Laboratórna diagnostika helmintiáz. Spôsob izolácie čistej kultúry Leishmania získanej zoškrabaním patologických tkanív

Jednoduché metódy

Makroskopická metóda. Pri skúmaní trusu možno nájsť helminty, ich hlavy, segmenty a úlomky strobila, uvoľnené samostatne alebo po odčervení. Táto metóda sa odporúča najmä na identifikáciu enterobiázy, taeniaázy a taeniarynchózy.

Malé časti výkalov sa zmiešajú s vodou v plochom kúpeli alebo v Petriho miske a pozorujú sa dobré osvetlenie na tmavom pozadí, ak je to potrebné, pomocou lupy odstráňte helminty a všetky podozrivé biele útvary pomocou pinzety alebo pipety. Zozbieraný materiál sa prenesie do inej misky s vodou alebo na podložné sklíčko v kvapke zriedeného glycerolu alebo izotonického roztoku chloridu sodného na ďalšie štúdium.

Pri metóde usadzovania by sa mala celá testovaná časť výkalov zmiešať s vodou v sklenenom valci a potom opatrne vypustiť vrchná vrstva voda. Toto sa opakuje niekoľkokrát. Keď sa kvapalina vyčíri, vypustí sa a sediment sa po malých častiach skúma v sklenenom kúpeli alebo Petriho miske, ako je uvedené vyššie.

Mikroskopické metódy sú hlavným spôsobom skúmania výkalov na detekciu vajíčok alebo lariev helmintov. Rôzne výskumné metódy sú opísané nižšie. Pre zvýšenie spoľahlivosti vyšetrenia je možné testy opakovať niekoľkokrát denne alebo v intervale 1-3 dní.

Metóda natívneho rozmazania. Natívny náter je najbežnejší a technicky dostupná metóda fekálne štúdie. V natívnom nátere môžete zistiť vajíčka a larvy helmintov všetkých typov. Ak je však počet vajíčok v stolici malý, nemožno ich vždy nájsť. Vyšetrenie stolice len pomocou natívneho náteru preto nie je úplné a malo by byť doplnené o metódy obohatenia. Efektívnosť vyšetrenia natívneho náteru sa výrazne zlepší prezeraním štyroch sklíčok pripravených zo vzorky stolice na dvoch sklíčkach bez krycích sklíčok, čo umožňuje celkovo vyšetriť približne rovnaké množstvo stolice ako pri Kato metóde (pozri nižšie).

Malé množstvo (veľkosti hlavičky zápalky) zmiešaných výkalov sa tenko rozotrie drevenou tyčinkou na povrch podložného sklíčka v kvapke 50 % roztoku glycerínu. Zvyčajne sa na jednom podložnom sklíčku pripravia dva nátery. Náter sa prezerá pod mikroskopom s malým zväčšením (zv. 8, približne 7). V pochybných prípadoch sa prekryje krycím sklom a skúma pri veľkom zväčšení (40 zväčšenie).

Na prípravu veľkého natívneho náteru sa 200 – 300 mg výkalov (veľkosť veľkého hrášku) rozomelie na sklo s rozmermi 6 x 9 cm v 15 – 20 kvapkách 50 % vodného roztoku glycerolu. Pohľad pod binokulárnym stereoskopickým mikroskopom (obv. 4, cca 12,5 alebo ob. 2, cca 17) v prechádzajúcom svetle bez krycích skiel. V pochybných prípadoch môžete objektív prepnúť na väčšie zväčšenie. V takýchto náteroch sú farebné veľké vajíčka helmintov jasne viditeľné, zatiaľ čo priehľadné vajíčka trpasličej pásomnice sú o niečo horšie. Táto metóda nie je vhodná na zisťovanie malých vajíčok. Zároveň veľký objem skúmaného materiálu a veľké zorné pole s vysokou hĺbkou ostrosti zaisťujú výraznú efektivitu tejto modifikácie v porovnaní s bežným natívnym náterom.

Hustý náter s celofánom (metóda Kato) je účinnejší ako štúdium natívneho náteru, ale vyžaduje aj kombináciu s metódami obohacovania. Zisťujú sa vajíčka všetkých druhov helmintov, avšak na zistenie vajíčok pásomnice trpasličej (transparentné vajíčka) alebo opisthorchida (malé vajíčka) musí laborant dávať obzvlášť pozor, aby ich neprehliadol (obr. 21).

Metóda je založená na detekcii vajíčok helmintov v hustom nátere výkalov, očistených glycerínom a zafarbených malachitovou zelenou. Predhydrofilný celofán sa nareže na platne s rozmermi 20 x 40 mm a ponorí sa do Kato zmesi (6 ml 3 % vodného roztoku malachitovej zelene, 500 ml glycerínu, 500 ml 6 % roztoku fenolu). 3-5 ml zmesi vystačí na 100 tanierov, ktoré sú pripravené na použitie za deň a môžu sa v rovnakej zmesi skladovať v dobre uzavretej nádobe pri izbovej teplote po dobu 6 mesiacov. Pri absencii malachitovej zelene (odporúča sa na zníženie únavy očí laboratórneho asistenta) a fenolu (dezinfekčný prostriedok) môžete použiť iba 50% vodný roztok glycerolu, účinnosť štúdie sa neznižuje.

Ryža. 20. Spôsob prípravy hustého celofánového náteru stolice podľa Kato

Na podložné sklíčko sa nanesie 100 mg výkalov, prikryje sa celofánovou platňou, ako je uvedené vyššie, a zatlačí sa gumovou zátkou, aby sa výkaly nerozšírili spod celofánu. Mikroskopia pri malom alebo veľkom zväčšení mikroskopu sa vykonáva najneskôr 1 hodinu (v horúcom počasí - 30-40 minút) po príprave náteru. Dôvodom nepriehľadnosti lieku môže byť hrubá vrstva výkalov, zlé spracovanie platne v zmesi Kato alebo nedostatočná doba expozície lieku pod celofánom. Zistenie vajíčok sťažuje aj zdĺhavé čírenie glycerínom a nadmerné vysychanie prípravku.

Metóda krútenia podľa S.S. Shulman. Metóda je navrhnutá na detekciu lariev helmintov, predovšetkým strongyloidov, vo výkaloch. Vyšetrujú sa len čerstvo vylúčené výkaly, z ktorých 2-3 g sa prenesú do sklenenej nádoby, krúživými pohybmi sa miešajú sklenenou tyčinkou s 3-5-násobným množstvom fyziologického roztoku, pričom sa nedotýkajú stien nádoby. V strede sa hromadia vajíčka a larvy helmintov. Po ukončení miešania sa kvapka na konci tyčinky rýchlo prenesie na podložné sklíčko, prikryje sa krycím sklíčkom a skúma sa pod mikroskopom.

Metódy obohatenia. Metódy obohatenia sú založené na rozdiele v špecifickej hmotnosti vajec a použitom soľnom roztoku, čo umožňuje ich detekciu v malých množstvách. Ak je špecifická hmotnosť vajec väčšia ako špecifická hmotnosť kvapaliny, potom sa vajcia koncentrujú v sedimente, ktorý sa skúma pod mikroskopom. Táto sedimentačná metóda sa používa pre vajíčka motolice. Pri vyššej špecifickej hmotnosti roztoku vajcia plávajú na povrch kvapaliny a potom sa skúma film. Ide o flotačné (plávajúce) metódy, sú najúčinnejšie na zisťovanie vajíčok machovky, bičíkovcov a trpasličích pásomníc.

Flotačné metódy. Metóda Fulleborn je založená na plávaní vajíčok helmintov v nasýtenom roztoku chloridu sodného, ​​ktorý má vysokú relatívnu hustotu (1,2), čo umožňuje detekovať vajíčka v malých množstvách. Metóda je účinnejšia ako štúdium natívneho náteru, aj keď je to komplikovanejšie. Výhodou metódy je nízka cena a dostupnosť. Odporúča sa kombinovať štúdium natívneho náteru a metódy Fulleborn.

Nasýtený roztok sa pripraví rozpustením 400 g chloridu sodného v 1 litri vody za varu. Relatívna hustota roztoku je 1,18-1,22. Roztok sa uchováva v uzavretej fľaši. Na vykonanie analýzy sa 2 až 3 g výkalov umiestnia do nádoby s objemom 30 až 50 ml a za miešania tyčinkou sa takmer po vrch pridá nasýtený roztok chloridu sodného. Pás papiera sa používa na rýchle odstránenie veľkých plávajúcich častíc. Po 45-60 minútach. Po usadení drôtenou slučkou odstráňte povrchový film a preneste ho na podložné sklíčko v kvapke 50% vodného roztoku glycerolu. Namiesto odstránenia filmu pomocou slučky môžete pridať roztok do nádoby na vrch, zakryť podložným sklom, na ktorého povrchu sa prilepia plávajúce vajcia. Pripravuje sa viacero príprav. Okrem toho sa skúmajú 2 až 4 preparáty zo sedimentu, ktorý sa odoberie pipetou do oka na 2 podložné sklíčka. Okrem povrchového filmu je potrebné preskúmať aj sediment, keďže vajíčka motolice, taeniíd a neoplodnených vajíčok oblých červov v tomto roztoku neplávajú. Vajíčka radu helmintov nevyplávajú hneď na povrch v soľnom roztoku. Takže, ak sa maximálny počet vajíčok trpasličích pásomníc objaví po 15-20 minútach, potom ascaris - po 1,5-2 hodinách, bičík - po 2-3 hodinách.

Medzi výhody tejto metódy teda patrí jej nízka cena a dostupnosť, nevýhodou je nutnosť prezerania preparátov na povrchovom filme a sedimente, ako aj doba usadzovania.

Metóda E. V. Kalantaryana je tiež obohacovacia metóda, ale je efektívnejšia a jednoduchšia ako Fullebornova metóda. Použije sa nasýtený roztok dusičnanu sodného s relatívnou hustotou 1,38. Preto vajíčka väčšiny helmintov plávajú a nachádzajú sa v povrchovom filme, vyšetrenie sedimentu nie je potrebné.

Na prípravu nasýteného roztoku dusičnanu sodného sa 1 kg soli dusičnanu sodného (dusičnanu sodného) rozpustí v 1 litri vody a varí sa, kým sa úplne nerozpustí a na povrchu sa nevytvorí film. Bez filtrovania nalejte do suchej fľaše. V neprítomnosti dusičnanu sodného ho možno nahradiť dusičnanom amónnym (dusičnan amónny), pričom sa rozpúšťa 1,7 kg na 1 liter vody. Relatívna hustota výsledného roztoku je 1,3, čo mierne znižuje účinnosť v porovnaní s roztokom dusičnanu sodného.

Výhody metódy: vajíčka väčšiny helmintov rýchlo plávajú a nachádzajú sa v povrchovom filme, čo eliminuje potrebu skúmania sedimentu. Nevýhodami metódy je nedostatok dusičnanu sodného, ​​ako aj skutočnosť, že vajíčka trematód a taeniidné onkosféry neplávajú a zostávajú v sedimente. Je potrebné vziať do úvahy, že keď sa výkaly držia v roztoku dlhší čas (viac ako 1-2 hodiny), vajíčka niektorých helmintov začnú napučiavať a usadzovať sa, miznú z povrchového filmu.

Sedimentačné metódy

Metóda P. P. Goryacheva je založená na princípe sedimentácie vajec. V tomto prípade sa náter ukáže ako ľahký, bez hrubých nečistôt, čo uľahčuje detekciu malých vajíčok trematód (opistorchid atď.). Špecifická hmotnosť vajec opisthorch je vysoká, takže neplávajú vo fyziologických roztokoch.

70-100 ml nasýteného roztoku chloridu sodného sa naleje do valca s priemerom 2-3 cm. Samostatne opatrne rozmiešajte 0,5 g fekálií v 20-25 ml vody a opatrne prefiltrujte cez lievik s dvoma vrstvami gázy do valca na soľný roztok, pričom sa vyhýbajte miešaniu (aby sa vytvorili dve zreteľne ohraničené vrstvy). Po 2-3 hodinách sa vrchná vrstva s výkalmi odsaje pipetou a zvyšný soľný roztok sa nechá 12-20 hodín odstáť alebo sa odstredí. Sediment sa napipetuje na podložné sklíčko, prikryje sa krycím sklíčkom a skúma sa pod mikroskopom.

Goryachevova metóda bola navrhnutá na zisťovanie opisthorchidných vajíčok a ukázalo sa, že je účinnejšia ako štúdium natívneho náteru a metóda Fulleborn. V súčasnosti sa na diagnostiku opisthorchiázy (klonorchiázy) odporúčajú metódy Kato a Kalantaryan ako dosť účinné a technicky jednoduchšie.

Krasilnikovova metóda. Pod vplyvom povrchovo aktívnych látok obsiahnutých v detergentoch (detergentoch) sa vajíčka hlíst uvoľňujú z výkalov a koncentrujú sa v sedimente.

Vopred si pripravte 1% roztok pracieho prášku Lotus. Na tento účel sa 10 g prášku rozpustí v 1 litri vody z vodovodu. Ak Lotus nie je k dispozícii, môžete použiť iné pracie prášky, ale z každého z nich musíte odobrať toľko, koľko sa rozpustí bez tvorby sedimentu v 1 litri vody z vodovodu. 20-30 ml čistiaceho roztoku sa naleje do sklenenej nádoby s objemom 30-50 ml, umiestni sa tam malá časť výkalov a dobre sa premieša. Pomer výkalov k roztoku by mal byť približne 1:20. Výkaly by mali byť v roztoku aspoň 24 hodín. Počas tejto doby sa na dne vytvorí sediment s 2-3 vrstvami. Spodná vrstva pozostáva z hrubých, ťažkých častíc, v strednej vrstve sa zhromažďujú vajíčka helmintov a vrchná vrstva sú belavé sivé vločky. Potom pomocou pipety odoberte 2-3 kvapky tekutiny zo strednej vrstvy a preneste ju na podložné sklíčko. Na jedno podložné sklíčko sa pripravia 2 preparáty, prikryjú sa krycím sklíčkom a skúmajú sa pod mikroskopom.

Krasilnikovova metóda umožňuje odhaliť vajíčka všetkých druhov helmintov vylučovaných výkalmi.

Éter-formalínová sedimentačná metóda a chemická sedimentačná metóda s vysoká účinnosť sú veľmi prácne, najmä pri hromadných vyšetreniach, preto je vhodnejšie použiť éter-octovú metódu. Umožňuje po dodatočnom ošetrení sedimentu chemickými činidlami získať takmer iba vajíčka hlíst, čo uľahčuje identifikáciu malých vajíčok motolice. Táto metóda sa ukázala ako univerzálna, deteguje vajíčka všetkých črevných helmintov, cysty črevných prvokov a dá sa použiť aj na kvantifikáciu intenzity invázie.

7 ml 10 % roztoku sa naleje do odstredivkových odmerných skúmaviek octová kyselina a pridajte 1 g výkalov po značku 8 ml. Výkaly sa dôkladne premiešajú tyčinkou, kým sa nevytvorí homogénna zmes, a potom sa prefiltrujú cez dve vrstvy gázy do ďalšej centrifugačnej skúmavky (tak, aby nová skúmavka s precedeným roztokom obsahovala opäť 8 ml; ak menej, môžete dodatočne lievik opláchnite obväzom s 10% roztokom kyseliny octovej, cez ktorý prefiltrujte fekálny roztok). Do tejto skúmavky pridajte 2 ml éteru (až po značku 10 ml), zazátkujte ju a intenzívne pretrepávajte 30 sekúnd. Zmes sa centrifuguje pri 3000 otáčkach za minútu počas 1 minúty (alebo 2 minúty pri 1500 otáčkach za minútu). Vrstva koagulantu (vo forme zátky v hornej časti skúmavky) sa oddelí od stien skúmavky pomocou tyčinky a opatrne sa vypustí spolu so supernatantom. Zrazenina (zvyčajne malá, bezfarebná) sa napipetuje na podložné sklíčka, prikryje sa krycím sklíčkom a skúma sa mikroskopicky.

Protozoá sú rozdelené do 4 tried:

Pri encystácii získa mikroorganizmus okrúhly tvar a je pokrytý ochranným plášťom. Vo forme cysty sa prvoky stávajú menej náchylnými na nepriaznivé faktory prostredia.

Nasledujúce položky môžu byť predmetom výskumu:

Poznámka:Existuje mnoho typov diagnostiky, zvážime tie typy, ktoré sú v klinickej laboratórnej praxi najbežnejšie.

Súkromné ​​typy diagnostiky

V každom konkrétnom prípade má laborant za úlohu nájsť konkrétny patogén, niekedy sú spolu s hlavným patogénom objavené aj iné.

V ľudskom čreve je schopných žiť 6 druhov tohto mikroorganizmu. Klinický význam má len dyzenteriálna améba, ktorá sa vyskytuje vo vegetatívnej forme a vo forme cýst.

Okrem toho sa používajú imunologické metódy:

• nepriama imunofluorescencia;
• nepriama aglutinácia (INA);
• radiálna imunodifúzia.

Poznámka: sérologické metódy sú neinformatívne a používajú sa len ako doplnok k hlavným v pochybných prípadoch.

Diagnostika riasiniek (ciliates)

Patogénnou formou mikroorganizmov tohto rodu je balantidium. Ide o mikrób, ktorý spôsobuje balantidiázu, ochorenie sprevádzané ulceróznym procesom hrubého čreva. Patogén sa deteguje v natívnom nátere vo forme vegetatívnej formy a cysty. Materiál na náter (výkaly a hlien) sa odoberie počas sigmoidoskopického vyšetrenia a vysieva sa na špeciálne médiá.

Diagnóza bičíkovcov (Leishmania, Giardia, Trypanozómy, Trichomonas)

Leishmania, trypanozómy, lamblia a trichomonas sú pre ľudí nebezpečné.

Leishmania- mikróby, spôsobujúce leishmaniózu, sa vyšetrujú v krvných náteroch, materiáloch kostná dreň, škrabance z kožných infiltrátov. V niektorých prípadoch sa pri diagnostike leishmánie používa kultivácia na živných médiách.

trypanozómy– pôvodcovia spavej choroby (americká/africká trypanozomiáza alebo Chagasova choroba).

Africký variant sa určuje v počiatočnom období počas štúdia periférnej krvi. S progresiou ochorenia sa patologické mikróby nachádzajú v materiáli punkcií lymfatických uzlín av pokročilých štádiách - v cerebrospinálnej tekutine.

Na diagnostiku trypanozómov v prípade podozrenia na Chagasovu chorobu sa skúmaný materiál skúma pod mikroskopom pri malom zväčšení. V tomto prípade sú šmuhy a hustá kvapka vopred zafarbené.

Trichomonas(črevné, orálne,) sa zisťujú mikroskopiou materiálov odobratých z postihnutých slizníc.

Identifikácia sporozoanov (malarické plazmodium, pôvodca kokcidózy atď.)

Najbežnejším a najnebezpečnejším druhom pre ľudí je malarický plazmód, ktorý má 4 hlavné typy patogénu: pôvodcu trojdňovej malárie, štvordňovej malárie, tropickej malárie a malárie ovale.

Sexuálny vývoj Plasmodium (sporogónia) prebieha u komárov rodu Anopheles. Asexuálna (schizogónia tkanív a erytrocytov) - v ľudskom pečeňovom tkanive a erytrocytoch. Tieto vlastnosti životný cyklus treba brať do úvahy pri diagnostike malarického plazmódia.

V krvi čerstvo chorého pacienta sa teda dajú zistiť zárodočné bunky sporogónneho cyklu. Ale na vrchole malarických záchvatov sa schizonty objavujú vo veľkom počte v krvi.

Okrem toho sa v rôznych fázach malarickej horúčky objavujú rôzne formy plazmódia:

• počas obdobia chladu sa krv naplní merozoitmi, typom schizontu;
• pri zvýšených teplotách sa v erytrocytoch hromadia prstencové trofozoity;
• pokles teploty je charakterizovaný prevahou amébovitých trofozoitov;
• počas obdobia normálneho stavu krv obsahuje dospelé formy schizontov.

Štúdium pôvodcu malárie (malarické plazmodium) sa uskutočňuje v nátere a v hustej kvapke.

Poznámka:Diagnóza malárie vyšetrením sterov a hustých kvapiek krvi je niekedy chybná. Krvné doštičky môžu byť v niektorých prípadoch mylne pripísané malarickému patogénu. Tiež niekedy fragmenty leukocytov a iných buniek simulujú plazmodium.

Základné metódy štúdia prvokov

Pozrime sa v krátkosti na najbežnejšie metódy výskumu prítomnosti prvokov.

Diagnostika prvokov pomocou natívneho náteru a náteru zafarbeného Lugolovým roztokom (v stolici)

Liečivo sa pripravuje z emulzie výkalov v izotonickom roztoku. Na podložné sklíčko sa nanesú dve kvapky chlóru sodného a Lugolov roztok. Testovaný materiál sa pridá k obom kompozíciám drevenou tyčinkou a po prekrytí sklom sa pozoruje pri rôznych rozlíšeniach mikroskopu.

Nájdené prvoky sa zaznamenávajú na základe určitých charakteristík. Pre presnosť pripravte 2-3 prípravky z rovnakého materiálu. V pochybných prípadoch sa analýza opakuje niekoľkokrát počas 2-3 týždňov.

Metóda môže odhaliť vegetatívne a cystické formy:

• lamblia;
• balantidium;
• dysenterická améba.

Spolu s patogénnymi formami sú identifikované aj nepatogénne prvoky. Aj u zdravých nosičov existujú luminálne a cystické formy.

Dôležité:výskum by sa mal vykonávať opakovane, aby sa predišlo nepresnostiam a chybám.

Výsledok diagnostiky prvokov pomocou metódy natívneho a farbeného náteru by mal obsahovať popis formy patogénu (luminál, cysta, tkanivo).

Požiadavky na výskum:

• materiál odobratý na analýzu (tekuté výkaly) sa vyšetrí najneskôr 30 minút po defekácii;
• formalizovaná stolica musí byť diagnostikovaná do 2 hodín po defekácii;
• materiál by nemal obsahovať nečistoty (dezinfekčné prostriedky, voda, moč);
• na prácu s materiálom používajte iba drevené palice, sklenené nie sú vhodné kvôli šmýkaniu hlienu;
• Tyčinky je potrebné ihneď po použití spáliť.

Konzervačná metóda (vyšetrenie stolice) na diagnostiku prvokov

Štúdia sa uskutočňuje fixáciou prvokov pomocou konzervačnej látky. Rozdiel medzi touto metódou a predchádzajúcou je v tom, že konzervačné látky vám umožňujú uchovávať liek na dlhú dobu.

Použité konzervačné látky:

• Barrow. Obsahuje konzervačné zložky: 0,7 ml chloridu sodného, ​​5 ml formalínu, 12,5 ml 96% alkoholu, 2 g fenolu a 100 ml destilovanej vody. Farbiace zloženie: 0,01% roztok tionínu (azura).
• Safarlievovo riešenie. Zloženie: 1,65 g síranu zinočnatého, 10 ml formalínu, 2,5 g kryštalického fenolu, 5 ml kyseliny octovej, 0,2 g metylénovej modrej, 100 ml vody. Tento konzervačný prostriedok sa používa v prípadoch, keď sa materiál musí skladovať dlhšie ako mesiac.

Prázdne fľaše sa naplnia konzervačným prostriedkom, materiál sa do nich prenesie v pomere 3:1, v prípade potreby sa pridá farbivo. Výsledky sa hodnotia štúdiom 2-3 liekov.

Metóda obohatenia formalínom a éterom (analýza prítomnosti prvokov vo výkaloch)

Táto diagnostická metóda umožňuje oddeliť a koncentrovať cysty prvokov. Na analýzu sú potrebné tieto zložky: formaldehyd (10 ml), 0,85 g izotonického roztoku, destilovaná voda, sírový éter, Lugolov roztok.

Zmes biomateriálu s uvedenými kvapalinami sa premieša a odstredí. Sediment získaný na dne skúmavky sa zafarbí Lugolovým roztokom a vyšetrí sa na prítomnosť cýst a vegetatívnych foriem.

Metóda detekcie Leishmania (náter z kostnej drene)

Na diagnostiku leishmaniózy sa používajú nasledujúce činidlá: Nikiforovova zmes (éter síry a etanol), fosfátový pufor, Azur-eozín podľa Romanovského.

Látka kostnej drene sa po špeciálnej príprave veľmi opatrne umiestni na podložné sklo. Používa sa mikroskop s imerzným systémom.

Počas akútneho obdobia ochorenia sa v punktáte nachádza veľké množstvo leishmánií.

Poznámka:Niekedy krvné bunky môže pripomínať spracovanú Leishmániu, preto je veľmi dôležité, aby bol laboratórny technik opatrný a mal dostatočné skúsenosti na vykonávanie nezávislého výskumu.

Metóda detekcie leishmánie v nátere z kožného infiltrátu

Požadované činidlá sú podobné predchádzajúcej analýze.

Testovaný materiál sa získa z existujúceho tuberkulózneho alebo ulcerózneho obsahu. Pri podozrení na leishmaniózu sa škrabanie robí veľmi opatrne skalpelom, bez krvi. Potom sa prípravok pripraví na sklo. Na zabezpečenie presnosti získaných výsledkov sa súčasne skúma niekoľko prípravkov.

V prítomnosti ochorenia sa leishmánia deteguje aj medzi makrofágmi, fibroblastmi a lymfoidnými bunkami prítomnými v testovanom materiáli.

Spôsob izolácie čistej kultúry Leishmania získanej zoškrabaním patologických tkanív

Pri tejto metóde diagnostiky prvokov sa tkanivové škrabance umiestnia do špeciálneho živné médium, pri ktorej dochádza k aktívnej reprodukcii Leishmania.

Pred odberom škrabania sa koža dôkladne ošetrí alkoholom, potom sa urobí rez do tuberkulózy, z ktorej sa odstráni obsah a umiestni sa do skúmavky s médiom. Materiál sa odoberie niekoľkokrát, potom sa umiestni do rôznych skúmaviek. Potom prebieha kultivácia v termostate pri teplote 22-24 stupňov. Výsledky sa hodnotia pod mikroskopom. Táto metóda sa používa vtedy, keď sú iné, lacnejšie a rýchlejšie metódy diagnostiky prvokov neúčinné.

Ako sa v praxi dešifrujú testy na prítomnosť prvokov pomocou kvapky krvi, si môžete pozrieť vo videorecenzii:

Lotin Alexander, lekársky publicista

Metódy helmintologický výskum sa delia na priame a nepriame. Priame metódy: detekcia samotných helmintov, ich fragmentov, vajíčok, lariev vo výkaloch, moči, dvanástnikových sekrétoch, spúte, nazálnom a vaginálnom hliene, obsahu subunguálnych priestorov, bioptované kúsky tkaniva. Nepriame metódy: identifikácia sekundárne zmeny vznikajúce v ľudskom tele v dôsledku vitálnej aktivity parazita, sérologických reakcií, všeobecný výskum krv, moč. Najbežnejšie metódy na vyšetrenie výkalov sú helminthovoskopické a protozooskopické. Pri diagnostike nie je možné identifikovať vajíčka alebo larvy všetkých druhov helmintov žijúcich v nich zažívacie ústrojenstvo osoba. Pri použití flotačnej metódy teda vajíčka motolice a v niektorých prípadoch aj neoplodnené vajíčka škrkaviek neplávajú do povrchového filmu (kvôli ich vysokej špecifickej hmotnosti). Je veľmi zriedkavé nájsť vajíčka červov a onkosféry taenidov vo výkaloch, ktoré sa zisťujú pomocou špeciálnych výskumných metód: zoškrabanie z perianálnych záhybov pre červy a taeniidy, sedimentačné metódy pre motolice (vajíčka opistorchidov atď.). Preto pri cielenom vyšetrení pacienta na helmintické infekcie musí lekár v odporúčaní uviesť, na ktorých helmintov sa má zamerať (diagnostika), čo laborantovi umožní zvoliť vhodnú techniku ​​na identifikáciu tohto typu helmintov. Výkaly odobraté z rôzne miesta stolicu v množstve najmenej 50 gramov (čajová lyžička) v čistej sklenenej nádobe je potrebné zaslať do laboratória najneskôr do 24 hodín po defekácii a v deň prevzatia vyšetriť. Ak je potrebné konzervovať stolicu do ďalší deň umiestnite na chladné miesto (0-4°C) alebo naplňte niektorým z konzervačných látok. Pred vyšetrením sa stolica premieša tyčinkou, aby sa vajíčka helmintov rovnomerne rozložili celková hmotnosť. Ak sa v prípravku nájdu vajíčka akéhokoľvek helminta, prezeranie sa nezastaví, pretože môže dôjsť k dvojitej alebo trojitej invázii. Sledovanie účinnosti liečby helmintových infekcií sa vykonáva vyšetrovaním vajíčok hlíst vo výkaloch 2-3 týždne alebo 2-3 mesiace po liečbe, v závislosti od zisteného helminta. Makroskopické metódy sa používajú na detekciu celých dospelých helmintov alebo ich fragmentov vo výkaloch voľným okom alebo pomocou ručnej lupy. Na povrchu výkalov po defekácii je často možné vidieť aktívne lezúce červy; škrkavky sa vylučujú výkalmi; Niekedy si ľudia sami všimnú prechod helmintov. U pacientov s diphyllobotriázou sa môžu vylučovať fragmenty pásomnice strobili (vo forme „rezancov“) a u tých, ktorí sú infikovaní taeniidmi (bravčová alebo hovädzia pásomnica), segmenty helmintov často odchádzajú s výkalmi (vo forme „bielych odrezkov“). “) alebo aktívne vyliezajú z konečníka. Makroskopická metóda je hlavnou metódou na diferenciálnu diagnostiku taeniasis a taeniarynchózy (v kombinácii s prieskumom). Zo špeciálnych makroskopických metód sa používa metóda sekvenčného premývania výkalov. Výkaly sa zmiešajú vo vode, aby sa získala jednotná suspenzia, a potom sa pri dobrom osvetlení starostlivo skúmajú v oddelených malých častiach v čiernych fotografických kyvetách alebo na tmavom pozadí v Petriho miskách. Pomocou pinzety alebo pitevnej ihly odstráňte všetky podozrivé biele častice, veľké útvary podozrivé z úlomkov helmintov a preskúmajte ich pod lupou medzi dvoma sklíčkami. Malé helminty alebo hlavy pásomníc sa vyšetrujú pod lupou v kvapke glycerínu alebo pod mikroskopom. Pri použití tejto metódy na diagnostikovanie segmentov bravčovej, hovädzej pásomnice a širokej pásomnice sa umyté segmenty vložia medzi dva poháre a pri pohľade na svetlo pod lupou alebo mikroskopom s malým zväčšením sa druh určí podľa štruktúry maternica (v zrelom segmente bravčová pásomnica Z centrálneho kmeňa sa tiahne 8-12 bočných vetiev a u hovädzej pásomnice je 18-32, častejšie 28-32; u širokej pásomnice sú segmenty širšie a maternica v strede má tvar „ rozeta“). Ak je maternica ťažko viditeľná, môže sa najprv nejaký čas uchovávať v 50% roztoku glycerínu, po ktorom je možné jasne vidieť aj prázdne kmene maternice. Pri identifikácii týchto cestód podľa štruktúry oddelených hlavičiek sa tieto opatrne umiestnia krkom do kvapky glycerínu medzi sklíčka (alebo sa prekryjú krycím sklíčkom) a bez stláčania sa skúmajú pod mikroskopom pri malom zväčšení.

Mikroskopické metódy sa delia na jednoduché, zložité a špeciálne.

Medzi jednoduché patria metódy natívneho náteru, natívneho náteru Lugolovým roztokom, metódy hrubého náteru pod celofánom podľa Kata, krútenia (podľa Shulmana) a perianálneho škrabania.

Komplexné metódy sú účinnejšie a sú založené na koncentrácii vajec v prípravkoch. Zahŕňajú predbežnú úpravu výkalov kvapalnými činidlami, v dôsledku čoho sa vajíčka helmintov buď vyzrážajú, alebo plávajú na povrch kvapaliny.

TO komplexné metódy metódy obohatenia zahŕňajú:

a) flotácia (keď je špecifická hmotnosť vajec menšia ako špecifická hmotnosť fyziologického roztoku a vajcia plávajú do povrchového filmu);

b) sedimentácia (keď je špecifická hmotnosť vajec väčšia ako špecifická hmotnosť soľných roztokov a vajcia sa usadzujú v sedimente).

Špeciálnymi metódami zisťovania vajíčok a lariev helmintov, cýst a vegetatívnych foriem prvokov sú metódy zoškrabovania, flotácie, sedimentácie, larvoskopie, protozooskopie, vyšetrenia žlče a metódy farbenia náterov výkalov, spúta atď.

Odber vzoriek a konzervácia

Na výskum sa výkaly odoberajú z rôznych miest v dávkach po 50 g a posielajú sa do laboratória v čistej sklenenej alebo plastovej nádobe s pevným vekom. Vyšetrujú sa čerstvé výkaly (nie staršie ako jeden deň) av niektorých prípadoch (pri testovaní na strongyloidózu) ihneď po defekácii. Bolo navrhnutých niekoľko fekálnych konzervačných látok obsahujúcich vajíčka hlíst: 4-10% roztok formalínu, ktorý sa musí zahriať na teplotu 50-60°, aby sa zabránilo vývoju vajíčok háďatiek; zmes 0,2% vodného roztoku dusičnanu sodného (1900 ml), Lugolovho roztoku (5 g jódu, 10 g jodidu draselného, ​​250 ml vody), formalínu (300 ml) a glycerínu (25 ml), v ktorej sú konzervované vajíčka helmintov 6-8 mesiacov; zmes glycerínu (5 ml), formalínu (5 ml) a vody (100 ml); roztoky 1-1,5% detergentov „Lotos“, „Extra“, „Barf“, „Tide“ atď. (v hmotnostnom pomere výkalov a roztoku detergentu 1: 5); zmes mertiolátu 1:1000 (200 ml), formalínu (25 ml), glycerínu (5 ml), destilovanej vody (250 ml) s prídavkom 0,6 ml Lugolovho roztoku (v pomere 1 g stolice na 10 ml). ml zmesi).

Na diagnostiku helmintiáz sa používajú makro- a mikrohelmintoskopické metódy na vyšetrenie výkalov.

Štúdie makrohelmintoskopie

Spôsob usadzovania

Denná dávka výkalov sa dôkladne premieša s 5-10-násobným množstvom vody, naleje sa do vysokých sklenených valcov (pohárov, vedier) a nechá sa, kým sa suspendované častice úplne neusadia. Horná zakalená vrstva sa opatrne scedí a na vrch sa pridá čistá voda (opakujte niekoľkokrát, kým sa voda nad sedimentom nevyjasní). Po odkvapkaní vrchnej vrstvy preneste sediment do kyvety alebo Petriho misky a prezrite si ho (na tmavom pozadí) pod lupou alebo voľným okom.

Skríningová metóda

Výkaly zmiešané s vodou sa umiestnia na horné sito zariadenia, ktoré pozostáva zo sústavy sít s otvormi zmenšujúceho sa priemeru, zariadenie sa napojí na vodovodnú sieť a otvorením vodovodného kohútika sa umyje a tečie kvapalina sa odvádza do kanalizácie. Veľké helminty zostávajú na hornom site, zatiaľ čo menšie sa zadržiavajú na spodnom site. Sitá sa otočia a po premytí obsahu do tmavých kyviet sa skúmajú voľným okom alebo pod lupou.

Mikrohelmintoskopické štúdie

Vykonajte za účelom detekcie vajíčok (helmintovo-ovoskopické metódy - farba. Obr. 1) alebo lariev hlíst (helmintovo-ovoskopické metódy).

Helminthoovoskopické metódy

Kvalitatívne metódy bez obohatenia

Natívny náter. Malé množstvo výkalov sa rozomelie na podložnom sklíčku v kvapke 50% roztoku glycerínu alebo prevarenej vody. Veľké častice sa opatrne odstránia, zmes sa prekryje krycím sklíčkom a skúma sa pod mikroskopom (vyšetria sa dva nátery). Je pohodlnejšie a jednoduchšie pripraviť dlhé šmuhy medzi dvoma sklenenými sklíčkami. Natívny náter sa používa iba ako doplnok k metódam obohacovania, pretože nie je dostatočne účinný, najmä pri slabých zamoreniach.

Hustý poter celofánom podľa Kato(K. Kato, 1954) je veľmi efektívna metóda výskumu. Kúsky hydrofilného celofánu (veľkosť 4 x 2 cm) sa namočia na 24 hodín do zmesi glycerínu (50 ml), 6 % roztoku fenolu (500 ml) a 3 % vodného roztoku (6 ml) zeleného malachitu (druhý je voliteľný). ). OK. 100 mg fekálií sa rozotrie na podložné sklíčko a prikryté kúskom vlhkého celofánu stlačí gumenou zátkou č. 5. Prípravok sa skúma po 30 – 60 minútach, keď mierne zaschne a vyčíri. výsledkom čoho sú vajíčka helmintov ľahko detekovateľné pod mikroskopom s malým zväčšením.

Kvalitatívne metódy s obohatením (metódy plávania a usadzovania)

Prvé sú založené na použití nasýtených roztokov rôznych chemikálií. látky, v ktorých vajíčka plávajú v dôsledku rozdielov v špecifickej hmotnosti.

Metóda Kofoid-Barber(Ch.A. Kofoid, M.A. Barber) upravené Fullebornom (F. Fulleborn, 1920). OK. 5 g výkalov vo vysokej a úzkej nádobe (objem 100 ml) rozmiešame drevenou tyčinkou v 100 ml nasýteného roztoku stolová soľ, poraziť jeho hmotnosť je 1,18 (400 g soli sa rozpustí varením v 1 litri vody). Veľké častice, ktoré vyplávajú na povrch, sa rýchlo odstránia tyčinkou alebo papierom. Po usadení zmesi po dobu 45-90 minút. Pomocou drôtenej slučky (priemer 0,8-1 cm) odstráňte všetok povrchový film a preneste ho na podložné sklíčko. Pri testovaní vajíčok háďatiek sa zmes nechá 10-15 minút odstáť. Fóliu môžete odstrániť priamo podložným sklom, nádobu prikryte tak, aby sa dostala do kontaktu s tekutinou (na okraje nádoby sa pridá nasýtený roztok soli). Po usadení sa podložné sklíčko vyberie, rýchlo prevráti a film s prilepenými vajíčkami hlíst sa skúma pod mikroskopom (bez krycieho skla). Táto metóda je dobrá pri identifikácii vajíčok všetkých háďatiek a trpasličích pásomníc. Vajcia ťažkej motolice; Väčšina cestodóz a neoplodnených škrkaviek zle pláva, preto sa skúma aj sediment. Aby sa to dosiahlo, po odstránení filmu sa kvapalina z nádoby rýchlo vypustí a niekoľko kvapiek sa odoberie zo sedimentu pomocou slučky alebo pipety, prenesie sa na podložné sklíčko, pridá sa kvapka glycerolu na vyčírenie a skúma sa pod mikroskopom. mikroskop.

Metóda E. V. Kalantaryan(1938) je efektívnejšia modifikácia Fullebornovej metódy. V nej je roztok kuchynskej soli nahradený nasýteným roztokom dusičnanu sodného, ​​sp. hmotnosť je 1,39 (jeden objem dusičnanu sodného sa pri varení rozpustí v rovnakom objeme vody), film sa odstráni po 20-30 minútach.

Používajú sa aj metódy Fausta (E. S. Faust, 1939), Brudastovej a kol. (1970) a ďalšie.

Na uloženie vajíčok helmintov sa používajú chemikálie. látky, ktoré rozpúšťajú tuky a bielkoviny vo výkaloch.

Telemannova metóda (W. Telemann, 1908) upravená Miyagawom (Y. Miyagawa, 1913). OK. 5 g výkalov sa rozomelie v mažiari alebo nádobe, pridá sa 5 ml etyléteru a 50% soľný roztok; zmes sa prefiltruje cez drôtené alebo vlasové sitko do skúmavky a odstredí. V skúmavke sa vytvoria 3 vrstvy: na vrchu - éter s rozpusteným tukom, dole - kyselina chlorovodíková s rozpustenými bielkovinovými látkami, v sedimente - nerozpustné časti výkalov a vajíčok helmintov. Horné vrstvy sa odčerpajú a k zrazenine sa pridá voda a odstredí sa. Niekoľko kvapiek sedimentu sa prenesie na sklíčko a skúma sa pod mikroskopom. Táto metóda dokáže odhaliť vajíčka všetkých druhov helmintov, no niekedy sú deformované.

Ritchieho metóda (L. S. Kitchie, 1948). Formaldehyd a éter sa používajú na rozpúšťanie tukov a bielkovín.

Na vyzrážanie vajíčok helmintov možno použiť rôzne čistiace prostriedky. V zahraničí sa rozšírila filtračná metóda v špeciálnych Bellových prístrojoch, ktorá sa používa na štúdium nielen výkalov, ale aj moču, krvi atď.

Existuje množstvo metód kombinujúcich princípy flotácie a sedimentácie vajec. Patria sem metódy S. A. Lanea, D. Rivasa, Gorkina a S. T. Darlinga. Jednu z týchto flotačno-sedimentačných metód, ako aj metódu sekvenčných drénov, navrhol N. V. Demidov (1963, 1965) pre výskum fascioliázy a dikroceliózy.

Kvantitatívne metódy

Stollova metóda(N. R. Stoll, 1926). Decinormálny roztok hydroxidu sodného sa naleje do odmernej širokej skúmavky alebo banky (s dvoma značkami: 56 a 60 ml) po prvú značku, pridáva sa výkal, kým hladina kvapaliny nedosiahne druhú značku, dôkladne sa premieša sklenenou tyčinkou a vložte 10 sklenených guľôčok alebo malých kamienkov, zazátkujte a pretrepávajte 1 minútu. Rýchlo, aby sa suspenzia neusadila, odoberte 0,075 ml zmesi (0,005 g výkalov) odmernou pipetou, preneste na podložné sklíčko s nanesenou mriežkou, prikryte krycím sklíčkom a spočítajte vajíčka helmintov v prípravku pod mikroskopom; Vynásobením výsledného čísla číslom 200 sa získa počet vajec v 1 g výkalov. Pre presnejší výsledok spočítajte vajcia v dvoch alebo viacerých prípravkoch a vezmite priemer. Metóda Stoll je necitlivá na mierne invázie. Preto sa odporúča počítať počet vajec v pripravených prípravkoch rôzne metódy flotácia alebo sedimentácia, s výhradou neustáleho používania rovnakej časti výkalov a misiek rovnakého objemu. Používa sa aj hustý Kato náter.

Bobria metóda(R. S. Bobor, 1950). Pripraví sa štandardný náter, ktorého hrúbka sa určí pomocou elektrofotometra a potom sa spočítajú všetky vajíčka helmintov v ňom.

Helmintolarvoskopické metódy

Behrmannova metóda(G. Baermann, 1917). 5 – 10 g čerstvo vylúčených výkalov sa umiestni na kovovú sieťku v sklenenom lieviku s gumenou hadičkou so svorkou na užšom konci. Aby sa zabránilo kontaminácii sedimentu časticami výkalov, odporúča sa položiť papier (na sieťku) alebo pridať do výkalov živočíšne uhlie alebo kukuričnú múku. Lievik sa naplní teplou vodou (t° 45-50°), kým nepríde do kontaktu s výkalmi. V dôsledku termotropizmu sa larvy aktívne sťahujú teplá voda a postupne sa hromadia v spodnej časti lievika, nad svorkou. Po 3-4 hodinách sa svorka otvorí, kvapalina sa vypustí do 1-2 skúmaviek, odstredí sa 2-3 minúty, vrchná vrstva sa scedí a sediment sa skúma na podložnom sklíčku pod mikroskopom.

Spôsob identifikácie schistozómových miracidií. Feces sa umyjú v tme pri teplote 8-10 °, sediment sa uchováva 45 minút. pri jasnom svetle pri t° 28°, potom nalejte do tmavej banky so slamkou na boku. Miracidia sú sústredené v priehľadnej bočnej trubici, odkiaľ sa dajú vyberať.

Na identifikáciu lariev machovca sa tiež používajú metódy podľa Fulleborna a kol.

Metódy na štúdium iných sekrétov, ako aj tkanív a orgánov

OK. 100 ml testovaného moču sa nechá 30 minút odstáť. vo valci a po odstránení vrchnej vrstvy nalejte 10-15 ml sedimentu do skúmavky, centrifugujte pri 1500 ot./min. počas 1-2 minút; skúma sa sediment. Je vhodné odobrať celú dennú porciu moču.

Urogenitálna schistosomiáza je diagnostikovaná identifikáciou miracidií. Časť čerstvého moču sa odstreďuje 5 minút, sediment sa naleje do čierno natretej banky s priehľadnou sklenenou trubicou priletovanou na vrchu. Pridajte vodu v pomere 1:5, 1:10 a vložte do termostatu na 25-30° na 2 hodiny. Miracidia vychádzajúce z vajíčok sú viditeľné cez priehľadnú trubicu voľným okom vo forme rýchlo sa pohybujúcich bodiek. Pri chronickej forme schistosomiázy pacienti ku koncu močenia uvoľňujú krv, ale vajíčka sa v moči nachádzajú len zriedka, preto sa odporúča uchýliť sa k biopsii močového mechúra.

Vyšetrenie spúta. Spútum môže obsahovať vajíčka paragonimu, schistozómy, tominxy, larvy migrujúcich háďatiek a fragmenty echinokokového močového mechúra. Celá dodaná časť spúta sa starostlivo skúma voľným okom alebo pod lupou, vyberú sa a preskúmajú sa všetky viditeľné zvyšky tkaniva, hrdzavé nahromadenia atď.; potom celú časť naskenujte šmuhami. Hnisavý spút nalejte rovnaké množstvo 0,5 % žieravého alkalického roztoku, odstredte a skontrolujte zrazeninu.

Pri niektorých helmintiázach sa pozoruje spútum charakteristické zmeny. Napríklad pri paragonimiáze v spúte možno nájsť nahromadenie vajíčok vo forme žltkastých hrudiek, ako aj veľké množstvo hlienu, leukocytov, červených krviniek, alveolárnych buniek, Kurschmannových špirál, elastických vlákien, Charcot-Leydenových kryštálov. . Odhalili sa aj charakteristické kryštály v tvare diamantu so zahrotenými koncami. Dostupnosť veľké číslo eozinofily umožňujú odlíšiť paragonimiázu od tuberkulózy.

Vyšetrenie obsahu abscesov a bodiek. IN hnisavý výtok abscesoch, ako aj v nádoroch a cystách odstránených počas operácie, možno nájsť helminty, ich fragmenty, larvy a vajíčka (echinokoky, alveokoky, sparganum, cysticercus, dirofilaria, škrkavky, toxokara, paragonimus atď.). Technika výskumu je obvyklá; v niektorých prípadoch sa histologické rezy pripravujú z nádorového tkaniva. Hnisavý obsah možno liečiť pomocou Telemannovej metódy; číra kvapalina sa skúma rovnakým spôsobom ako obsah dvanástnika pridaním éteru síry. Echinokoková tekutina sa odstredí a sediment sa vyšetrí na prítomnosť scolexu a háčikov; Prípravky sa farbia karbolfuchsínom podľa Ziehla-Neelsena.

Krvný test. V krvi sa nachádzajú mikrofilárie a larvy migrujúcich háďatiek. Z prsta alebo ušného lalôčika sa odoberie kvapka krvi a vyšetrí sa čerstvá alebo sa z nej pripravia prípravky.

Kvapka krvi sa umiestni na sklíčko s naneseným štvorčekom vazelíny a zľahka sa pritlačí krycím sklíčkom. Pod mikroskopom sú viditeľné mikrofilárie pohybujúce sa medzi krvinkami. Krv môže byť umiestnená medzi dve vrstvy lepiacej celulózovej pásky; mikrofilárie zostávajú pohyblivé počas 6 hodín; v úplne vysušenom prípravku sa dajú rozlíšiť pod mikroskopom do 30 dní. Druhy Microfilariae možno identifikovať iba v zafarbených škvrnách alebo hustých kvapkách. Pripravené preparáty sa sušia, hemolyzujú a farbia podľa Romanovského - Giemsa, Wright, Ziehl-Neelsen, Leishman, Papanicolaou (pozri metóda farbenia Wright, metóda Romanovsky-Giemsa, metóda Ziehl-Neelsen). Po zistení mikrofilárií v kvapke krvi zafarbenej podľa Romanovského-Giemsa sa prípravok dodatočne zafarbí Hansenovým hematoxylínom; za 15-60 minút. umývajte 2 minúty. v tečúcej vode. Prefarbený prípravok sa diferencuje v 0,2 % soľnom roztoku; Plášť mikrofilárií je natretý svetlofialovou farbou a jadrová látka tela je tmavofialová.

Pri miernom zamorení je potrebné vyšetriť 2-10 ks krvi antikoagulantom (napr. 5% rozt. citrát sodný) pomocou jednej z nasledujúcich metód.

Knottova metóda (J. Knott, 1939), upravená Markell a Voge (E.K. Markell, M. Voge, 1965). 2 ml krvi sa zmiešajú v centrifugačnej skúmavke s 10 dielmi 1% kyseliny octovej, centrifugujú sa 2 minúty. pri 1500 otáčkach za minútu; povrchová vrstva sediment sa rozloží na niekoľko podložných sklíčok a skúma sa pod mikroskopom. Prípravky je možné farbiť pomocou Romanovského-Giemsa alebo iných metód.

Bellova filtračná metóda (D. R. Bell, 1967). V aparatúre pozostávajúcej z lievika z nehrdzavejúcej ocele s pravouhlým otvorom a membránových filtrov rovnakého tvaru, s rozmermi 19 x 42 mm, s veľkosťou pórov 0,8 až 5 μm, krv hemolyzovaná v zmesi 1 ml tipolového detergentu a 9 ml roztoku fiziolu (na urýchlenie filtrácie je zariadenie napojené na vákuovú pumpu). Filter sa fixuje vo vriacej destilovanej vode a farbí sa Romanovského-Giemsa alebo Ehrlichovým horúcim hematoxylínom. Farebný filter sa suší v exsikátore alebo v izopropylalkohole (postupne v 3 šálkach), čistí sa na skle s imerzným olejom a skúma sa pod krycím sklíčkom. Farebné prípravky vydržia niekoľko týždňov. Bellova metóda je najúčinnejšia na kvantitatívne zaznamenávanie mikrofilárií v krvi.

Používa sa tiež Goldsmidova polyvidónová metóda.

Vyšetrenie kože. V koži možno nájsť mikrofilárie onchocerkov a larvy zvieracích helmintov, ktoré spôsobujú kožná forma larva migrans(cm). Rezy kože alebo materiál získaný skarifikáciou sa odoberajú zo stehna, lýtka, sedacieho alebo deltového svalu. Kužeľovitý kus epidermis sa zdvihne entomologickým špendlíkom a odreže sa žiletkou a skúma sa na skle v kvapke fyziologického roztoku. O negatívny výsledokčerstvý prípravok sa znovu preskúma po 10 minútach; Larvy sú zvyčajne lokalizované na okrajoch prípravku. Výsledný materiál sa môže uchovávať v 2 ml roztoku fiziolu počas 1-2 hodín. a preskúmajte sediment. Pacientovi sa odporúča odobrať 5 rezov kože.

Prípravky možno pripraviť aj z krvi a tkanivovej tekutiny uvoľnenej po silnom stlačení rezov. Kvapky sa farbia podľa Mayera, Romanovského-Giemsa alebo Delafieldovho hematoxylínu.

Štandardná metóda na kvantifikáciu zamorenia. Biopsia oblasti kože priem. 3-5 mm a vážiace aspoň 1-4 mg, odvážte, nakrájajte na malé kúsky a spočítajte larvy pod mikroskopom vo fyziol. roztok na podložnom skle; 1-4 larvy v zornom poli sú označené znakom +, 5-9 lariev znakom ++, 10-19 znakom +++, 20 a viac znakom + + + +. Je vhodnejšie vykonať kvantitatívne výpočty na farebných prípravkoch.

Testovanie na trichinelózu, cysticerkózu a schistosomiázu

Detekcia lariev Trichinella

Kompresná metóda. Kúsok dvojhlavého resp lýtkový sval(v blízkosti šľachy), odobratý chirurgicky s použitím asepsie, sa rozštiepi na oddelené tenké vlákna pomocou pitevných ihiel, vytlačí sa medzi dve podložné sklíčka v kvapke glycerínu tak, aby bol prípravok tenký a priehľadný. Pod mikroskopom s tmavým zorným poľom sú dobre viditeľné larvy Trichinella. Je efektívne študovať niekoľko kusov svalov v kompresoroch používaných vo veterinárnej medicíne. prax, najmä v špeciálnych trichineloskopoch.

Bechmanova metóda trávenia(G. W. Bachman, 1928). 1 a rozdrvené svaly sa zalejú 60 ml umelej žalúdočnej šťavy (0,5 g pepsínu; 0,7 ml koncentrovanej kyseliny chlorovodíkovej; 100 ml vody) a nechajú sa 18 hodín. v termostate pri t° 37°; vrchná vrstva kvapaliny sa vypustí, k sedimentu sa pridá teplá voda (t° 37-45°) a naleje sa do Behrmannovho prístroja. Po hodine sa kvapalina vypustí do skúmavky, odstredí sa a sediment sa preskúma. Ak sú larvy uzavreté vo zvápenatených tobolkách, najskôr sa odvápnia v roztoku kyseliny chlorovodíkovej, dusíka alebo sírovej.

Biotest. Kúsky skúmaných svalov sa kŕmia bielymi myšami alebo potkanmi. Po 2-3 dňoch sa v obsahu dvanástnika môžu nachádzať pohlavne zrelé trichinely a po 2-3 týždňoch larvy vo svaloch bránice a jazyka.

Histologické rezy. Svalové časti sú fixované v Bouinovej, Zenkerovej alebo inej tekutine; obvyklým spôsobom Rezy sa pripravia na mikrotóme a zafarbia sa Delafieldovým hematoxylínom.

Detekcia cysticercií

Voľným okom sa vyšetruje kúsok exstirpovaného svalu, väziva a pod., opatrne sa izoluje cysticercus - belavý priesvitný mechúrik veľký 1-2 cm, rozdrví sa medzi dvoma podložnými sklíčkami v kvapke glycerínu a vyšetrí sa pod mikroskopom. . Na stanovenie životaschopnosti cysticerkov izolovaných z tkanív sa uchovávajú v 50% roztoku žlče pre fyziol. roztok v termostate pri t° 37°; za 10-60 minút. hlava životaschopného cysticerku sa otočí smerom von. Zvápenatené cysticery sa predbežne hodinu odvápňujú 4% roztokom kyseliny dusičnej.

Detekcia schistozómových vajíčok

Pri hrone, formách schistosomiázy, kedy tvorba granulómov bráni uvoľneniu vajíčok z tkanív do lúmenu čreva alebo do močových ciest, sa využíva biopsia sliznice konečníka, ktorá sa vykonáva špeciálnou lyžičkou pomocou rektoskopu, výber oblasti s viditeľnou léziou. Biopsia sa rozdrví medzi dvoma sklenenými sklíčkami a skúma sa pod mikroskopom. Ak je výsledok negatívny, kúsky sa vyčíria v 4% roztoku lúhu a pripraví sa z nich histol. plátky. Orálne sa robí biopsia jejunálnej sliznice a výsledný materiál sa vyšetruje kompresnou metódou alebo sa z neho pripravia histolové rezy. V niektorých prípadoch genitourinárnej schistosomiázy možno diagnózu stanoviť len na základe endovesikálnej biopsie. Pri hepatolienálnej forme schistosomiázy sa vykonáva punkčná biopsia pečene; Z výsledného materiálu sa pripraví histol a rezy, ktoré sa skúmajú pod fluorescenčným mikroskopom. Fluorescenčný mikroskop s tmavým poľom sa používa aj na vyšetrenie tkaniva pečene na schistozómové vajíčka. Ak je ženský pohlavný trakt postihnutý schistozómami, výtok sa odoberie pomocou vaginálneho zrkadla alebo sa odoberú kúsky sliznice krčka maternice ostrou lyžičkou; výsledný materiál sa skúma pod mikroskopom na skle v kvapke roztoku fiziolu.

Testovanie na enterobiázu a taeniazu

Perianálne škrabanie (odporúča sa užívať večer, 1 - 1,5 hodiny po tom, ako pacient ide spať, alebo ráno pred toaletou). So zápalkou, šikmo narezanou a navlhčenou v kvapke tekutiny (fyziol, roztok, prevarená voda alebo 2% roztok sódy bikarbóny), nanesenej na podložné sklíčko, robím to opatrne? škrabanie zo sliznice konečníka a záhybov okolo nej (od stredu smerom von). Hlien nazbieraný na konci zápalky sa zoškrabe okrajom krycieho sklíčka do kvapky tekutiny na podložnom sklíčku a prikryté rovnakým krycím sklom sa vyšetrí. Pri hromadných vyšetreniach, pri odberoch zoškrabov v detských alebo iných ústavoch, sa použitá zápalka vloží do kvapky tekutiny na podložné sklíčko, po zaschnutí kvapky sa prekryje ďalším podložným sklom a zabalená sa dopraví do laboratória. papier a zaistite gumičkou. Na štúdium rektálneho hlienu používajú špeciálny prístroj – Shachmatovovu alebo Ziemannovu trubicu, pomocou ktorej odoberajú hlieny z konečníka a skúmajú šmuhy pod mikroskopom.

Metóda vatového tampónu. Pacienti dostanú skúmavku s vatovým tampónom na sklenenej alebo drevenej tyčinke, ktorú si odnesú domov; ráno si pacient utrie perianálne záhyby navlhčeným tampónom prevarená voda a umiestnite ho do skúmavky s malým množstvom vody. V laboratóriu sa výtery prepláchnu v tej istej skúmavke novou dávkou vody a sediment sa po odstredení skúma.

Hallova celofánová metóda (M. S. Hall, 1937). Štvorcový kus celofánu je pripevnený gumičkou na sklenenej tyči. Zoškrabanie sa urobí suchým celofánom a umiestni sa do skúmavky. V laboratóriu sa celofán z tyčinky mierne posunie a po odstrihnutí hrotu nožnicami sa narovná na podložnom skle; navlhčeným v desaťnormálnom roztoku hydroxidu sodného, ​​prikrytý krycím sklíčkom a skúmaný pod mikroskopom.

Grahamova metóda celulózovej pásky (S. F. Graham, 1941). Prúžok celulózovej pásky sa pritlačí lepiacou stranou k perianálnym záhybom subjektu, potom tou istou stranou k podložnému sklíčku a skúma sa bez krycieho skla; Môžete pridať kvapku toluénu. V. V. Kaledin (1972) na tieto účely navrhol použitie celuloidových diskov vyrezaných z umytého röntgenového filmu a navlhčených glycerínom; disky sa skúmajú na podložnom sklíčku v kvapke silikátového lepidla. Metódu celulózovej pásky možno použiť aj na vyšetrenie detskej bielizne.

Subungválne škrabanie. Okraje nechtu, nechtového lôžka a subungválnych priestorov sa navlhčia 0,5-1% roztokom žieraviny a utrie sa vlhkými vatovými tampónmi. Výtery sa umiestnia do centrifugačných skúmaviek s rovnakým roztokom, odstredia sa a sediment sa vyšetrí.

Metódy štúdia predmetov životné prostredie pre vajíčka a larvy helmintov (sanitárne a helmintologické štúdie)

Vykonáva sa výskum na určenie stupňa kontaminácie predmetov vajíčkami a larvami helmintov vonkajšie prostredie. Získané údaje slúžia na posúdenie dôstojnosti. stav inštitúcií a podnikov a účinnosť opatrení prijatých na boj proti helmintióze.

Pri štúdiu stupňa kontaminácie rôznych objektov prostredia vajíčkami a larvami helmintov a hodnotení ich úlohy v epidemiológii helmintových infekcií je dôležité stanoviť nielen počet nájdených vajíčok, ale aj ich životaschopnosť a invazívnosť, ktoré sa určujú : a) podľa vzhľadu pod mikroskopom; b) farbenie rôznymi farbivami, vrátane luminiscenčných; živé vajíčka a larvy sa spravidla nenatierajú; c) kultivácia za optimálnych podmienok až do invazívneho štádia; d) infekcia laboratórnych zvierat (biotest).

Štúdie vody a kanalizácie. Na jednu štúdiu použite 10-25 litrov vody (rieky, moria, rybníky, bazény, zásobovanie vodou) a 1-2-5 litrov splaškov.

Metóda 3. G. Vasiľková (1941). Voda alebo odpadová voda sa filtruje cez membránové ultrafiltry v Goldmannovom prístroji, ktorý pozostáva zo skleneného alebo kovového lievika s filtrami pripojenými cez prstencovú dýzu k Bunsenovej banke. Na urýchlenie procesu filtrácie je k zariadeniu pripojené vákuové čerpadlo. Po filtrácii sa membránové filtre skúmajú pod mikroskopom, vyčistia sa 50 % roztokom glycerolu; nahromadený sediment sa vyčistí a oddelene sa vyšetrí vo forme náterov. Používajú sa aj filtračné zariadenia iných prevedení.

Metóda G. Sh. Gudzhabidze a G. A. Yudin (1963) na štúdium kanalizačných tekutín. 1 liter kvapaliny sa nechá 2 hodiny vo valci Lisenko; výsledný sediment (5-9 ml) sa spracuje ako pri testovaní pôdy (pozri nižšie).

Metóda N. A. Romanenko (1967). Do 1 litra odpadovej kvapaliny umiestnenej v sklenenom valci s objemom 1200-1500 ml pridajte 0,4-0,6 g síranu hlinitého alebo chloridu železitého (za účelom koagulácie, urýchlenia procesu sedimentácie suspendovaných častíc) a po 40 minút. zmes sa odstreďuje 3 minúty. pri 1000 otáčkach za minútu; vrchná vrstva sa odkvapká a na rozpustenie vločiek sa pridá 1 – 2 ml 3 % roztoku kyseliny chlorovodíkovej, potom 150 ml nasýteného roztoku dusičnanu sodného. Sediment sa skúma ako pôda.

Výskum pôdy

Kontaminácia pôdy vajíčkami helmintov sa určuje s cieľom identifikovať ohniská helmintiázy a posúdiť účinnosť práce na ich zlepšení.

Metóda 3. G. Vasiľková a V. A. Gefter (1948). 12,5 g pôdy sa zmieša v skúmavkách (objem 100 ml) vyrobených z nehrdzavejúcej ocele alebo mosadze s 20 ml 5% roztoku žieravého alkálií, pričom sa pridá 10 sklenených guľôčok alebo malých kamienkov. Skúmavky sa utesnia gumovými zátkami a pretrepávajú sa 20 minút. v trepačke alebo ručne. Po odstránení zátok sa skúmavky odstreďujú 3-5 minút, povrchová kvapalina sa scedí, k sedimentu sa pridá 60-80 ml nasýteného roztoku dusičnanu sodného a po dôkladnom premiešaní sa opäť 3-5 minút odstreďuje. Tento povrchový film s plávajúcimi vajíčkami sa odstráni dotykom povrchu zmesi zložitou slučkou (5-6 slučiek spojených na spoločnej tyči) a prenesie sa do pohára vody; zmiešať s rovnakým roztokom, odstrediť; Celý postup sa opakuje najmenej 3 krát. Obsah pohára, do ktorého sa film prenesie, sa zriedi vodou a prefiltruje cez membránové filtre, ktoré sa skúmajú pod mikroskopom v kvapke glycerínu.

Metóda 3. G. Vasilková a V. A. Gefter, modifikovaná A. A. Namitokovom (1961), sa líši od hlavnej metódy tým, že namiesto skúmania filmových preparátov sa použije polovica obsahu skúmavky (zakaždým, keď sa pridá nová časť nasýtený roztok dusičnanu sodného), prefiltrujte a skontrolujte filtre.

N. A. Romanenko (1968) odporúča skúmať vzorky pôdy a splaškového kalu na vajíčka helmintov pomocou prístroja navrhnutého G. Sh. Gudzhabidzem. 50 g pôdy sa dôkladne premieša počas 1 minúty. v 150 ml vody v centrifugačných skúmavkách (kapacita 250 ml) so špeciálnymi čepeľami poháňanými elektromotorom. Zmes sa odstreďuje počas 3 minút. pri 1000 ot./min., vypustite vodu a pridajte 150 ml nasýteného roztoku dusičnanu sodného, ​​premiešajte a znova odstreďujte 3 minúty. Skúmavky so vzorkami sa umiestnia do stojana, pridáva sa roztok dusičnanu sodného, ​​kým sa nevytvorí konvexný meniskus, prekryjú sa podložnými sklíčkami (10 x 6 cm) a nechajú sa 10-15 minút, potom sa poháre odstránia a skúmajú; postup sa opakuje najmenej 4 krát.

Výskum lariev helmintov metódou Behrmanna (1917). 200 – 400 g pôdy sa umiestni do kúska gázy na kovovú sieť (s otvormi s priemerom 1 – 2 mm) umiestnenú na širokej časti skleneného lievika namontovaného na statíve. Na úzky koniec lievika je natiahnutá gumová hadička so svorkou. Lievik sa naplní teplou (t° 50°) vodou tak, aby sa spodná časť pletiva s pôdou dostala do kontaktu s vodou. V dôsledku termotropizmu sa larvy aktívne plazia do teplej vody a usadzujú sa v spodnej časti gumovej trubice nad svorkou. Po 3-4 hodinách sa 50 ml obsahu uvoľní z lievika do skúmavky, odstredí sa a sediment sa vyšetrí.

Výskum zeleniny, ovocia a bobúľ

Študujú hlavne zeleninu, bobuľové ovocie a ovocie konzumované bez nich tepelné spracovanie. Metóda 3. G. Vasiľková (1948). 5-10 kusov zeleniny alebo ovocia (cca 0,5 kg) alebo 100-200 g zeleniny (hlávkový šalát, cibuľka) sa niekoľko hodín zaleje vodou v sklenených nádobách so širokým hrdlom so zabrúsenými zátkami a pretrepáva sa 10-20 minút . v trepačke alebo ručne. Voda sa vypustí, skúmané objekty sa opláchnu čistá voda a všetka splachovacia voda je filtrovaná v Goldmannovom prístroji; Filtre sa skúmajú prečistením glycerínom. Filtre môžete tónovať 25% Lugolovým roztokom v glyceríne; v tomto prípade sú vajíčka helmintov zafarbené Hnedá farba a sú ľahko rozpoznateľné medzi škrobovými zrnami, zafarbenými v Modrá farba. S veľkým sedimentom sa zaobchádza ako s pôdou.

Štúdium vymývania z domácich potrieb a rúk. Štetec na lepidlo (alebo vatový tampón obalený v kúsku nylonovej látky) namočený v 2% roztoku sódy bikarbóny sa opakovane prechádza po vyšetrovanom predmete alebo rukách a potom sa v rovnakom roztoku naleje do skúmavky. V laboratóriu sa kefy a tampóny opláchnu čistou vodou; Všetka premývacia voda sa odstredí a sediment sa preskúma.

Metóda V. A. Gefter (1960). Efektívnejšie je zbierať prach z mäkkých zariadení pomocou vysávača pripojeného k lieviku, okraje pozostávajú z 2 odnímateľných častí: na povrchu spodnej časti je umiestnený membránový filter, pokrytý kovovou alebo plastovou sieťkou a zosilnený nasadením vrchná časť lieviky. Zostavený lievik je spojený s hadicou vysávača gumovou hadicou. Prach sa z objektu zbiera 3 minúty, potom sa filter vyberie a vymení za nový. V laboratóriu sa filtre skúmajú pod mikroskopom, čistia sa glycerínom. Ak je vrstva prachu na filtri veľká, zoškrabe sa a zobrazí sa vo forme šmúh alebo sa s ním zaobchádza ako s pôdou.

Imunologické diagnostické metódy

Možnosť použitia imunol. Spôsoby diagnostiky helmintiázy sú spôsobené schopnosťou helmintov produkovať aktívne antigény, ktoré ovplyvňujú imunokompetentné bunky hostiteľa a stimulujú produkciu protilátok. Najúčinnejšie imunodiagnostické metódy sú pri črevnej helmintióze, keď sekréty a výlučky helmintov, ktoré majú antigénnu aktivitu, vstupujú priamo do krvi hostiteľa. Imunálne reakcie sa využívajú na diagnostiku askariózy, trichinelózy, filariózy, schistosomiázy, echinokokózy a alveokokózy, cysticerkózy, paragonimiázy, komplexu symptómov larva migrans (toxokaróza, angiostrongylóza) atď. Používajú sa rôzne sérologické testy (precipitačné reakcie, agglutačné reakcie , fluorescenčné protilátky ) a intradermálne alergické testy. Antigény sa pripravujú z lariev a zrelých helmintov pomocou soľných extraktov z homogenátov čerstvých zmrazených alebo lyofilizovaných tkanív, ako aj rôznych biologicky aktívnych tekutín (tekutina z echinokokových pľuzgierov, brušná tekutina škrkaviek atď.). Vzhľadom na to, že helminty majú veľmi zložitú antigénnu štruktúru a ich antigénna mozaika obsahuje zložky a jednotlivé determinanty, ktoré skrížene reagujú s inými typmi helmintov, baktérií a hostiteľských antigénov, vyvíjajú sa metódy na ich prečistenie od nešpecifických zložiek. Uskutoční sa frakcionácia rôzne metódy: gélová filtrácia v kolónach so Sephadexom, iónomeničová chromatografia na DEAE-Sephadexe, ošetrenie kyselinami atď. Frakčné antigény majú zvyčajne vyššiu špecifickosť ako celé extrakty, ale ich aktivita je približne rovnaká. Imunodiagnostické metódy nájdu všetko väčšie uplatnenie. Reakcie sa používajú nielen na čo najúplnejšiu a včasnú identifikáciu pacientov, ale aj na štúdium ohniskov a štúdium epidemiológie helmintiáz.

Sérologické reakcie. Mikroprecipitačná reakcia na živých larvách sa používa na diagnostiku háďatiek – preimaginálnej fázy askariózy, ankylostomózy a trichinelózy. Reakcia sa stáva pozitívnou 5-10 dní po infekcii (ascariáza, ankylostomóza) a pretrváva 90-100 dní. Antigénom sú živé larvy háďatka izolované z tkanív experimentálne infikovaných laboratórnych zvierat. Izolované larvy sa dôkladne premyjú z hostiteľských proteínov sterilným fyziolom, roztokom a destilovanou vodou, každá po 10-15 kópiách. umiestnite pomocou Pasteurovej pipety na sterilné sklenené podložné sklíčko s jamkou. Naneste 2-3 kvapky testovacieho séra, prikryte sterilným krycím sklom, vložte do vlhkej komôrky (Petriho miska vystlaná navlhčeným filtračným papierom) a nechajte pôsobiť 24-48 hodín. v termostate pri t° 37°. Ak je reakcia pozitívna, pod mikroskopom s malým zväčšením je viditeľná okolo úst a análne otvory larvy sú sivobiele, mierne opalizujúce masy guľovitých alebo cikcakovito tvarovaných precipitátov. Účinnosť reakcie dosahuje 85-95%.

Reakciu zrážania prstenca vyvinul V. P. Pashuk (1957) na diagnostiku trichinelózy. Reakcia sa stáva pozitívnou po 2-3 týždňoch choroby. Jeho účinnosť dosahuje 80-90%. Antigén je práškový extrakt z lariev sušených pri 35°, izolovaný zo svalov infikovaných zvierat. V skúmavkách pr. 0,5 cm, nalejte 0,1 ml z každého riedenia antigénu a opatrne naň navrstvite (alebo spustite na dno) rovnaké množstvo testovacieho séra, aby sa tekutiny nezmiešali. Skúmavky sa uchovávajú 30 minút. v termostate pri t° 37° a potom 30-60 minút. pri izbovej teplote. Pri pozitívnej reakcii sa na rozhraní medzi antigénom a sérom objaví belavý jemný krúžok, ktorý sa pri pretrepaní ľahko rozpadne.

Precipitačnú reakciu v géli podľa Ouchterlonyho (O. Ouchterlony, 1949) v mikromodifikácii A. I. Guseva a V. S. Tsvetkova navrhli I. A. Ginovker, E. A. Zabozlaeva, A. V. Doronin (1970) na diagnostiku skorých fáz opisthorchie. Podľa predbežných údajov je jeho účinnosť 87%. Antigén je extrakt z homogenátu čerstvého zmrazeného sexuálne zrelého opisthorchis izolovaného z pečene mačiek.

Bola vyvinutá reakcia nepriamej hemaglutinácie (pozri) s diagnostikom - suspenziou formalinizovaných a tanizovaných ovčích erytrocytov, senzibilizovaných echinokokovou tekutinou.

L. N. Stepankovskaya (1972) na diagnostiku echinokokózy a alveokokózy.

RNGA s diagnostikom z formalinizovaných ovčích erytrocytov, senzibilizovaných extraktom z homogenátu čerstvých mrazených cysticerov pásomnice bravčovej, navrhla L. M. Konovalová (1973) na diagnostiku mozgovej cysticerkózy; je účinný v 85 % prípadov.

RNGA s ascaris diagnosticum sa navrhuje na diagnostiku preimaginálnej fázy askariózy.

Reakcia fixácie komplementu (pozri) sa uskutočňuje podľa bežnej metódy a používa sa na diagnostiku trichinelózy a cysticerkózy.

Luminiscenčná protilátková metóda (nepriama metóda). Túto metódu s odtučneným suchým homogenátom cysticerci z pásomnice bravčovej ako antigénom fixovaným na podložnom sklíčku vyvinula JI. M. Konovalovej (1973) na diagnostiku ľudskej cysticerkózy. Na diagnostiku trichinelózy bola vyvinutá rovnaká reakcia s histolom, rezmi lariev Trichinella ako antigénom.

E. S. Leikina, V. A. Gefter.

Pri zisťovaní vajíčok helmintov na rôznych objektoch prostredia (pôda, voda, zelenina a pod.) je vždy potrebné zistiť ich životaschopnosť vzhľadom, farbením vitálnymi farbami, kultiváciou v optimálnych podmienkach a vykonaním biologického testu, t.j.

Kŕmenie laboratórnych zvierat.

Stanovenie životaschopnosti vajíčok alebo lariev helmintov podľa vzhľadu. Vajíčka helmintov sa mikroskopujú najskôr pri malom a potom pri veľkom zväčšení. V deformovaných a mŕtvych vajíčkach helmintov je škrupina roztrhnutá alebo ohnutá dovnútra, plazma je zakalená a uvoľnená. V segmentovaných vajíčkach sú drviace gule (blastoméry) nerovnaké veľkosti, nepravidelného tvaru a často posunuté k jednému pólu. Niekedy existujú abnormálne vajíčka, ktoré sa napriek vonkajším deformáciám vyvíjajú normálne. U živých lariev škrkavky je jemná zrnitosť prítomná len v strednej časti tela, odumieraním sa zrnitosť šíri po celom tele a vznikajú veľké lesklé hyalínové vakuoly - takzvané perlové šnúry.

Na stanovenie životaschopnosti zrelých vajíčok škrkaviek, bičíkovcov, škrkaviek by sa aktívne pohyby lariev mali vyvolať miernym zahriatím lieku (na teplotu nepresahujúcu 37 ° C). Vhodnejšie je sledovať životaschopnosť lariev škrkavky a vretenice po ich izolovaní z obalu vajíčka stlačením krycieho skla prípravku pitevnou ihlou alebo pinzetou.

U lariev invazívnych škrkaviek je často vidieť odlupovanie puzdra na hlavovom konci a u lariev bičíkovcov, ktoré ukončili vývoj vo vajíčku, sa na tomto mieste pri veľkom zväčšení nachádza vodič. U mŕtvych lariev helmintov, bez ohľadu na ich umiestnenie (vo vajíčku alebo mimo neho), je zaznamenaný rozpad tela. V čom vnútorná štruktúra Larva sa stáva hrudkovitou alebo zrnitou a telo sa stáva zakaleným a nepriehľadným. V tele sa nachádzajú vakuoly a na kutikule sa nachádzajú zlomy.

Životaschopnosť taeniidných onkosfér (hovädzí, bravčová pásomnica atď.) je určená pohybom embryí, keď sú im vystavené. tráviace enzýmy. Vajíčka sú umiestnené na hodinovom sklíčku so žalúdočnou šťavou psa alebo umelou duodenálnou šťavou. Zloženie posledne menovaného: pankreatín 0,5 g, hydrogénuhličitan sodný 0,09 g, destilovaná voda 5 ml. Poháre hodiniek s vajíčkami sa umiestnia na 4 hodiny do termostatu pri 36-38 C. Súčasne sa živé embryá uvoľnia zo škrupín. Škrupiny živých onkosfér sa rozpúšťajú aj v okyslenom pepsíne a v alkalický roztok trypsínu po 6-8 hodinách v termostate pri 38 °C.

Ak umiestnite taenidové vajíčka do 1% roztoku sulfidu sodného alebo 20% roztoku chlórnanu sodného alebo do 1% roztoku chlórovej vody pri 36-38 °C, zrelé a živé embryá sa uvoľnia z membrán a nezmení do 1 dňa. Nezrelé a mŕtve onkosféry sa zmenšujú alebo napučiavajú a prudko sa zväčšujú a potom sa „rozpustia“ v priebehu 10 minút - 2 hodín Živé embryá taenidov sa tiež aktívne pohybujú v zmesi 1% roztoku chloridu sodného, ​​0,5% roztoku hydrogénuhličitanu sodného a žlče pri 36-38 °C.

Životaschopnosť skolexu echinokokov sa určuje pri nízkom zahrievaní. K tomu sa vo vode premyté tobolky scolexu alebo plodu vložia do kvapky vody na podložné sklíčko s otvorom, prikryjú sa krycím sklíčkom a skúmajú sa pod mikroskopom s vyhrievacím stolíkom pri teplote 38 – 39 °C. Ak nie je k dispozícii vykurovací stôl, liek sa zahrieva pomocou akéhokoľvek zdroja tepla. Súčasne sa životaschopný scolex aktívne pohybuje, sťahuje alebo uvoľňuje prísavky, predlžuje a skracuje proboscis. Ak umiestnite scolex na 0,5-1% vodný roztok filiciléne pri izbovej teplote, potom sa všetky životaschopné scolexy rýchlo ukážu a zomrú. Neživotaschopné scolexy nie sú evertované.

Životaschopnosť Adolescaria fascioli zozbieraných na rastlinách a iných objektoch vodných útvarov sa kontroluje ich skúmaním na podložnom sklíčku vo fyziologickom roztoku pod mikroskopom s vyhrievacím stolíkom. Keď sa larvy trematód zahrejú, začnú sa pohybovať.

Životaschopnosť vajíčok trpasličích pásomníc je určená umiestnením háčikov na embryu.

V živých vajíčkach pásomnice trpasličej dochádza k pomalým kyvadlovým pohybom protoplazmy a takmer nepostrehnuteľnému oddeľovaniu a posúvaniu zahrotených koncov bočného páru háčikov do strán od stredného páru.

Kontrakcie protoplazmy embrya a embryonálnych háčikov pomáhajú embryu uvoľniť sa najskôr z membrán onkosféry a potom z vonkajšieho obalu vajíčka.

V živom vajci sú stredný pár a bočné páry háčikov umiestnené paralelne, v niektorých vajciach sú čepele bočných párov blízko seba a sú umiestnené v uhle menšom ako 45° vzhľadom na stredný pár háčikov.

Umierajúce embryo sa kŕčovito sťahuje a pomaly odďaľuje háčiky. V mŕtvom embryu sa pohyb háčikov zastaví a sú umiestnené neusporiadane; niekedy sú háčiky bočné k susednému páru posunuté od seba v pravom, tupom alebo ostrom uhle.

Niekedy sa pozoruje zvrásnenie embrya a tvorba granulácie. Presnejšia metóda je založená na objavení sa pohybov onkosféry počas prudkej zmeny teploty: od 5-10 do 38-40 ° C.

Stanovenie životaschopnosti nedospelých háďatiek by sa malo študovať vo vlhkej komore (Petriho misky), vajíčka škrkaviek v 3 % roztoku formaldehydu pripraveného v izotonickom roztoku chloridu sodného pri teplote 24-30 °C, vajíčka škrkavky v 3 % roztoku % Riešenie kyseliny chlorovodíkovej pri teplote 30 – 35 °C zašľaháme vajíčka do izotonického roztoku chloridu sodného pri teplote 37 °C. Petriho misky otvárajte 1-3x týždenne kvôli lepšiemu prevzdušneniu a filtračný papier navlhčite čistou vodou.

Pozorovania vývoja vajíčok helmintov sa vykonávajú najmenej 2-krát týždenne. Absencia príznakov vývoja v priebehu 2-3 mesiacov naznačuje ich neživotaschopnosť. Známky vývoja vajíčok helmintov sú najskôr štádiami drvenia, rozdeľovaním obsahu vajíčka na samostatné blastoméry. Počas prvého dňa sa vyvinie až 16 blastomér, ktoré prechádzajú do druhého štádia - morula atď.

Vajíčka húsenice sa pestujú v sklenenom valci (50 cm vysoký a 7 cm v priemere) uzavretom zátkou. Zmes rovnakých objemov sterilného piesku, drevené uhlie a výkaly s vajíčkami machovca, zriedené vodou na polotekutú konzistenciu, sa opatrne nalejú na dno valca pomocou sklenenej trubice. Počas 1-2 dní usadzovania v tme pri teplote 25-30 °C sa z vajíčok vyliahnu rabditiformné larvy, ktoré sa po 5-7 dňoch stanú filariformnými: larvy vylezú po stenách valca, kde sú viditeľné aj voľným okom. Vajíčka trematód, ako sú opisthorchiidy, diphyllobothriidy, fascioly atď., ktoré sa prirodzene vyvíjajú vo vode, sa umiestnia na hodinové sklíčko, Petriho misku alebo do inej nádoby a nalejú sa malou vrstvou obyčajnej vody. Pri pestovaní vajíčok Fasciola treba brať do úvahy, že v tme sa rýchlejšie vyvíjajú, pričom miracidium sa tvorí v živých vajíčkach pri teplote 22-24 °C po 9-12 dňoch. Pri mikroskopovaní vyvíjajúcich sa vajíčok motolice sú pohyby miracidia jasne viditeľné. Miracidium fasciola vychádza zo škrupiny vajíčka iba na svetle. Počas kultivácie sa voda mení po 2-3 dňoch.

Hýdavec a strongyloidné larvy sa kultivujú na agare v Petriho miske so živočíšnym uhlím. Po 5-6 dňoch v termostate pri teplote 26-30 °C sa larvy plazia po agare a zanechávajú za sebou cestu baktérií (Fullebornova metóda).

Metóda Haradu a Moriho (1955). Pridajte 7 ml destilovanej vody do skúmaviek umiestnených na stojane. Pomocou drevenej tyčinky odoberte 0,5 g výkalov a urobte rozmazanie na filtračný papier (15 x 150 mm) 5 cm od ľavého okraja (táto operácia sa vykonáva na hárku papiera na ochranu povrchu laboratórnej lavice). Potom sa prúžok s náterom vloží do skúmavky tak, aby ľavý koniec bez náteru dosiahol dno skúmavky. Horný koniec je pokrytý kúskom celofánu a pevne obalený elastickým pásom. Na skúmavku sa napíše číslo a priezvisko vyšetrovanej osoby. V tomto stave sa skúmavky skladujú 8-10 dní pri teplote 28 °C. Ak chcete študovať kultúru, odstráňte celofánový kryt a vyberte pásik filtračného papiera pomocou pinzety. Pri tomto postupe je potrebné postupovať opatrne, pretože malé množstvo infekčných lariev sa môže presunúť na horný koniec filtračného papiera alebo na stranu skúmavky a preniknúť pod povrch celofánu.

Skúmavky sa umiestnia na 15 minút do horúceho vodného kúpeľa s teplotou 50 °C, potom sa ich obsah pretrepe a rýchlo naleje do 15 ml skúmavky, aby sa larvy usadili. Po odstredení sa supernatant odstráni a sediment sa prenesie na podložné sklíčko, prikryje sa krycím sklíčkom a mikroskopicky sa skúma pri malom zväčšení.

Na diferenciálnu diagnostiku filariformných lariev je potrebné použiť údaje uvedené v tabuľke. 13.

Metódy farbenia vajíčok a lariev helmintov. Mŕtve tkanivá vo väčšine prípadov vnímajú farby rýchlejšie ako živé. Tieto znaky sa používajú v helmintológii na určenie životaschopnosti vajíčok a lariev helmintov. V niektorých prípadoch sú však niektoré farby lepšie vnímané živými tkanivami ako mŕtvymi.

Tabuľka 13. Odlišná diagnóza vláknité larvy A.duodenale, N.americanus, Strongyloides stercoralis, Trichostrongylus spp.

Na rozdielne rozpoznávanie živých a mŕtvych vajíčok a lariev sa používajú nasledujúce farby a metódy.

Leukobase metylénová modrá sa používa na farbenie živých a mŕtvych tkanív. Živá bunka alebo tkanivo redukuje metylénovú modrú na bezfarebnú leukobázu, mŕtve tkanivo túto schopnosť nemá, preto získava farbu.

Na farbenie vajíčok škrkavky môžete použiť metylénovú modrú v roztoku kyseliny mliečnej so žieravinou (0,05 g metylénovej modrej, 0,5 g hydroxidu sodného, ​​15 ml kyseliny mliečnej). Živé vajcia nevnímajú farbu, embryá mŕtvych vajíčok zmodrajú.

Metóda farbenia nie je použiteľná pre nezrelé vajíčka škrkaviek a bičíkovcov; pigmentovaná škrupina je zafarbená, a preto nie je vidieť, či je zárodočná bunka vo vnútri vajíčka zafarbená.

Larvy Ascaris sa farbia zásaditým roztokom brilantnej krezylovej modrej farby v koncentrácii 1:10 000. nasledujúcim spôsobom: na podložné sklíčko sa nanesie kvapka tekutiny s vajíčkami škrkavky a kvapka roztoku hlavnej farby. Preparát sa prekryje krycím sklíčkom, ktoré sa pri miernom poklepávaní pitevnou ihlou tesne pritlačí k preparátu. Počet objavujúcich sa lariev a stupeň ich zafarbenia sa pozoruje pod mikroskopom, potom sa po 2-3 hodinách znova vyšetrí ten istý prípravok. Za živé sa považujú len nedeformované larvy, ktoré sa nefarbili 2 hodiny. Mŕtve larvy sa zafarbia, keď škrupina sa zlomí (čiastočne alebo úplne).

Možnosť farbenia prípravkov roztokom jódu je indikovaná pri stanovení životaschopnosti vajíčok škrkavky vtáčej. V tomto prípade sa ako farbivo používa 5% alkoholový roztok jódu. Pri aplikácii na prípravok sa embryá mŕtvych vajíčok Ascaridia v priebehu 1-3 s sfarbia do oranžova. Mŕtve vajíčka opisthorchis a onkosféry pásomnice hovädzieho dobytka sa zafarbia roztokom toluidínovej modrej (1:1000) a mŕtve onkosféry pásomnice hovädzieho dobytka sa zafarbia roztokom brilantnej kresylovej modrej (1:10 000). Zároveň embryá a škrupiny mŕtvych aj živých vajec získavajú farbu. Preto sa po farbení vajíčka a onkosféry umyjú čistá voda a dodatočne zafarbené safranínom (zriedeným 1:10 000 v 10% alkoholovom roztoku). Alkohol zo škrupín odstráni farbu a safranín im dodá červenú farbu. Výsledkom je, že živé vajcia sčervenajú, embryo mŕtvych sa zmení na modré a škrupina zostane červená. Mŕtve embryá onkosfér pásomnice hovädzieho dobytka sa rýchlo, v priebehu niekoľkých minút, farbia jasne červenou alebo ružovou farbou safranínom alebo modrou brilantnou kresylovou modrou pri riedení 1:4000 alebo indigokarmínom pri riedení 1:1000-1:2000.

Živé embryá sa vplyvom týchto farbív nemenia ani po 2-7 hodinách.

Na určenie životaschopnosti vajíčok pásomnice trpasličích sa odporúča použiť tieto farby: 1) brilantná kresylová modrá (1:8000) - po 1 hodine sa onkosféra mŕtvych vajíčok obzvlášť jasne zafarbí, čo ostro vynikne na svetle alebo bezfarebné pozadie zvyšku vajíčka; 2) safranín: zriedený 1:8000 s expozíciou počas 2 hodín a 1:5000 počas 3-5 hodín; 3) 50% roztok kyseliny pyrogalovej v riedení 1:2 - pri vystavení 1 hodine pri teplote 29-30 “C (čím nižšia teplota, tým dlhší je proces farbenia).

Živé plerocerkoidy pásomnice sa veľmi dobre farbia vodným roztokom (1:1000) neutralrot po dobu 5-20 minút. Na získanie pretrvávajúcej ružovej farby, ktorá nezmizne do 5 dní a neovplyvňuje motilitu plerocerkoidov, zvyčajne stačí 10 minút. Stupeň sfarbenia sa kontroluje prezeraním lariev v čistom izotonickom roztoku chloridu sodného, ​​na tento účel sa z náteru pravidelne odstraňujú plerocerkoidy. Na farbenie mŕtvych plerocerkoidov je vhodné použiť metylénovú modrú.

R. E. Chobanov a kol., (1986) navrhli metódu stanovenia životaschopnosti vajíčok a lariev hlíst pomocou „rubrínového“ pigmentu získaného kultiváciou plesne Peniciliium rubrum ako farbiva. Na tento účel použite 3% vodný roztok farbiva.

Proces farbenia vajíčok a lariev je ukončený po 1,5 hodine.Neživotaschopné vajíčka lykožrútov, pásomníc hovädzieho dobytka a trpasličích pásomníc, háčkovitých červov, trichostrongyloidov získavajú intenzívnu ružovú farbu, larvy hákovcov a trichostrongyloidov sčervenajú. Menej jasná farba sa pozoruje vo vajíčkach škrkaviek a bičíkovcov, pretože po uvoľnení z čriev už majú tmavohnedú farbu: životaschopné vajíčka a larvy nie sú sfarbené.

Fyzikálno-chemické metódy na stimuláciu uvoľňovania miraculidu z vajíčok motolice. S.M. German a S.A. Beer (1984) vyvinuli metódy na stanovenie životaschopnosti vajec opisthorchidných a dikrocéliových vystavením vajec reakčnému médiu. Ak sú nažive, miracidium sa uvoľní. Metódy sú založené na fyzikálno-chemickej aktivácii liahnej žľazy miracidium a stimulácii motorická aktivita larvy. Stimulácia sa dosiahne vystavením vajíčok trematódy špeciálnemu reakčnému médiu v kombinácii so sekvenčnými technikami - vytvorenie teplotného rozdielu, vysušenie suspenzie vajíčok, vystavenie slabému toku tekutiny v testovacej kvapke, ktoré prispievajú k masívnemu uvoľneniu miracidií z vajcia.

Stanovenie životaschopnosti opisthorchidných vajec metódou Hermana a Beera. Suspenzia vajec vo vode (kohútik, usadená) sa vopred ochladí na 10-12 °C. Všetky nasledujúce operácie sa uskutočňujú pri teplote miestnosti (18-22 °C). Do centrifugačnej skúmavky sa pridá jedna kvapka (približne 0,05 ml) suspenzie obsahujúcej 100 až 400 vajec. Skúmavky sa umiestnia do stojana na 5-10 minút, aby sa vajíčka usadzovali. Potom úzky pásik Pomocou filtračného papiera opatrne odsajte prebytočnú vodu, kým sa úplne neodstráni. Pridajte 2 kvapky média do skúmavky, pretrepte, preneste obsah pipetou na podložné sklíčko a nechajte pôsobiť 5-10 minút, pričom mierne pretrepte (alebo umiestnite pod sušič vlasov), aby sa v testovacej kvapke vytvorili slabé prúdy tekutiny. pozastavenie. Táto operácia, ktorá napodobňuje peristaltiku čreva mäkkýšov, umožňuje aktivovať uvoľňovanie miracidií. Potom sa k suspenzii pridajú ďalšie 2 kvapky média a prípravok sa mikroskopuje pomocou bežného svetelného mikroskopu (X200). Počas tejto doby by sa malo otvoriť veko vajíčok s životaschopným miracidiom a larva sa aktívne vynorí do prostredia. Vďaka prítomnosti etanolu v ňom je miracidium imobilizované po 3-5 minútach a potom zafarbené farbivom nachádzajúcim sa v médiu. Výsledkom je, že miracidia sa ľahko detegujú a počítajú.

Príprava reakčného média. Médium sa pripraví v 0,05 M Tris-HCi pufri pri optimálnych podmienkach pH 8,0-9,5. Do tlmivého roztoku sa pridáva etanol na 10-13 % a farbivo (safranín, metylénová modrá a iné, ktoré pôsobia v rozmedzí pH) slabé zafarbenie kvapalina (napríklad pre safranín bude jeho konečná koncentrácia 1:50 000). Môžete použiť iný tlmivý roztok, ktorý funguje v alkalických limitoch pH, ​​napríklad 0,05 M fosfát (pH 8,5). Preto médium obsahuje 96% etanolu - 12 dielov; farbivo (materský roztok) - 1-10 dielov; 0,05 M Tris-NS! pufer (pH 8,5-9,5) - až 100 dielov. Príklad média: 12 dielov 96% etanolu, 1 diel nasýteného roztoku safranínu, zvyšok do 100 dielov - 0,05 M Tris-HCl tlmivý roztok, pH 9,5.

Stanovenie životaschopnosti vajíčok dikrocélia metódou Hermana, Beera, Stratana. Kvapka suspenzie obsahujúcej 100 až 150 vajíčok motolice sa umiestni do centrifugačnej skúmavky na 1 až 2 minúty, aby sa vajíčka sedimentovali. Kvapalina sa potom opatrne vysuší pomocou prúžku filtračného papiera. Pridajte 1-2 kvapky reakčného média pomocou Pasteurovej pipety a inkubujte vo vodnom kúpeli pri 28-30 °C počas 2-3 minút. Zloženie média: 6 dielov butanolu, 94 dielov 0,4% roztoku chloridu sodného alebo 0,3% roztoku chloridu draselného v destilovanej vode. Vajcia v médiu sa prenesú pipetou na podložné sklíčko a nechajú sa 1,5 – 2 hodiny pri izbovej teplote (18 – 22 °C), pričom sa každých 25 – 30 minút pridávajú 1 – 2 kvapky (0,05). ml) roztoku butanolu v destilovanej vode. Potom sa preparát skúma pod mikroskopom pri 100- až 200-násobnom zväčšení. Životaschopnosť je určená počtom otvorených vajíčok s uvoľnenými miracidiami. Butanol preniká cez póry škrupiny vajec, dostáva sa k miracidiám a aktivuje ich. Inkubácia pri uvedenej teplote podporuje tento proces. Butanol v koncentrácii 3-7% je škodlivý pre miracidium vychádzajúce z vajíčka. Prenesenie suspenzie vajíčok zo skúmavky na podložné sklíčko umožňuje v čase uvoľnenia miracidia (po 30-40 minútach) znížiť koncentráciu butanolu v dôsledku odparovania na bezpečnú úroveň (1,5-0,5%). Prítomnosť chloridu sodného v médiu v koncentrácii 0,1-0,5% (alebo chloridu draselného v koncentrácii 0,05-0,4%) určuje aktivitu uvoľneného miracídia. Na rozdiel od malých priehľadných vajíčok opisthorcha majú vajíčka dicrocelium tmavú škrupinu, majú jasne viditeľnú čiapočku, ktorá sa otvára po vynorení miracídia. Preto je vhodnejšie posúdiť životaschopnosť vajíčok dikrocélia skôr počítaním otvorených vajíčok ako farbením a počítaním miracidií.

Luminiscenčná metóda na štúdium vajíčok a lariev helmintov.

Prvýkrát v helmintologickej praxi sa metódy fluorescenčnej mikroskopie použili v roku 1955. Uvádza sa, že fluorescenčná mikroskopia umožňuje rozlíšiť živé a mŕtve predmety bez poškodenia vajíčka. Na fluorescenciu sa nepoužili UV lúče, ale modrofialová časť viditeľného svetla s konvenčným mikroskopom a sklíčkami; aplikovaný na iluminátor OI-18 špeciálna sada farebné filtre.

Zistilo sa, že živé a mŕtve vajíčka škrkaviek, škrkaviek, trpasličích pásomníc, hovädzích pásomníc, širokých pásomníc a iných helmintov fluoreskujú odlišne. Tento jav je pozorovaný ako počas primárnej luminiscencie bez použitia farbív, tak aj pri farbení fluorochrómmi (akridínová oranž, koryfosfín, primulín, aurolín, berlerín sulfát, trypaflavín, rivanol, chinín atď.).

Nefarbené, živé, nesegmentované vajíčka škrkavky žiaria jasnozelenou farbou so žltkastým odtieňom; v mŕtvych vajciach škrupina vyžaruje zelené svetlo oveľa jasnejšia ako tmavozelená zárodočná; Vo vajíčkach škrkavky s larvou sa objavuje iba škrupina a v mŕtvych vajíčkach je škrupina aj larva jasne žltá.

Nepigmentované a nesegmentované živé vajíčka pinworms a trpasličích pásomníc vyžarujú zelenožlté svetlo; V odumretých vajíčkach škrupina intenzívne luminiscuje na pozadí tmavozelenej embryonálnej hmoty. Pri sekundárnej luminiscencii (pri farbení akridínovou oranžou v riedení 1:10 000 a 1:50 000 od 30 minút do 2 hodín) luminiscencia živých a mŕtvych hlíst, motolíc a cestód odlišne.

Škrupina živých a mŕtvych Ascaris lumbricoides, Toxocara leonina, Enterobius vermicularis, Hymenolepis nana, H.fraterna, H. diminuta, T.saginatus, D.latum je sfarbená do oranžovočervena. Embryá živých Asc. lumbricoides, T.leonina, H.diminuta, D.latum a onkosféry pásomnice hovädzieho dobytka fluoreskujú matne tmavozelenou alebo šedozelenou farbou. Mŕtve embryá týchto vajíčok helmintov vyžarujú „horiace“ oranžovo-červené svetlo. Živé larvy červov a toxocara (uvoľnené vaječné škrupiny) vyžarujú tlmené šedozelené svetlo, keď uhynú, farba sa zmení z hlavy na „horiacu“ svetlozelenú, potom žltú, oranžovú a nakoniec jasne oranžovú.

Pri farbení fluorochrómmi - coryphosphilus, primulín - mŕtve vajíčka škrkaviek a bičíkovcov vykazujú žiaru od fialovožltej po medenočervenú. Životaschopné vajíčka neluminiscujú, ale sú natreté tmavozelenou farbou. Živé vajíčka motolice Paragonimus westermani a Clonorchis sinensis pri farbení akridínovou oranžovou neluminiscujú, ale mŕtve vajíčka vyžarujú žltozelené svetlo.

Na stanovenie životaschopnosti lariev helmintov možno použiť aj luminiscenčnú metódu. Larvy strongylátov a rhabditatus fluorochrómované roztokom akridínovej oranžovej (1:2000) teda žiaria: živé - zelené (s odtieňom), mŕtve - jasne oranžovým svetlom. Živé larvy Trichinella nežiaria alebo žiaria slabo, keď sú ošetrené 10 minút roztokmi fluoresceín izotiokyanátu, auramínu atď. Fluorochrómované mŕtve larvy (v koncentrácii 1:5000) jasne žiaria.

Živé miracidia vychádzajúce z škrupiny vyžarujú tlmené modrasté svetlo so sotva znateľným svetložltým korolom riasiniek, ale 10-15 minút po smrti sa objavia s jasným „horiacim“ svetlozeleným a potom oranžovo-červeným svetlom.