale.

Diagnosticul flagelaților (Leishmania, Giardia, Trypanosomes, Trichomonas)

Leishmania, tripanozomii, lamblia și trichomonas sunt periculoase pentru oameni.

Leishmania- microbi, provocând leishmanioză, sunt examinate în frotiuri de sânge, materiale măduvă osoasă, zgârieturi de la infiltrate cutanate. În unele cazuri, la diagnosticarea leishmaniei, se utilizează cultura pe medii nutritive.

Tripanozomi– agenți cauzali ai bolii somnului (tripanosomiaza americană/africană sau boala Chagas).

Varianta africană este determinată în perioada inițială în timpul studiului sângelui periferic. Pe măsură ce boala progresează, microbii patologici se găsesc în materialul puncțiilor ganglionilor limfatici, iar în stadii avansate - în lichidul cefalorahidian.

Pentru a diagnostica tripanozomii dacă se suspectează boala Chagas, materialul examinat este examinat la microscop la o mărire mică. În acest caz, frotiurile și picătura groasă sunt pre-pătate.

Trichomonas(intestinale, orale) sunt detectate prin microscopie a materialelor prelevate din mucoasele afectate.

Identificarea sporozoarelor (plasmodul malaric, agentul cauzal al coccidozei etc.)

Cea mai răspândită și periculoasă specie pentru oameni este plasmodiumul malaric, care are 4 tipuri principale de patogeni: agentul cauzal al malariei de trei zile, al malariei de patru zile, al malariei tropicale și al malariei ovale.

Dezvoltarea sexuală a Plasmodium (sporogonie) are loc la țânțarii Anopheles. Asexual (schizogonie tisulară și eritrocitară) - în țesutul și eritrocitele hepatice umane. Aceste caracteristici ciclu de viață trebuie luate în considerare la diagnosticarea plasmodiului malaric.

Astfel, în sângele unui pacient nou bolnav, pot fi detectate celule germinale ale ciclului de sporogonie. Dar la apogeul atacurilor de malarie, schizoții apar în număr mare în sânge.

Mai mult, în diferite faze ale febrei malarie apar diferite forme de plasmodium:

în perioada de frig, sângele se umple cu merozoiți, un tip de schizont;
la temperaturi ridicate, trofozoiții în formă de inel se acumulează în eritrocite;
o scădere a temperaturii se caracterizează printr-o predominanță a trofozoiților asemănătoare amibei;
în perioadele de stare normală, sângele conține forme adulte de schizonți.

Studiul agentului cauzal al malariei (plasmodul malaric) se efectuează într-un frotiu și într-o picătură groasă.

Notă:Diagnosticul malariei prin examinarea frotiurilor și a picăturilor groase de sânge este uneori eronat. Trombocitele din sânge în unele cazuri pot fi atribuite în mod eronat agentului patogen al malariei. De asemenea, uneori fragmente de leucocite și alte celule simulează plasmodiul.

Metode de bază pentru studiul protozoarelor

Să ne uităm pe scurt la cele mai comune metode de cercetare pentru prezența protozoarelor.

Diagnosticul protozoarelor folosind un frotiu nativ și un frotiu colorat cu soluție de Lugol (în scaun)

Medicamentul este preparat dintr-o emulsie de fecale într-o soluție izotonă. Două picături de clor de sodiu și soluție Lugol sunt aplicate pe o lamă de sticlă. Materialul de testat este adăugat la ambele compoziții cu un băț de lemn și, după acoperire cu sticlă, este vizualizat la diferite rezoluții de microscop.

Protozoarele găsite sunt înregistrate pe baza anumitor caracteristici. Pentru acuratețe, pregătiți 2-3 preparate din același material. În cazurile îndoielnice, analiza se repetă de mai multe ori pe parcursul a 2-3 săptămâni.

Metoda poate detecta formele vegetative și chistice:

lamblia;
balantidiu;
ameba dizenterică.

Alături de formele patogene sunt identificate și protozoarele nepatogene. Tot la purtătorii sănătoși există forme luminale și chistice.

Important:cercetarea ar trebui efectuată în mod repetat pentru a evita inexactitățile și erorile.

Rezultatul diagnosticării protozoarelor folosind metoda frotiului nativ și colorat ar trebui să conțină o descriere a formei agentului patogen (luminal, chist, țesut).

Cerințe de cercetare:

materialul luat pentru analiză (fecale lichide) este examinat nu mai târziu de 30 de minute după defecare;
scaunul formalizat trebuie diagnosticat în 2 ore după defecare;
materialul nu trebuie să conțină impurități (dezinfectanți, apă, urină);
pentru a lucra cu materialul, folosiți numai bețe de lemn, cele de sticlă nu sunt potrivite din cauza alunecării mucusului;
Bețișoarele trebuie arse imediat după utilizare.

Metoda de conservare (examinarea scaunului) pentru diagnosticarea protozoarelor

Studiul se realizează prin fixarea protozoarelor cu un conservant. Diferența dintre această metodă și cea anterioară este că conservanții vă permit să păstrați medicamentul pentru o perioadă lungă de timp.

Conservanti folositi:

Barrow. Conține ingrediente conservante: 0,7 ml clorură de sodiu, 5 ml formol, 12,5 ml alcool 96%, 2 g fenol și 100 ml apă distilată. Compoziție colorantă: 0,01% soluție de tionină (azura).
Soluția lui Safarliev. Ingrediente: 1,65 g sulfat de zinc, 10 ml formol, 2,5 g fenol cristalin, 5 ml acid acetic, 0,2 g albastru de metilen, 100 ml apă. Acest conservant este utilizat în cazurile în care materialul trebuie păstrat mai mult de o lună.

Sticlele goale sunt umplute cu un conservant, materialul este transferat în ele într-un raport de 3:1, apoi se adaugă colorant dacă este necesar. Rezultatele sunt evaluate prin studierea a 2-3 medicamente.

Metoda de îmbogățire cu formol-eter (analiza prezenței protozoarelor în fecale)

Această metodă de diagnosticare vă permite să separați și să concentrați chisturile protozoare. Următoarele ingrediente sunt necesare pentru analiză: formaldehidă (10 ml), 0,85 g soluție izotonică, apă distilată, eter sulfuric, soluția lui Lugol.

Amestecul de biomaterial cu lichidele enumerate este amestecat și centrifugat. Sedimentul obținut la fundul eprubetei este colorat cu soluție de Lugol și examinat pentru prezența chisturilor și a formelor vegetative.

Metoda de detectare a Leishmania (frotiul de măduvă osoasă)

Pentru diagnosticarea leishmaniozei se folosesc următorii reactivi: amestecul lui Nikiforov (eter sulfuric și etanol), tampon fosfat, Azur-eozin conform Romanovsky.

Substanța măduvei osoase se așează foarte atent pe o lamă de sticlă după o pregătire specială. Se folosește un microscop cu sistem de imersie.

În perioada acută a bolii, un număr mare de leishmanie se găsesc în punctat.

Notă:Uneori celule de sânge poate semăna cu Leishmania prelucrată, de aceea este foarte important ca tehnicianul de laborator să fie atent și să aibă suficientă experiență pentru a efectua cercetări independente.

Metodă de depistare a leishmaniei într-un frotiu de infiltrat cutanat

Reactivii necesari sunt similari cu analiza anterioara.

Materialul de testat este obținut din conținutul de tuberculi sau ulcerații existente. Dacă se suspectează leishmanioza, răzuirea se face foarte atent cu bisturiul, fără sânge. Apoi preparatul se prepară pe sticlă. Pentru a asigura acuratețea rezultatelor obținute, sunt examinate simultan mai multe preparate.

În prezența bolii, leishmania este detectată și printre macrofage, fibroblaste și celule limfoide prezente în materialul de testat.

Metodă de izolare a unei culturi pure de Leishmania obţinută prin răzuirea ţesuturilor patologice

Cu această metodă de diagnosticare a protozoarelor, răzuirea țesuturilor sunt plasate într-un mod special mediu nutritiv, în care are loc reproducerea activă a Leishmania.

Înainte de a lua răzuirea, pielea este tratată temeinic cu alcool, apoi se face o incizie în tubercul, de pe fundul căreia se scoate conținutul și se pune într-o eprubetă cu mediu. Materialul este luat de mai multe ori, după care este pus în diferite eprubete. Apoi cultivarea are loc într-un termostat la o temperatură de 22-24 de grade. Rezultatele sunt evaluate la microscop. Această metodă este utilizată atunci când alte metode mai ieftine și mai rapide de diagnosticare a protozoarelor sunt ineficiente.

Puteți vedea cum testele pentru prezența protozoarelor folosind o picătură de sânge sunt descifrate în practică, urmărind recenzia video:

Lotin Alexander, editorialist medical

Metode cercetări helmintologice sunt împărțite în directe și indirecte. Metode directe: depistarea helminților înșiși, a fragmentelor lor, a ouălor, a larvelor în fecale, urină, secreții duodenale, spută, mucus nazal și vaginal, conținutul spațiilor subunguale, bucăți de țesut biopsiate. Metode indirecte: identificarea modificări secundare, care apar în corpul uman ca urmare a activității vitale a parazitului, reacții serologice, cercetare generală sânge, urină. Cele mai comune metode de examinare a fecalelor sunt helminto-ovoscopic și protozooscopic. La diagnosticare, este imposibil să se identifice ouăle sau larvele tuturor tipurilor de helminți care trăiesc în sistem digestiv persoană. Astfel, atunci când se utilizează metoda de flotație, ouăle de trematode și, în unele cazuri, ouăle de viermi rotunzi nefertilizate nu plutesc în pelicula de suprafață (datorită gravității lor specifice ridicate). Este foarte rar întâlnit în fecale ouă de oxiuri și oncosfere de taeniid, care sunt detectate prin metode speciale de cercetare: răzuire din pliurile perianale pentru oxiuri și taeniide, metode de sedimentare pentru trematode (ouă de opistorhide etc.). Prin urmare, pentru o examinare țintită a unui pacient pentru infecții cu helminți, medicul în sesizare trebuie să indice pe ce helminți trebuie să se concentreze (diagnostic), ceea ce va permite asistentului de laborator să aleagă tehnica adecvată pentru identificarea acestui tip de helminți. Fecale luate din locuri diferite scaunul într-o cantitate de cel puțin 50 de grame (linguriță) într-un recipient de sticlă curat trebuie trimis la laborator în cel mult 24 de ore de la defecare și examinat în ziua primirii. Dacă este necesar să se păstreze scaunul până când ziua urmatoare se pune la loc rece (0-4°C) sau se umple cu unul dintre conservanti. Înainte de examinare, scaunul este amestecat cu un băț, astfel încât ouăle de helminți să fie distribuite uniform în masa totala. Dacă în preparat se găsesc ouă de helmint, vizualizarea nu este oprită, deoarece poate exista o invazie dublă sau triplă. Monitorizarea eficacității tratamentului infecțiilor cu helminți se realizează prin examinarea fecalelor pentru ouă de helminți la 2-3 săptămâni sau la 2-3 luni după tratament, în funcție de helmintul detectat. Metodele macroscopice sunt utilizate pentru a detecta helminți întregi maturi sau fragmentele acestora în fecale cu ochiul liber sau cu lupa manuală. Adesea, oxiurii care se târăsc activ pot fi observați pe suprafața fecalelor după defecare; viermii rotunzi sunt excretați în fecale; Uneori, oamenii înșiși observă trecerea helminților. La pacienții cu difilobotriază, fragmentele de strobili de tenie pot fi excretate (sub formă de „tăitei”), iar la cei infectați cu taeniide (teniia de porc sau de bovină), segmentele de helminți pleacă adesea cu fecale (sub formă de „tunsoare albe”. ”) sau se târăsc activ din anus. Metoda macroscopică este principala pentru diagnosticul diferențial al taeniasis și taeniarynchosis (în combinație cu un sondaj). Dintre metodele macroscopice speciale, se folosește metoda de spălare secvențială a fecalelor. Fecalele sunt amestecate în apă pentru a obține o suspensie uniformă, după care, la lumină bună, sunt examinate cu atenție în porțiuni mici separate în cuve fotografice negre sau pe un fundal întunecat în vase Petri. Folosind o pensetă sau un ac de disecție, îndepărtați toate particulele albe suspecte, formațiunile mari suspecte pentru fragmente de helminți și examinați-le sub o lupă între două lame. Mici helminți sau capete de cestode sunt examinate sub o lupă într-o picătură de glicerină sau la microscop. Atunci când se utilizează această metodă de diagnosticare a segmentelor de carne de porc, tenia bovină și tenia lată, segmentele spălate sunt plasate între două pahare și, privind lumina sub lupă sau microscop cu mărire redusă, specia este determinată de structura de uterul (într-un segment matur tenia de porc Din trunchiul central se extind 8-12 ramuri laterale, iar la tenia bovină sunt 18-32, mai des 28-32; la tenia lată, segmentele sunt mai largi, iar uterul din centru este sub formă de „ rozetă"). Dacă uterul este greu de văzut, atunci poate fi mai întâi păstrat pentru o perioadă de timp într-o soluție de glicerină 50%, după care chiar și trunchiurile goale ale uterului pot fi văzute clar. La identificarea acestor cestode după structura capetelor detașate, ele sunt așezate cu grijă cu gâtul într-o picătură de glicerină între lame (sau acoperite cu o lamelă) și, fără a strânge, examinate la microscop la mărire mică.

Metodele microscopice sunt împărțite în simple, complexe și speciale.

Printre cele simple se numără metodele de frotiu nativ, frotiul nativ cu soluție Lugol, metodele de frotiu gros sub celofan după Kato, răsucirea (după Shulman) și răzuirea perianală.

Metodele complexe sunt mai eficiente și se bazează pe concentrația de ouă în preparate. Acestea implică pretratarea fecalelor cu reactivi lichizi, în urma cărora ouăle de helminți fie precipită, fie plutesc la suprafața lichidului.

LA metode complexe metodele de îmbogățire includ:

a) flotație (când greutatea specifică a ouălor este mai mică decât greutatea specifică a soluției saline și ouăle plutesc în pelicula de suprafață);

b) sedimentare (când greutatea specifică a ouălor este mai mare decât greutatea specifică a soluțiilor saline și ouăle se depun în sediment).

Metodele speciale de detectare a ouălor și a larvelor de helminți, chisturi și forme vegetative ale protozoarelor sunt metode de răzuire, flotare, sedimentare, larvoscopie, protozooscopie, examinare a bilei și metode de colorare a frotiurilor de fecale, spută etc.

Prelevarea probelor și conservarea

Pentru cercetare, fecalele sunt prelevate din diferite locuri în porții de 50 g și trimise la laborator într-un recipient curat de sticlă sau plastic, cu un capac etanș. Fecalele proaspete (nu mai mult de o zi) sunt examinate și, în unele cazuri (când se testează pentru strongiloidiază) imediat după defecare. Au fost propuși o serie de conservanți fecale care conțin ouă de helminți: soluție de formol 4-10%, care trebuie încălzită la o temperatură de 50-60° pentru a preveni dezvoltarea ouălor de anchilostoma; un amestec de soluție apoasă 0,2% de azotat de sodiu (1900 ml), soluție Lugol (5 g iod, 10 g iodură de potasiu, 250 ml apă), formol (300 ml) și glicerină (25 ml), în care se păstrează ouăle de helminți 6-8 luni; un amestec de glicerină (5 ml), formol (5 ml) și apă (100 ml); soluții de 1-1,5% detergenți „Lotos”, „Extra”, „Barf”, „Tide”, etc. (în raportul de greutate dintre fecale și soluție de detergent 1: 5); un amestec de mertiolat 1: 1000 (200 ml), formol (25 ml), glicerină (5 ml), apă distilată (250 ml) cu adăugarea a 0,6 ml de soluție Lugol (în proporție de 1 g de fecale la 10 ml amestec).

Pentru diagnosticarea helmintiazelor se folosesc metode macro și microhelmintoscopice pentru examinarea fecalelor.

Studii de macrohelmintoscopie

Metoda de decontare

O porție zilnică de fecale este bine amestecată cu de 5-10 ori cantitatea de apă, turnată în cilindri de sticlă înalți (borcane, găleți) și lăsată până când particulele în suspensie s-au depus complet. Stratul tulbure superior este scurs cu grijă și se adaugă apă curată în partea de sus (repetați de mai multe ori până când apa de deasupra sedimentului devine limpede). După scurgerea stratului superior, transferați sedimentul într-o cuvă sau cuvă Petri și vizualizați-l (pe un fundal întunecat) sub o lupă sau cu ochiul liber.

Metoda de screening

Fecalele amestecate cu apă se așează pe sita superioară a aparatului, constând dintr-un sistem de site cu orificii cu diametru descrescător, aparatul este conectat la rețeaua de alimentare cu apă și, prin deschiderea robinetului de apă, se spală, iar curgerea lichidul este scurs în canalizare. Helminții mari rămân pe sita superioară, în timp ce cei mai mici sunt reținuți pe cele inferioare. Sitele se răstoarnă și, după spălarea conținutului în cuve închise la culoare, se examinează cu ochiul liber sau sub lupă.

Studii de microhelmintoscopie

Se efectuează în scopul depistarii ouălor (metode helmint-ovoscopic - culoare. Fig. 1) sau larvelor de helmint (metode helmint-ovoscopic).

Metode helmintoovoscopice

Metode calitative fără îmbogățire

Frotiu nativ. O cantitate mică de fecale este măcinată pe o lamă de sticlă într-o picătură de soluție de glicerină 50% sau apă fiartă. Particulele mari sunt îndepărtate cu grijă, amestecul este acoperit cu o lametă și examinat la microscop (se examinează două frotiuri). Este mai convenabil și mai ușor să pregătiți frotiuri lungi între două lame de sticlă. Frotiul nativ este folosit doar pe lângă metodele de îmbogățire, deoarece nu este suficient de eficient, mai ales pentru infestările slabe.

Frotiu gros cu celofan, conform lui Kato(K. Kato, 1954) este foarte metoda eficienta cercetare. Bucățile de celofan hidrofil (4x2 cm dimensiune) se înmoaie timp de 24 de ore într-un amestec de glicerină (50 ml), soluție de fenol 6% (500 ml) și soluție apoasă 3% (6 ml) de malachit verde (acesta din urmă este opțional). ). BINE. 100 mg de fecale se untează pe o lamă de sticlă și se acoperă cu o bucată de celofan umed, se presează cu un dop de cauciuc nr. 5. Preparatul se examinează după 30-60 de minute, când se usucă ușor și devine limpede, ca un rezultat din care ouăle de helminți sunt ușor de detectat la un microscop cu mărire redusă.

Metode calitative cu îmbogățire (metode de flotare și decantare)

Primele se bazează pe utilizarea soluțiilor saturate de diferite substanțe chimice. substanțe în care ouăle plutesc din cauza diferențelor de greutate specifică.

Metoda Kofoid-Barber(Ch.A. Kofoid, M.A. Barber) modificat de Fulleborn (F. Fulleborn, 1920). BINE. 5 g de fecale într-un borcan înalt și îngust (volum de 100 ml) se amestecă cu un băț de lemn în 100 ml de soluție saturată sare de masă, bate greutatea sa este de 1,18 (400 g sare se dizolvă prin fierbere în 1 litru de apă). Particulele mari care plutesc la suprafață sunt îndepărtate rapid cu un bețișor sau o bucată de hârtie. După decantarea amestecului timp de 45-90 de minute. Utilizați o buclă de sârmă (0,8-1 cm în diametru) pentru a îndepărta toată pelicula de suprafață și transferați-o pe o lamă de sticlă. Când se testează pentru ouă de vierme, amestecul este lăsat să stea timp de 10-15 minute. Puteți îndepărta filmul direct cu o lamă de sticlă, acoperiți borcanul astfel încât acesta să intre în contact cu lichidul (se adaugă o soluție saturată de sare pe marginile borcanului). După decantare, lama este îndepărtată, răsturnată rapid, iar filmul cu ouă de helminți care aderă este examinat la microscop (fără geam de acoperire). Această metodă este bună la identificarea ouălor tuturor nematodelor și teniei pitice. Ouă de dorloat greu; Majoritatea cestodelor și a viermilor rotunzi nefertilați plutesc prost, așa că sedimentul este și el examinat. Pentru a face acest lucru, după îndepărtarea filmului, lichidul din borcan este scurs rapid și câteva picături sunt luate din sediment cu o buclă sau pipetă, transferate pe o lamă de sticlă, se adaugă o picătură de glicerol pentru clarificare și se examinează sub un microscop.

Metoda E. V. Kalantaryan(1938) Este o modificare mai eficientă a metodei Fulleborn. În ea, soluția de sare de masă este înlocuită cu o soluție saturată de azotat de sodiu, sp. greutatea este de 1,39 (un volum de azotat de sodiu se dizolvă într-un volum egal de apă când este fiert), pelicula se îndepărtează după 20-30 de minute.

Se mai folosesc metodele lui Faust (E. S. Faust, 1939), Brudastova et al. (1970) și alții.

Produsele chimice sunt folosite pentru a depune ouă de helminți. substanțe care dizolvă grăsimile și proteinele în fecale.

Metoda Telemann (W. Telemann, 1908) modificată de Miyagawa (Y. Miyagawa, 1913). BINE. 5 g de fecale se macină într-un mojar sau borcan, adăugând 5 ml de eter etilic și soluție salină 50%; amestecul este filtrat printr-o sită de sârmă sau păr într-o eprubetă și centrifugat. În eprubetă se formează 3 straturi: în partea de sus - eter cu grăsime dizolvată, dedesubt - acid clorhidric cu substanțe proteice dizolvate, în sediment - părți insolubile de fecale și ouă de helminți. Straturile superioare sunt drenate, iar la precipitat se adaugă apă și se centrifug. Câteva picături de sediment sunt transferate pe o lamă de sticlă și examinate la microscop. Această metodă poate detecta ouăle de toate tipurile de helminți, dar acestea sunt uneori deformate.

Metoda Ritchie (L. S. Kitchie, 1948). Formaldehida și eterul sunt folosite pentru a dizolva grăsimile și proteinele.

Se pot folosi diverși detergenți pentru a precipita ouăle de helminți. Metoda de filtrare în dispozitivele speciale Bell a devenit larg răspândită în străinătate, care este folosită pentru a studia nu numai fecalele, ci și urina, sângele etc.

Există o serie de metode care combină principiile flotației și sedimentării ouălor. Acestea includ metodele lui S. A. Lane, D. Rivas, Gorkina și S. T. Darling. Una dintre aceste metode de flotație-sedimentare, precum și metoda drenurilor secvențiale, a fost propusă de N.V.Demidov (1963, 1965) pentru cercetarea fascioliazelor și dicroceliozei.

Metode cantitative

Metoda Stoll(N. R. Stoll, 1926). O soluție decinormală de hidroxid de sodiu se toarnă într-o eprubetă sau un balon gradat (cu două semne: 56 și 60 ml) până la primul semn, se adaugă fecale până când nivelul lichidului atinge al doilea semn, se amestecă bine cu o baghetă de sticlă și, punând 10 mărgele de sticlă sau pietricele mici, se oprește și se agită timp de 1 minut. Rapid, pentru ca suspensia să nu se depună, luați 0,075 ml din amestec (0,005 g de fecale) cu o pipetă gradată, transferați-o pe o lamă de sticlă cu o rețea aplicată pe ea, acoperiți-o cu o lametă și numărați ouăle de helminți. în prepararea la microscop; Înmulțind numărul rezultat cu 200, se obține numărul de ouă din 1 g de fecale. Pentru un rezultat mai precis, numărați ouăle în două sau mai multe preparate și luați media. Metoda Stoll este insensibilă la invaziile ușoare. Prin urmare, se recomandă numărarea numărului de ouă din preparatele preparate diverse metode flotație sau sedimentare, sub rezerva utilizării constante a unei părți egale de fecale și vase de același volum. Se folosește și un frotiu gros de Kato.

Metoda castorului(R. S. Beaver, 1950). Se prepară un frotiu standard, a cărui grosime este determinată cu ajutorul unui electrofotometru, apoi se numără toate ouăle de helminți din el.

Metode helmintolarvoscopice

metoda Behrmann(G. Baermann, 1917). 5-10 g de fecale proaspăt excretate se pun pe o plasă metalică într-o pâlnie de sticlă, cu un tub de cauciuc cu o clemă la capătul îngust. Pentru a evita contaminarea sedimentului cu particule de fecale, se recomandă plasarea hârtiei (pe plasă) sau adăugarea în fecale de cărbune animal sau făină de porumb. Pâlnia se umple cu apă caldă (t° 45-50°) până când vine în contact cu fecalele. Datorită termotropismului, larvele se mută activ în apa caldași se acumulează treptat în partea inferioară a pâlniei, deasupra clemei. După 3-4 ore, clema este deschisă, lichidul este drenat în 1-2 eprubete, centrifugat timp de 2-3 minute, stratul superior este drenat, iar sedimentul este examinat pe o lamă de sticlă la microscop.

Metodă de identificare a miracidiei schistozomale. Fecalele se spală la întuneric la o temperatură de 8-10°, sedimentul se păstrează timp de 45 de minute. în lumină puternică la t° 28°, apoi se toarnă într-un balon întunecat cu un pai în lateral. Miracidia sunt concentrate într-un tub lateral transparent, de unde pot fi selectate.

Pentru identificarea larvelor de anchilostoma se folosesc și metodele lui Fulleborn și colab.

Metode de studiere a altor secreții, precum și a țesuturilor și organelor

BINE. 100 ml de urină de testat se lasă să stea timp de 30 de minute. într-un cilindru și, după ce a îndepărtat stratul superior, se toarnă 10-15 ml de sediment într-o eprubetă, se centrifughează la 1500 rpm timp de 1-2 minute; sedimentul este examinat. Este recomandabil să colectați întreaga porțiune zilnică de urină.

Schistosomiaza urogenitală este diagnosticată prin identificarea miracidiei. O porție de urină proaspătă este centrifugă timp de 5 minute, sedimentul este turnat într-un balon vopsit în negru, cu un tub de sticlă transparent lipit în partea de sus. Adăugați apă într-un raport de 1:5, 1:10 și puneți într-un termostat la 25-30° timp de 2 ore. Miracidia care iese din ouă sunt vizibile printr-un tub transparent cu ochiul liber sub formă de puncte care se mișcă rapid. In cronica, o forma de schistosomiaza, pacientii elibereaza sange spre finalul urinarii, dar ouale se gasesc rar in urina, de aceea se recomanda recurgerea la o biopsie a vezicii urinare.

Examinarea sputei. Sputa poate conține ouă de paragonimus, schistozomi, tominx, larve de nematozi migratori și fragmente de vezică echinococică. Întreaga porțiune de spută livrată este examinată cu atenție cu ochiul liber sau sub lupă, se selectează și se examinează toate resturile vizibile de țesut, acumulările de culoarea ruginii etc.; apoi scanați întreaga porțiune cu frotiuri. Sputa purulentă se toarnă o cantitate egală de soluție alcalină caustică 0,5%, se centrifughează și se examinează precipitatul.

În unele helmintiază se observă spută modificări caracteristice. Cu paragonimiaza, de exemplu, în spută se pot găsi acumulări de ouă sub formă de bulgări gălbui, precum și o cantitate mare de mucus, leucocite, globule roșii, celule alveolare, spirale Kurschmann, fibre elastice, cristale Charcot-Leyden. . Au fost dezvăluite și cristale caracteristice în formă de diamant cu capete ascuțite. Disponibilitate un numar mare eozinofilele permit diferențierea paragonimiazei de tuberculoză.

Examinarea conținutului abceselor și punctatelor. ÎN scurgeri purulente abcese, precum și în tumorile și chisturile îndepărtate în timpul intervenției chirurgicale, se pot găsi helminți, fragmentele acestora, larve și ouă (echinococcus, alveococcus, sparganum, cysticercus, dirofilaria, vierme rotunzi, toxocara, paragonimus etc.). Tehnica de cercetare este obișnuită; în unele cazuri, secțiunile histologice sunt pregătite din țesut tumoral. Conținutul purulent poate fi tratat folosind metoda Telemann; Lichidul limpede este examinat în același mod ca și conținutul duodenal, adăugând eter sulfuric. Lichidul echinococic este centrifugat și sedimentul este examinat pentru prezența scolexului și a cârligelor; Preparatele sunt colorate cu carbolfuchsin conform Ziehl-Neelsen.

Test de sange. Microfilariile și larvele de nematozi migratori se găsesc în sânge. Se ia o picătură de sânge dintr-un deget sau dintr-un lobul urechii și se examinează în stare proaspătă sau se prepară preparate din acesta.

O picătură de sânge se pune pe o lamă cu un pătrat de vaselină aplicată și se presează ușor cu o lametă. La microscop, microfilariile sunt vizibile care se deplasează între celulele sanguine. Sângele poate fi plasat între două straturi de bandă adezivă de celuloză; microfilariile rămân mobile timp de 6 ore; într-un preparat complet uscat ele pot fi distinse la microscop în decurs de 30 de zile. Speciile de microfilarii pot fi identificate numai în frotiuri colorate sau picături groase. Preparatele preparate sunt uscate, hemolizate și colorate conform Romanovsky - Giemsa, Wright, Ziehl-Neelsen, Leishman, Papanicolaou (vezi metoda de colorare Wright, metoda Romanovsky-Giemsa, metoda Ziehl-Neelsen). După ce au detectat microfilarii într-o picătură de sânge colorată conform Romanovsky-Giemsa, preparatul este colorat suplimentar cu hematoxilină Hansen; în 15-60 de minute. spala timp de 2 minute. în apă curgătoare. Preparatul recolorat se diferențiază într-o soluție salină 0,2%; Învelișul microfilariei este vopsit în violet pal, iar substanța nucleară a corpului este violet închis.

Pentru infestări ușoare, este necesar să se examineze 2-10 bucăți de sânge cu un anticoagulant (de exemplu, cu o soluție de 5% citrat de sodiu) folosind una dintre următoarele metode.

Metoda lui Knott (J. Knott, 1939), modificată de Markell și Voge (E.K. Markell, M. Voge, 1965). 2 ml de sânge se amestecă într-un tub de centrifugă cu 10 părți de acid acetic 1%, se centrifughează timp de 2 minute. la 1500 rpm; Strat de suprafață drenat, sedimentul este distribuit pe mai multe lame de sticlă și examinat la microscop. Preparatele pot fi colorate folosind Romanovsky-Giemsa sau alte metode.

Metoda de filtrare cu clopot (D. R. Bell, 1967). Într-un aparat format dintr-o pâlnie din oțel inoxidabil cu orificiu dreptunghiular și filtre cu membrană de aceeași formă, cu dimensiunile 19 x 42 mm, cu dimensiunea porilor de 0,8 până la 5 μm, sânge hemolizat într-un amestec de 1 ml de detergent tipol și 9 ml soluție de fiziol (pentru a accelera filtrarea, dispozitivul este conectat la o pompă de vid). Filtrul se fixează în apă distilată clocotită și se colorează cu Romanovsky-Giemsa sau cu hematoxilină fierbinte Ehrlich. Filtrul colorat se usucă într-un desicator sau în alcool izopropilic (secvențial în 3 căni), se curăță pe sticlă cu ulei de imersie și se examinează sub lamelă. Preparatele colorate durează câteva săptămâni. Metoda Bell este cea mai eficientă pentru înregistrarea cantitativă a microfilariilor din sânge.

Se folosește și metoda polividonă Goldsmid.

Examinarea pielii.În piele puteți găsi microfilarii de onchocerci și larve de helminți de animale care provoacă formă cutanată larva migrans(cm.). Secțiunile de piele sau materialul obținut prin scarificare sunt prelevate de pe coapsă, gambe, fese sau mușchi deltoid. O bucată de epidermă în formă de con este ridicată cu un ac entomologic și, tăiată cu un brici, se examinează pe sticlă într-o picătură de soluție de fiziol. La rezultat negativ un preparat proaspăt este reexaminat după 10 minute; Larvele sunt de obicei localizate la marginile preparatului. Materialul rezultat poate fi păstrat în 2 ml soluție de fiziol timp de 1-2 ore. și examinează sedimentul. Se recomandă să luați 5 secțiuni de piele de la pacient.

Preparatele pot fi, de asemenea, preparate din sânge și lichid tisular eliberat după comprimarea puternică a secțiunilor. Picăturile sunt colorate în funcție de hematoxilina Mayer, Romanovsky-Giemsa sau Delafield.

Metodă standard de cuantificare a infestărilor. Zona de piele biopsiată diam. 3-5 mm și cântărind cel puțin 1-4 mg, cântăriți, tăiați în bucăți mici și numărați larvele la microscop în fiziol. soluție pe o lamă de sticlă; 1-4 larve din câmpul vizual sunt indicate prin semnul +, 5-9 larve prin semnul ++, 10-19 prin semnul +++, 20 sau mai multe prin semnul + + + +. Este mai convenabil să efectuați calcule cantitative pe preparatele colorate.

Testarea trichinelozei, cisticercozei și schistosomiazei

Detectarea larvelor de Trichinella

Metoda de compresie. O bucată de două capete sau mușchi de vițel(lângă tendon), luată chirurgical prin asepsie, se împarte în fibre subțiri separate cu ace de disecție, strânse între două lame de sticlă într-o picătură de glicerină, astfel încât preparatul să fie subțire și transparent. La microscop cu un câmp vizual întunecat, larvele de Trichinella sunt clar vizibile. Este eficient să studiezi mai multe bucăți de mușchi în compresorii folosite în medicina veterinară. practică, în special în trichineloscoape speciale.

Metoda de digestie a lui Bechman(G. W. Bachman, 1928). 1 și mușchii zdrobiți se toarnă cu 60 ml suc gastric artificial (0,5 g pepsină; 0,7 ml acid clorhidric concentrat; 100 ml apă) și se lasă timp de 18 ore. într-un termostat la t° 37°; se scurge stratul superior de lichid, se adaugă apă caldă (t° 37-45°) în sediment și se toarnă într-un aparat Behrmann. După o oră, lichidul este scurs într-o eprubetă, centrifugat și sedimentul examinat. Dacă larvele sunt închise în capsule calcificate, acestea sunt mai întâi decalcificate într-o soluție de acid clorhidric, azot sau sulfuric.

Biotest. Bucăți din mușchii studiati sunt hrăniți la șoareci sau șobolani albi. După 2-3 zile, Trichinella matură sexual poate fi găsită în conținutul duodenal, iar după 2-3 săptămâni, larvele pot fi găsite în mușchii diafragmei și ai limbii.

Secțiuni histologice. Piesele musculare sunt fixate în lichidul lui Bouin, Zenker sau alt lichid; în mod obişnuit Secțiunile sunt preparate pe un microtom și colorate cu hematoxilină Delafield.

Detectarea cisticercilor

Se examinează cu ochiul liber o bucată de mușchi extirpat, țesut conjunctiv etc., se izolează cu grijă cisticercul - o veziculă translucidă albicioasă de 1-2 cm, zdrobită între două lame de sticlă într-o picătură de glicerină și examinată la microscop. . Pentru a determina viabilitatea cisticercilor izolați din țesuturi, aceștia sunt păstrați într-o soluție de bilă 50% pentru physiol. soluție într-un termostat la t° 37°; în 10-60 de minute. capul cisticercului viabil se întoarce spre exterior. Cisticercii calcificați se decalcifică preliminar cu o soluție de acid azotic 4% timp de o oră.

Detectarea ouălor de schistozom

În hron, forme de schistosomiază, când formarea granuloamelor împiedică eliberarea ouălor din țesuturi în lumenul intestinal sau în tractul urinar, se utilizează o biopsie a mucoasei rectale, care se efectuează cu o lingură specială folosind un rectoscop, selectând o zonă cu o leziune vizibilă. Piesa biopsiată este zdrobită între două lame de sticlă și examinată la microscop. Dacă rezultatul este negativ, piesele sunt limpezite într-o soluție de 4% alcalii caustice și din acestea se prepară histol. felii. Se efectuează o biopsie a mucoasei jejunale pe cale orală și materialul rezultat este examinat folosind metoda de compresie sau se prepară secțiuni histol din acesta. În unele cazuri de schistosomiază genito-urinară, diagnosticul poate fi pus doar pe baza biopsiei endovezicale. În forma hepatolienală a schistosomiazei, se efectuează o biopsie prin puncție a ficatului; Din materialul rezultat, histolul și secțiunile sunt preparate și examinate la microscop fluorescent. Microscopul cu fluorescență cu un câmp întunecat este, de asemenea, utilizat pentru examinarea țesutului hepatic pentru ouă de schistozom. Dacă tractul genital feminin este afectat de schistozomi, secreția este colectată folosind un speculum vaginal sau bucăți din membrana mucoasă a colului uterin sunt luate cu o lingură ascuțită; materialul rezultat este examinat la microscop pe sticlă într-o picătură de soluție de fiziol.

Testare pentru enterobiaza și taeniasis

Razuire perianala (se recomanda administrarea seara, la 1 - 1,5 ore dupa ce pacientul se culca, sau dimineata inainte de a face toaleta). Cu un chibrit, tăiat oblic și umezit într-o picătură de lichid (fiziol, soluție, apă fiartă sau soluție 2% de bicarbonat de sodiu), aplicat pe o lamă de sticlă, fac asta cu grijă? răzuirea de pe membrana mucoasă a anusului și a pliurilor din jurul acesteia (din centru spre exterior). Mucusul colectat la sfârșitul meciului este curățat cu marginea unui pahar de acoperire într-o picătură de lichid pe o lamă de sticlă și, acoperit cu același pahar de acoperire, este examinat. În timpul examinărilor în masă, când se efectuează răzuire în instituții pentru copii sau în alte instituții, chibritul folosit se pune într-o picătură de lichid pe o lamă de sticlă; după ce picătura s-a uscat, se acoperă cu o altă lamă de sticlă și se livrează la laborator, învelită în hârtie și se asigură cu o bandă elastică. Pentru a studia mucusul rectal, ei folosesc un dispozitiv special - un tub Shakhmatov sau Ziemann, cu care preiau mucusul din rect și examinează frotiurile la microscop.

Metoda tamponului de bumbac. Pacienților li se dă o eprubetă cu un tampon de vată pe un bețișor de sticlă sau de lemn pentru a le duce acasă; dimineața pacientul șterge pliurile perianale cu un tampon umezit apa fiarta, și îl pune într-o eprubetă cu o cantitate mică de apă. În laborator, tampoanele sunt clătite în aceeași eprubetă cu o nouă porție de apă, iar sedimentul este examinat după centrifugare.

Metoda celofanului lui Hall (M. S. Hall, 1937). O bucată pătrată de celofan este fixată cu o bandă elastică pe o tijă de sticlă. Razuirea se face cu celofan uscat si se pune intr-o eprubeta. În laborator, celofanul este ușor mutat de pe băț și, după ce îi tăie vârful cu foarfecele, se îndreaptă pe o lamă de sticlă; umezit cu soluție decinormală de hidroxid de sodiu, acoperit cu o lamă și examinat la microscop.

Metoda benzii de celuloză a lui Graham (S. F. Graham, 1941). O bandă de bandă de celuloză este presată cu partea adezivă pe pliurile perianale ale subiectului, apoi cu aceeași parte pe o lamă de sticlă și examinată fără un geam de acoperire; Puteți adăuga o picătură de toluen. V. V. Kaledin (1972) a propus în aceste scopuri folosirea de discuri de celuloid tăiate din peliculă cu raze X spălate și umezite cu glicerină; discurile se examinează pe o lamă de sticlă într-o picătură de adeziv silicat. Metoda benzii de celuloză poate fi folosită și pentru a examina lenjeria pentru copii.

Razuire subunguala. Marginile unghiei, ale patului unghial și ale spațiilor subunguale sunt umezite cu o soluție de 0,5-1% de alcali caustici și șterse cu tampoane de bumbac umede. Tampoanele sunt plasate în tuburi de centrifugă cu aceeași soluție, centrifugate și sedimentul examinat.

Metode de studiere a obiectelor mediu inconjurator pentru ouă și larve de helminți (studii sanitare și helmintologice)

Se efectuează cercetări pentru a determina gradul de contaminare a obiectelor cu ouă și larve de helminți Mediul extern. Datele obținute sunt folosite pentru a evalua demnitatea. starea instituţiilor şi întreprinderilor şi eficacitatea măsurilor luate pentru combaterea helmintiazelor.

Atunci când se studiază gradul de contaminare a diferitelor obiecte de mediu cu ouă și larve de helminți și se evaluează rolul lor în epidemiologia infecțiilor cu helminți, este important să se stabilească nu numai numărul de ouă găsite, ci și viabilitatea și gradul de invaziv al acestora, care sunt determinate. : a) după aspect, la microscop; b) colorarea cu diverși coloranți, inclusiv luminiscenți; de regulă, ouăle și larvele vii nu sunt vopsite; c) cultivare în condiţii optime până la stadiul invaziv; d) infectarea animalelor de laborator (biotest).

Studii de apă și canalizare. Pentru un studiu, folosiți 10-25 litri de apă (râuri, mări, iazuri, piscine, alimentare cu apă) și 1-2-5 litri de canalizare.

Metoda 3. G. Vasilkova (1941). Apa sau canalizarea este filtrată prin ultrafiltre cu membrană într-un aparat Goldmann, constând dintr-o pâlnie din sticlă sau metal cu filtre conectate printr-o duză inelară la un balon Bunsen. Pentru a accelera procesul de filtrare, la dispozitiv este conectată o pompă de vid. După filtrare, filtrele cu membrană sunt examinate la microscop, curăţate cu o soluţie de glicerol 50%; sedimentul acumulat este curățat și examinat separat sub formă de frotiuri. Sunt utilizate și dispozitive de filtrare de alte modele.

Metoda lui G. Sh. Gudzhabidze și G. A. Yudin (1963) pentru studierea fluidului de canalizare. 1 litru de lichid se lasă timp de 2 ore într-un cilindru Lisenko; sedimentul rezultat (5-9 ml) este prelucrat ca la testarea solului (vezi mai jos).

Metoda N. A. Romanenko (1967). La 1 litru de lichid rezidual plasat într-un cilindru de sticlă cu o capacitate de 1200-1500 ml, adăugați 0,4-0,6 g sulfat de aluminiu sau clorură ferică (în scopul coagulării, accelerarea procesului de sedimentare a particulelor în suspensie) și după 40 de ani. minute. amestecul este centrifugat timp de 3 minute. la 1000 rpm; stratul superior se scurge, iar pentru a dizolva fulgii se adaugă 1-2 ml soluție 3% de acid clorhidric, apoi 150 ml soluție saturată de azotat de sodiu. Sedimentul este examinat ca solul.

Cercetarea solului

Contaminarea solului cu ouă de helminți este determinată pentru a identifica focarele de helmintiază și pentru a evalua eficacitatea lucrărilor de îmbunătățire a acestora.

Metoda 3. G. Vasilkova și V. A. Gefter (1948). 12,5 g de pământ se amestecă în eprubete (volum 100 ml) din oțel inoxidabil sau alamă cu 20 ml de soluție 5% de alcali caustic, adăugând 10 mărgele de sticlă sau pietricele mici. Tuburile sunt sigilate cu dopuri de cauciuc și agitate timp de 20 de minute. într-un aparat de agitare sau manual. După îndepărtarea dopurilor, tuburile sunt centrifugate timp de 3-5 minute, lichidul de suprafață este scurs, 60-80 ml de soluție saturată de azotat de sodiu se adaugă în sediment și, după amestecarea temeinică, se centrifug din nou timp de 3-5 minute. Această peliculă de suprafață cu ouă plutitoare este îndepărtată prin atingerea suprafeței amestecului cu o buclă complexă (5-6 bucle conectate pe o tijă comună) și transferată într-un pahar cu apă; se amestecă cu aceeași soluție, se centrifugă; Întreaga procedură se repetă de cel puțin 3 ori. Conținutul cupei în care este transferat filmul este diluat cu apă și filtrat prin filtre cu membrană, care sunt examinate la microscop într-o picătură de glicerol.

Metoda 3. G. Vasilkova și V. A. Gefter, așa cum au fost modificate de A. A. Namitokov (1961), diferă de metoda principală prin aceea că, în loc să examineze preparatele de film, se utilizează jumătate din conținutul eprubetei (adăugând de fiecare dată o nouă porțiune de soluție saturată de azotat de sodiu), se filtrează și se examinează filtrele.

N. A. Romanenko (1968) recomandă examinarea probelor de sol și a nămolului de canalizare pentru ouă de helminți folosind aparatul propus de G. Sh. Gudzhabidze. 50 g de pământ se amestecă bine timp de 1 minut. in 150 ml apa in tuburi de centrifuga (capacitate 250 ml) cu lame speciale actionate de un motor electric. Amestecul este centrifugat timp de 3 minute. la 1000 rpm, se scurge apa si se adauga 150 ml de solutie saturata de azotat de sodiu, se amesteca si se centrifuga din nou timp de 3 minute. Eprubete cu probe se pun într-un suport, se adaugă soluție de azotat de sodiu până se formează un menisc convex, se acoperă cu lame de sticlă (10 x 6 cm) și se lasă 10-15 minute, apoi se scot ochelarii și se examinează; procedura se repetă de cel puțin 4 ori.

Cercetări asupra larvelor de helminți folosind metoda lui Behrmann (1917). 200-400 g de pământ se pun într-o bucată de tifon pe o plasă metalică (cu găuri de 1-2 mm diametru) așezată pe partea lată a unei pâlnii de sticlă montată pe un trepied. Un tub de cauciuc cu o clemă este întins pe capătul îngust al pâlniei. Pâlnia este umplută cu apă caldă (t° 50°), astfel încât partea inferioară a plasei cu solul să intre în contact cu apa. Datorită termotropismului, larvele se târăsc activ în apă caldă și, stabilindu-se, se acumulează în partea inferioară a tubului de cauciuc deasupra clemei. După 3-4 ore, 50 ml din conținut sunt eliberați din pâlnie într-o eprubetă, centrifugat și sedimentul examinat.

Cercetarea legumelor, fructelor și fructelor de pădure

Ei studiază în principal legumele, fructele de pădure și fructele consumate fără tratament termic. Metoda 3. G. Vasilkova (1948). 5-10 bucăți de legume sau fructe (aprox. 0,5 kg) sau 100-200 g de verdeață (salată verde, ceapă verde) se toarnă cu apă timp de câteva ore în borcane de sticlă cu gât larg, cu dopuri măcinate și se agită timp de 10-20 de minute. . într-un aparat de agitare sau manual. Se scurge apa, se clătesc obiectele studiate apă curatăși toată apa de spălare este filtrată într-un aparat Goldmann; Filtrele sunt examinate prin curățarea lor cu glicerină. Puteți colora filtrele cu soluție de Lugol 25% în glicerină; în acest caz, ouăle de helminți sunt pătate culoarea maroși sunt ușor de recunoscut printre boabele de amidon, colorate în Culoarea albastră. Sedimentul mare este tratat ca solul.

Studiul spălărilor de la obiecte de uz casnic și mâini. O perie de lipici (sau un tampon de bumbac învelit într-o bucată de țesătură de nailon) înmuiată într-o soluție de 2% de bicarbonat de sodiu este trecută în mod repetat peste obiectul sau mâinile care sunt examinate și apoi clătită în aceeași soluție turnată într-o eprubetă. În laborator, periile și tampoanele sunt clătite cu apă curată; Toată apa de spălare este centrifugă și sedimentul este examinat.

Metoda V. A. Gefter (1960). Este mai eficient să colectați praful din echipamentele moi folosind un aspirator conectat la o pâlnie; marginile sunt formate din 2 părți detașabile: un filtru cu membrană este plasat pe suprafața părții inferioare, acoperit cu o plasă de metal sau plastic și consolidat. punându-l pe el top parte pâlnii. Pâlnia asamblată este conectată la furtunul aspiratorului cu un tub de cauciuc. Praful este colectat de pe obiect timp de 3 minute, după care filtrul este îndepărtat și înlocuit cu unul nou. În laborator, filtrele sunt examinate la microscop, curățate cu glicerină. Dacă stratul de praf de pe filtru este mare, acesta este răzuit și văzut sub formă de pete sau tratat ca pământ.

Metode de diagnostic imunologic

Posibilitatea utilizării imunolului. metodele de diagnosticare a helmintiazelor se datorează capacității helminților de a produce antigene active care afectează celulele imunocompetente ale gazdei și stimulează producția de anticorpi. Cele mai eficiente metode de imunodiagnostic sunt pentru helmintiaza intestinală, când secrețiile și excrementele helminților, care au activitate antigenică, intră direct în sângele gazdei. Reacțiile imunolice sunt utilizate pentru diagnosticarea ascariazei, trichinelozei, filariozei, schistosomiazei, echinococozei și alveococozei, cisticercozei, paragonimiazei, complexului simptomatic al larvei migrans (toxocarioză, angiostrongiloză), etc. Se folosesc diverse teste serol (precipitare, reacții de fixare a reacției de precipitare, reacții de fixare). , anticorpi fluorescente ) și teste de alergie intradermică. Antigenele sunt preparate din larve și helminți maturi folosind extracte sărate din omogenate din țesuturi proaspete congelate sau liofilizate, precum și diverse lichide biologic active (lichid din blistere echinococice, lichid abdominal al viermilor rotunzi etc.). Datorită faptului că helminții au o structură antigenică foarte complexă și mozaicul lor antigenic conține componente și determinanți individuali care reacționează încrucișat cu alte tipuri de helminți, bacterii și antigeni gazdă, sunt în curs de dezvoltare metode pentru a-i purifica de componente nespecifice. Se efectuează fracţionarea metode diferite: filtrare pe gel în coloane cu Sephadex, cromatografie cu schimb ionic pe DEAE-Sephadex, tratament cu acizi etc. Antigenele fracționate au de obicei specificitate mai mare decât extractele întregi, dar activitatea lor este aproximativ aceeași. Metodele de imunodiagnostic găsesc totul aplicare mai mare. Reacțiile sunt utilizate nu numai pentru identificarea cea mai completă și mai timpurie a pacienților, ci și pentru studiul focarelor și studierea epidemiologiei helmintiazelor.

Reacții serologice. Reacția de microprecipitare asupra larvelor vii este utilizată pentru a diagnostica nematozi - faza preimaginală a ascariazei, bolii anchilostoma și trichineloză. Reacția devine pozitivă la 5-10 zile de la infectare (ascariază, boala anchilostoma) și persistă 90-100 de zile. Antigenul este larvele nematode vii izolate din țesuturile animalelor de laborator infectate experimental. Larvele izolate sunt spălate temeinic de proteinele gazdă cu fiziol steril, soluție și apă distilată și câte 10-15 copii fiecare. plasat folosind o pipetă Pasteur pe o lamă de sticlă sterilă cu un godeu. Se aplică 2-3 picături de ser de testare, se acoperă cu o sticlă de acoperire sterilă, se pune într-o cameră umedă (vasă Petri căptușită cu hârtie de filtru umezită) și se lasă timp de 24-48 de ore. într-un termostat la t° 37°. Dacă reacția este pozitivă, la microscop cu mărire redusă, vizibil în jurul gurii și gauri anale larvele sunt mase alb-cenușii, ușor opalescente de precipitate sferice sau în formă de zig-zag. Eficiența reacției ajunge la 85-95%.

Reacția de precipitare a inelului a fost dezvoltată de V.P. Pashuk (1957) pentru diagnosticul trichinelozei. Reacția devine pozitivă la 2-3 săptămâni de boală. Eficacitatea sa ajunge la 80-90%. Antigenul este un extract de pulbere din larve uscate la 35°, izolat din mușchii animalelor infectate. În eprubete dia. 0,5 cm, se toarnă 0,1 ml din fiecare diluție a antigenului și se adaugă cu grijă pe ea (sau se coboară până la fund) o cantitate egală de ser de testare, astfel încât lichidele să nu se amestece. Eprubetele se păstrează timp de 30 de minute. într-un termostat la t° 37°, apoi 30-60 de minute. la temperatura camerei. Cu o reacție pozitivă, la interfața dintre antigen și ser apare un inel delicat albicios, care se dezintegrează ușor atunci când este agitat.

Reacția de precipitare în gel conform Ouchterlony (O. Ouchterlony, 1949) în micromodificare de către A. I. Gusev și V. S. Tsvetkov a fost propusă de I. A. Ginovker, E. A. Zabozlaeva, A. V. Doronin (1970) pentru diagnosticul fazelor precoce ale opisthorchiasis. Conform datelor preliminare, eficacitatea sa este de 87%. Antigenul este un extract dintr-un omogenat de opistorhis matur sexual proaspăt congelat izolat din ficatul pisicilor.

S-a dezvoltat reacția de hemaglutinare indirectă (vezi) cu diagnosticum - o suspensie de eritrocite de oaie formalinizate și tanizate, sensibilizate cu lichid echinococic.

L.N. Stepankovskaya (1972) pentru diagnosticul echinococozei și alveococozei.

RNGA cu un diagnostic din eritrocite formalinizate de oaie, sensibilizat cu un extract de omogenat de cisticerci proaspăt congelați de tenia de porc, a fost propus de L. M. Konovalova (1973) pentru diagnosticul cisticercozei cerebrale; este eficient în 85% din cazuri.

RNGA cu ascaris diagnosticum este propusă pentru diagnosticarea fazei preimaginale a ascariazei.

Reacția de fixare a complementului (vezi) se realizează după metoda obișnuită și este utilizată pentru diagnosticul trichinelozei și cisticercozei.

Metoda anticorpilor luminescenți (metoda indirectă). Această metodă, cu omogenat uscat degresat de cisticerci de tenia de porc ca antigen fixat pe o lamă de sticlă, a fost dezvoltată de JI. M. Konovalova (1973) pentru diagnosticul cisticercozei umane. Aceeași reacție cu histol, secțiuni de larve de Trichinella ca antigen a fost dezvoltată pentru diagnosticarea trichinelozei.

E. S. Leikina, V. A. Gefter.

Atunci când ouăle de helminți sunt depistate pe diverse obiecte de mediu (sol, apă, legume etc.), este întotdeauna necesar să se determine viabilitatea acestora prin aspect, colorarea cu vopsele vitale, cultivarea în condiții optime și efectuarea unui test biologic, i.e.

Hrănirea animalelor de laborator.

Determinarea viabilității ouălor sau larvelor de helminți după aspect. Ouăle de helminți sunt microscopate mai întâi la mic, apoi la mare mărire. În ouăle de helminți deformate și moarte, coaja este ruptă sau îndoită spre interior, plasma este tulbure și slăbită. În ouăle segmentate, bilele de zdrobire (blastomerii) sunt inegale ca mărime, de formă neregulată și adesea mutate la un singur pol. Uneori există ouă anormale care, în ciuda deformărilor externe, se dezvoltă normal. La larvele de viermi rotunzi vii, granularitatea fină este prezentă numai în partea mijlocie a corpului; pe măsură ce mor, granularitatea se răspândește în tot corpul și apar vacuole mari hialine strălucitoare - așa-numitele șiruri de perle.

Pentru a determina viabilitatea ouălor mature de viermi rotunzi, viermi bici, oxiuri, mișcările active ale larvelor ar trebui să fie cauzate de încălzirea ușoară a medicamentului (la o temperatură care nu depășește 37 ° C). Este mai convenabil să se observe viabilitatea larvelor de viermi rotunzi și tricoceluși după ce acestea sunt izolate din coaja de ou prin apăsarea pe paharul preparatului cu un ac de disecție sau o pensetă.

La larvele invazive de viermi rotunzi, se observă adesea o teacă desprinzându-se la capătul capului, iar la larvele de viermi bici care s-au dezvoltat complet în ou, se găsește un stilt în acest loc la o mărire mare. La larvele de helminți moarte, indiferent de locația lor (în ou sau în afara acestuia), se observă degradarea corpului. în care structura interna Larva devine aglomerată sau granulară, iar corpul devine tulbure și opac. Vacuolele se găsesc în corp, iar rupturi se găsesc pe cuticulă.

Viabilitatea oncosferelor taeniide (bovine, tenia de porc etc.) este determinată de mișcarea embrionilor atunci când sunt expuși la acestea. enzime digestive. Ouăle se pun pe un pahar de ceas cu suc gastric al câinelui sau suc duodenal artificial. Compoziția acestuia din urmă: pancreatină 0,5 g, bicarbonat de sodiu 0,09 g, apă distilată 5 ml. Paharele de ceas cu ouă se pun într-un termostat la 36-38 "C timp de 4 ore. În același timp, embrionii vii sunt eliberați de coaja lor. Cojile oncosferelor vii se dizolvă, de asemenea, în pepsină acidulată și în soluție alcalină tripsina după 6-8 ore într-un termostat la 38 °C.

Dacă puneți ouă de taeniid într-o soluție de 1% de sulfură de sodiu sau o soluție de 20% de hipoclorură de sodiu sau într-o soluție de 1% apă cu clor la 36-38 ° C, embrionii maturi și vii sunt eliberați din membrane și nu nu se schimba in 1 zi. Oncosferele imature și moarte se micșorează sau se umflă și cresc brusc, apoi se „dizolvă” în 10 minute - 2 ore. De asemenea, embrionii vii de taeniid se mișcă activ într-un amestec de soluție de clorură de sodiu 1%, soluție de bicarbonat de sodiu 0,5% și bilă la 36-38. °C.

Viabilitatea scolexului echinococilor este determinată cu încălzire scăzută. Pentru a face acest lucru, capsulele de scolex sau pui spălate în apă sunt plasate într-o picătură de apă pe o lamă de sticlă cu o gaură, acoperite cu o lamă și examinate la microscop cu o etapă de încălzire la o temperatură de 38-39 °C. Dacă nu există o masă de încălzire, medicamentul este încălzit folosind orice sursă de căldură. În același timp, scolexul viabil se mișcă activ, contractând sau relaxând ventuzele, lungind și scurtând trompa. Dacă plasați scolexul la 0,5-1% soluție de apă filicilene la temperatura camerei, atunci tot scolexul viabil se va dovedi rapid și va muri. Scolexul neviabil nu este erupt.

Viabilitatea Adolescaria fascioli colectată pe plante și alte obiecte ale corpurilor de apă este verificată prin examinarea lor pe o lamă de sticlă în soluție fiziologică la microscop cu o etapă de încălzire. Când larvele trematode sunt încălzite, ele încep să se miște.

Viabilitatea ouălor de tenia pitici este determinată de locația cârligelor pe embrion.

În ouăle vii ale teniei pitice au loc mișcări lente, asemănătoare pendulului, ale protoplasmei și depărtarea aproape imperceptibilă și deplasarea capetelor ascuțite ale perechii laterale de cârlige spre părțile laterale din perechea mijlocie.

Contracțiile protoplasmei embrionului și cârligele embrionare ajută embrionul să se elibereze mai întâi de membranele oncosferei și apoi de coaja exterioară a oului.

Într-un ou viu, perechea mediană și perechile laterale de cârlige sunt situate paralele; la unele ouă, lamele perechilor laterale sunt apropiate și situate la un unghi mai mic de 45° față de perechea de mijloc de cârlige.

Embrionul aflat pe moarte se contractă convulsiv și îndepărtează încet cârligele. Într-un embrion mort, mișcarea cârligelor se oprește și sunt situate în dezordine; uneori, cârligele laterale de perechea adiacentă sunt depărtate într-un unghi drept, obtuz sau acut.

Uneori se observă încrețirea embrionului și formarea granulării. O metodă mai precisă se bazează pe apariția mișcărilor oncosferei în timpul unei schimbări bruște a temperaturii: de la 5-10 la 38-40 ° C.

Determinarea viabilității nematozilor imaturi trebuie studiată într-o cameră umedă (cube Petri), plasând ouă de viermi rotuși într-o soluție de formaldehidă 3% preparată într-o soluție izotonă de clorură de sodiu la o temperatură de 24-30 ° C, ouă de viermi bici într-un 3. % soluție de acid clorhidric la o temperatură de 30-35 °C, ouă de oxiuri într-o soluție izotonică de clorură de sodiu la o temperatură de 37 °C. Cutiile Petri trebuie deschise de 1-3 ori pe săptămână pentru o mai bună aerare, iar hârtia de filtru trebuie reumidificată cu apă curată.

Observațiile dezvoltării ouălor de helminți se efectuează de cel puțin 2 ori pe săptămână. Absența semnelor de dezvoltare în 2-3 luni indică non-viabilitatea acestora. Semnele dezvoltării ouălor de helminți sunt mai întâi etapele zdrobirii, împărțind conținutul oului în blastomere separate. În prima zi se dezvoltă până la 16 blastomeri, care trec în a doua etapă - morula etc.

Ouăle de anchilostoma se cultivă într-un cilindru de sticlă (50 cm înălțime și 7 cm în diametru) închis cu dop. Un amestec de volume egale de nisip steril, cărbune iar fecalele cu ouă de anchilostoma, diluate cu apă până la o consistență semi-lichidă, se toarnă cu grijă pe fundul cilindrului folosind un tub de sticlă. În timpul a 1-2 zile de așezare în întuneric la o temperatură de 25-30 ° C, larvele rabditiforme ies din ouă, iar după 5-7 zile devin filariforme: larvele se târăsc pe pereții cilindrului, unde sunt. vizibil chiar și cu ochiul liber. Ouăle trematodelor, precum opistorhidele, difilobotriidele, fasciolele etc., care se dezvoltă în mod natural în apă, se pun pe un pahar de ceas, o placă Petri sau într-un alt vas și se toarnă un strat mic de apă obișnuită. La cultivarea ouălor de Fasciola, trebuie avut în vedere faptul că acestea se dezvoltă mai repede în întuneric, în timp ce miracidiumul se formează în ouăle vii la o temperatură de 22-24 °C după 9-12 zile. La microscopia ouălor trematode în curs de dezvoltare, mișcările miracidiului sunt clar vizibile. Miracidium fasciola iese din coaja ouă numai în lumină. În timpul cultivării, apa se schimbă după 2-3 zile.

Larvele de anchilostoma și strongiloide sunt cultivate pe agar într-o cutie Petri cu cărbune animal. După ce au stat într-un termostat la o temperatură de 26-30 °C timp de 5-6 zile, larvele se târăsc peste agar, lăsând în urmă o cale de bacterii (metoda Fullleborn).

Metoda lui Harada și Mori (1955). Adăugați 7 ml de apă distilată în eprubetele plasate într-un suport. Cu ajutorul unui bețișor de lemn, luați 0,5 g de fecale și faceți un frotiu pe hârtie de filtru (15X150 mm) la 5 cm de marginea stângă (această operațiune se efectuează pe o foaie de hârtie pentru a proteja suprafața bancului de laborator). Apoi banda cu frotiu este introdusă în eprubetă, astfel încât capătul din stânga liber de frotiu să ajungă la fundul eprubetei. Capătul superior este acoperit cu o bucată de celofan și strâns înfășurat cu o bandă elastică. Pe eprubetă sunt scrise numărul și prenumele persoanei examinate. În această stare, tuburile se păstrează timp de 8-10 zile la o temperatură de 28 °C. Pentru a studia cultura, scoateți capacul din celofan și îndepărtați o bandă de hârtie de filtru cu penseta. Trebuie avut grijă atunci când faceți acest lucru, deoarece un număr mic de larve infecțioase se pot deplasa la capătul superior al hârtiei de filtru sau în lateralul tubului și se pot pătrunde sub suprafața celofanului.

Tuburile sunt plasate într-o baie de apă fierbinte la o temperatură de 50 °C timp de 15 minute, după care conținutul lor este agitat și turnat rapid într-o eprubetă de 15 ml pentru a sedimenta larvele. După centrifugare, supernatantul este îndepărtat, iar sedimentul este transferat pe o lamă de sticlă, acoperit cu o lamă și examinat la microscop cu o mărire mică.

Pentru diagnosticul diferențial al larvelor filariforme, este necesar să se utilizeze datele prezentate în tabel. 13.

Metode de colorare a ouălor și a larvelor de helminți. Țesuturile moarte în majoritatea cazurilor percep vopselele mai repede decât cele vii. Aceste caracteristici sunt folosite în helmintologie pentru a determina viabilitatea ouălor și larvelor de helminți. Cu toate acestea, în unele cazuri, unele vopsele sunt mai bine percepute de țesuturile vii decât de cele moarte.

Tabelul 13. Diagnostic diferentiat larve în formă de filar de A.duodenale, N.americanus, Strongyloides stercoralis, Trichostrongylus spp.

Pentru recunoașterea diferențială a ouălor și larvelor vii și moarte, se folosesc următoarele vopsele și metode.

Albastrul de metilen leucobază este folosit pentru a colora țesuturile vii și moarte. O celulă sau un țesut viu reduce albastrul de metilen într-o leucobază incoloră; țesutul mort nu are această capacitate, așa că capătă culoare.

Pentru a colora ouăle de viermi rotunzi, puteți folosi albastru de metilen într-o soluție de acid lactic cu alcali caustic (0,05 g albastru de metilen, 0,5 g hidroxid de sodiu, 15 ml acid lactic). Ouăle vii nu percep culoarea; embrionii ouălor moarte devin albaștri.

Metoda de colorare nu este aplicabilă pentru ouăle imature ale viermilor rotunzi și ale viermilor bici; coaja pigmentată este colorată și, prin urmare, nu este vizibil dacă celula germinativă din interiorul oului este colorată.

Larvele de Ascaris sunt colorate cu o soluție bazică de vopsea albastru cresil strălucitor la o concentrație de 1:10 000. în felul următor: o picătură de lichid cu ouă de viermi rotunzi și o picătură din soluția principală de vopsea se aplică pe o lamă de sticlă. Preparatul este acoperit cu o lamelă, care este presată strâns pe specimen în timp ce se bate ușor cu un ac de disecție. La microscop se observă numărul de larve emergente și gradul de colorare a acestora, după care se examinează din nou același preparat după 2-3 ore.Numai larvele neformate care nu s-au colorat timp de 2 ore sunt considerate vii.Larvele moarte sunt colorate atunci când coaja se rupe (parțial sau complet).

Posibilitatea colorării preparatelor cu soluție de iod este indicată la determinarea viabilității ouălor de viermi rotunzi aviari. În acest caz, o soluție de alcool de 5% de iod este utilizată ca colorant. Când se aplică preparatului, embrionii ouălor moarte de Ascaridia devin portocalii în 1-3 s. Ouăle moarte de opistorhis și oncosferele de tenie bovină sunt colorate cu o soluție de albastru de toluidină (1:1000), iar oncosferele moarte de tenia bovină sunt colorate cu o soluție de albastru cresyl strălucitor (1:10.000). În același timp, embrionii și cojile ouălor moarte și vii capătă culoare. Prin urmare, după colorare, ouăle și oncosferele sunt spălate apă curatăși în plus colorat cu safranină (diluat 1:10.000 într-o soluție de alcool 10%). Alcoolul îndepărtează culoarea de pe cochilii, iar safranina le dă o culoare roșie. Ca urmare, ouăle vii devin roșii, embrionul celor morți devine albastru, iar coaja rămâne roșie. Embrionii morți de oncosfere de tenia bovine sunt colorați rapid, în câteva minute, în roșu aprins sau roz cu safranină sau albastru cu albastru cresyl strălucitor la o diluție de 1:4000 sau cu indigo carmin la o diluție de 1:1000-1:2000.

Embrionii vii nu se schimba sub influenta acestor coloranti nici dupa 2-7 ore.

Pentru a determina viabilitatea ouălor de tenia pitici, se recomandă utilizarea următoarelor vopsele: 1) albastru cresyl strălucitor (1:8000) - după 1 oră, oncosfera ouălor moarte devine deosebit de viu colorată, care iese puternic în evidență față de palid. sau fond incolor al restului de ou; 2) safranina: diluată 1:8000 cu expunere timp de 2 ore și 1:5000 timp de 3-5 ore; 3) Soluție 50% de acid pirogalic în diluție de 1:2 - când este expus timp de 1 oră la o temperatură de 29-30 °C (cu cât temperatura este mai mică, cu atât procesul de vopsire este mai lung).

Plerocercoizii vii ai teniei sunt foarte bine colorați cu o soluție apoasă (1:1000) de neutralrot timp de 5-20 de minute. Pentru a obține o culoare roz persistentă care să nu dispară în 5 zile și să nu afecteze motilitatea plerocercoizilor, de obicei sunt suficiente 10 minute. Gradul de colorare este controlat prin vizualizarea larvelor într-o soluție izotonică pură de clorură de sodiu, scop în care plerocercoizii sunt periodic îndepărtați din vopsea. Este recomandabil să folosiți albastru de metilen pentru a colora plerocercoizii morți.

R.E. Chobanov și colaboratorii (1986) au propus o metodă de determinare a viabilității ouălor și larvelor de helminți folosind pigment „rubrină”, obținut prin cultivarea mucegaiului Peniciliium rubrum, ca colorant. Pentru a face acest lucru, utilizați o soluție apoasă de colorant 3%.

Procesul de colorare a ouălor și a larvelor se finalizează după 1,5 ore.Ouăle neviabile de oxiuri, tenii bovine și pitice, anchilostoma, tricostrongilide capătă o culoare roz intens, larvele de anchilostoma și tricostrongilide devin roșii. O culoare mai puțin strălucitoare se observă în ouăle viermilor rotunzi și tricocelor, deoarece, atunci când sunt eliberate din intestine, au deja o culoare maro închis: ouăle și larvele viabile nu sunt colorate.

Metode fizico-chimice pentru stimularea eliberării miraculidului din ouăle de trematode. Au fost dezvoltate metode de S.M. German și S.A. Beer (1984) pentru a determina viabilitatea ouălor de opistorhide și dicroceliu prin expunerea ouălor la un mediu de reacție. Dacă sunt în viață, miracidiul este eliberat. Metodele se bazează pe activarea fizico-chimică a glandei de ecloziune miracidium și stimularea activitate motorie larvele. Stimularea se realizează prin expunerea ouălor de trematod la un mediu de reacție special în combinație cu tehnici secvențiale - crearea unei diferențe de temperatură, uscarea unei suspensii de ouă, expunerea la un flux slab de lichid în picătura de testare, care contribuie la eliberarea masivă a miracidiei din ouăle.

Determinarea viabilității ouălor de opistorhide folosind metoda Herman și Beer. O suspensie de ouă în apă (robinet, decantat) este prerăcită la 10-12 °C. Toate operațiunile ulterioare se efectuează la temperatura camerei (18-22 °C). O picătură (aproximativ 0,05 ml) dintr-o suspensie care conține 100-400 de ouă este adăugată într-un tub de centrifugă. Tuburile se pun într-un suport timp de 5-10 minute pentru a sedimenta ouăle. Apoi bandă îngustă Folosind hârtie de filtru, aspirați cu grijă excesul de apă până când acesta este complet îndepărtat. Adăugați 2 picături de mediu în eprubetă, agitați, transferați conținutul cu o pipetă pe o lamă de sticlă și lăsați timp de 5-10 minute, agitând ușor (sau puneți sub uscător de păr) pentru a crea curenti slabi de lichid în picătura de suspensie de test. . Această operație, care imită peristaltismul intestinului moluștei, permite activarea eliberării miracidiei. După aceasta, în suspensie se adaugă încă 2 picături de mediu și apoi preparatul este microscopizat folosind un microscop cu lumină convențional (X200). În acest timp, capacul de ouă cu un miracidiu viabil ar trebui să se deschidă, iar larva iese activ în mediu. Datorită prezenței etanolului în el, miracidiul este imobilizat după 3-5 minute, apoi colorat cu un colorant găsit în mediu. Ca urmare, miracidia sunt ușor de detectat și numărat.

Prepararea mediului de reacție. Mediul este preparat în tampon Tris-HCi 0,05 M la condiții optime de pH de 8,0-9,5. Etanol este adăugat în tampon la 10-13% și un colorant (safranină, albastru de metilen și altele care funcționează în intervalul de pH) colorare slabă lichid (de exemplu, pentru safranină concentrația sa finală va fi de 1:50.000). Puteți utiliza un alt tampon care funcționează în limitele de pH alcaline, de exemplu fosfat 0,05 M (pH 8,5). Prin urmare, mediul conține 96% etanol - 12 părți; colorant (soluție mamă) - 1-10 părți; 0,05 M Tris-NS! tampon (pH 8,5-9,5) - până la 100 părți. Exemplu de mediu: 12 părți etanol 96%, 1 parte dintr-o soluție saturată de safranină, restul până la 100 părți - tampon Tris-HCl 0,05 M, pH 9,5.

Determinarea viabilității ouălor de dicroceliu folosind metoda Herman, Beer, Stratan. O picătură de suspensie care conține 100-150 de ouă de trematode este plasată într-un tub de centrifugă timp de 1-2 minute pentru a sedimenta ouăle. Lichidul este apoi uscat cu grijă folosind o bandă de hârtie de filtru. Se adaugă 1-2 picături de mediu de reacție folosind o pipetă Pasteur și se incubează într-o baie de apă la 28-30 °C timp de 2-3 minute. Compoziție mediu: 6 părți butanol, 94 părți soluție de clorură de sodiu 0,4% sau soluție de clorură de potasiu 0,3% în apă distilată. Ouăle din mediu se transferă cu o pipetă pe o lamă de sticlă și se lasă timp de 1,5-2 ore la temperatura camerei (18-22 °C), cu 1-2 picături (0,05) adăugate la fiecare 25-30 de minute (pe măsură ce se usucă). ).ml) soluţie de butanol în apă distilată. După aceasta, preparatul este examinat la microscop la o mărire de 100-200x. Viabilitatea este determinată de numărul de ouă deschise cu miracidie eliberate. Butanolul pătrunde prin porii cojii de ou, ajunge la miracidie și le activează. Incubarea la temperatura menționată îmbunătățește acest proces. Butanolul in concentratie de 3-7% este in detrimentul miracidiului care iese din ou. Transferarea unei suspensii de ouă dintr-o eprubetă pe o lamă de sticlă permite, în momentul în care miracidiul este eliberat (după 30-40 de minute), reducerea concentrației de butanol datorată volatilizării la un nivel sigur (1,5-0,5%). Prezența clorurii de sodiu în mediu la o concentrație de 0,1-0,5% (sau a clorurii de potasiu la o concentrație de 0,05-0,4%) determină activitatea miracidiului eliberat. Spre deosebire de ouăle mici și transparente de opistorc, ouăle de dicrocelium au o coajă de culoare închisă; au un capac clar vizibil, care se deschide după apariția miracidiului. Prin urmare, este mai convenabil să se evalueze viabilitatea ouălor de dicroceliu prin numărarea ouălor deschise, mai degrabă decât prin colorarea și numărarea miracidiei.

Metodă luminiscentă pentru studierea ouălor și larvelor de helminți.

Pentru prima dată în practica helmintologică, metodele de microscopie fluorescentă au fost folosite în 1955. S-a raportat că microscopia fluorescentă face posibilă diferențierea obiectelor vii și moarte fără a deteriora oul. Pentru fluorescență nu s-au folosit razele UV, ci partea albastru-violetă a luminii vizibile, cu microscop convențional și lame de sticlă; aplicat la iluminatorul OI-18 set special filtre de culoare.

S-a constatat că ouăle vii și moarte de viermi rotunzi, oxiuri, tenii pitici, tenia bovine, tenii late și alți helminți fluoresc diferit. Acest fenomen se observă atât în timpul luminiscenței primare fără utilizarea coloranților, cât și atunci când se colorează cu fluorocromi (acridină portocalie, corifosfină, primulină, aurolină, sulfat de berlerina, tripaflavină, rivanol, chinină etc.).

Ouăle de viermi rotunzi necolorate, vii, nesegmentate strălucesc în verde strălucitor cu o nuanță gălbuie; în ouăle moarte coaja radiază lumina verde mult mai strălucitor decât cel germinal verde închis; În ouăle de viermi rotunzi cu o larvă, apare doar coaja, iar în ouăle moarte, atât coaja, cât și larva sunt galbene strălucitoare.

Ouăle vii nepigmentate și nesegmentate de oxiuri și tenii pitici emit o lumină galben-verzuie; În ouăle moarte, coaja luminesce intens pe fundalul unei mase embrionare de culoare verde închis. Cu luminiscență secundară (atunci când este colorată cu portocaliu de acridină la o diluție de 1:10.000 și 1:50.000 de la 30 de minute la 2 ore), coaja nematodelor, trematodelor și cestodelor vii și morți luminesce diferit.

Învelișul Ascaris lumbricoides vii și morți, Toxocara leonina, Enterobius vermicularis, Hymenolepis nana, H.fraterna, H. diminuta, T.saginatus, D.latum este de culoare portocalie-roșu. Embrionii de Asc. lumbricoides, T.leonina, H.diminuta, D.latum și oncosferele teniei bovine au fluorescentă într-o culoare verde închis sau gri-verde. Embrionii morți ai acestor ouă de helminți emit o lumină roșie-portocalie „arzătoare”. Larvele vii de oxiuri și toxocara (coji de ouă eliberate) emit o lumină slabă gri-verde; când mor, culoarea se schimbă de la capătul capului la un verde deschis „arzător”, apoi galben, portocaliu și, în final, portocaliu strălucitor.

Când sunt colorate cu fluorocromi - coryphosphilus, primulină - ouăle moarte ale viermilor rotunzi și ale viermilor bici prezintă o strălucire de la galben-liliac la roșu-cupru. Ouăle viabile nu luminesc, ci sunt vopsite în verde închis. Ouăle vii ale trematodelor Paragonimus westermani și Clonorchis sinensis nu luminesc atunci când sunt colorate cu portocaliu de acridină, dar ouăle moarte emit o lumină verde-gălbuie.

Metoda luminiscenței poate fi folosită și pentru a determina viabilitatea larvelor de helminți. Astfel, larvele de strongilat și rhabditatus fluorocromate cu o soluție de portocală de acridină (1:2000) strălucesc: cele vii - verzi (cu nuanță), cele moarte - cu o lumină portocalie strălucitoare. Larvele vii de Trichinella nu strălucesc și nu dau o strălucire slabă atunci când sunt tratate timp de 10 minute cu soluții de izotiocianat de fluoresceină, auramină etc. Larvele moarte fluorocromate (la o concentrație de 1:5000) dau o strălucire strălucitoare.

Miracidiile vii care ies din coajă emit o lumină slabă albăstruie cu o corolă galben deschis a cililor abia vizibilă, dar la 10-15 minute după moarte ele apar cu o lumină verde deschis „arzătoare” și apoi portocaliu-roșu.

CATEGORII

Screening

Ecografia extremităților

Tipuri de ultrasunete

Ecografia abdominală

Ecografia toracelui

ARTICOLE POPULARE

	Negația nu cu verbe (la forma personală, la infinitiv, la forma gerunziului) se scrie separat: a nu lua, nu a fost, neștiind, încet.
	Prezentare, raportați principalele trăsături ale filozofiei renașterii
	Stilul de ficțiune
	Copiii pământului Prezentare suntem copiii pământului pentru grădiniță
	Prezentare pe tema barierelor în calea comunicării, lucrarea a fost finalizată de studenți.Fără comunicare, ne închidem în

2023 „kingad.ru” - examinarea cu ultrasunete a organelor umane