Analiza culturii mixte skl de limfocite. Cultură mixtă de limfocite

Fiecare dezvoltator web trebuie să cunoască SQL pentru a scrie interogări de baze de date. Și, deși phpMyAdmin nu a fost anulat, este adesea necesar să vă murdărești mâinile pentru a scrie SQL de nivel scăzut.

De aceea am pregătit un scurt tur al elementelor de bază ale SQL. Să începem!

1. Creați un tabel

Instrucțiunea CREATE TABLE este folosită pentru a crea tabele. Argumentele trebuie să fie numele coloanelor, precum și tipurile de date ale acestora.

Să creăm un tabel simplu numit lună. Este format din 3 coloane:

• id– Numărul lunii din anul calendaristic (întreg).
• Nume– Numele lunii (șir, maximum 10 caractere).
• zile– Numărul de zile din această lună (întreg).

Iată cum ar arăta interogarea SQL corespunzătoare:

CREATE TABLE luni (id int, nume varchar(10), zile int);

De asemenea, la crearea tabelelor, este recomandabil să adăugați o cheie primară pentru una dintre coloane. Acest lucru va păstra înregistrările unice și va accelera interogările selectate. Fie ca în cazul nostru numele lunii să fie unic (coloana Nume)

CREATE TABLE luni (id int, name varchar(10), days int, PRIMARY KEY (nume));

data si ora

Tip de date	Descriere
DATA	Valori date
DATETIME	Valori date și ore cu precizie minute
TIMP	Valori de timp

2. Introduceți rânduri

Acum să completăm tabelul nostru luni Informatii utile. Adăugarea înregistrărilor la un tabel se face prin instrucțiunea INSERT. Există două moduri de a scrie această instrucțiune.

Prima modalitate nu este de a specifica numele coloanelor în care vor fi inserate datele, ci de a specifica doar valorile.

Această notație este simplă, dar nesigură, deoarece nu există nicio garanție că, pe măsură ce proiectul se extinde și tabelul este editat, coloanele vor fi în aceeași ordine ca înainte. O modalitate mai sigură (și în același timp mai greoaie) de a scrie o instrucțiune INSERT necesită specificarea atât a valorilor, cât și a ordinii coloanelor:

Iată prima valoare din listă VALORI se potrivește cu primul nume de coloană specificat și așa mai departe.

3. Extragerea datelor din tabele

Declarația SELECT este a noastră cel mai bun prieten când dorim să obținem date din baza de date. Este folosit foarte des, așa că vă rugăm să citiți cu atenție această secțiune.

Cea mai simplă utilizare a instrucțiunii SELECT este o interogare care returnează toate coloanele și rândurile dintr-un tabel (de exemplu, un tabel numit personaje):

SELECTAȚI * DIN „personaje”

Caracterul asterisc (*) înseamnă că dorim să obținem date din toate coloanele. Deoarece bazele de date SQL constau de obicei din mai mult de un tabel, este necesar să se specifice cuvânt cheie FROM , urmat de un spațiu urmat de numele tabelului.

Uneori nu dorim să obținem date de la toate coloanele dintr-un tabel. Pentru a face acest lucru, în loc de asterisc (*), trebuie să scriem numele coloanelor dorite separate prin virgule.

SELECT ID, numele FROM luna

De asemenea, în multe cazuri dorim ca rezultatele să fie sortate într-o anumită ordine. În SQL, facem acest lucru cu ORDER BY . Poate fi nevoie de un modificator opțional - ASC (implicit) pentru a sorta în ordine crescătoare sau DESC pentru a sorta în ordine descrescătoare:

SELECT ID, nume FROM luna ORDEREA DUPĂ nume DESC

Când utilizați ORDER BY, asigurați-vă că este ultimul în instrucțiunea SELECT. În caz contrar, va fi emis un mesaj de eroare.

4. Filtrarea datelor

Ați învățat cum să selectați anumite coloane dintr-o bază de date folosind o interogare SQL, dar ce se întâmplă dacă vrem să recuperăm și anumite rânduri? Clauza WHERE vine în ajutor aici, permițându-ne să filtram datele în funcție de o condiție.

În această interogare, selectăm doar acele luni din tabel lună care sunt mai mari de 30 de zile folosind operatorul mai mare decât (>).

SELECT ID, nume FROM luna WHERE zile > 30

5. Filtrare avansată a datelor. operatori AND și SAU

Anterior, filtram datele folosind un singur criteriu. Pentru o filtrare mai complexă a datelor, puteți utiliza operatorii AND și SAU și operatorii de comparație (=,<,>,<=,>=,<>).

Aici avem un tabel care conține cele mai bine vândute patru albume din toate timpurile. Să le alegem pe cele care sunt clasificate ca rock și au mai puțin de 50 de milioane de exemplare vândute. Acest lucru se poate face cu ușurință prin plasarea unui operator AND între aceste două condiții.

SELECT * FROM albume WHERE gen = „rock” AND sales_in_millions<= 50 ORDER BY released

6. În/Între/Like

WHERE acceptă, de asemenea, mai multe comenzi speciale, permițându-vă să verificați rapid interogările cele mai frecvent utilizate. Aici sunt ei:

• IN - folosit pentru a specifica o gamă de condiții, dintre care oricare poate fi îndeplinită
• BETWEEN - Verifică dacă valoarea se află în intervalul specificat
• LIKE - caută anumite modele

De exemplu, dacă vrem să selectăm albume cu popși suflet muzica, putem folosi IN("value1","value2") .

SELECTAȚI * DIN albumele WHERE genre IN ("pop","soul");

Dacă vrem să obținem toate albumele lansate între 1975 și 1985, am scrie:

SELECTAȚI * DIN albumele WHERE lansate ÎNTRE 1975 ȘI 1985;

7. Funcții

SQL este plin de funcții care fac tot felul de lucruri utile. Iată câteva dintre cele mai frecvent utilizate:

• COUNT() - returnează numărul de rânduri
• SUM() - returnează suma totală a unei coloane numerice
• AVG() - returnează valoarea medie dintr-un set de valori
• MIN() / MAX() - Obține valoarea minimă / maximă dintr-o coloană

Pentru a obține cel mai recent an în tabelul nostru, trebuie să scriem următoarea interogare SQL:

SELECTARE MAX (lansat) FROM albume;

8. Subinterogări

În paragraful anterior, am învățat cum să facem calcule simple cu date. Dacă dorim să folosim rezultatul din aceste calcule, nu ne putem lipsi de interogări imbricate. Să presupunem că vrem să ieșim artist, albumși anul lansării pentru cel mai vechi album din tabel.

Știm cum să obținem aceste coloane specifice:

SELECT artist, album, lansat DIN albume;

De asemenea, știm cum să obținem cel mai devreme an:

SELECT MIN (lansat) FROM album;

Tot ce este nevoie acum este să combinați cele două interogări cu un WHERE:

SELECT artist,album,released FROM albums WHERE lansat = (SELECT MIN(released) FROM albums);

9. Îmbinarea tabelelor

În bazele de date mai complexe, există mai multe tabele care sunt legate între ele. De exemplu, mai jos sunt două tabele despre jocuri video ( jocuri video) și dezvoltatori de jocuri video ( game_developers).

Masa jocuri video există o coloană pentru dezvoltatori ( developer_id), dar conține un număr întreg, nu numele dezvoltatorului. Acest număr este un identificator ( id) a dezvoltatorului corespunzător din tabelul dezvoltatorilor de jocuri ( game_developers) legând cele două liste în mod logic, permițându-ne să folosim informațiile stocate în ambele în același timp.

Dacă vrem să creăm o interogare care să returneze tot ce trebuie să știm despre jocuri, putem folosi un INNER JOIN pentru a lega coloanele din ambele tabele.

SELECT video_games.name, video_games.genre, game_developers.name, game_developers.country FROM video_games INNER JOIN game_developers ON video_games.developer_id = game_developers.id;

Acesta este cel mai simplu și mai comun tip JOIN. Există mai multe alte opțiuni, dar se aplică cazurilor mai puțin frecvente.

10. Aliasuri

Dacă te uiți la exemplul anterior, vei observa că sunt numite două coloane Nume. Acest lucru este confuz, așa că să setăm un alias la una dintre coloanele repetate, de exemplu, Nume de la masă game_developers va fi chemat dezvoltator.

De asemenea, putem scurta interogarea prin aliasarea numelor tabelelor: jocuri video Hai sa sunăm jocuri, game_developers - dezvoltatori:

SELECT games.name, games.genre, devs.name AS dezvoltator, devs.country FROM video_games AS jocuri INNER JOIN game_developers AS devs ON games.developer_id = devs.id;

11. Actualizarea datelor

Adesea trebuie să schimbăm datele în unele rânduri. În SQL, acest lucru se face cu instrucțiunea UPDATE. Declarația UPDATE constă din:

• Tabelul care conține valoarea de înlocuire;
• Numele coloanelor și noile lor valori;
• Rândurile selectate cu WHERE pe care dorim să le actualizăm. Dacă acest lucru nu se face, atunci toate rândurile din tabel se vor schimba.

Mai jos este tabelul seriale TV cu serii cu ratingul lor. Cu toate acestea, o mică eroare s-a strecurat în tabel: deși seria Urzeala tronurilorși este descrisă ca o comedie, chiar nu este. Să reparăm asta!

tv_series date table UPDATE tv_series SET gen = "drama" WHERE id = 2;

12. Ștergerea datelor

Ștergerea unui rând de tabel cu SQL este un proces foarte simplu. Tot ce trebuie să faceți este să selectați tabelul și rândul pe care doriți să le ștergeți. Să eliminăm ultimul rând din tabel din exemplul anterior seriale TV. Acest lucru se face folosind instrucțiunea >DELETE.

DELETE FROM tv_series WHERE id = 4

Fiți atenți când scrieți instrucțiunea DELETE și asigurați-vă că este prezentă clauza WHERE, altfel toate rândurile tabelului vor fi șterse!

13. Ștergerea unui tabel

Dacă vrem să eliminăm toate rândurile, dar să părăsim tabelul în sine, atunci folosiți comanda TRUNCATE:

TRUNCATE TABLE nume_tabel;

În cazul în care dorim cu adevărat să ștergem atât datele, cât și tabelul în sine, atunci comanda DROP va fi utilă:

DROP TABLE nume_tabel;

Fii foarte atent cu aceste comenzi. Nu pot fi anulate!/p>

Aceasta încheie tutorialul nostru SQL! Nu am acoperit prea multe, dar ceea ce știți deja ar trebui să fie suficient pentru a vă oferi niște abilități practice în cariera dvs. pe web.

Co-cultivarea limfocitelor cu molecule MHC-II de haplotip diferit determină transformarea și proliferarea blastică a acestora. Celulele care reacţionează aparţin limfocitelor T şi sunt stimulate de determinanţi străini MHC-II localizaţi pe limfocitele B, macrofage. Puterea reacției depinde de gradul de diferență dintre antigenele de histocompatibilitate. Pentru a evalua reactivitatea unui individ în raport cu varianta alelica MHC, se prepară o cultură unidirecțională de limfocite. Pentru a face acest lucru, celulele stimulatoare sunt pre-tratate cu mitomicina sau iradiate, în timp ce celulele stimulatoare își pierd capacitatea de a se diviza, dar rămân viabile.

Reactivitatea într-o cultură mixtă de limfocite este unul dintre criteriile de evaluare imunitatea celulară. SKL permite efectuarea Tastarea HLA, pentru a selecta o pereche de donator-recipient pentru transplant de țesut și organ, pentru a face o corelație între antigenele HLA și anumite boli.

Pentru a stabili reacția, se folosește o suspensie de limfocite izolate din sângele pacienților (donator și primitor). Celulele care răspund spălate sunt suspendate într-o cantitate mică de mediu 199 (0,5 ml) şi, după numărarea numărului de celule, sunt ajustate la 0,6 x 106 celule/ml. Suspensia de celule stimulatoare se prepară în mod similar cu adăugarea unei soluții de mitomicina C (500 μg de mitomicina C în 1 ml de soluție salină tamponată) la o rată de 0,1 ml per 1 ml de suspensie. Amestecul de celule este incubat timp de 40 de minute la 37°C într-o baie de apă cu agitare, apoi mediu rece 199 este adăugat la suspensie şi celulele sunt spălate de trei ori prin centrifugare. Precipitatul este suspendat în mediu de cultura cultivare, aducând numărul de celule la 0,6 * 106 celule/ml.

La godeurile unei plăci imunologice sterile cu fund rotund se adaugă 0,1 ml de suspensie celulară în soluția lui Hank și se adaugă 0,1 ml suspensie celulară care poartă variante alelice MHC. Aceeași cantitate de soluție Hank a fost adăugată la control.

Contabilitatea rezultatelor se efectuează după incubarea celulelor la 37 ° C timp de 3-5 zile, în funcție de formularea reacției folosind o metodă morfologică sau izotopică (vezi RBTL).

La transplantare măduvă osoasă alegerea unui donator histocompatibil se bazează pe rezultatele tipării HLA a donatorului și a primitorului, precum și atunci când se determină compatibilitatea perechilor donor-receptor HLA-identice selectate în SCL, care este etapa finală a evaluării compatibilității. Pentru aceasta, se utilizează o reacție SCL bidirecțională folosind o metodă de microcultură într-o placă cu 96 de godeuri cu o evaluare a mărimii proliferării prin încorporarea de H3-timidină radioactivă în ADN-ul limfocitelor în proliferare.

În prezent, se acordă multă atenție studiului rolului mecanisme imunitareîn procesul de reproducere, deoarece încălcarea lor duce la dezvoltarea infertilității și întreruperea timpurie a sarcinii. Studii ale parametrilor imunologici și relația acestora cu procesele reproductive a condus la concluzia că restructurarea este necesară sistem imunitarîn pregătirea corpului mamei pentru sarcină, începând cu perioada ovulatorie, la momentul implantării embrionului și la perioada timpurie sarcina.

Una dintre cele mai complexe și dificil de diagnosticat cauze ale infertilității și avorturilor spontane recurente este disfuncția imunitară.

Cu scopul de a detectarea în timp util se examinează infertilitatea imunologică în laboratorul de imunologie a reproducerii cupluri folosind următoarele metode diagnosticare:

• studiul nivelului de răspuns proliferativ al limfocitelor unei femei la antigenele partenere (într-o cultură mixtă de limfocite)
• determinarea activității factorilor de blocare în serul sanguin al unei femei.
• evaluarea conţinutului cantitativ al subpopulaţiilor de celule citotoxice naturale în sânge periferic femei.
• imunograma extinsă
• studiul conținutului de celule reglatoare cu activitate supresoare din sângele periferic.
• la identificarea clinică şi semne de laborator infertilitate imunologică, pacienților li se recomandă să se supună procedura medicala- aloimunizarea cu limfocitele soțului, care se efectuează în conformitate cu un program individual.

Consultatie necesara:

• dacă în absenţa ginecologică şi boli endocrine cu viata sexuala regulata pe parcursul anului nu exista sarcini.
• în cazul avorturilor spontane repetate (mai mult de 1 dată) (avort spontan).
• la FIV nereușită in istorie.
• cu ameninţarea întreruperii unei sarcini reale.

Dacă sunt detectate încălcări, este prescrisă o procedură în scopul imunocorecției încălcărilor. aloimunizare cu limfocite partenere (AIL). Aceasta metoda tratamentele sunt aprobate Serviciul Federal privind supravegherea în domeniul asistenței medicale (licență FS nr. 2009/179 din 02.07.2009)

Procedura se efectuează numai dacă partenerul are rezultate negative testarea pentru infecția HIV, sifilis și hepatita virala(B, C). Complicațiile în AIL nu au fost identificate. Metoda AIL are un efect imunocorector pronunțat, crește eficacitatea tratamentului infertilității, ca în ciclu natural, precum și fertilizare in vitro(ECO). De asemenea, este prescris pentru încercările nereușite de fertilizare in vitro.

AIL se efectuează 1 dată în 28-30 de zile (în conformitate cu ciclu menstrual femei) în prima fază a ciclului. Primul curs include 3 proceduri AIL. După a 2-a procedură, cuplul reia analiza de control. În prezența unei dinamici pozitive, a treia procedură AIL este ultima. În absența dinamicii, doza de celule pentru imunizare este crescută și se efectuează al 2-lea curs, care include 2 proceduri. După o analiză de control, în unele cazuri, este necesar să se prescrie un al treilea curs de imunizare cu o creștere a dozei de celule. După atingerea valorilor standard, efectul pozitiv durează în decurs de 6-8 luni.

Pentru perioada 2003-2013. în laboratorul de imunoterapie celulară au fost efectuate circa 3000 de proceduri de aloimunizare cu limfocite ale partenerilor. Pentru această procedură, din sângele partenerului sunt izolate doar limfocitele, care sunt întotdeauna prezente în spermă. În alte țări*, de 20 de ani se desfășoară și procedura de aloimunizare, care ajută o femeie să poarte și să nască un copil sănătos.

Tipul serviciului	preț, freacă.
Testul de transformare a limfocitelor	1650
Test de transformare a limfocitelor (Detecția sesibilizării pe 2v-va)	2 900
Test de transformare a limfocitelor (Detecția sesibilizării pe 3v-va)	3 900
Test de transformare a limfocitelor (examen imunologic pentru infertilitate)	3 200
Imunogramă extinsă cu markeri de activare	4 625
Studiu cuprinzător al stării imunitare	4 125
Vaccinarea (aloimunizare cu limfocitele partenerului 1 doză)	1 900
Vaccinarea (aloimunizare cu limfocitele partenerului 2 doză)	2 750
Vaccinarea (aloimunizare cu limfocitele partenerului 3 doză)	3 400
Investigarea limfocitelor CD16+/CD56+ (examen imunologic pentru infertilitate numai celule NK)	1 250
Studiul activității macrofagelor (medii condiționate ale macrofagelor)	9 400
Studiul activității macrofagelor (medii condiționate)	1 500
Crioconservarea celulelor mononucleare pentru aloimunizare	650

2.2. Metode de interacțiuni celulare

Aproape toate metodele de interacțiuni celulare utilizate în imunogenetica clinică se bazează pe fenomenul de formare a blastului într-o cultură mixtă de limfocite, descoperit de cercetătoarea canadiană Barbara Bain. Reacția culturii mixte de limfocite (MLC) a permis un studiu fin diferențiat al complexului HLA și, în special, a uneia dintre subunitățile sale, locusul HLA-D. O serie de alte metode de interacțiuni celulare - limfoliza mediată celular (Cell-mediated Lympholysis - CML), testul de amorsare a limfocitelor (Primed Lymphocyte Typing) - se bazează pe metoda MLC sau o conține ca parte integrantă.

2.2.1. Cultură mixtă de limfocite (MCL)

Principiul metodei este prezentat în fig. 10, care arată că două populații de limfocite genetic diferite interacționează între ele în cultura in vitro. Una dintre populații este tratată cu mitomicină C sau iradiată, în urma căreia își pierde capacitatea de formare a blastului și de încorporare a timidinei (3 HT), însă, fără a pierde proprietățile antigenice, își păstrează capacitatea de stimulare (stimulente; S- populație).

Celulele care răspund la stimulare (respondenții, populația R) se transformă în blasturi după câteva zile și includ timidina adăugată în cultură. Intensitatea reacției este măsurată folosind o etichetă de radiație prin încorporarea de 3H-timidină.

Sunt cunoscute mai multe variante ale reacției unei culturi mixte de limfocite, dintre care două sunt propuse aici: una tradițională și una microvariantă implementată în plăci Cook (Fig. 11).

Orez. 11. Echipamente pentru microvariante MLC și CML. 1 - tableta fund rotund e 96 gauri; 2-pipeta automata ("Pipetman") cu program pentru diferite volume; 3 - pipeta automata ("Sigma") pentru un anumit volum; 4 - vârf de pipetă de unică folosință; 5 - cutie laminara

Versiunea tradițională a MLC (modificată de F. S. Baranova):

Limfocitele sunt izolate pe un gradient de ficoll-urografină așa cum este descris mai sus. Prima spălare este efectuată în PBS (NaCI - 8,0 g, Na2HP04 - 1,15 g, KH2PO4 - 0,2 g, KC1 - 0,2 g per 1 litru de H20); următoarele două sunt produse în mediu 199 cu ser AB 5% (grup de 15 donatori);

Celulele care răspund sunt resuspendate în mediu 199 cu ser AB 10% şi concentraţia celulară este ajustată la 0,6 x 106 în 1 ml;

Celulele stimulatoare izolate în același mod la o concentrație de 5 - 106 per 1 ml sunt tratate cu mitomicină C (60 y/ml) de la Serva și incubate timp de 40 minute la 37°C într-o baie de apă. După incubare, celulele sunt spălate de 3 ori cu mediu 199 cu 5% ser AB, resuspendate în mediu 199 cu 10% ser AB, aducând concentrația la 0,6 x 106 în 1 ml;

0,5 ml de celule care răspund și 0,5 ml de celule stimulatoare sunt amestecate într-un tub de centrifugă, se adaugă 0,04 ml de 10 ml de soluție Hepes (Serva) și se incubează timp de 144 de ore; experiența este pusă în trei paralele (triplet);

Cu 24 de ore înainte de sfârșitul incubării, se adaugă în tuburi 3 H-timidină 1μCi (3,7x10 4 BC), per probă. activitate specifică 5mSi/mmol (18,5x107 Bq/mmol) şi se continuă incubarea;

La sfârșitul incubării, celulele sunt transferate în filtre millipore (0,6 - 0,9 microni), spălate salină(37°C) și soluție de acid tricloracetic 5% răcită (4°C). Filtrele sunt uscate și plasate în flacoane cu 5 ml de lichid de scintilație (5 g de PPO și 0,5 g de POPOP la 1 litru de toluen)*. Activitatea de încorporare a 3H-timidinei este măsurată pe un contor p; rezultatul este exprimat în incluziuni absolute ale unei etichete radioactive în 1 min sau în indicele de stimulare (SI) conform formulei:

* (PPO - 2,5-fenol-oxazol; POPOP - (1,4-di-2-15-fenol oxazolitbenzen).)

Valoarea medie a CPM în trei prototipuri

SI = CPM medie a trei martori/Martori sunt culturi spontane de celule care răspund.

Varianta MLC micro în tablete Cook. La cel de-al 8-lea Workshop au fost elaborate cerințe care standardizează microvarianta MLC, în conformitate cu care este prezentată mai jos:

Limfocitele sunt izolate într-un gradient isopac-ficoll și resuspendate în mediu RPMJ-1640*, aducând concentrația la 5x105 în 1 ml;

* (Mediul 199 amestecat cu ser uman din grupa AB (ser 5% luat de la mai multe persoane) poate fi utilizat.)

Celulele stimulatoare sunt tratate cu mitomicina C sau antrenament;

5x10 4 reponderi și același număr de stimulenți sunt plasați folosind o micropipetă de tip Pipetman în fiecare godeu al unei microplăci Cook cu fund rotund;

Plăcile sunt incubate într-un termostat cu alimentare automată de 5% CO 2 timp de 120 h; apoi se adaugă lμmCi3H-timidină în fiecare godeu la o activitate specifică timidinei de 6 Ci/mmol; toate manipulările sunt efectuate cu o pipetă Pipetman;

La 16 ore după adăugarea timidinei, culturile din fiecare godeu sunt transferate în filtre millipore cu o pipetă automată și spălate cu ser fiziologic și apoi cu acid tricloracetic 5%; este convenabil să folosiți „recoltatoare” speciale pentru a transfera cultura în filtre millipore;

Activitatea de încorporare a timidinei este determinată așa cum este descris mai sus.

2.2.2. Limfoliza mediată celular (LMC)

LMC a fost utilizată în studiile imunogenetice relativ recent (din 1972), dar în timpuri recente devine din ce în ce mai mult tehnica populara, permițându-vă să studiați în detaliu rolul verigii eferente a imunității la transplant și să obțineți recunoaștere ca metoda informativă monitorizarea imunologică. Principiul metodei este prezentat în fig. 12. Metoda se bazează pe tehnica propusă de J. Lightbody (1971), care este rezumată după cum urmează.

1. LMC începe cu un test HLC convențional în care celulele care răspund recunosc „stimulatori”, sensibilizează celulele care răspund și formează ucigași sensibilizați.

2. A doua fază, în care ucigașii sensibilizați sunt amestecați cu celule țintă marcate cu 51 Cr, constă în distrugerea acestora din urmă de către celulele ucigașe efectoare; celulele țintă pot avea același genotip ca „stimulatorii” din prima fază a MLC, sau pot fi celule ale celui de „al treilea” partener, dotate cu determinanți antigenici în comun cu „stimulatorii” sau fără aceștia.

3. Cantitatea de crom radioactiv eliberată din celulele țintă distruse și eliberată în mediul de cultură servește ca măsură a intensității efectului ucigaș.

Orez. 12. Principiul limfolizei mediate celular (LMC). I row - sensibilizarea celulelor care răspund, formarea de ucigași; Rândul II - interacțiunea ucigașilor cu ținta; rândul III - distrugerea celulei țintă; ieșire din mediul de cultură 51 Cr

Aici sunt descrise trei variante de LMC: versiunea tradițională modificată de L.P. Alekseev (1979), microvarianta în plăci Cook, CML direct (Direct-CML -D-CML.

Opțiune tradițională[Alekseev L.P., 1979].

Metoda este împărțită în mai multe etape.

Primesc asasini:

Limfocitele periferice ale ambelor populații (celule R și celule S) sunt izolate în mod obișnuit, spălate în gradient de densitate de trei ori în mediu 199 cu ser AB 5% (10 min, 150 g);

1x106 celule R (0,8 ml) sunt amestecate în tuburi de centrifugă cu 2x106 celule S (0,2 ml) tratate cu mitomicină C şi incubate timp de 144 ore la 37°C;

Celulele sunt centrifugate la 150 g timp de 10 min, iar peletul este resuspendat în mediu 199 cu adăugare de ser de viţel 20% (mediu 199 + adică), aducând concentraţia la 1x106 în 1 ml;

Unul dintre eșantioane este lăsat să studieze nivelul MLC, restul sunt folosite ca ucigași gata făcut.

Primirea țintelor:

Limfocitele izolate convenţional sunt resuspendate în mediu 199 cu ser AB 20% şi incubate cu fitohemaglutinină (0,003 mg/ml Wellcome) timp de 72 ore la 37°C; concentrația celulară 1x106 în 1 ml;

Celulele sunt centrifugate timp de 10 min la 150 g, peletul este resuspendat în mediu 199 cu 5% ser AB, iar concentrația celulară este ajustată la 2x104 în 1 ml;

51 Cr 100 uCi/ml (3,7x106 Bq/ml) este adăugat la suspensie şi incubat timp de 40 min la 37°C;

Celulele sunt spălate de trei ori în mediu 199 suplimentat cu ser AB 5% (150 g, 10 min) iar peletul este resuspendat în mediu 199 suplimentat cu ser AB 5%. aducând concentraţia la 2x10 4 în 1 ml.

Declarație de reacții:

5x105 killers (0,5 ml) sunt amestecate cu 1x104 ţinte (0,5 ml), incubate timp de 4 ore (37°C) şi centrifugate la 150 g timp de 10 min;

Supernatantul este aspirat și impulsul cauzat de 51 Cr este numărat pe un contor ß; numărarea se efectuează în 0,5 ml de supernatant;

Nivelul de citoliză se calculează prin următoarea formulă:

ekeper. ieșire 51 Cr - ieșire spontană 51 Cr/max, ieșire 51 Cr - ieșire spontană 41 Cr × 100.

Eliberarea spontană de crom este măsurată pe ținte incubate timp de 4 ore (37°C) fără celule ucigașe; randament maxim de crom - pe ținte complet distruse prin îngheț-dezgheț; Toate testele sunt efectuate în tripleți.

Microvarianta LMC în tablete [după Mawas S., 1976]:

Faza de producere a ucigașului este efectuată ca MLC în plăci cu fund rotund, dar celulele R și S sunt amestecate în cantități egale la 2x105 PA fiecare godeu și incubate la 37°C;

După 5 zile, celulele sunt colectate cu o pipetă Pasteur într-o eprubetă, numărul de celule vii este numărat cu albastru de tripan, iar concentrația este ajustată la 10x106 în 1 ml;

Celulele țintă sunt cultivate cu PHA timp de 3 zile;

În ziua reacţiei, celulele ţintă sunt spălate (300 g) şi resuspendate în mediul de cultură, distribuindu-se 1 ml în eprubete şi aducând la 1x106 în 1 ml;

200 uCi51Cr (7,4x106 BK) sunt adăugate în fiecare tub cu celule țintă și incubate timp de 1 oră la 37°C; spălați celulele de 3 ori; sedimentul este resuspendat și ajustat la o concentrație de 1x10 în 1 ml (viu);

Testul este implementat în microplăci cu fund rotund; pentru aceasta, în fiecare godeu sunt distribuite 0,7 - 1x106 celule killer (0,1 ml) şi 1x104 celule ţintă (0,1 ml); volumul total al suspensiei din fiecare godeu este de 0,2 ml, se adaugă 0,05 ml de mediu în fiecare godeu și se incubează (37°C) timp de 4 ore;

Plăcile sunt centrifugate la 800 g într-o centrifugă Beckman timp de 10 minute; supernatantul din fiecare godeu este transferat în eprubete și numărat pe un contor y;

Faza de producție ucigașă (MLC) este efectuată pe mediu RPMJ-1640 suplimentat cu 20% plasmă umană; pentru faza de ucidere, mediul MEM este utilizat cu adăugarea de 20% plasmă umană, preîncălzită.

CML direct (D-CML). LMC directă este o tehnică dezvoltată special în scopuri clinice care și-a găsit utilizare în monitorizarea imunologică. Schema acestei reacții este prezentată în fig. 13.

Principala diferență față de LMC tradițională este că stadiul formării ucigașului (faza de sensibilizare) nu are loc in vitro, ci in vivo, adică în corpul uman sensibilizat prin transplantul unui organ sau țesut alogen. Datorită impactului țesutului alogen, limfocitele primitorului sunt sensibilizate la antigenele tisulare ale donatorului și nu necesită tratament special in vitro, durata testului se reduce semnificativ în timp, deoarece doar țintele trebuie pregătite mai întâi.

Țintele sunt limfocitele obținute din sângele periferic sau, mai frecvent, din splina unui donator (vezi 2.1.2) și congelate prin oricare dintre metodele descrise mai sus (vezi 2.1.3).

2.2.3. Citotoxicitate mediată de celule dependente de anticorpi (ADCC)

Acest tip de răspuns celular este similar ca mecanism de acțiune cu CML descris mai sus. Principiul reacției este prezentat în fig. 14. Componentele reacției sunt celulele țintă (celule donatoare sau limfocite alogene), serul (alogene sau primitoare), care conțin probabil anticorpi direcționați către determinanții celulei țintă și celule efectoare (limfocite primitoare sau limfocite alogene).

Celulele efectoare în acest tip de interacțiune sunt așa-numitele celule K situate în sângele periferic. Spre deosebire de celulele ucigașe din LMC, acestea efectuează un efect citotoxic fără sensibilizare prealabilă, totuși, manifestarea efectului citotoxic al celulelor K este posibilă numai prin anticorpi direcționați către determinanții celulelor țintă. Liza specifică este măsurată prin eliberarea de 51 Cr dacă serul de testat conține anticorpi la determinanții țintă.

Determinanții țintă în ADCC pot fi specificități ale aproape tuturor loci HLA, inclusiv HLA-D, HLA-DR, precum și determinanți din afara sistemului HLA.

Cel mai răspândit această reacție complexă a fost obținută în monitorizarea imunologică pentru a detecta anticorpii celulelor B. În acest sens, au fost propuse mai multe modificări, care implică îmbogățirea suspensiei de celule țintă cu limfocite B, adsorbția serurilor pe trombocite etc.

În plus, sunt luate în considerare o serie de alte caracteristici ale răspunsului din acest sistem. Serul de testat trebuie să fie decomplementat, altfel reacția poate avea loc ca o citotoxicitate dependentă de complement mediată de anticorpi. De asemenea, se presupune că celulele efectoare pot provoca o anumită distrugere a țintelor de tipul CML.

În cele din urmă, întregul set de probe din testul de limfocitotoxicitate mediată celular dependentă de anticorpi este după cum urmează:

Ținte + efectori + ser testat (probă experimentală);

Ținte (proba de control, adică eliberarea spontană de 51 Cr);

Ținte + efectori (test de control pentru activitatea efectorului);

Ținte + ser de testare (control ser).

Limfocitele sunt izolate în modul obișnuit și resuspendate în RPMI-1640 + 10% ser fetal bovin; tratarea suspensiei cu fier carbonil pentru îndepărtarea monocitelor; se adaugă clorură de amoniu sau H20 pentru a liza eritrocitele rămase;

Se adaugă 51 Cr la suspensia de celule țintă sub formă de soluție de Na2CrO4 100 - 200 uCi ml (3,7x106 - 7,4x106 BK/ml) și se incubează timp de 40 - 60 minute;

Celulele sunt spălate de trei ori în RPMI + 0,1% HSA, resuspendate în același mediu și ajustate la 2x108 în 1 ml; 50 pl de suspensie celulară marcată sunt plasați într-o eprubetă și activitatea izotopică este apoi numărată pe un contor y pentru a detecta "captarea" izotopică completă; restul este picurat în godeurile tabletei la 50 pl de suspensie (1x105 celule per godeu);

Suspensia celulelor-efectori este adusă la 2x107 celule în 1 ml și în. se pun 50 ui de suspensie (sau 100 ui) în fiecare godeu, raportul efector la țintă 10:1 (sau 20:1);

Incubarea durează 4 ore într-un incubator cu atmosferă umedă cu 5% CO 2 (durata incubației poate fi prelungită până la 8 ore);

Se prepară în eprubete mai multe diluții ale serului de testat (1:25; 1:100) și se adaugă în godeuri până la 50 µl din fiecare diluție: și ser nediluat; Setarea finală a testului arată așa cum se arată în tabel. 23.

Tabelul 23

Setarea ADCC. Toate opțiunile de probă, µl

* (În loc de serul de testare, este instilat un pool de seruri AV.)

** (În locul serului de testare, se instilează un ser HLA monospecific îndreptat împotriva țintelor (nu a efectorilor).)

Panourile sunt incubate timp de 4 ore într-o atmosferă umedă cu 4% CO2; durata incubației poate fi prelungită până la 8 ore;

După incubare, jumătate din volumul din fiecare godeu (100 μl) se aspira cu grijă cu o pipetă automată și se pune în tuburi pentru numărarea impulsurilor de 51 Cr; activitatea se numără pe un contor γ;

Calculele sunt după cum urmează:

% eliberare de 51 Cr = 2 × A op - activitate de fundal/B - activitate de fundal × 100;

% citotoxicitate = A op - A sp /100 - A sp × 100, unde A op - % eliberare de 51 Cr în probe experimentale; Si cn -% eliberare spontana; B - asimilarea completă a izotopului.

Cum rezultat pozitiv Se consideră citotoxicitate de 5% sau mai mare după 4 ore de incubare.