Lažno negativan test - neizravni Coombsov test. Coombsov test: izravan i neizravan

– antiglobulinski test čiji je cilj identificirati u Rh-negativnoj krvi nepotpuna anti-eritrocitna protutijela na Rh faktor - specifični protein koji se nalazi na površini eritrocita Rh-pozitivne krvi. Postoje dvije vrste ovaj test: izravno – dokazivanje protutijela na površini crvenih krvnih stanica, neizravno – dokazivanje protutijela u krvnom serumu. Izravna ispitivanja provode se u dijagnostici i praćenju liječenja bolesti krvi: hemolitička anemija, hemolitička bolest novorođenčad i drugi. Provodi se neizravni test za procjenu kompatibilnosti krvi davatelja i primatelja tijekom transfuzije, kao i za određivanje prisutnosti i rizika od Rh sukoba pri planiranju i vođenju trudnoće. Materijal za Coombsov test je deoksigenirana krv, studija se provodi pomoću metoda koje se temelje na reakciji aglutinacije. Obično oba testa daju negativan rezultat. Analiza je gotova u roku od jednog dana. Ukupno je u Moskvi pronađeno 87 adresa na kojima se ova analiza može napraviti.

– antiglobulinski test čiji je cilj identificirati u Rh-negativnoj krvi nepotpuna anti-eritrocitna protutijela na Rh faktor - specifični protein koji se nalazi na površini eritrocita Rh-pozitivne krvi. Postoje dvije vrste ovog testa: izravni - otkrivanje protutijela na površini crvenih krvnih stanica, neizravni - otkrivanje protutijela u krvnom serumu. Izravna ispitivanja provode se u dijagnostici i praćenju liječenja bolesti krvi: hemolitička anemija, hemolitička bolest novorođenčadi i dr. Provodi se neizravni test za procjenu kompatibilnosti krvi davatelja i primatelja tijekom transfuzije, kao i za određivanje prisutnosti i rizika od Rh sukoba pri planiranju i vođenju trudnoće. Materijal za Coombsov test je venska krv, studija se provodi metodama koje se temelje na reakciji aglutinacije. Obično oba testa daju negativan rezultat. Analiza je gotova u roku od jednog dana.

Coombsov test – Kliničko ispitivanje Rh-negativna krv, usmjerena na otkrivanje antitijela na Rh faktor. Test se koristi za prepoznavanje rizika od razvoja Rh konflikta i hemolitičkih reakcija. U svakoj osobi površina crvenih krvnih stanica sadrži određeni skup antigena ili aglutinogena - spojeva različite prirode, po prisutnosti ili odsutnosti koje se prosuđuje krvna grupa i Rh faktor. Postoje mnoge vrste antigena, uključujući medicinska praksa najveći praktični značaj imaju aglutinogene A i B koji određuju krvnu grupu i aglutinogen D koji određuje Rh faktor. Na pozitivan Rh faktor D antigeni se otkrivaju na vanjskoj membrani eritrocita, ali ne ako su negativni.

Coombsov test, koji se naziva i antiglobulinski test, ima za cilj otkrivanje nepotpunih antieritrocitnih antitijela na sustav Rh faktora u krvi. Antitijela na Rh faktor - specifičnih imunoglobulina, koji nastaju u Rh-negativnoj krvi kada u nju uđu eritrociti s aglutinogenima D. To se može dogoditi kod miješanja krvi fetusa i trudnice, tijekom transfuzije krvi bez prethodne krvne grupe. Coombsov test postoji u dvije verzije - izravnoj i neizravnoj. Prilikom izvođenja izravnog Coombsovog testa otkrivaju se antitijela pričvršćena na površinu crvenih krvnih stanica. Studija se koristi za određivanje uzroka hemolitičke reakcije. Indirektni Coombsov test je usmjeren na otkrivanje antieritrocitnih protutijela u krvnoj plazmi. Neophodno je utvrditi kompatibilnost krvi između davatelja i primatelja ili majke i fetusa, a pomaže u sprječavanju razvoja Rh konflikta i naknadne hemolize crvenih krvnih stanica.

Krv za obje verzije Coombsovog testa uzima se iz vene. Analiza se provodi aglutinacijom pomoću antiglobulinskog seruma. Rezultati studije koriste se u hematologiji za utvrđivanje uzroka hemolitičkih reakcija, u kirurgiji i reanimaciji pri provođenju transfuzije krvi, u opstetriciji i ginekologiji pri praćenju trudnoće kod žena s Rh-negativnom krvlju.

Indikacije

Izravni Coombsov test, koji otkriva antitijela pričvršćena na površinu crvenih krvnih stanica, propisan je za hemolitičke reakcije (uništavanje crvenih krvnih stanica) različitog porijekla. Studija je indicirana za primarnu autoimunu hemolitičku anemiju, posttransfuzijsku hemolitičku anemiju, hemolitičku bolest novorođenčadi, hemolizu eritrocita uzrokovanu autoimunim, tumorskim ili zaraznim bolestima, kao i uzimanje lijekovi, na primjer, kinidin, metildopa, prokainamid. Neizravni Coombsov test, koji određuje antitijela u krvnoj plazmi, koristi se za sprječavanje razvoja Rh sukoba. Indiciran je za pacijente koji se pripremaju za transfuziju krvi, kao i za trudnice s negativan Rh faktor pod uvjetom da budući otac dijete ima pozitivan Rh faktor.

Za određivanje Rh kompatibilnosti, Coombsov test nije propisan pacijentima s Rh pozitivnom krvlju. U tim slučajevima na površini crvenih krvnih zrnaca već postoje antigeni, stvaranje antitijela ne može se potaknuti transfuzijom krvi ili ulaskom fetalne krvi u krvotok trudnice. Također, studija nije indicirana za trudnice ako oba roditelja imaju negativan Rh faktor - nasljednu recesivnu osobinu. Dijete u takvim parovima uvijek ima Rh negativna krv, imunološki sukob s majkom je nemoguć. Na hemolitičke patologije Antiglobulinski test se ne koristi za praćenje uspješnosti terapije, jer rezultati ne odražavaju aktivnost procesa razaranja crvenih krvnih stanica.

Ograničenje Coombsovog testa je složenost istraživačkog postupka – dobiti pouzdane rezultate potrebno je pridržavati se temperaturnih i vremenskih uvjeta, pravila za pripremu reagensa i biomaterijala. Prednosti Coombsovog testa uključuju njegovu visoka osjetljivost. Kod hemolitičke anemije, rezultati ovog testa ostaju pozitivni, čak i ako su razine hemoglobina, bilirubina i retikulocita normalizirane.

Priprema za analizu i prikupljanje materijala

Materijal koji se koristi za izvođenje Coombsovog testa je venska krv. Posebni zahtjevi Nema vremena za postupak vađenja krvi i pripremu pacijenta. Kao i kod svake studije, preporuča se napraviti pauzu nakon jela od najmanje 4 sata i prestati pušiti u zadnjih 30 minuta. tjelesna aktivnost, Izbjegavajte emocionalni stres. Također je vrijedno unaprijed razgovarati sa svojim liječnikom o potrebi prestanka uzimanja lijekova - neki lijekovi mogu iskriviti rezultate Coombsovog testa. Krv se uzima špricom iz lakatna vena, rjeđe iz vene na stražnja stranačetke U roku od nekoliko sati materijal se isporučuje u laboratorij.

Kod izvođenja izravnog Coombsovog testa serumu krvi bolesnika dodaje se antiglobulinski serum. Nakon nekog vremena, smjesa se ispituje na prisutnost aglutinata - oni nastaju ako postoje antitijela na crvenim krvnim stanicama. Ako je nalaz pozitivan, određuje se aglutinacijski titar. Indirektni Coombsov test sastoji se od više faze. Najprije se antitijela prisutna u serumu fiksiraju na ubrizgane crvene krvne stanice tijekom inkubacije. Zatim se u uzorak dodaje antiglobulinski serum, nakon nekog vremena utvrđuje se prisutnost i titar aglutinata. Period analize je 1 dan.

Normalni rezultati

Normalno je rezultat izravnog Coombsovog testa negativan (-). To znači da u krvi nema protutijela povezanih s crvenim krvnim zrncima i ona ne mogu izazvati hemolizu. Normalan rezultat Indirektni Coombsov test također je negativan (-), odnosno u krvnoj plazmi nema antitijela na Rh faktor. Kada se priprema za transfuziju krvi za primatelja, to znači kompatibilnost s krvlju davatelja; kada se prati trudnoća, to znači odsutnost Rh senzibilizacije majke, nizak rizik od razvoja imunološkog sukoba. Fiziološki faktori, kao što su prehrambene navike ili tjelesna aktivnost, ne može utjecati na rezultat testa. Stoga, ako je rezultat pozitivan, potrebna je konzultacija liječnika.

Dijagnostička vrijednost analize

Pozitivan rezultat Coombsovog testa izražava se kvalitativno, od (+) do (++++), ili kvantitativno, titrima od 1:16 do 1:256. Određivanje koncentracije protutijela na crvenim krvnim stanicama iu krvnom serumu provodi se u obje vrste uzoraka. Ako je izravni Coombsov test pozitivan, otkrivaju se antitijela na vanjskoj membrani crvenih krvnih stanica, koja dovode do uništenja tih krvnih stanica. Uzrok može biti transfuzija krvi bez prethodne tipizacije - posttransfuzijska hemolitička reakcija, kao i eritroblastoza novorođenčeta, hemolitička reakcija zbog primjene lijekova, primarna ili sekundarna autoimuna hemolitička anemija. Sekundarna destrukcija crvenih krvnih stanica može biti uzrokovana sistemskim eritemskim lupusom, Evansovim sindromom, Waldenströmovom makroglobulinemijom, paroksizmalnom hladnom hemoglobinurijom, kroničnom limfocitnom leukemijom, limfomom, infektivnom mononukleozom, sifilisom, mikoplazmom pneumonije.

Pozitivan rezultat neizravnog Coombsovog testa ukazuje na prisutnost antitijela na Rh faktor u plazmi. U praksi to znači da je došlo do Rh senzibilizacije i postoji mogućnost razvoja Rh konflikta nakon infuzije krvi davatelja tijekom trudnoće. Radi sprječavanja komplikacija u trudnoći, žene s pozitivnim rezultatom Coombsovog testa stavljaju se u poseban registar.

Liječenje abnormalnosti

Coombsov test odnosi se na izoserološke studije. Njegovi rezultati omogućuju prepoznavanje hemolitičke reakcije, kao i određivanje kompatibilnosti krvi davatelja i primatelja, majke i fetusa, kako bi se spriječio razvoj Rh sukoba. Ako je rezultat testa pozitivan, trebate potražiti savjet od svog liječnika - opstetričar-ginekologa, hematologa, kirurga.

Antitijela, koji se nalazi na površini eritrocita, može biti u statičkom ili slobodnom stanju krvna plazma. Ovisno o stanju protutijela provodi se izravna ili neizravna Coombsova reakcija. Ako postoji razlog za vjerovanje da su antitijela fiksirana na površini crvenih krvnih zrnaca, provodi se izravni Coombsov test. U ovom slučaju, test se odvija u jednoj fazi - dodavanje antiglobulinski serum. Ako su nepotpuna protutijela prisutna na površini crvenih krvnih stanica, aglutinacija crvene krvne stanice

Neizravna reakcija

Neizravna Coombsova reakcija odvija se u 2 faze. Prvo morate umjetno implementirati senzibilizacija crvene krvne stanice Da bi se to postiglo, crvena krvna zrnca i krvni serum koji se testiraju se inkubiraju, što uzrokuje fiksaciju antitijela na površini crvenih krvnih zrnaca. Nakon toga se provodi druga faza Coombsovog testa - dodavanje antiglobulinskog seruma.

Reakcija taloženja - RP (od lat. praecipilo taložiti) je stvaranje i taloženje kompleksa topljivog molekularnog antigena s protutijelima u obliku zamućenja tzv. talog. Nastaje miješanjem antigena i protutijela u jednakim količinama, a višak jednog od njih smanjuje razinu stvaranja imunološkog kompleksa. Reakcija taloženja provodi se u epruvetama (reakcija prstenaste precipitacije), u gelovima, hranjivim podlogama itd. Varijante reakcije taloženja u polutekućem agaru ili agaroznom gelu, dvostruka imunodifuzija po Ouchterlony, zračna imunodifuzija, imunoepektroforeza i tako dalje.

Prstenasta reakcija taloženja. Reakcija se provodi u uskim epruvetama za taloženje: topljivi antigen nanosi se na imunološki serum. Uz optimalan omjer antigena i antitijela, na granici ove dvije otopine stvara se neprozirni sloj. taložni prsten. Ako se u reakciji kao antigeni koriste prokuhani i filtrirani ekstrakti tkiva, tada se ta reakcija naziva prva termoprecipitacijska reakcija (reakcija u kojoj se otkriva hapten antraksa).
Ouchterlony dvostruka imunodifuzijska reakcija. Za postavljanje reakcije, rastopljeni agar gel tanki sloj izlije se na staklenu ploču i nakon stvrdnjavanja se u njemu izrežu rupe. Antigeni i imunološki serumi stavljaju se odvojeno u jažice gela, koje difundiraju jedna prema drugoj. Na mjestu susreta, u jednakim omjerima, stvaraju talog u obliku bijele pruge. U višekomponentnim sustavima pojavljuje se nekoliko linija precipitata između jažica s antigenima i protutijelima; u identičnim AG, linije taloga se spajaju; u neidentičnim AG-ovima se sijeku.
Reakcija radijalne imunodifuzije. Imuni serum s rastopljenim agar gelom ravnomjerno se izlije na staklo. Nakon skrućivanja u gelu prave se jažice u koje se stavlja antigen u različitim razrjeđenjima. Antigen, difundirajući u gel, formira prstenaste precipitacijske zone oko jažica s antitijelima. Promjer precipitacijskog prstena proporcionalan je koncentraciji antigena. Reakcija se koristi za određivanje imunoglobulina raznih klasa, komponenti sustava komplementa itd. u krvnom serumu.
Imunoelektroforeza- kombinacija metode elektroforeze i imunoprecipitacije: smjesa antigena se unosi u jažice gela i elektroforezom razdvaja u gelu, zatim se u žlijeb paralelno sa zonama elektroforeze dodaje imunoserum čija antitijela difundiraju u gel i formiraju precipitacijske linije na mjestu "susreta" s antigenom.
Reakcija flokulacije(prema Ramonu) (od lat. f1oecus - ljuskice vune) - pojava opalescencije ili flokulentne mase (imunoprecipitacije) u epruveti tijekom reakcije toksin - antitoksin ili toksoid - antitoksin. Koristi se za određivanje aktivnosti antitoksičnog seruma ili toksoida.

HLA tipizacija- proučavanje ljudskog glavnog histokompatibilnog kompleksa - HLA kompleksa. Ova formacija uključuje regiju gena na kromosomu 6 koji kodiraju HLA antigene uključene u različite imunološke reakcije.

Zadaci za HLA tipizacija mogu biti vrlo različiti - biološka identifikacija (HLA tip se nasljeđuje zajedno s roditeljskim genima), određivanje predispozicije za razne bolesti, odabir davatelja za transplantaciju organa - to uključuje usporedbu rezultata HLA tipizacije tkiva davatelja i primatelja. HLA tipizacijom utvrđuje se koliko su supružnici slični ili različiti po antigenima histokompatibilnosti radi dijagnosticiranja slučajeva neplodnosti.

HLA tipizacija sugerira Analiza HLA polimorfizma a provodi se dvjema metodama – serološkom i molekularno genetičkom. Klasična serološka metoda HLA tipizacije temelji se na mikrolimfocitotoksičnom testu, a molekularna metoda koristi PCR (lančanu reakciju polimerazom).

Serološki HLA tipizacija provedeno na izoliranim populacijama stanica. Antigene glavnog histokompatibilnog kompleksa nose uglavnom limfociti. Stoga se kao glavni nositelji antigena klase I koristi suspenzija limfocita T, a za određivanje antigena HLA klase II suspenzija limfocita B. Za izolaciju potrebne stanične populacije iz cijele krvi koristi se ili centrifugiranje ili imunomagnetsko odvajanje. Vjeruje se da prva metoda može dovesti do lažno pozitivnih podataka, jer to rezultira smrću nekih stanica. Druga metoda je prepoznata kao specifičnija - više od 95% stanica ostaje održivo.

Ali osnova za izvođenje limfocitotoksičnog testa HLA tipizacija je specifični serum koji sadrži antitijela na različite alelne varijante HLA antigena klase I i II. Serološkim testom može se odrediti HLA tip ispitujući koji serumi reagiraju s limfocitima, a koji ne.

Ako dođe do reakcije između stanica i seruma, rezultat je stvaranje kompleksa antigen-antitijelo na površini stanice. Nakon dodavanja otopine koja sadrži komplement dolazi do lize i smrti stanice. Serološki test HLA tipizacije procjenjuje se pomoću fluorescentne mikroskopije za procjenu pozitivnih (crvena fluorescencija) i negativnih (zelena fluorescencija) reakcija ili fazno-kontrastne mikroskopije za procjenu bojenja jezgre mrtve stanice. Rezultat HLA tipizacije izvodi se uzimajući u obzir specifičnost reagiranih seruma i unakrsno reagirajućih skupina antigena, te intenzitet reakcije citotoksičnosti.

Nedostaci seroloških HLA tipizacija su prisutnost križnih reakcija, slab afinitet protutijela ili niska ekspresija HLA antigena, odsutnost proteinskih produkata u nizu HLA gena.

Suvremenije, molekularne metode HLA tipizacija koriste već standardizirane sintetske uzorke koji ne reagiraju s antigenima na površini leukocita, već s DNA i izravno pokazuju koji su antigeni prisutni u uzorku. Molekularne metode ne zahtijevaju živa bijela krvna zrnca, može se proučavati bilo koja ljudska stanica, a za rad je dovoljno nekoliko mikrolitara krvi ili se možete ograničiti na struganje s oralne sluznice.

Molekularna genetika HLA tipizacija koristi PCR metodu, čiji je prvi korak dobivanje čiste genomske DNA (iz pune krvi, suspenzije leukocita, tkiva).

Uzorak DNK se zatim kopira - umnožava in vitro pomoću početnica (kratke jednolančane DNK) specifične za određeni HLA lokus. Krajevi svakog para početnica moraju biti strogo komplementarni jedinstvenoj sekvenci koja odgovara specifičnom alelu, inače neće doći do pojačanja.

Nakon PCR-a, tijekom ponovljenog kopiranja, ispada veliki broj DNK fragmenti, koji se mogu procijeniti vizualno. Da bi se to postiglo, reakcijske smjese podvrgavaju se elektrolizi ili hibridizaciji, a pomoću programa ili tablice utvrđuje se je li došlo do specifičnog pojačanja. Rezultat HLA tipizacije prikazuje se u obliku iscrpnog izvješća na razini gena i alela. Zbog standardizacije korištenih uzoraka, molekularni HLA tipizacija točnije serološki. Osim toga, pruža više informacija (više novih DNA alela) i više visoka razina njegova detaljizacija, budući da omogućuje identifikaciju ne samo antigena, već i samih alela, koji određuju koji je antigen prisutan na stanici.

Imunološka reakcija lize. Reakcija se temelji na sposobnosti specifičnih protutijela da stvaraju imunološke komplekse sa stanicama, uključujući eritrocite i bakterije, što dovodi do aktivacije sustava komplementa duž klasičnog puta i lize stanice. Od reakcija imunološke lize najčešće se koristi reakcija hemolize, a rijetko reakcija bakteriolize (uglavnom u diferencijaciji kolere i kolerolikih vibrija).

Reakcija hemolize. Pod utjecajem reakcije s protutijelima u prisutnosti komplementa, mutna suspenzija crvenih krvnih stanica postaje svijetlo crvena bistra tekućina- "lakirana krv" zbog oslobađanja hemoglobina. Kod postavljanja dijagnostičke reakcije fiksacije komplementa (FFR), reakcija hemolize se koristi kao indikator: za ispitivanje prisutnosti ili odsutnosti (fiksacije) slobodnog komplementa.

Lokalna reakcija hemolize u gelu(Erneova reakcija) jedna je od varijanti reakcije hemolize. Omogućuje određivanje broja stanica koje stvaraju antitijela. Broj stanica koje izlučuju antitijela - hemolizine - određen je brojem plakova hemolize koji se pojavljuju u agar gelu koji sadrži eritrocite, suspenziju stanica limfnog tkiva koje se proučava i komplement.

Metoda imunofluorescencije

(RIF, reakcija imunofluorescencije) je metoda za otkrivanje specifičnih Ag (Ags) pomoću Abs (Ags) konjugiranih na fluorokrom. Ima visoku osjetljivost i specifičnost. Koristi se za ekspresnu dijagnostiku infekcija. bolesti (identifikacija uzročnika u istraživačkom materijalu), kao i za određivanje Ab i površinskih receptora i markera leukocita (imunofenotipizacija) i dr. stanica. Izravni I. m. sastoji se od obrade dijela tkiva ili razmaza patološkog materijala ili mikrobne kore koji sadrži specifične Abs konjugirane s fluorokromom; preparat se ispere kako bi se oslobodio nevezanih abs i ispita pod fluorescentnim mikroskopom. U pozitivnim slučajevima, blistavo svjetlo pojavljuje se oko periferije objekta. imunološki kompleks. Kontrola je neophodna kako bi se isključila nespecifična luminiscencija. Na neizravni. Ih. u prvoj fazi, isječak tkiva ili razmaz tretira se nefluorescentnim specifičnim sredstvom, u drugom - s luminescentnim sredstvom protiv -globulina životinje koja je korištena u prvoj fazi. U pozitivnom slučaju nastaje svjetleći kompleks koji se sastoji od Ar, At prema njemu i At prema At (sendvič metoda). Osim fluorescentnog mikroskopa, kod fenotipizacije stanica u obzir se uzima i RIF. laserski razvrstivač ćelija .

Protočna citometrija- metoda optičkog mjerenja parametara stanice, njezinih organela i procesa koji se u njoj odvijaju.

Tehnika uključuje otkrivanje raspršenja svjetlosti laserske zrake dok stanica prolazi kroz nju u struji tekućine, a stupanj raspršenosti svjetlosti omogućuje da se dobije predodžbu o veličini i strukturi stanice. Osim toga, analiza uzima u obzir razinu fluorescencije kemijskih spojeva koji su dio stanice (autofluorescencija) ili dodani uzorku prije protočne citometrije.

Stanična suspenzija, prethodno obilježena fluorescentnim monoklonskim protutijelima ili fluorescentnim bojama, ulazi u struju tekućine koja prolazi kroz protočnu ćeliju. Uvjeti su odabrani na način da se stanice redaju jedna za drugom zbog tzv. hidrodinamičko fokusiranje mlaza u mlazu. U trenutku kada stanica pređe lasersku zraku, detektori bilježe:

raspršenje svjetlosti pod malim kutovima (od 1° do 10°) ( ovu karakteristiku koristi se za određivanje veličine ćelije).

raspršenje svjetlosti pod kutom od 90° (omogućuje procjenu omjera jezgra/citoplazma, kao i heterogenost i granularnost stanica).

intenzitet fluorescencije kroz nekoliko fluorescentnih kanala (od 2 do 18-20) - omogućuje određivanje subpopulacijskog sastava stanične suspenzije itd.

Nanesite 1 veliku kap seruma O(I), A(II), B(III) na ploču ili predmetno staklo pomoću pipeta (drugačije!). Nakon što zabilježite vrijeme, čistim staklenim štapićem ili čistim kutom predmetnog stakla pomiješajte kapljice seruma s kapljicama krvi. Određivanje traje 5 minuta uz protresanje pločice, zatim svakoj mješavini kapi dodati 1 kap fiziološke otopine i ocijeniti rezultate. Bolje je da serum dolazi u 2 različite serije. Rezultati krvne grupe moraju odgovarati u obje serije seruma.

Procjena rezultata izohemaglutinacije:

izohemaglutinacija. Ako je reakcija pozitivna, u smjesi se pojavljuju sitna crvena zrnca ljepljivih crvenih krvnih stanica. Zrna se spajaju u veća zrna, a ova u ljuskice. Serum je gotovo bezbojan;

ako je reakcija negativna, smjesa ostaje jednoliko obojena 5 minuta ružičasta boja i nema zrna;

Pri radu s 3 seruma skupina O(I), A(II), B(III) moguće su 4 kombinacije reakcija:

1. ako su sva 3 seruma dala negativnu reakciju, odnosno smjesa je jednoliko obojena ružičasto - to je O(I) krvna grupa;

   ako je samo serum skupine A(II) dao negativnu reakciju, a serumi O(I) i B(III) dali su pozitivnu reakciju, odnosno pojavila su se zrnca - to je A(II) krvna grupa;

   serum skupine B(II) dao je negativnu reakciju, a serumi skupine O(I) i A(II) pozitivnu reakciju - to je B(III) krvna grupa.

sva 3 seruma su dala pozitivne reakcije - testirana krv je bila AB(IV) skupina. U ovom slučaju, studija se provodi sa serumom AB(IV) skupine.

Bilješka! Kapi krvi koja se ispituje trebaju biti 5-10 puta manje od kapi seruma.

Pogreške izohemaglutinacije.

Neizvođenje aglutinacije tamo gdje bi trebala biti i prisutnost aglutinacije tamo gdje ne bi trebala biti. To može biti posljedica slabog titra seruma plus slabe aglutinacije crvenih krvnih stanica.

Prisutnost aglutinacije tamo gdje je ne bi trebalo biti- To je pseudoaglutinacija, kada hrpe crvenih krvnih stanica tvore "kolone novčića". Protresanje ploče ili dodavanje fiziološke otopine ih uništava.

Panaglutinacija, kada serum spaja sve crvene krvne stanice, uključujući i one svoje krvne grupe. Do 5. minute znakovi aglutinacije nestaju.

Postoji i takozvana hladna panaglutinacija, kada se crvena krvna zrnca lijepe zajedno zbog niske temperature zraka (ispod 15°C) u prostoriji.

U svim tim slučajevima provodi se ponovljena reakcija ili korištenje standardnih crvenih krvnih stanica.

Određivanje Rh krvi

Za određivanje Rh statusa, tj. za otkrivanje prisutnosti ili odsutnosti antigena Rh sustava u krvi ljudi, koriste se standardni anti-Rh serumi (reagensi), različiti u specifičnosti, tj. koji sadrže antitijela na različite antigene ovog sustava. Za određivanje Rh 0 (D) antigena najčešće se koristi antirezus serum uz dodatak 10% otopine želatine ili standardni antirezus reagens pripremljen unaprijed s 33% otopinom poliglucina. Za dobivanje preciznijih rezultata istraživanja, kao i za identifikaciju antigena drugih seroloških sustava, koristi se Coombsov test (također je vrlo osjetljiv u određivanju kompatibilnosti transfuzirane krvi). Za istraživanje se koristi nativna krv ili krv pripremljena s nekim konzervansom. U tom slučaju krv treba isprati od konzervansa deseterostrukim volumenom izotonične otopine natrijevog klorida. Pri određivanju Rh statusa- Rh 0 (D) treba koristiti dva uzorka seruma ili anti-Rhesus reagensa dvije različite serije i istovremeno standardne crvene krvne stanice dobivene iz krvi Rh-pozitivnih (Rh +) i Rh-negativnih (Rh -) pojedince treba koristiti za kontrolu. Pri određivanju ostalih izoantigena potrebno je koristiti kontrolne crvene krvne stanice koje sadrže ili nemaju antigen protiv kojeg su usmjerena antitijela u standardnom serumu.

Parcijalni toplinski aglutinini najčešća su vrsta protutijela koja mogu uzrokovati razvoj autoimune hemolitičke anemije. Ova antitijela pripadaju IgG, rjeđe IgM, IgA.

COOMBSOV TEST

Coombsov test: uvod. Coombsov test je laboratorijska dijagnostička metoda koja se temelji na reakciji hemaglutinacije.

Glavna metoda za dijagnosticiranje autoimune hemolitičke anemije je Coombsov test. Temelji se na sposobnosti antitijela specifičnih za imunoglobuline (osobito IgG) ili komponente komplementa (osobito S3) da aglutiniraju eritrocite obložene IgG ili S3.

Vezanje IgG i C3b za eritrocite uočeno je kod autoimune hemolitičke anemije i imunohemolitičke anemije izazvane lijekovima. Izravni Coombsov test. Izravni Coombsov test koristi se za otkrivanje protutijela ili komponenti komplementa fiksiranih na površini crvenih krvnih stanica. Provodi se na sljedeći način:

Za dobivanje protutijela na ljudske imunoglobuline (antiglobulinski serum) ili komplement (antikomplementarni serum), životinja se imunizira ljudskim serumom, imunoglobulinima ili humanim komplementom. Serum dobiven od životinje se pročišćava od antitijela na druge proteine.

Crvena krvna zrnca pacijenta isperu se fiziološkom otopinom kako bi se potpuno uklonio serum, koji neutralizira antitijela na imunoglobuline i komplement te može uzrokovati lažno negativan rezultat.

Ako su protutijela ili komponente komplementa fiksirane na površini crvenih krvnih stanica, dodatak antiglobulina ili antikomplementnog seruma uzrokuje aglutinaciju crvenih krvnih stanica.

Izravni Coombsov test koristi se u sljedećim slučajevima:

Autoimuna hemoliza.

Hemolitička bolest novorođenčadi.

Imunološka hemolitička anemija izazvana lijekovima.

Hemolitičke transfuzijske reakcije. Indirektni Coombsov test. Indirektni Coombsov test otkriva antitijela na crvena krvna zrnca u serumu. Da bi se to postiglo, pacijentov serum se inkubira s crvenim krvnim stanicama donora grupe 0, a zatim se izvodi izravni Coombsov test.

Indirektni Coombsov test koristi se u sljedećim slučajevima:

Određivanje individualne kompatibilnosti krvi davatelja i primatelja.

Detekcija aloantitijela, uključujući antitijela koja uzrokuju hemolitičke transfuzijske reakcije.

Određivanje površinskih antigena eritrocita u medicinska genetika i sudske medicine.

Potvrda jednojajčanih blizanaca tijekom transplantacije koštane srži.

Da bi se proveo biološki test, krv se počinje transfuzirati što je brže moguće (po mogućnosti u mlazu). Nakon transfuzije 25 ml krvi, cijev sustava se steže stezaljkom. Zatim slijedi pauza od 3 minute tijekom koje se prati stanje primatelja. Za izvođenje biološkog testa tri puta se ubrizgava 25 ml krvi. Na kraju testa (nakon transfuzije prvih 75 ml krvi u frakcijskim dozama od 25 ml u intervalima od 3 minute), sustav se podešava na potrebna brzina transfuzija. Kada se pacijentu daje više od jedne boce krvi, potrebno je izvaditi iglu iz vene. U tom slučaju, igla se izvadi iz epruvete bočice u kojoj je istekla krv i umetne u sljedeću bočicu. Cijev sustava (gumena ili plastična) je u ovom trenutku stegnuta stezaljkom. Ako tijekom transfuzije krvi postane potrebno primijeniti bilo koji drugi lijek intravenozno primatelju, to se čini probijanjem gumene cijevi sustava. Proboji plastične cijevi su neprihvatljivi jer ne otpadaju. Nakon svake transfuzije krvi, pacijent se mora pratiti kako bi se identificirao i brzo eliminirao moguće komplikacije, uključujući alergijske reakcije. 2 sata nakon završetka transfuzije krvi potrebno je izmjeriti tjelesnu temperaturu. Ako se poveća, mjerenje se mora ponoviti svaki sat tijekom sljedeća 4 sata. Jednako je važno praćenje mokrenja i sastava urina, što omogućuje utvrđivanje prisutnosti toksične posttransfuzijske reakcije. Pojava oligurije i anurije nakon transfuzije krvi, prisutnost krvnih stanica i bjelančevina u urinu izravni su pokazatelj razvoja posttransfuzijske hemolize.

Coombsov test– test za otkrivanje antitijela pričvršćenih na površinu ili otopljenih u plazmi. Koristi se za otkrivanje imunizacije i antitijela na crvena krvna zrnca. Drugi naslov antiglobulinski test. Može biti izravna ili neizravna.

Na direktni antiglobulinski test otkriva antitijela fiksirana na površini crvenih krvnih stanica. Provodi se ako postoji sumnja na, na druge autoimune bolesti, nakon uzimanja lijekova (metildopa, penicilin, kinin) itd.

Crvena krvna zrnca senzibilizirana su in vivo – antitijela su već čvrsto vezana za njih, a dodatak antiglobulinskog seruma (anti-IgG) uzrokuje slijepljenje senzibiliziranih stanica, što je vidljivo golim okom.

Indirektni Coombsov test detektira antieritrocitna protutijela u krvnoj plazmi, provodi se prije transfuzije krvi i tijekom.

Antieritrocitna antitijela su vrsta autoantitijela, tj. antitijela protiv vlastitih tkiva. Autoantitijela se javljaju tijekom patološke reaktivnosti imunološki sustav za neke lijekove, na primjer visoke doze penicilin.

Crvena krvna zrnca na svojoj površini sadrže razne kemijske strukture(glikolipidi, saharidi, glikoproteini i proteini), u medicini nazvani antigeni. Osoba nasljeđuje od svojih roditelja specifičnu kartu antigena na svakom crvenom krvnom zrncu.

Antigeni se spajaju u skupine i potom se krv dijeli u nekoliko skupina – prema sustavu AB0, Rh, Kell, Lewis, Kidd, Duffy. Najpoznatiji i najznačajniji u radu liječnika su AB0 i Rh faktor (Rh).

AB0 sustav

Rh status osobe određen je prisutnošću ovih antigena. Posebno važan antigen eritrocita je antigen D. Ako je prisutan, onda govore o Rh pozitivna krv RhD, a ako ga nema – oh Rh negativan Rhd.

Ako se odgovarajuće antitijelo veže za antigene eritrocita, eritrocit se uništava - hemoliza.

Indikacije

Glavna indikacija za direktnoantiglobulinski test- sumnja na hemolitičku anemiju. Najčešće se radi kod primarne autoimune hemolitičke anemije, hemolize kod reumatskih, tumorskih, zarazne bolesti, hemoliza izazvana lijekovima.

Ako se anemija pojavi nekoliko dana ili mjeseci nakon transfuzije krvi ili tijekom dugotrajna žutica Direktan Coombsov test također se provodi na novorođenčetu.

Neizravnoradi se antiglobulinski test prije transfuzije krvi i tijekom trudnoće Rh-negativne žene.

Autoimuna hemolitička anemija

Autoimuna hemolitička anemija (primarna)– klasična autoimuna bolest nepoznatog uzroka. Interakcija unutar imunološkog sustava je poremećena, što dovodi do percepcije vlastitih crvenih krvnih zrnaca kao stranih. U limfnim čvorovima se sintetiziraju antitijela klase IgG (reagiraju na t 37°C) i/ili IgM (na t 40°C) koja, kada se pričvrste na površinu eritrocita, pokreću niz enzima ( sustav komplementa) i “buše” stijenku eritrocita što dovodi do njegove destrukcije – hemolize.

Prvi simptomi uzrokovani su uništavanjem crvenih krvnih stanica i smanjenjem hemoglobina. Među njima:

• umor, opća slabost, razdražljivost
• dispneja
• bolovi u trbuhu i prsima, mučnina
• tamna boja urina
• bol u leđima
• ikterična promjena boje kože i sluznica
• smanjenje broja crvenih krvnih stanica i

Izravan pozitivan rezultat Coombs testovi 100% potvrđuje dijagnozu autoimune hemolitičke anemije, dokazujući njezino autoimuno podrijetlo. Istodobno, negativan rezultat ne omogućuje uklanjanje dijagnoze.

Sekundarna hemolitička anemija

Sekundarna autoimuna hemolitička anemija i pozitivan Coombsov test mogu se javiti kod sljedećih bolesti:

• Evansov sindrom
• infekcija pneumonijom

Pozitivan antiglobulinski test kod ovih bolesti jedan je od simptoma, a ne kriterij za dijagnozu.

Hemolitička bolest novorođenčadi

Uzrok hemolitička bolest novorođenčadi - nekompatibilnost krvne grupe majke i fetusa, u većini slučajeva prema Rh sustavu, u pojedinačnim slučajevima - prema sustavu AB0, kazuistički - prema drugim antigenima.

Rh sukob se razvija ako fetus Rh-negativne žene naslijedi Rh-pozitivnu krv od oca.

Bolest se kod novorođenčeta razvija samo ako je majka već razvila antitijela na odgovarajuće antigene, što se događa nakon prethodne trudnoće, pobačaji, transfuzije nekompatibilna krv. Najčešći razlog pokretanja sinteze antitijela na antigene membrane eritrocita je porođaj (feto-maternalno krvarenje). Prvo rođenje uglavnom se odvija bez komplikacija, ali kasniji su prepuni hemolitičke bolesti novorođenčeta u prvim danima nakon rođenja.

Simptomi hemolitičke bolesti novorođenčadi:

• žutost kože
• , i sluznice
• povećana jetra i slezena
• problemi s disanjem
• oticanje cijelog tijela
• ekscitacija i postupna depresija središnjeg živčanog sustava

Anemija nakon transfuzije krvi

Indirektni Coombsov test provodi se prije transfuzije krvi za procjenu kompatibilnosti, a izravni Coombsov test - nakon njega ako se sumnja na posttransfuzijsku hemolizu, tj. u prisutnosti simptoma kao što su groznica, suzenje (pročitajte dolje). Svrha analize je identificirati protutijela na transfuzirane crvene krvne stanice koja su se vezala na crvene krvne stanice primatelja i uzrokuju posttransfuzijsku hemolizu, kao i prerano uklanjanje donorskih crvenih krvnih stanica iz krvotoka primatelj (onaj koji je primio krv).

Simptomi:

• povećanje tjelesne temperature
• kožni osip
• bol u leđima
• Crvena
• mučnina
• vrtoglavica

Dekodiranje

Vrijedno je podsjetiti da su temeljna pravila za dešifriranje izravnih i neizravnih antiglobulinskih testova ista. Jedina razlika je mjesto antitijela – u krvi ili na crvenim krvnim stanicama.

• Ako direktni Coombsov test je negativan– to znači da antitijelo ne “sjeda” na crvena krvna zrnca te treba dalje tražiti uzrok simptoma i napraviti neizravni Coombsov test
• Ako pozitivan rezultat Coombsov test otkriven nakon transfuzije krvi, infekcija, lijekova - pozitivnost traje do 3 mjeseca (životni vijek crvenih krvnih zrnaca 120 dana - 3 mjeseca)
• pozitivan rezultat antiglobulinskog testa sa autoimuna bolest traje mjesecima pa i godinama

Norma

• direktni Coombsov test – negativan
• neizravni Coombsov test – negativan

Kvalitativno pozitivan rezultat mjeri se brojem pluseva od jedan do četiri (+, ++, +++, ++++), a kvantitativno u digitalnom obliku - 1:16, 1:256 itd.

Da. Vaš liječnik svakako treba znati da ste primili transfuziju krvi, budući da to sada utječe na ispravno tumačenje rezultata pretraga. Kada primate tuđu (iako mnogo puta testiranu) krv, uvijek postoji mogućnost da će vaše tijelo razviti antitijela protiv transfuzirane krvi. Ta će antitijela osigurati loš utjecaj o zdravstvenom stanju. Za naknadne transfuzije krvi liječnik mora znati da ste već primili transfuziju, što znači da je bilo vremena za sintezu antitijela. Za trudnice su ove informacije još važnije.

3. Ako postoji neusklađenost Rh faktora između majke i djeteta, hoće li sva djeca biti bolesna?

Ovisi o tome je li dijete Rh pozitivno ili negativno (RhD). Nosioci krvnih grupa I, II, III i IV mogu biti Rh pozitivni ili negativni. U situaciji kada je majka Rh negativna, a dijete Rh pozitivno, antitijela će se stvarati već s prvom trudnoćom, no tek nakon prvog poroda (ili prekida trudnoće) dolazi do izravnog kontakta između krvi majke i majke. dijete. Hemolitički učinak protutijela ostvarit će se tek tijekom drugog i sljedeće rođenje, što će dovesti do hemolitičke bolesti u novorođenčeta.

Svaka žena s negativnim Rh faktorom treba pažljivo pregledati tijekom trudnoće i nakon poroda preventivno liječenje kako bi se spriječila pojava protutijela i daljnjih komplikacija.

4. Tijekom trudnoće, je li potrebno znati krvnu grupu mog muža prije izvođenja Coombsovog testa?

Morate ne samo znati, već i provjeriti krvnu grupu biološkog oca djeteta tijekom trudnoće.

Podaci

• prvi put predložen u Cambridgeu 1945
• prag osjetljivosti - najmanje 300 fiksiranih molekula antitijela na jednom crvenom krvnom zrncu
• broj antitijela koja pokreću hemolizu - pojedinačno za svaku osobu (od 16-30 do 300)
• dinamika ostalih laboratorijskih pokazatelja hemolitičke anemije (hemoglobin, bilirubin, retikulociti) može se normalizirati, a Coombsov test će ostati na istoj razini

Coombsov test zadnji put je modificirao: 16. ožujka 2018 Marija Bodjan

Normalno, u krvi nema antitijela na crvena krvna zrnca.

Izravni Coombsov test je antiglobulinski test (aglutinacija u gelu koja omogućuje detekciju potpunih dvovalentnih protutijela), kojim se otkrivaju protutijela IgG klase i C3 komponenta komplementa na površini crvenih krvnih stanica. Tipično, protutijela otkrivena izravnim Coombsovim testom imaju široku specifičnost koja nije povezana s dobro utvrđenim antigenom. Pozitivan direktni Coombsov test jasno ukazuje da pacijent ima hemolitičku anemiju, iako ne boluju svi bolesnici s pozitivnim direktnim antiglobulinskim testom od ove bolesti. U približno 10% bolesnika izravnim Coombsovim testom ne mogu se utvrditi protutijela ili komponente komplementa na membrani crvenih krvnih stanica (test je negativan), no unatoč tome boluju od autoimune hemolitičke anemije. Da bi se razjasnila specifičnost protutijela u takvim slučajevima, koriste se testovi s njihovim ispiranjem. Izravni Coombsov test, pozitivan samo na komplement, obično se odnosi na hladna protutijela tipa IgM. U ovom slučaju, antitijela IgM nisu prisutna na crvenim krvnim stanicama kada bazalna temperatura tijela. Međutim, zbog činjenice da IgM antitijela aktivno fiksiraju komplement, a komplement ostaje na crvenim krvnim stanicama, kod ovog oblika autoimune hemolitičke anemije (bolest hladnog agutinina) Coombsov test će biti pozitivan samo na komplement.

Izravni Coombsov test pozitivan je na autoimunu hemolitičku anemiju uzrokovanu toplim protutijelima, autoimunu anemiju izazvanu lijekovima (pri uzimanju metildope do 20% bolesnika ima pozitivnu reakciju), adsorpcijski tip hemolitičke anemije, imunokompleksni tip hemolitičke anemija (test je pozitivan samo na C3), s autoimunom hemolitičkom anemijom uzrokovanom hladnim protutijelima - bolest hladnog aglutinina (test je pozitivan samo na C3). Kod paroksizmalne hladne hemoglobinurije direktni Coombsov test je negativan.

Indirektni Coombsov test - neizravni antiglobulinski test (otkriva nepotpuna antitijela) omogućuje vam prepoznavanje atipičnih antitijela u krvi, uključujući aloantitijela na strane antigene eritrocita. Naziv (indirektan) dobio je po tome što se javlja u 2 stadija. U početku bolesnikov krvni serum, koji sadrži nepotpuna antitijela, stupa u interakciju s dodanim korpuskularnim Ag dijagnostikumom bez vidljivih manifestacija. U drugoj fazi dodani antiglobulinski serum dolazi u interakciju s nepotpunim antitijelima adsorbiranim na antigene, uz pojavu vidljivog taloga. Transfuzija homolognih (alogenih) crvenih krvnih stanica ili trudnoća su najviše uobičajeni razlozi stvaranje ovih antieritrocitnih antitijela. Kombinacija pozitivnog neizravnog Coombsovog testa s negativnim izravnim testom ne daje ništa za dijagnozu autoimune hemolitičke anemije. Pozitivan indirektni Coombsov test uzrokuje određene poteškoće pri odabiru krvi za transfuziju i provođenju unakrsnog testa kompatibilnosti s konzerviranom krvlju, ali nema drugu dijagnostičku vrijednost.