A limfociták skl vegyes tenyészetének elemzése. Limfociták vegyes kultúrája

Minden webfejlesztőnek ismernie kell az SQL-t ahhoz, hogy adatbázis-lekérdezéseket írhasson. És bár a phpMyAdmin nem lett törölve, az alacsony szintű SQL írásához gyakran be kell piszkolni a kezét.

Ezért készítettünk egy rövid ismertetőt az SQL alapjairól. Kezdjük el!

1. Hozzon létre egy táblázatot

A CREATE TABLE utasítás táblák létrehozására szolgál. Az argumentumoknak az oszlopok nevének és adattípusának kell lenniük.

Hozzunk létre egy egyszerű táblázatot, melynek neve hónap. 3 oszlopból áll:

• id– A hónap száma a naptári évben (egész szám).
• név– A hónap neve (karakterlánc, maximum 10 karakter).
• napok– Napok száma ebben a hónapban (egész szám).

Így nézne ki a megfelelő SQL-lekérdezés:

CREATE TABLE hónapok (id int, név varchar(10), napok int);

Táblázatok létrehozásakor is célszerű az egyik oszlophoz elsődleges kulcsot adni. Ez egyedivé teszi a nyilvántartásokat, és felgyorsítja a kiválasztott lekérdezéseket. Legyen esetünkben egyedi a hónap neve (oszlop név)

TÁBLÁZAT LÉTREHOZÁSA hónapok (id int, név varchar(10), napok int, PRIMARY KEY (name));

dátum és idő

Adattípus	Leírás
DÁTUM	Dátumértékek
DÁTUM IDŐ	Dátum és idő értékek perc pontossággal
IDŐ	Időértékek

2. Sorok beszúrása

Most pedig töltsük ki a táblázatunkat hónapok hasznos információ. A rekordok táblához való hozzáadása az INSERT utasításon keresztül történik. Ezt az utasítást kétféleképpen írhatjuk meg.

Az első módszer az, hogy nem adjuk meg azoknak az oszlopoknak a nevét, ahová az adatokat beillesztjük, hanem csak az értékeket adjuk meg.

Ez a jelölés egyszerű, de nem biztonságos, mert nincs garancia arra, hogy a projekt bővítésekor és a táblázat szerkesztése során az oszlopok ugyanabban a sorrendben lesznek, mint korábban. Az INSERT utasítások biztonságosabb (és egyben körülményesebb) írási módja az értékek és az oszlopok sorrendjének megadását igényli:

Itt van a lista első értéke ÉRTÉKEK megegyezik az elsőként megadott oszlopnévvel, és így tovább.

3. Adatok kinyerése táblákból

A SELECT utasítás a miénk legjobb barát amikor adatokat szeretnénk lekérni az adatbázisból. Nagyon gyakran használják, ezért kérjük, figyelmesen olvassa el ezt a részt.

A SELECT utasítás legegyszerűbb használata egy olyan lekérdezés, amely egy tábla összes oszlopát és sorát adja vissza (például egy táblából karakterek):

SELECT * FROM "karakterek"

A csillag karakter (*) azt jelenti, hogy az összes oszlopból szeretnénk adatokat szerezni. Mivel az SQL adatbázisok általában egynél több táblából állnak, meg kell adni kulcsszó FROM, majd egy szóköz, majd a táblázat neve.

Néha nem akarunk adatokat lekérni egy táblázat nem minden oszlopából. Ehhez a csillag (*) helyett vesszővel elválasztva kell beírnunk a kívánt oszlopok nevét.

SELECT azonosító, név FROM hónap

Ezenkívül sok esetben azt szeretnénk, hogy az eredmények meghatározott sorrendben legyenek rendezve. SQL-ben ezt az ORDER BY paranccsal tesszük. Szükség lehet egy opcionális módosítóra - ASC (alapértelmezett) a növekvő sorrendben, vagy DESC a csökkenő sorrendben:

SELECT id, név FROM hónaptól ORDER BY név DESC

Az ORDER BY használatakor ügyeljen arra, hogy az utolsó legyen a SELECT utasításban. Ellenkező esetben hibaüzenet jelenik meg.

4. Adatszűrés

Megtanulta, hogyan válasszon ki adott oszlopokat egy adatbázisból SQL lekérdezéssel, de mi van akkor, ha bizonyos sorokat is szeretnénk lekérni? Itt segít a WHERE záradék, amely lehetővé teszi az adatok feltétel alapján történő szűrését.

Ebben a lekérdezésben csak azokat a hónapokat jelöljük ki a táblázatból hónap amelyek 30 napnál hosszabbak a nagyobb mint (>) operátor használatával.

SELECT azonosító, név FROM hónap WHERE nap > 30

5. Speciális adatszűrés. ÉS és VAGY operátorok

Korábban egyetlen feltétel alapján szűrtük az adatokat. Bonyolultabb adatszűréshez használhatja az ÉS és VAGY operátorokat, valamint az összehasonlító operátorokat (=,<,>,<=,>=,<>).

Itt van egy táblázat, amely minden idők négy legkelendőbb albumát tartalmazza. Válogassuk ki azokat, amelyek a rocknak ​​minősülnek, és kevesebb mint 50 millió példányban keltek el. Ez könnyen megtehető, ha a két feltétel közé egy ÉS operátort helyezünk.

SELECT * FROM albumok WHERE műfaj = "rock" ÉS eladások_milliókban<= 50 ORDER BY released

6. In/Between/Like

A WHERE számos speciális parancsot is támogat, lehetővé téve a leggyakrabban használt lekérdezések gyors ellenőrzését. Itt vannak:

• IN - egy sor feltétel megadására szolgál, amelyek bármelyike ​​teljesíthető
• BETWEEN – Ellenőrzi, hogy az érték a megadott tartományban van-e
• LIKE - bizonyos mintákat keres

Például, ha albumokat szeretnénk kiválasztani a popés lélek zene, használhatjuk az IN("érték1","érték2") -t.

SELECT * FROM albumok WHERE műfaj IN ("pop", "soul");

Ha meg akarjuk szerezni az összes 1975 és 1985 között megjelent albumot, akkor ezt írjuk:

SELECT * FROM albumok WHERE 1975 ÉS 1985 KÖZÖTT;

7. Funkciók

Az SQL tele van olyan funkciókkal, amelyek mindenféle hasznos dolgot végeznek. Íme néhány a leggyakrabban használtak közül:

• COUNT() - a sorok számát adja vissza
• SUM() - egy numerikus oszlop teljes összegét adja vissza
• AVG() - egy értékkészlet átlagértékét adja vissza
• MIN() / MAX() – A minimális/maximális értéket kéri le egy oszlopból

Ahhoz, hogy táblázatunkban a legutóbbi év szerepeljen, a következő SQL lekérdezést kell írnunk:

SELECT MAX(megjelent) albumokból;

8. Allekérdezések

Az előző bekezdésben megtanultuk, hogyan lehet egyszerű számításokat végezni adatokkal. Ha a számítások eredményét szeretnénk felhasználni, akkor nem nélkülözhetjük a beágyazott lekérdezéseket. Tegyük fel, hogy ki akarjuk adni művész, albumés kiadás éve a táblázat legrégebbi albumához.

Tudjuk, hogyan lehet ezeket a konkrét oszlopokat megszerezni:

SELECT előadó, album, megjelent FROM albumokból;

Azt is tudjuk, hogyan szerezzük be a legkorábbi évet:

SELECT MIN(megjelent) FROM album;

Most már csak össze kell kapcsolni a két lekérdezést a WHERE-vel:

SELECT előadó,album,kiadva FROM albumokból WHERE megjelent = (SELECT MIN(megjelent) FROM albumokból);

9. Táblázatok összevonása

Az összetettebb adatbázisokban több tábla is kapcsolódik egymáshoz. Az alábbiakban például két táblázat található a videojátékokról ( videójátékok) és videojáték-fejlesztők ( game_developers).

asztal videójátékok van egy fejlesztői oszlop ( fejlesztői_azonosító), de egy egész számot tartalmaz, nem a fejlesztő nevét. Ez a szám egy azonosító ( id) a megfelelő fejlesztőtől a játékfejlesztői táblázatból ( game_developers) logikusan összekapcsolja a két listát, lehetővé téve, hogy a mindkettőben tárolt információkat egyszerre használjuk fel.

Ha olyan lekérdezést szeretnénk készíteni, amely mindent visszaad, amit a játékokról tudnunk kell, akkor egy INNER JOIN segítségével összekapcsolhatjuk mindkét tábla oszlopait.

SELECT video_games.name, video_games.genre, game_developers.name, game_developers.country FROM video_games BELSŐ CSATLAKOZÁS game_developers ON video_games.developer_id = game_developers.id;

Ez a legegyszerűbb és leggyakoribb JOIN típus. Számos más lehetőség is létezik, de ezek ritkább esetekre vonatkoznak.

10. Álnevek

Ha megnézi az előző példát, észre fogja venni, hogy két oszlop van nevezett név. Ez zavaró, ezért állítsunk be egy álnevet az ismétlődő oszlopok egyikéhez, például név az asztaltól game_developers hívják majd fejlesztő.

A lekérdezést a táblanevek álnévvel is lerövidíthetjük: videójátékok hívjuk játékok, game_developers - fejlesztők:

SELECT games.name, games.genre, devs.name AS fejlesztő, devs.country FROM video_games AS games INNER JOIN game_developers AS devs ON games.developer_id = devs.id;

11. Adatfrissítés

Gyakran néhány sorban módosítanunk kell az adatokat. SQL-ben ez az UPDATE utasítással történik. Az UPDATE utasítás a következőkből áll:

• A pótlási értéket tartalmazó táblázat;
• Oszlopnevek és új értékeik;
• A WHERE elemmel kijelölt sorok, amelyeket frissíteni szeretnénk. Ha ez nem történik meg, akkor a táblázat összes sora megváltozik.

Alul a táblázat látható TV sorozat sorozatokkal azok értékelésével. A táblázatba azonban egy apró hiba csúszott: bár a sorozat Trónok harcaés komédiaként írják le, valójában nem az. Javítsuk ki!

tv_series táblázat adatai UPDATE tv_series SET genre = "dráma" WHERE id = 2;

12. Adatok törlése

Egy táblázatsor törlése SQL-lel nagyon egyszerű folyamat. Csak annyit kell tennie, hogy kiválasztja a törölni kívánt táblázatot és sort. Távolítsuk el a táblázat utolsó sorát az előző példából TV sorozat. Ez a >DELETE utasítással történik.

DELETE FROM tv_series WHERE id = 4

Legyen óvatos a DELETE utasítás írásakor, és ügyeljen a WHERE záradék meglétére, ellenkező esetben az összes táblasor törlődik!

13. Táblázat törlése

Ha az összes sort el akarjuk távolítani, de magát a táblázatot elhagyjuk, akkor használjuk a TRUNCATE parancsot:

TRUNCATE TABLE táblanév;

Abban az esetben, ha valóban törölni akarjuk az adatokat és magát a táblát is, akkor a DROP parancs jól jön:

DROP TABLE táblázat_neve;

Legyen nagyon óvatos ezekkel a parancsokkal. Nem vonhatók vissza!/p>

Ezzel az SQL oktatóanyagunk véget ért! Nem sokat foglalkoztunk vele, de amit már tud, annak elegendőnek kell lennie ahhoz, hogy gyakorlati készségeket adjon a webes karrierje során.

A limfociták és a különböző haplotípusú MHC-II molekulák együttes tenyésztése blast transzformációt és proliferációt okoz. A reagáló sejtek a T-limfocitákhoz tartoznak, és a B-limfocitákon, makrofágokon elhelyezkedő idegen MHC-II determinánsok stimulálják őket. A reakció erőssége a hisztokompatibilitási antigének közötti különbség mértékétől függ. Az egyed MHC allélvariánssal szembeni reaktivitásának értékelésére egy egyirányú limfocitatenyészetet készítünk. Ennek érdekében a stimulátorsejteket mitomicinnel előkezelnek vagy besugároznak, miközben a stimuláló sejtek elveszítik osztódási képességüket, de életképesek maradnak.

A limfociták vegyes tenyészetében való reaktivitás az értékelés egyik kritériuma sejtes immunitás. Az SKL lehetővé teszi a kivitelezést HLA gépelés, donor-recipiens pár kiválasztására szövet- és szervátültetésre, korreláció megállapítására a HLA antigének és bizonyos betegségek között.

A reakció felállításához a betegek (donor és recipiens) véréből izolált limfociták szuszpenzióját használjuk. A mosott reagáló sejteket kis mennyiségű 199 táptalajban (0,5 ml) szuszpendáljuk, és a sejtek számának megszámlálása után 0,6*106 sejt/ml-re állítjuk be. A stimuláló sejtszuszpenziót hasonló módon állítjuk elő mitomicin C oldatának (500 μg mitomicin C 1 ml pufferolt sóoldatban) hozzáadásával 0,1 ml/1 ml szuszpenzió arányban. A sejtkeveréket 40 percig 37 °C-on vízfürdőben, keverés közben inkubáljuk, majd hideg 199-es tápközeget adunk a szuszpenzióhoz, és a sejteket centrifugálással háromszor mossuk. A csapadékot benne szuszpendáljuk táptalaj tenyésztéssel, a sejtek számát 0,6*106 sejt/ml-re emelve.

A Hank-féle oldatban lévő sejtszuszpenzió 0,1 ml-ét egy steril, kerek fenekű immunológiai lemez lyukaiba adjuk, és 0,1 ml MHC allélváltozatokat hordozó sejtszuszpenziót adunk hozzá. Ugyanennyi Hank-oldatot adtunk a kontrollhoz.

Az eredményeket a sejtek 37 °C-on 3-5 napig tartó inkubálása után végezzük, a reakció összetételétől függően morfológiai vagy izotópos módszerrel (lásd RBTL).

Átültetéskor csontvelő a hisztokompatibilis donor kiválasztása a donor és a recipiens HLA-tipizálásának eredményein, valamint a kiválasztott HLA-azonos donor-recipiens párok kompatibilitásának meghatározásakor történik az SCL-ben, ami a kompatibilitás értékelésének utolsó szakasza. Ehhez kétirányú SCL-reakciót alkalmaznak mikrokultúrás módszerrel egy 96 lyukú lemezen, a proliferáció mértékének felmérésével a radioaktív H 3 -timidinnek a proliferáló limfociták DNS-ébe történő beépülése révén.

Jelenleg nagy figyelmet fordítanak a szerep tanulmányozására immunmechanizmusok a reproduktív folyamatban, mivel megsértésük meddőség kialakulásához és a terhesség korai megszakadásához vezet. Immunológiai paraméterek vizsgálata és kapcsolatuk a szaporodási folyamatok arra a következtetésre vezetett, hogy szerkezetátalakításra van szükség immunrendszer az anya testének terhességre való felkészítésében, kezdve azzal ovulációs időszak, az embrióbeültetés időpontjában és a korai időszak terhesség.

A meddőség és az ismétlődő spontán vetélések egyik legösszetettebb és legnehezebben diagnosztizálható oka az immunrendszer diszfunkciója.

Azzal a céllal időben történő felismerés az immunológiai meddőséget a reprodukciós immunológiai laboratóriumban vizsgálják párok segítségével következő módszereket diagnosztika:

• a női limfociták partnerantigénekre adott proliferatív válaszának szintjének vizsgálata (limfociták vegyes kultúrájában)
• a blokkoló faktorok aktivitásának meghatározása egy nő vérszérumában.
• a természetes citotoxikus sejtek alpopulációinak mennyiségi tartalmának értékelése perifériás vér nők.
• kiterjesztett immunogram
• a perifériás vérben szupresszor aktivitással rendelkező szabályozó sejtek tartalmának vizsgálata.
• azonosításakor klinikai és laboratóriumi jelek immunológiai meddőség esetén javasolt a betegeknek alávetni orvosi eljárás- alloimmunizálás a férj limfocitáival, amelyet egyéni ütemterv szerint végeznek.

Konzultáció szükséges:

• ha hiányában nőgyógyászati ​​és endokrin betegségek rendszeres szexuális élet mellett az év során nincs terhesség.
• ismétlődő (1-nél többször) spontán abortuszok (vetélés) esetén.
• nál nél sikertelen IVF a történelemben.
• valódi terhesség megszakításának fenyegetésével.

Ha jogsértéseket észlelnek, eljárást írnak elő a jogsértések immunokorrekciója céljából. alloimmunizálás partner limfocitákkal (AIL). Ez a módszer a kezelések jóváhagyottak Szövetségi Szolgálat az egészségügy területén végzett felügyeletről (2009/179 sz. FS engedély, 2009.07.02.)

Az eljárást csak akkor hajtják végre, ha a partner rendelkezik negatív eredményeket HIV-fertőzés, szifilisz és vírusos hepatitisz(IDŐSZÁMÍTÁSUNK ELŐTT). Az AIL szövődményeit nem azonosították. Az AIL módszer kifejezett immunkorrekciós hatással rendelkezik, növeli a meddőségi kezelés hatékonyságát, mint pl. természetes körforgás, szintén in vitro megtermékenyítés(ECO). Sikertelen in vitro megtermékenyítési kísérletekre is felírják.

Az AIL-t 1 alkalommal 28-30 napon belül hajtják végre (a menstruációs ciklus nők) a ciklus 1. fázisában. Az első tanfolyam 3 AIL eljárást tartalmaz. A 2. eljárás után a pár újra elvégzi a kontrollelemzést. Pozitív dinamika esetén a harmadik AIL eljárás az utolsó. Dinamika hiányában az immunizáláshoz szükséges sejtek dózisát növelik, és a 2. tanfolyamot végzik, amely 2 eljárást tartalmaz. A kontrollelemzés után bizonyos esetekben szükség van a 3. immunizálási kúra előírására a sejtek dózisának növelésével. A standard értékek elérése után a pozitív hatás 6-8 hónapon belül tart.

A 2003-2013 közötti időszakra. a celluláris immunterápia laboratóriumában mintegy 3000 alloimmunizálási eljárást végeztek partnerek limfocitáival. Ehhez az eljáráshoz csak limfocitákat izolálnak a partner véréből, amelyek mindig jelen vannak a spermában. Más országokban* szintén 20 éve végeznek alloimmunizálási eljárást, amely segít egy nőnek egészséges gyermeket szülni és szülni.

A szolgáltatás típusa	ár, dörzsölje.
Limfocita transzformációs teszt	1650
Limfocita transzformációs teszt (szezibilizáció kimutatása 2v-va-n)	2 900
Limfocita transzformációs teszt (szenzibilizáció kimutatása 3v-va-n)	3 900
Limfocita transzformációs teszt (immunológiai vizsgálat meddőség megállapítására)	3 200
Kibővített immunogram aktivációs markerekkel	4 625
Az immunállapot átfogó vizsgálata	4 125
Védőoltás (alloimmunizálás partner limfocitáival 1 adag)	1 900
Védőoltás (alloimmunizálás partner limfocitáival, 2 adag)	2 750
Védőoltás (alloimmunizálás partner limfocitáival, 3 adag)	3 400
CD16+/CD56+ limfociták vizsgálata (immunológiai vizsgálat meddőségre csak NK sejtek)	1 250
A makrofágok aktivitásának vizsgálata (a makrofágok kondicionált környezete)	9 400
A makrofágok aktivitásának vizsgálata (feltételes táptalaj)	1 500
Mononukleáris sejtek mélyhűtése alloimmunizálás céljából	650

2.2. Sejtkölcsönhatások módszerei

A klinikai immunogenetikában alkalmazott sejtkölcsönhatások szinte valamennyi módszere azon a jelenségen alapszik, hogy a limfociták vegyes tenyészetében kialakul a blasztképződés, amelyet Barbara Bain kanadai kutató fedezett fel. A kevert limfocita tenyészet (MLC) reakció lehetővé tette a HLA komplex és különösen annak egyik alegységének, a HLA-D lókusznak a finom differenciált vizsgálatát. Számos egyéb sejtkölcsönhatási módszer - sejtközvetített limfolízis (Cell-mediált limfolízis - CML), a priming limfociták tesztje (Primed Lymphocyte Typing) - az MLC módszeren alapul, vagy szerves részeként tartalmazza.

2.2.1. Limfocita vegyes kultúra (MCL)

A módszer elve az ábrán látható. 10. ábra, amely azt mutatja, hogy két genetikailag különböző limfociták populációja lép kölcsönhatásba egymással in vitro tenyészetben. Az egyik populációt mitomicin C-vel kezelnek vagy besugároznak, aminek következtében elveszti a blastképző képességét és a timidin beépülési képességét (3 HT), ugyanakkor az antigén tulajdonságok elvesztése nélkül megtartja stimuláló képességét (stimulánsok; S- népesség).

A stimulációra reagáló sejtek (reszponderek, R-populáció) néhány nap múlva blasztokká alakulnak át, és timidint is tartalmaznak a tenyészethez. A reakció intenzitását sugárzási jelzéssel mérjük3H-timidin beépítésével.

A vegyes limfocitatenyészet reakciójának számos változata ismert, amelyek közül kettőt javasolunk itt: egy hagyományos és egy Cook lemezeken megvalósított mikrovariánst (11. ábra).

Rizs. 11. Berendezések MLC és CML mikrovariánsokhoz. 1 - tabletta kerek fenék e 96 lyuk; 2-automata pipetta ("Pipetman") különböző térfogatú programokkal; 3 - automatikus pipetta ("Sigma") egy bizonyos térfogathoz; 4 - eldobható pipettahegy; 5 - lamináris doboz

Az MLC hagyományos verziója (F. S. Baranova módosította):

A limfocitákat ficoll-urographin gradiensen izoláljuk a fent leírtak szerint. Az első mosást PBS-ben végezzük (NaCl - 8,0 g, Na 2 HP0 4 - 1,15 g, KH 2PO 4 - 0,2 g, KC1 - 0,2 g 1 liter vízben); a következő kettőt 5% AB szérumot tartalmazó 199-es tápközegben állítják elő (15 donorból álló csoport);

A reagáló sejteket 10% AB szérumot tartalmazó 199 tápközegben újraszuszpendáljuk, és a sejtkoncentrációt 0,6 x 106-ra állítjuk be 1 ml-ben;

Az ugyanilyen módon izolált stimuláló sejteket 1 ml-enként 5-10 6 koncentrációban mitomicin C-vel (60 γ/ml) kezeljük a Serva cégtől, és 40 percig 37 °C-on vízfürdőben inkubáljuk. Inkubálás után a sejteket háromszor mossuk 5% szérum-AB-t tartalmazó 199-es tápközeggel, majd 10% AB-szérumot tartalmazó 199-es tápközegben újraszuszpendáljuk, így a koncentrációt 0,6x106-ra állítjuk be 1 ml-ben;

0,5 ml reagáló sejtet és 0,5 ml stimuláló sejtet összekeverünk egy centrifugacsőben, hozzáadunk 0,04 ml 10 ml Hepes-oldatot (Serva), és 144 órán át inkubáljuk; a tapasztalat három párhuzamba kerül (hármas);

24 órával az inkubáció vége előtt 3H-timidint 1 μCi (3,7x10 4 BC) adunk a csövekhez, mintánként konkrét tevékenység 5 mSi/mmol (18,5x107 Bq/mmol), és folytassuk az inkubálást;

Az inkubálás végén a sejteket millipórusos szűrőkre (0,6-0,9 mikronos) visszük át, majd mossuk. sóoldat(37 °C) és lehűtött 5%-os triklór-ecetsavoldat (4 °C). A szűrőket megszárítjuk, és 5 ml szcintillációs folyadékot tartalmazó fiolákba helyezzük (5 g PPO és 0,5 g POPOP 1 liter toluolban)*. A3H-timidin beépülési aktivitását β-számlálóval mérjük; az eredményt a radioaktív jelölés abszolút zárványaiban fejezzük ki 1 perc alatt, vagy a stimulációs indexben (SI) a következő képlet szerint:

* (PPO - 2,5-fenol-oxazol; POPOP - (1,4-di-2-15-fenol-oxazolit-benzol).)

A CPM átlagos értéke három prototípusban

SI = három kontroll átlagos CPM-je/kontrolljai a reagáló sejtek spontán tenyészetei.

MLC mikrováltozat Cook tablettákban. A 8. Workshopon az MLC mikrováltozatot szabványosító követelményeket dolgoztak ki, amelyeknek megfelelően az alábbiakban bemutatjuk:

A limfocitákat isopac-ficoll gradiensben izoláljuk, és RPMJ-1640* tápközegben újraszuszpendáljuk, 1 ml-ben 5x105-re állítva a koncentrációt;

* (Használható az AB csoportba tartozó humán szérummal kevert 199-es táptalaj (több egyedtől vett 5% szérum).)

A stimulátor sejteket mitomicin C-vel vagy tréninggel kezelik;

5x104 repondert és ugyanannyi stimulánst helyezünk Pipetman típusú mikropipetta segítségével egy Cook kerek fenekű mikrolemez minden egyes lyukába;

A lemezeket 120 órán keresztül 5% CO 2 automatikus ellátású termosztátban inkubáljuk; majd lμmCi 3 H-timidint adunk minden egyes üreghez 6 Ci/mmol timidin fajlagos aktivitással; minden manipulációt Pipetman pipettával végeznek;

16 órával a timidin hozzáadása után az egyes üregekből származó tenyészeteket automata pipettával millipórusos szűrőkre visszük át, majd sóoldattal, majd 5%-os triklór-ecetsavval mossuk; kényelmes speciális "kombájnokat" használni a kultúra millipore szűrőkbe való átviteléhez;

A timidin beépülési aktivitását a fent leírtak szerint határozzuk meg.

2.2.2. Sejtközvetített limfolízis (CML)

A CML-t viszonylag nemrégiben (1972 óta) alkalmazták immunogenetikai vizsgálatokban, de ben mostanában egyre több lesz népszerű technika, amely lehetővé teszi, hogy részletesen tanulmányozza a transzplantációs immunitás efferens láncszemének szerepét és elismerést szerezzen, mint informatív módszer immunológiai monitorozás. A módszer elve az ábrán látható. 12. A módszer a J. Lightbody (1971) által javasolt technikán alapul, amelyet az alábbiakban foglalunk össze.

1. A CML egy hagyományos HLC teszttel kezdődik, amelyben a válaszadó sejtek felismerik a "stimulátorokat", szenzibilizálják a válaszadó sejteket, és szenzitizált gyilkosokat képeznek.

2. A második fázis, amelyben a szenzitizált ölőket összekeverik51Cr-jelölt célsejtekkel, az utóbbiakat effektor ölősejtekkel elpusztítják; A célsejtek ugyanazzal a genotípussal rendelkezhetnek, mint a "stimulátorok" az MLC első fázisában, vagy lehetnek a "harmadik" partner sejtjei, amelyek a "stimulátorokkal" közös antigéndeterminánsokkal rendelkeznek, vagy azok nélkül.

3. Az elpusztult célsejtekből felszabaduló és a táptalajba kerülő radioaktív króm mennyisége a gyilkos hatás intenzitásának mértéke.

Rizs. 12. A sejtközvetített limfolízis (CML) elve. I. sor - a reagáló sejtek érzékenyítése, gyilkosok kialakulása; II sor - a gyilkosok interakciója a célponttal; III sor - a célsejt megsemmisítése; exit 51 Cr táptalaj

A CML három változatát írjuk le itt: a hagyományos változatot L. P. Alekseev (1979) módosította, a Cook lemezek mikrováltozatát, a közvetlen CML-t (Direct-CML -D-CML).

Hagyományos lehetőség[Alekseev L.P., 1979].

A módszer több szakaszra oszlik.

Bérgyilkosokat szerezni:

Mindkét populáció (R-sejtek és S-sejtek) perifériás limfocitáit a szokásos módon izoláljuk, sűrűséggradiensben háromszor mossuk 5% AB szérumot tartalmazó 199-es tápközegben (10 perc, 150 g);

1x106 R-sejtet (0,8 ml) centrifugacsövekben összekeverünk 2x106 S-sejttel (0,2 ml), amelyeket mitomicin C-vel kezelünk, és 144 órán át 37 °C-on inkubáljuk;

A sejteket 150 g-vel 10 percig centrifugáljuk, és a pelletet 20% borjúszérum hozzáadásával 199-es tápközegben (199. táptalaj +, azaz) újraszuszpendáljuk, így a koncentrációt 1x106-ra állítjuk be 1 ml-ben;

Az egyik mintát az MLC szintjének tanulmányozására hagyják, a többit kész gyilkosként használják.

Célpontok fogadása:

A hagyományosan izolált limfocitákat 20% AB szérumot tartalmazó 199 tápközegben újraszuszpendáljuk, és fitohemagglutininnel (0,003 mg/ml Wellcome) 72 órán át 37 °C-on inkubáljuk; sejtkoncentráció 1x10 6 1 ml-ben;

A sejteket 10 percig 150 g-vel centrifugáljuk, a pelletet 5% AB-szérumot tartalmazó 199-es tápközegben újraszuszpendáljuk, és a sejtkoncentrációt 2x104-re állítjuk be 1 ml-ben;

51 Cr 100 μCi/ml-t (3,7x10 6 Bq/ml) adunk a szuszpenzióhoz, és 40 percig 37 °C-on inkubáljuk;

A sejteket háromszor mossuk 5% AB szérummal kiegészített 199 tápközegben (150 g, 10 perc), és a pelletet 5% AB szérummal kiegészített 199 tápközegben újraszuszpendáljuk. a koncentrációt 2x10 4-re hozzuk 1 ml-ben.

A reakciók kimutatása:

5x105 gyilkost (0,5 ml) összekeverünk 1x104 célponttal (0,5 ml), 4 órán át inkubáljuk (37 °C), és 150 g-vel 10 percig centrifugáljuk;

A felülúszót leszívjuk, és az 51Cr által kiváltott impulzust egy a-számlálón megszámoljuk; a számlálást 0,5 ml felülúszóban végezzük;

A citolízis szintjét a következő képlettel számítjuk ki:

ekeper. output 51 Cr - spontán output 51 Cr/max, output 51 Cr - spontán output 41 Cr × 100.

A króm spontán felszabadulását mérjük 4 órán át (37 °C) ölősejtek nélkül inkubált célpontokon; maximális krómhozam - a fagyasztással-olvasztással teljesen megsemmisült célpontokon; Minden vizsgálatot hármasban végeznek.

A CML mikrovariánsai tablettákban [Mawas S., 1976 szerint]:

A gyilkos előállítási fázist MLC-ként hajtjuk végre kerek fenekű lemezeken, de az R- és S-sejteket egyenlő mennyiségben keverjük össze 2x105 PA nyomáson mindegyik lyukban, és 37 °C-on inkubáljuk;

5 nap elteltével a sejteket Pasteur-pipettával kémcsőbe gyűjtjük, az élő sejtek számát tripánkékkel megszámoljuk, és a koncentrációt 1 ml-ben 10x106-ra állítjuk be;

A célsejteket PHA-val tenyésztjük 3 napig;

A reakció napján a célsejteket mossuk (300 g), és újraszuszpendáljuk a tápközegben, 1 ml-t kémcsövekbe osztunk, és 1 ml-ben 1 x 10 6-ra állítjuk;

200 μCi 51Cr-t (7,4x10 6 BK) adunk minden egyes célsejteket tartalmazó csőhöz, és 1 órán át 37 °C-on inkubáljuk; mossa meg a sejteket háromszor; az üledéket újra szuszpendáljuk, és 1 ml-ben (élő) 1x10 koncentrációra állítjuk be;

A tesztet kerek fenekű mikrolemezeken hajtják végre; ehhez 0,7-1x106 ölősejtet (0,1 ml) és 1x104 célsejtet (0,1 ml) osztunk ki minden egyes lyukba; a szuszpenzió össztérfogata mindegyik lyukban 0,2 ml, mindegyik lyukba 0,05 ml táptalajt adunk, és 4 órán át (37 °C) inkubáljuk;

A lemezeket 800 g-vel centrifugáljuk Beckman centrifugában 10 percig; az egyes lyukak felülúszóját kémcsövekbe visszük, és γ-számlálóval megszámoljuk;

Az ölőtermelési fázist (MLC) 20% humán plazmával kiegészített RPMJ-1640 táptalajon végezzük; az ölési fázishoz MEM táptalajt használunk 20% előmelegített humán plazma hozzáadásával.

Közvetlen CML (D-CML). A közvetlen CML egy kifejezetten klinikai célokra kifejlesztett technika, amelyet az immunológiai monitorozásban alkalmaztak. Ennek a reakciónak a sémája az ábrán látható. 13.

A fő különbség a hagyományos CML-hez képest, hogy a gyilkos képződés szakasza (szenzitizációs fázis) nem in vitro, hanem in vivo következik be, azaz az allogén szerv vagy szövet átültetésével érzékenyített emberi szervezetben. Az allogén szövet hatása miatt a recipiens limfocitái szenzitizálódnak a donor szöveti antigénjeivel szemben, és nem igényelnek speciális in vitro kezelést, a teszt időtartama időben jelentősen lecsökken, mivel először csak a célpontokat kell előkészíteni.

A célpontok a perifériás vérből vagy gyakrabban a donor lépéből nyert limfociták (lásd a 2.1.2 pontot), és a fent leírt módszerek bármelyikével lefagyasztották (lásd a 2.1.3 pontot).

2.2.3. Antitest-dependens-cell-mediált citotoxicitás (ADCC)

Ez a típusú sejtes válasz hatásmechanizmusában hasonló a fent leírt CML-hez. A reakció elvét az ábra mutatja. 14. A reakció komponensei a célsejtek (donor sejtek vagy allogén limfociták), a szérum (allogén vagy recipiens), feltehetően célsejt-determinánsokra irányított antitesteket tartalmazó szérum és effektor sejtek (recipiens limfociták vagy allogén limfociták).

Az ilyen típusú kölcsönhatásban az effektorsejtek a perifériás vérben található úgynevezett K-sejtek. A CML-ben a gyilkos sejtekkel ellentétben ezek előzetes szenzitizálás nélkül fejtenek ki citotoxikus hatást, azonban a K-sejtek citotoxikus hatásának megnyilvánulása csak a célsejtek determinánsaira irányuló antitesteken keresztül lehetséges. A specifikus lízist az 51 Cr felszabadulásával mérjük, ha a tesztszérum a céldeterminánsok ellen antitesteket tartalmaz.

Az ADCC céldeterminánsai szinte az összes HLA-lókusz sajátosságai lehetnek, beleértve a HLA-D-t, a HLA-DR-t, valamint a HLA-rendszeren kívüli determinánsokat is.

Legelterjedtebb ezt az összetett reakciót immunológiai monitorozás során kaptuk a B-sejtes antitestek kimutatására. Ebben a tekintetben számos módosítást javasoltak, beleértve a célsejt-szuszpenzió B-limfocitákkal való dúsítását, a szérumok adszorpcióját a vérlemezkéken stb.

Ezen túlmenően a rendszerben a válaszadás számos egyéb jellemzőjét is figyelembe veszik. A tesztszérumot dekomplementálni kell, különben a reakció antitest-mediált komplementfüggő citotoxicitásként mehet végbe. Azt is feltételezik, hogy az effektor sejtek bizonyos célpontok pusztulását okozhatják a CML típusa miatt.

Végső soron az antitestfüggő sejt által közvetített limfocitotoxicitás vizsgálatának teljes mintakészlete a következő:

Célpontok + effektorok + tesztelt szérum (kísérleti minta);

Célpontok (kontrollminta, azaz 51 Cr spontán felszabadulása);

Célpontok + effektorok (effektor aktivitás kontrolltesztje);

Célpontok + tesztszérum (szérum kontroll).

A limfocitákat a szokásos módon izoláljuk, és RPMI-1640 + 10% magzati borjúszérumban szuszpendáljuk; a szuszpenziót karbonil-vassal kezeljük a monociták eltávolítására; adjunk hozzá ammónium-kloridot vagy H 2 O-t a fennmaradó eritrociták líziséhez;

51Cr-t adunk a célsejt-szuszpenzióhoz 100-200 µCi ml (3,7x106-7,4x106 BK/ml) Na2CrO4-oldat formájában, és 40-60 percig inkubáljuk;

A sejteket háromszor mossuk RPMI + 0,1% HSA eleggyel, újra szuszpendáljuk ugyanabban a tápközegben, és 1 ml-ben 2x10 8-ra állítjuk; A jelölt sejtszuszpenzióból 50 µl-t teszünk egy kémcsőbe, majd az izotópaktivitást γ-számlálóval megszámoljuk a teljes izotóp-"felvétel" kimutatására; a maradékot a tabletta üregeibe csepegtetjük 50 µl szuszpenzióban (1x105 sejt lyukanként);

A sejt-effektorok szuszpenzióját 2x107 sejtre tesszük 1 ml-ben és innen. tegyen 50 µl szuszpenziót (vagy 100 µl) minden lyukba, effektor: célpont arány 10:1 (vagy 20:1);

Az inkubáció 4 órán át tart nedves atmoszférájú, 5% CO 2 -tartalmú inkubátorban (az inkubáció időtartama 8 óráig meghosszabbítható);

Készítsen kémcsövekben több hígítást a tesztszérumból (1:25; 1:100), és adjon a mérőhelyekhez legfeljebb 50 µl-t minden hígításból: és hígítatlan szérumot; A teszt végső beállítása a táblázatban látható. 23.

23. táblázat

ADCC beállítása. Minden minta lehetőség, µl

* (A tesztszérum helyett AV-szérumot csepegtetünk be.)

** (A tesztszérum helyett a célpontok (nem az effektorok) ellen irányuló monospecifikus HLA-szérumot csepegtetnek be.)

A paneleket 4 órán át inkubáljuk nedves atmoszférában, 4% CO 2 tartalommal; az inkubáció időtartama 8 óráig meghosszabbítható;

Inkubálás után minden lyukból a térfogat felét (100 μl) egy automata pipettával óvatosan leszívjuk, és csövekbe helyezzük az 51 Cr impulzusok számlálására; az aktivitást γ-számlálóval számoljuk;

A számítások a következők:

51 Cr %-os felszabadulása = 2 × A op - háttéraktivitás/B - háttéraktivitás × 100;

% citotoxicitás = A op - A sp /100 - A sp × 100, ahol A op - 51 Cr felszabadulása a kísérleti mintákban; És cn -% spontán felszabadulás; B - az izotóp teljes asszimilációja.

Hogyan pozitív eredmény 5%-os vagy magasabb citotoxicitást 4 órás inkubáció után figyelembe kell venni.