Аналіз скла змішана культура лімфоцитів. Змішана культура лімфоцитів
Кожен веб-розробник повинен знати SQL, щоб писати запити до баз даних. І хоча phpMyAdmin ніхто не скасовував, часто необхідно забруднити руки, щоб написати низькорівневий SQL.
Саме тому ми підготували короткий екскурс основами SQL. Почнемо ж!
1. Створення таблиці
Для створення таблиць призначена інструкція CREATE TABLE. Як аргументи має бути задано назву стовпців, а також їх типи даних.
Створимо просту таблицю на ім'я month. Вона складається з 3 колонок:
- id– Номер місяця у календарному році (ціле число).
- name- Назва місяця (рядок, максимум 10 символів).
- days– Кількість днів цього місяця (ціле число).
Ось як виглядатиме відповідний SQL запит:
CREATE TABLE months (id int, name varchar(10), days int);
Також під час створення таблиць доцільно додати первинний ключ однієї із колонок. Це дозволить тримати записи унікальними та прискорить запити на вибірку. Нехай у нашому випадку унікальною буде назва місяця (стовпець name)
CREATE TABLE months (id int, name varchar(10), days int, PRIMARY KEY (name));
| Тип даних | Опис |
|---|---|
| DATE | Значення дати |
| DATETIME | Значення дати та часу з точністю до мінти |
| TIME | Значення часу |
2. Вставка рядків
Тепер давайте заповнювати нашу таблицю months корисною інформацією. Додавання записів до таблиці здійснюється через інструкцію INSERT. Є два способи запису цієї інструкції.
Перший спосіб не вказати імена стовпців, куди буде вставлено дані, а вказати лише значення.
Цей спосіб запису простий, але небезпечний, оскільки немає гарантії, що в міру розширення проекту та редагування таблиці, стовпці будуть розташовуватися в тому ж порядку, що й раніше. Безпечний (і в той же час більш громіздкий) спосіб запису інструкції INSERT вимагає вказівки як значень, так і порядку стовпців:
Тут перше значення у списку VALUESвідповідає першому зазначеному імені стовпця тощо.
3. Вилучення даних із таблиць
Інструкція SELECT - наш кращий другколи ми хочемо отримати дані з бази даних. Вона використовується дуже часто, так що поставтеся до цього розділу дуже уважно.
Найпростіше використання інструкції SELECT - запит, який повертає всі стовпці та рядки з таблиці (наприклад, таблиці на ім'я) characters):
SELECT * FROM "characters"
Символ зірочка (*) означає, що ми хочемо отримати дані зі всіх стовпців. Так, бази даних SQL зазвичай складаються з більш ніж однієї таблиці, то потрібно обов'язково вказувати ключове слово FROM , за яким через пробіл має слідувати назву таблиці.
Іноді ми не хочемо отримати дані не зі всіх стовпців у таблиці. Для цього, замість зірочки (*) ми повинні через кому записати імена бажаних стовпців.
SELECT id, name FROM month
Крім того, у багатьох випадках ми хочемо, щоб отримані результати були відсортовані у порядку. У SQL ми робимо це за допомогою ORDER BY. Він може приймати опціональний модифікатор – ASC (за замовчуванням), який сортує за зростанням або DESC, який сортує за спаданням:
SELECT id, name FROM month ORDER BY name DESC
У разі використання ORDER BY переконайтеся, що воно буде останнім в інструкції SELECT . В іншому випадку буде видано повідомлення про помилку.
4. Фільтрування даних
Ви дізналися, як вибрати з бази даних за допомогою SQL запиту строго певні стовпці, але що якщо нам потрібно отримати ще й певні рядки? На допомогу тут приходить умова WHERE , що дозволяє нам фільтрувати дані в залежності від умови.
У цьому запиті ми вибираємо лише ті місяці з таблиці month, у яких більше 30 днів за допомогою оператора більше (>).
SELECT id, name FROM month WHERE days > 30
5. Розширена фільтрація даних. Оператори AND та OR
Раніше ми використовували фільтрацію даних із використанням одного критерію. Для більш складної фільтрації даних можна використовувати оператори AND та OR та операторів порівняння (=,<,>,<=,>=,<>).
Тут ми маємо таблицю, що містить чотири найбільш продаваних альбомів усіх часів. Давайте виберемо ті з них, які класифікуються як рок і які мають менше 50 мільйонів проданих копій. Це можна легко зробити шляхом розміщення оператора AND між цими двома умовами.
SELECT * FROM albums WHERE genre = "рок" AND sales_in_millions<= 50
ORDER BY released
6. In/Between/Like
WHERE також підтримує кілька спеціальних команд, дозволяючи швидко перевіряти запити, що найчастіше використовуються. Ось вони:
- IN – служить для визначення діапазону умов, будь-яка з яких може бути виконана
- BETWEEN – перевіряє, чи знаходиться значення у вказаному діапазоні
- LIKE – шукає за певними патернами
Наприклад, якщо ми хочемо вибрати альбоми з піпі соулмузикою ми можемо використовувати IN("value1","value2") .
SELECT * FROM albums WHERE genre IN ("pop", "soul");
Якщо ми хочемо отримати всі альбоми, видані між 1975 та 1985 роками, ми повинні записати:
SELECT * FROM albums WHERE released BETWEEN 1975 AND 1985;
7. Функції
SQL напханий з функціями, які роблять різні корисні речі. Ось деякі з найчастіше використовуваних:
- COUNT() – повертає кількість рядків
- SUM() – повертає загальну суму числового стовпця
- AVG() – повертає середнє значення з безлічі значень
- MIN() / MAX() – отримує мінімальне / максимальне значення зі стовпця
Щоб отримати останній рік у нашій таблиці ми повинні записати такий SQL запит:
SELECT MAX(released) FROM albums;
8. Підзапити
У попередньому пункті ми навчилися робити прості розрахунки із даними. Якщо ми хочемо використати результати від цих розрахунків, нам не обійтися без вкладених запитів. Допустимо, ми хочемо вивести artist, albumі release yearдля найстарішого альбому в таблиці.
Ми знаємо, як отримати ці конкретні стовпці:
SELECT artist, album, released FROM albums;
Ми також знаємо, як отримати ранній рік:
SELECT MIN(released) FROM album;
Все, що потрібно зараз, - це об'єднати два запити за допомогою WHERE:
SELECT artist,album,released FROM albums WHERE released = (SELECT MIN(released) FROM albums);
9. Об'єднання таблиць
У складніших базах даних є кілька таблиць, пов'язаних друг з одним. Наприклад, нижче представлені дві таблиці про відеоігри ( video_games) та розробників відеоігор ( game_developers).
В таблиці video_gamesє колонка розробник ( developer_id), але у ній міститься ціле число, а чи не ім'я розробника. Це число є ідентифікатор ( id) відповідного розробника з таблиці розробників ігор ( game_developers), пов'язуючи логічно два списки, що дозволяє нам використовувати інформацію, що зберігається в них обох одночасно.
Якщо ми хочемо створити запит, який повертає все, що потрібно знати про ігри, ми можемо використовувати INNER JOIN для зв'язку колонок з обох таблиць.
SELECT video_games.name, video_games.genre, game_developers.name, game_developers.country FROM video_games INNER JOIN game_developers ON video_games.developer_id = game_developers.id;
Це найпростіший і найпоширеніший тип JOIN. Є кілька інших варіантів, але вони застосовуються до менш частих випадків.
10. Аліаси
Якщо ви подивіться на попередній приклад, то ви помітите, що існують дві колонки звані name. Це збиває з пантелику, так що давайте встановимо псевдонім одного з повторюваних стовпців, наприклад, nameз таблиці game_developersбуде називатися developer.
Ми також можемо скоротити запит задавши псевдоніми імен таблиць: video_gamesназвемо games, game_developers - devs:
SELECT games.name, games.genre, devs.name AS developer, devs.country FROM video_games AS games INNER JOIN game_developers AS devs ON games.developer_id = devs.id;
11. Оновлення даних
Часто ми маємо змінити дані у деяких рядках. У SQL це робиться за допомогою інструкції UPDATE. Інструкція UPDATE складається з:
- Таблиці, де знаходиться значення для заміни;
- Імен стовпців та їх нових значень;
- Вибрані за допомогою WHERE рядки, які ми хочемо оновити. Якщо цього зробити, то зміняться всі рядки в таблиці.
Нижче наведено таблицю tv_seriesз серіалами зі своїм рейтингом. Однак у таблицю закралася маленька помилка: хоча серіал Гра престоліві описується як комедія, він насправді не є. Давайте виправимо це!
Дані таблиці tv_series UPDATE tv_series SET genre="драма" WHERE id=2; 12. Видалення даних
Видалення рядка таблиці за допомогою SQL – це дуже простий процес. Все, що вам потрібно - це вибрати таблицю і рядок, який потрібно видалити. Давайте видалимо з попереднього прикладу останній рядок у таблиці tv_series. Робиться це за допомогою інструкції >DELETE
DELETE FROM tv_series WHERE id = 4
Будьте обережними при написанні інструкції DELETE і переконайтеся, що умова WHERE є, інакше всі рядки таблиці будуть видалені!
13. Видалення таблиці
Якщо ми хочемо видалити всі рядки, але залишити саму таблицю, то скористайтеся командою TRUNCATE:
TRUNCATE TABLE table_name;
У випадку, коли ми насправді хочемо, щоб видалити і дані, і саму таблицю, нам знадобиться команда DROP:
DROP TABLE table_name;
Будьте дуже обережні з цими командами. Їх не можна скасувати!
На цьому ми завершуємо наш підручник з SQL! Ми багато чого не розповіли, але те, що ви вже знаєте, має бути достатньо, щоб дати вам кілька практичних навичок у вашій веб-кар'єрі.
Спільне культивування лімфоцитів, що мають молекули МНС-II різного гаплотипу, спричиняє їх бласттрансформацію та проліферацію. Клітини, що реагують, відносяться до Т-лімфоцитів і стимулюються чужорідними MHC-II детермінантами, розташованими на В-лімфоцитах, макрофагах. Сила реакції залежить від ступеня різниці між антигенами гістосумісності. Для оцінки реактивності індивіда щодо алельного варіанту МНС готують односпрямовану культуру лімфоцитів. Для цього клітини-стимулятори попередньо обробляють мітоміцином або опромінюють, при цьому клітини, що стимулюють, втрачають здатність до поділу, але зберігають життєздатність.
Реактивність у змішаній культурі лімфоцитів є одним із критеріїв в оцінці клітинного імунітету. СКЛ дозволяє провести типування HLA, підібрати пару донор-реципієнт при трансплантаціях тканин та органів, провести кореляцію між HLA-антигенами та певними захворюваннями.
Для постановки реакції використовують завись лімфоцитів, виділених з крові пацієнтів (донора та реципієнта). Відмиті клітини, що відповідають, суспендують у невеликій кількості середовища 199 (0,5 мл) і після підрахунку кількості клітин доводять до 0,6 * 10 6 клітин/мл. Суспензію стимулюючих клітин приготують аналогічно з додаванням розчину мітоміцину С (500 мкг мітоміцину С в 1 мл забуференого фізрозчину) з розрахунку 0,1 мл на 1 мл суспензії. Клітинну суміш інкубують 40 хвилин при 37 °С на водяній бані, помішуючи, потім до суспензії додають холодне середовище 199 і тричі клітини відмивають при центрифунировании. Осад суспендують у живильному середовищікультивування, доводячи кількість клітин до 0,6 * 106 клітин/мл.
У лунки стерильного круглодонного імунологічного планшета вносять по 0,1 мл клітинної суспензії в розчині Хенкса і додають 0,1 мл клітинної суспензії, що несе алельні варіанти МНС. У контроль додають таку кількість розчину Хенкса.
Облік результатів проводять після інкубування клітин при 37 °С 3-5 діб, залежно від постановки реакції з використанням морфологічного або ізотопного методу (див. РБТЛ).
При трансплантації кісткового мозкувибір гістосумісного донора проводиться за результатами HLA-типування донора та реципієнта, а також при визначенні сумісності відібраних HLA-ідентичних пар донор-реципієнт у СКЛ, яка є фінальним етапом оцінки сумісності. Для цього використовується постановка двонаправленої реакції СКЛ з використанням культурального мікрометоду в 96-лунковій планшеті з оцінкою величини проліферації включення радіоактивного Н 3 -тимідину в ДНК проліферуючих лімфоцитів.
Велика увага в даний час приділяється дослідженню ролі імунних механізміву репродуктивному процесі, оскільки їх порушення призводить до розвитку безплідності та раннього переривання вагітності. Дослідження імунологічних параметрів та їх взаємозв'язку з репродуктивними процесамидозволили зробити висновок про необхідність перебудови імунної системипри підготовці організму матері до вагітності, починаючи з овуляторного періоду, в момент імплантації ембріона та в ранній періодвагітності.
Однією з найбільш складних і важко діагностованих причин безпліддя і спонтанних викиднів, що повторюються, є імунні дисфункції.
З метою своєчасного виявленняімунологічного безпліддя в лабораторії імунології репродукції проводиться обстеження подружніх парз використанням наступних методівдіагностики:
- дослідження рівня проліферативної відповіді лімфоцитів жінки на антигени партнера (у змішаній культурі лімфоцитів)
- визначення активності блокуючих факторів у сироватці крові жінки.
- оцінка кількісного вмісту субпопуляцій природних цитотоксичних клітин периферичної кровіжінки.
- розширена імунограма
- дослідження вмісту регуляторних клітин із супресорною активністю у периферичній крові.
- при виявленні клінічних та лабораторних ознакімунологічного про безпліддя пацієнтам рекомендовано проведення лікувальної процедури– алоімунізації лімфоцитами чоловіка, яка проводиться відповідно до індивідуального графіка.
Консультація необхідна:
- якщо за відсутності гінекологічних та ендокринних захворюваньпри регулярному статевому житті протягом року немає вагітностей.
- у разі повторюваних (більше 1 разу) спонтанних переривань вагітності (викидні).
- при невдалих ЕКЗв анамнезі.
- при загрозі переривання справжньої вагітності
При виявленні порушень з метою імунокорекції порушень призначається процедура алоімунізації лімфоцитами партнера (АІЛ). Цей методлікування дозволено до застосування Федеральною службоюз нагляду у сфері охорони здоров'я (ліцензія ФС №2009/179 від 02.07.2009)
Процедура проводиться лише за наявності у партнера негативних результатіваналізу на ВІЛ-інфекції, сифіліс та вірусні гепатити(В, С). Ускладнення при АІЛ не виявлено. Метод АІЛ має виражений імунокоригуючий ефект, підвищує ефективність лікування безпліддя, як у природному циклі, так і при екстракорпоральне запліднення(ЕКО). Також призначається при невдалих спробах екстракорпорального запліднення.
АІЛ проводиться 1 раз на 28-30 днів (відповідно до менструальним цикломжінки) в першу фазу циклу. Перший курс включає 3 процедури АІЛ. Після другої процедури пара повторно здає контрольний аналіз. За наявності позитивної динаміки третя процедура АІЛ є останньою. За відсутності динаміки - доза клітин для імунізації підвищується і проводиться другий курс, що включає дві процедури. Після контрольного аналізу в деяких випадках необхідне призначення 3 курсу імунізації із збільшенням дози клітин. Після досягнення нормативних значень позитивний ефект утримується в межах 6-8 місяців.
За період із 2003 по 2013рр. у лабораторії клітинної імунотерапії було проведено близько 3000 процедур алоімунізації лімфоцитами партнерів. Для цієї процедури з крові партнера виділяються лише лімфоцити, які завжди присутні у спермальній рідині. В інших країнах* протягом 20 років також проводиться процедура алоімунізації, яка допомагає жінці виносити та народити здорову дитину.
| Вид послуги | Ціна, руб. |
| Тест трансформації лімфоциту (Виявлення сесибілізації на 1в-во) | 1650 |
| Тест трансформації лімфоциту (Виявлення сесибілізації на 2в-ва) | 2 900 |
| Тест трансформації лімфоциту (Виявлення сесибілізації на 3в-ва) | 3 900 |
| Тест трансформації лімфоциту (імунологічне обстеження при безплідді) | 3 200 |
| Імунограма розширена з активаційними маркерами | 4 625 |
| Комплексне дослідження імунного статусу | 4 125 |
| Вакцинація (алоімунізація лімфоцитами партнера 1 доза) | 1 900 |
| Вакцинація (алоімунізація лімфоцитами партнера 2 доза) | 2 750 |
| Вакцинація (алоімунізація лімфоцитами партнера 3 доза) | 3 400 |
| Дослідження CD16+/CD56+ лімфоцитів (імунологічне обстеження при безплідді тільки НК-клітини) | 1 250 |
| Дослідження макрофагальної активності (кондиційні середовища макрофагів) | 9 400 |
| Дослідження макрофагальної активності (кондиційні середовища) | 1 500 |
| Кріоконсервування мононуклеарів для алоімунізації | 650 |
2.2. Методи клітинних взаємодій
В основі багатьох методів клітинних взаємодій, що використовуються клінічною імуногенетикою, лежить феномен бластоутворення в змішаній культурі лімфоцитів, відкритий канадською дослідницею Барбарою Бейн. Реакція змішаної культури лімфоцитів (mixed lymphocyte culture - MLC) дозволила здійснити тонке диференційоване вивчення комплексу HLA і, зокрема, однієї з його субодиниць - локусу HLA-D. Ряд інших методів клітинних взаємодій – клітинно-опосередкований лімфолізис (Cell-mediated Lympholysis – CML), тест примування лімфоцитів (Primed Lymphocyte Typing) – ґрунтується на методі MLC або містить його як складову частину.
2.2.1. Змішана культура лімфоцитів (MCL)
Принцип методу зображено на рис. 10, з якого видно, що дві популяції генетично лімфоцитів, що розрізняються, взаємодіють між собою в культурі in vitro. Одна з популяцій обробляється мітоміцином С або опромінюється, внаслідок чого втрачає здатність до бластоутворення та включення тимідину (3 НТ), проте, не втрачаючи антигенних властивостей, зберігає здатність до стимуляції (стимулятори; S-популяція).
Клітини, що відповідають на стимуляцію (респондери, R-населення), через кілька днів трансформуються в бласти і включають тимідин, що додається в культуру. Інтенсивність реакції вимірюється за допомогою радіаційної мітки включення 3 Н-тимідину.
Відомі кілька варіантів реакції змішаної культури лімфоцитів, з яких тут пропонуються два: традиційний та мікроваріант, що реалізується у планшетах Cook (рис. 11).
Мал. 11. Устаткування для мікроваріантів MLC та CML. 1 - планшет круглодонний е 96 лунками; 2-автоматична піпетка ("Pipetman") із програмою для різних обсягів; 3 - автоматична піпетка ("Sigma") для певного обсягу; 4 - наконечник для піпетки одноразового використання; 5 – ламінарний бокс
Традиційний варіант MLC (модифікація Ф. С. Баранова):
Лімфоцити виділяють на фіколл-урографиновому градієнті, як описано вище. Першу відмивання виробляють в PBS (NaCl - 8,0 г, Na 2 HP0 4 - 1,15 г, KH 2 PO 4 - 0,2 г, KC1 - 0,2 г на 1л H 2 O); дві наступні виробляють у середовищі 199 з 5%-АВ-сироватки (пул від 15 донорів);
Клітини, що відповідають, ресуспендують в середовищі 199 з 10% сироваткою АВ і доводять концентрацію клітин до 0,6 x 10 6 в 1 мл;
Виділені таким же чином стимулюючі клітини в концентрації 5 - 10 6 в 1 мл обробляють мітоміцином (60 γ/мл) фірми "Serva" і інкубують 40 хв при 37°С у водяній бані. Після інкубації клітини відмивають 3 рази середовищем 199 з 5% сироваткою АВ, ресуспендують у середовищі 199 з 10% сироваткою АВ, доводячи концентрацію до 0,6 x 10 6 один мл;
0,5 мл клітин, що відповідають, і 0,5 мл стимулюючих клітин змішують у центрифужній пробірці, додають 0,04 мл 10 мл розчину Hepes ("Serva") і інкубують 144 год; досвід ставлять у трьох паралелях (триплет);
За 24 год до закінчення інкубації до пробірок додають 3 Н-тимідин 1μCi (3,7x10 4 БК), на пробу питомої активності 5mСi/мМоль (18,5x10 7 БК/мМоль) та продовжують інкубацію;
Після закінчення інкубації клітини переносять на міліпорові фільтри (0,6 - 0,9 мікрон), промивають фізіологічним розчином(37°С) та охолодженим 5% розчином трихлороцтової кислоти (4°С). Фільтри сушать і поміщають у флакони з 5 мл сцинтиляційною рідиною (5 г РРО та 0,5 г РОРОР - на 1 л толуолу)*. Активність включення 3 Н-тимідину вимірюють на β-лічильнику; результат виражають в абсолютних включеннях радіоактивної мітки за 1 хв або в індексі стимуляції (ІС) за формулою:
* (РРО – 2,5-фенол-оксазол; РОРОР - (1,4-ді-2-15-фенолоксазолітбензол).)
Середнє значення СРМ у трьох дослідних зразках
ІС = Середнє значення СРМ у трьох контрольних зразках/Контрольними зразками є спонтанні культури відповідних клітин.
Мікроваріант MLC у планшетах Cook. На 8-му Уоркшопі вироблено вимоги, що стандартизують мікроваріант MLC, відповідно до яких він викладається нижче.
Лімфоцити виділяють у градієнті ізопак-фіколу та ресуспендують у середовищі RPMJ-1640*, доводячи концентрацію до 5х10 5 в 1 мл;
* (Можна використовувати середовище 199, змішане з людською сироваткою групи АВ (5% сироватки, взятої від кількох індивідів).)
Клітини-стимулятори обробляють мітоміцином або навчанням;
5x10 4 репондерів і стільки стимуляторів поміщають за допомогою мікропіпетки типу Pipetman в кожну лунку круглодонного мікропланшета Cook;
Планшети інкубують у термостаті з автоматичною подачею 5% CO2 протягом 120 год; потім кожну лунку вносять lμmCi 3 Н-тимидина при специфічної активності тимідину 6 Ci/мМоль; всі маніпуляції проводять піпеткою Pipetman;
Через 16 годин після внесення тимідину культури з кожної лунки автоматичною піпеткою переносять на міліпорові фільтри та промивають фізіологічним розчином, а потім 5% трихлороцтовою кислотою; зручно використовувати спеціальні "харвестери" для перенесення культури на міліпорові фільтри;
Активність включення тимідину визначають, як описано вище.
2.2.2. Клітинно-опосередкований лімфолізис (CML)
CML використовується в імуногенетичних дослідженнях порівняно недавно (з 1972 р.), проте в Останнім часомстає все більше популярною технікою, дозволяючи детально вивчити роль еферентної ланки трансплантаційного імунітету та завойовуючи визнання як інформативний методімунологічного моніторингу Принцип методу зображено на рис. 12. В основі методу лежить техніка, запропонована J. Lightbody (1971), яка коротко зводиться до наступного.
1. CML починається зі звичайного HLC-тесту, в якому відбувається розпізнавання відповідними клітинами "стимуляторів", сенсибілізація клітин, що відповідають, і формування сенсибілізованих кілерів.
2. Друга фаза, в якій сенсибілізовані кілери змішуються з міченими 51 Сr клітинами-мішенями, полягає в деструкції останніх ефекторних клітин-кілерів; клітини-мішені можуть мати генотип такий же, як "стимулятори" у першій фазі MLC, а можуть бути клітинами "третього" партнера, наділеними загальними зі "стимуляторами" антигенними детермінантами або без них.
3. Кількість радіоактивного хрому, що вивільняється з зруйнованих клітин-мішеней і виходить у культуральне середовище, є мірою інтенсивності кілер-ефекту.
Мал. 12. Принцип клітинно-опосередкованого лімфолізу (CML). I ряд - сенсибілізація клітин, що відповідають, утворення кілерів; II ряд – взаємодія кілерів з мішенню; III ряд – руйнування клітини-мішені; вихід 51 Cr культуральне середовище
Тут описано три варіанти CML: традиційний варіант модифікації Л. П. Алексєєва (1979), мікроваріант у планшетах Cook, пряма CML (Direct-CML -D-CML.
Традиційний варіант[Алексєєв Л. П., 1979].
Метод поділено кілька етапів.
Отримання кілерів:
Периферичні лімфоцити обох популяцій (R-клітини та S-клітини) виділяють звичайним шляхом, в градієнті щільності відмивають тричі в середовищі 199 з 5% АВ-сироваткою (10 хв, 150 g);
1x10 6 R-клітин (0,8 мл) змішують у центрифужних пробірках з 2x10 6 S-клітин (0,2 мл), оброблених мітоміцином, інкубують 144 год при 37°С;
Клітини центрифугують при 150 g протягом 10 хв, а осад ресуспендують у середовищі 199 з додаванням 20% телячої сироватки (середа 199 + тобто), довівши концентрацію до 1x10 6 в 1 мл;
Одну із проб залишають для дослідження рівня MLC, інші використовують як готові кілери.
Отримання мішеней:
Виділені звичайним шляхом лімфоцити ресуспендують у середовищі 199 з 20% АВ-сироваткою та інкубують з фітогемагглютиніном (0,003 мг/мл Wellcome) протягом 72 годин при 37°С; концентрація клітин 1x10 6 один мл;
Клітини центрифугують 10 хв при 150 g, осад ресуспендують в середовищі 199 з 5% Сироваткою АВ і доводять концентрацію клітин до 2x10 4 в 1 мл;
До суспензії додають 51 Cr 100 μCi/мл (3,7x10 6 БК/мл) і інкубують 40 хв при 37°С;
Клітини тричі відмивають у середовищі 199 з добавкою 5% АВ-сироватки (150 g, 10 хв) і осад ресуспендують у середовищі 199 з 5% АВ-сироваткою. довівши концентрацію до 2x10 4 один мл.
Постановка реакцій:
5x10 5 кілерів (0,5 мл) змішують з 1x10 4 мішеней (0,5 мл), інкубують 4 год (37°С) і центрифугують при 150 g 10 хв;
Суспернатант відсмоктують і на лічильнику підраховують імпульсацію, що викликається 51 Cr; підрахунок ведуть у 0,5 мл супернатанту;
Рівень цитолізу підраховують за такою формулою:
екепер. вихід 51 Cr - спонтанний вихід 51 Cr/максим, вихід 51 Cr - спонтанний вихід 41 Cr × 100.
Спонтанний вихід хрому вимірюється на мішені, інкубованих 4 год (37°С) без клітин-кілерів; максимальний вихід хрому - на мішенях, повністю зруйнованих заморожуванням-відтаванням; всі проби здійснюються у триплетах.
Мікроваріант CML у планшетах [по Mawas С., 1976]:
Фаза отримання кілерів здійснюється як MLC у круглодонних планшетах, але змішують у рівних кількостях R- і S-клітини по 2x10 5 па кожну лунку і інкубують при 37°С;
Через 5 діб клітини збирають пастерівською піпеткою в пробірку, підраховують з блакитним трипаном число живих і доводять концентрацію до 10x10 6 в 1 мл;
Клітини-мішені протягом 3 днів культивують із ФГА;
У день постановки реакції клітини-мішені відмивають (300 g) і ресуспендують в культуральному середовищі, розподіляючи по 1 мл пробірки і доводячи до 1x10 6 в 1 мл;
Додають у кожну пробірку з клітинами-мішенями по 200 μCi 51 Cr(7,4x10 6 БК) і інкубують 1 годину при 37°С; відмивають клітини 3 рази; осад ресуспендують і доводять до концентрації 1x10 один мл (живих);
Тест реалізується у круглодонних мікропланшетах; для цього розподіляють у кожну лунку 0,7 - 1x10 6 клітин-кілерів (0,1 мл) і 1x10 4 клітин-мішеней (0,1 мл); загальний обсяг суспензії в кожній лунці 0,2 мл, додають у кожну лунку по 0,05 мл середовища та інкубують (37°С) 4 год;
Планшети центрифугують за 800 g на центрифузі Beckman протягом 10 хв; супернатант з кожної лунки переносять у пробірки та підраховують на γ-лічильнику;
Фазу отримання кілерів (MLC) проводять серед RPMJ-1640 з додаванням 20% людської плазми; для фази кілінгу використовують середовище MEM з додаванням 20% людської плазми, попередньо прогрітої.
Пряма CML (D-CML).Пряма CML є технікою, створеною спеціально для клінічних цілей, що знайшла використання при імунологічному моніторингу. Схема цієї реакції зображено на рис. 13.
Основна відмінність від традиційної CML полягає в тому, що стадія утворення кілерів (фаза сенсибілізації) протікає не in vitro, in vivo, тобто в організмі людини, сенсибілізованого пересадкою аллогенного органу або тканини. Внаслідок впливу алогенної тканини лімфоцити реципієнта сенсибілізовані до тканинних антигенів донора і не потребують спеціальної обробки in vitro, тривалість тесту значно скорочується в часі, оскільки попередньо слід підготувати лише мішені.
Як мішені використовують лімфоцити, отримані з периферичної крові або, частіше, із селезінки донора (див. 2.1.2) і заморожені будь-яким із описаних вище способів (див. 2.1.3).
2.2.3. Антитілозалежна клітинно-опосередкована цитотоксичність (Antibody-dependent-cell mediated Cytotoxicity - ADCC)
Цей тип клітинних реакцій подібний механізмів дії з описаної вище CML. Принцип реакції зображено на рис. 14. Компонентами реакції є клітини-мішені (донорські клітини або алогенні лімфоцити), сироватка (алогенна або реципієнта), що, ймовірно, містить антитіла, спрямовані до детермінантів клітин-мішеней, і клітини-ефектори (лімфоцити реципієнта або алогенні).
Клітками-ефекторами у цьому типі взаємодії служать звані К-клітини, що у периферичної крові. На відміну від клітин-кілерів у CML вони здійснюють цитотоксичний ефект без попередньої сенсибілізації, проте прояв цитотоксичної дії К-клітин можливий лише за допомогою антитіл, спрямованих до детермінантів клітин-мішеней. Специфічний лізис вимірюється вивільненням 51 Cr, якщо досліджувана сироватка містить антитіла до детермінантів мішеней.
Детермінантами-мішенями ADCC можуть бути практично специфічності всіх HLA-локусів, включаючи HLA-D, HLA-DR, а також детермінанти, що лежать поза HLA-системи .
Найбільшого поширенняця складна реакція отримала в імунологічному моніторингу для виявлення В-клітинних антитіл. У зв'язку з цим було запропоновано кілька модифікацій, що передбачають збагачення суспензії клітин-мішеней В-лімфоцитами, адсорбцію сироваток на тромбоцитах і т.д.
Крім того, враховується ряд інших особливостей реагування в даній системі. Досліджувана сироватка має бути декомплементована, тому що в іншому випадку реакція може піти за типом антитіло-опосередкованої комплементзалежної цитотоксичності. Передбачається також, що клітини-ефектори можуть викликати певну деструкцію мішеней типу CML.
Зрештою весь набір проб у тесті антитілозалежних клітинно-опосередкованої лімфоцитотоксичності наступний:
Мішені + ефектори + випробувана сироватка (досвідчена проба);
Мішені (контрольна проба, тобто спонтанне вивільнення 51 Cr);
Мішені + ефектори (контрольна проба на активність ефекторів);
Мішені + випробувана сироватка (сироватковий контроль).
Лімфоцити виділяють звичайним чином та ресуспендують у RPMI-1640 + 10% ембріональної телячої сироватки; обробляють суспензію карбонільним залізом для видалення моноцитів; додають амонію хлорид або H 2 O для лізису еритроцитів, що залишилися;
У суспензію клітин-мішеней додають 51 Cr у формі розчину Na 2 CrO 4 100 - 200µCi мл (3,7x10 6 - 7,4x106 БК/мл) і інкубують 40 - 60 хв;
Клітини тричі відмивають у RPMI +0,1% HSA, ресуспендують у тому ж середовищі і доводять до 2x10 8 один мл; 50 µl суспензії мічених клітин поміщають у пробірку і надалі підраховують ізотопну активність на γ-лічильнику для виявлення повного ізотопного засвоєння; інше розкопують у лунки планшета по 50 µl суспензії (1x10 5 клітин на лунку);
Суспензія клітин-ефекторів доводиться до 2x10 7 кл один мл і в. кожну лунку поміщають 50 µl суспензії (або 100 µl), співвідношення ефекторів та мішеней 10:1 (або 20:1);
Інкубація триває 4 години у вологій атмосфері термостата з 5% CO 2 (тривалість інкубації може бути продовжена до 8 годин);
Готують у пробірках кілька розведень випробуваної сироватки (1:25; 1:100) і додають у лунки до 50 µl кожного розведення: і нерозведену сироватку; остаточна постановка тесту має вигляд, як показано в табл. 23.
Таблиця 23
Постановка ADCC. Усі варіанти проб, µl
* (Замість випробуваної сироватки закопують пул АВ-сироваток.)
** (Замість випробуваної сироватки закопують моноспецифічну HLA-сироватку, спрямовану проти мішеней (не ефекторів).)
Інкубація панелей триває 4 години у вологій атмосфері з 4% CO 2 ; тривалість інкубації може бути продовжена до 8 годин;
Після інкубації половину об'єму з кожної лунки (100 μl) обережно відсмоктують автоматичною піпеткою та поміщають у пробірки для підрахунку імпульсації 51 Cr; активність підраховують на γ-лічильнику;
Обчислення такі:
% вивільнення 51 Cr = 2 × А оп - фонова активність/В - фонова активність × 100;
% цитотоксичності = А оп - А сп /100 - А сп × 100, де А оп - % вивільнення 51 Cr у дослідних пробах; А сп -% спонтанного вивільнення; В - повне засвоєння ізотопу.
Як позитивний результатрозглядається 5% та вище цитотоксичність після 4 годин інкубації.
