Analiza skl miješane kulture limfocita. Mješovita kultura limfocita

Svaki web programer treba poznavati SQL da bi mogao pisati upite bazi podataka. I, iako phpMyAdmin nije otkazan, često je potrebno zaprljati ruke za pisanje SQL-a niske razine.

Zato smo pripremili kratku turu o osnovama SQL-a. Započnimo!

1. Napravite tablicu

Naredba CREATE TABLE koristi se za kreiranje tablica. Argumenti moraju biti nazivi stupaca, kao i njihovi tipovi podataka.

Kreirajmo jednostavnu tablicu pod nazivom mjesec. Sastoji se od 3 stupca:

• iskaznica– Broj mjeseca u kalendarskoj godini (cijeli broj).
• Ime– Naziv mjeseca (string, maksimalno 10 znakova).
• dana– Broj dana u ovom mjesecu (cijeli broj).

Ovako bi izgledao odgovarajući SQL upit:

CREATE TABLE mjeseci (id int, name varchar(10), days int);

Također, prilikom izrade tablica, poželjno je dodati primarni ključ za jedan od stupaca. To će evidenciju zadržati jedinstvenom i ubrzati zahtjeve za dohvaćanje. U našem slučaju neka naziv mjeseca bude jedinstven (kolona Ime)

CREATE TABLE mjeseci (id int, name varchar(10), days int, PRIMARY KEY (name));

Datum i vrijeme

Tip podataka	Opis
DATUM	Vrijednosti datuma
DATUM VRIJEME	Vrijednosti datuma i vremena točne do minute
VRIJEME	Vremenske vrijednosti

2. Umetanje redaka

Sada popunimo našu tablicu mjeseca korisna informacija. Dodavanje zapisa u tablicu vrši se pomoću naredbe INSERT. Postoje dva načina za pisanje ove upute.

Prva metoda nije određivanje imena stupaca u koje će se podaci umetnuti, već određivanje samo vrijednosti.

Ova metoda snimanja je jednostavna, ali nesigurna, budući da nema jamstva da će, kako se projekt bude širio i tablica uređivala, stupci biti u istom redoslijedu kao prije. Siguran (a ujedno i glomazan) način pisanja izjave INSERT zahtijeva navođenje i vrijednosti i redoslijeda stupaca:

Ovdje je prva vrijednost na popisu VRIJEDNOSTI odgovara prvom navedenom nazivu stupca, itd.

3. Izdvajanje podataka iz tablica

Izjava SELECT je naša najbolji prijatelj kada želimo dobiti podatke iz baze podataka. Koristi se vrlo često, stoga obratite posebnu pozornost na ovaj odjeljak.

Najjednostavnija upotreba naredbe SELECT je upit koji vraća sve stupce i retke iz tablice (na primjer, tablice po nazivu likovi):

SELECT * FROM "znakovi"

Simbol zvjezdice (*) znači da želimo dobiti podatke iz svih stupaca. Budući da se SQL baze podataka obično sastoje od više od jedne tablice, potrebno je navesti ključna riječ FROM , nakon čega slijedi naziv tablice odvojen razmakom.

Ponekad ne želimo dobiti podatke iz svih stupaca u tablici. Da bismo to učinili, umjesto zvjezdice (*) moramo napisati nazive željenih stupaca, odvojene zarezima.

ODABERITE id, naziv IZ mjeseca

Osim toga, u mnogim slučajevima želimo da rezultirajući rezultati budu poredani određenim redoslijedom. U SQL-u to radimo koristeći ORDER BY. Može prihvatiti izborni modifikator - ASC (zadano) sortiranje uzlaznim redoslijedom ili DESC, sortiranje silaznim redoslijedom:

SELECT id, naziv OD mjeseca ORDER BY name DESC

Kada koristite ORDER BY, provjerite je li na zadnjem mjestu u izjavi SELECT. U protivnom će se prikazati poruka o pogrešci.

4. Filtriranje podataka

Naučili ste kako odabrati određene stupce iz baze podataka pomoću SQL upita, ali što ako trebamo dohvatiti i određene retke? Ovdje u pomoć dolazi klauzula WHERE koja nam omogućuje filtriranje podataka ovisno o stanju.

U ovom upitu biramo samo te mjesece iz tablice mjesec, u kojem ima više od 30 dana korištenja operatora veće od (>).

SELECT id, naziv FROM mjesec WHERE dana > 30

5. Napredno filtriranje podataka. operatori I i ILI

Ranije smo koristili filtriranje podataka prema jednom kriteriju. Za složenije filtriranje podataka možete koristiti operatore I i ILI te operatore usporedbe (=,<,>,<=,>=,<>).

Ovdje imamo tablicu s četiri najprodavanija albuma svih vremena. Izaberimo one koji se svrstavaju u rock, a prodani su u manje od 50 milijuna primjeraka. To se lako može učiniti postavljanjem operatora AND između ova dva uvjeta.

SELECT * FROM albumi WHERE žanr = "rock" AND prodaja_u_milijunima<= 50 ORDER BY released

6. U/Između/Sviđa mi se

WHERE također podržava nekoliko posebnih naredbi, omogućujući vam da brzo provjerite najčešće korištene upite. Evo ih:

• IN – služi za označavanje raspona uvjeta od kojih se svaki može ispuniti
• BETWEEN – provjerava je li vrijednost unutar navedenog raspona
• LIKE – traži određene uzorke

Na primjer, ako želimo odabrati albume sa pop I duša glazbe, možemo koristiti IN("vrijednost1","vrijednost2") .

SELECT * FROM albuma WHERE žanr IN ("pop","soul");

Ako želimo dobiti sve albume izdane između 1975. i 1985., moramo napisati:

ODABERITE * IZ albuma GDJE objavljeni IZMEĐU 1975. I 1985.;

7. Funkcije

SQL je prepun funkcija koje rade razne korisne stvari. Evo nekih od najčešće korištenih:

• COUNT() – vraća broj redaka
• SUM() - vraća ukupni zbroj numeričkog stupca
• AVG() - vraća prosjek skupa vrijednosti
• MIN() / MAX() – Dobiva minimalnu/maksimalnu vrijednost iz stupca

Da bismo dobili posljednju godinu u našoj tablici, moramo napisati sljedeći SQL upit:

SELECT MAX(released) FROM albuma;

8. Podupiti

U prethodnom odlomku naučili smo kako napraviti jednostavne izračune s podacima. Ako želimo koristiti rezultat ovih izračuna, ne možemo bez ugniježđenih upita. Recimo da želimo ispisati umjetnik, album I godina izdanja za najstariji album u tablici.

Znamo kako dobiti ove specifične stupce:

ODABIR izvođača, albuma, objavljenog FROM albuma;

Također znamo kako dobiti najraniju godinu:

SELECT MIN(released) FROM album;

Sve što je sada potrebno je kombinirati dva upita koristeći WHERE:

SELECT izvođač,album,izdan FROM albuma WHERE objavljen = (SELECT MIN(izdano) FROM albuma);

9. Spajanje tablica

U složenijim bazama podataka postoji više međusobno povezanih tablica. Na primjer, u nastavku su dvije tablice o video igrama ( video igre) i programeri videoigara ( game_developers).

U stolu video igre postoji stupac programera ( programer_id), ali sadrži cijeli broj, a ne ime programera. Ovaj broj predstavlja identifikator ( iskaznica) odgovarajućeg programera iz tablice programera igara ( game_developers), logički povezujući dva popisa, omogućujući nam da koristimo informacije pohranjene u oba u isto vrijeme.

Ako želimo stvoriti upit koji vraća sve što trebamo znati o igrama, možemo koristiti INNER JOIN za povezivanje stupaca iz obje tablice.

SELECT video_games.name, video_games.genre, game_developers.name, game_developers.country FROM video_games INNER JOIN game_developers ON video_games.developer_id = game_developers.id;

Ovo je najjednostavniji i najčešći tip JOIN-a. Postoji nekoliko drugih opcija, ali one se odnose na manje uobičajene slučajeve.

10. Aliasi

Ako pogledate prethodni primjer, primijetit ćete da postoje dva stupca tzv Ime. Ovo je zbunjujuće, pa postavimo alias za jedan od ponavljajućih stupaca, ovako Ime sa stola game_developers bit će pozvan programer.

Također možemo skratiti upit dodavanjem alijasa nazivima tablica: video igre nazovimo igre, game_developers - programeri:

SELECT games.name, games.genre, devs.name AS developer, devs.country FROM video_games AS games INNER JOIN game_developers AS devs ON games.developer_id = devs.id;

11. Ažuriranje podataka

Često moramo promijeniti podatke u nekim redovima. U SQL-u to se radi pomoću naredbe UPDATE. Izjava UPDATE sastoji se od:

• Tablica u kojoj se nalazi zamjenska vrijednost;
• Nazivi stupaca i njihove nove vrijednosti;
• Reci odabrani pomoću WHERE koje želimo ažurirati. Ako se to ne učini, svi redci u tablici će se promijeniti.

Dolje je tablica TV serije s TV serijama i njihovom gledanošću. Međutim, u tablicu se uvukla mala greška: iako serija Igra prijestolja i opisana je kao komedija, zapravo nije. Popravimo ovo!

Tablični podaci tv_series UPDATE tv_series SET žanr = "drama" WHERE id = 2;

12. Brisanje podataka

Brisanje retka tablice pomoću SQL-a vrlo je jednostavan postupak. Sve što trebate učiniti je odabrati tablicu i redak koji želite obrisati. Izbrišimo posljednji red u tablici iz prethodnog primjera TV serije. To se radi pomoću instrukcije >DELETE.

DELETE FROM tv_series WHERE id = 4

Budite oprezni kada pišete naredbu DELETE i provjerite je li klauzula WHERE prisutna, inače će svi redovi u tablici biti izbrisani!

13. Brisanje tablice

Ako želimo obrisati sve retke, ali ostaviti samu tablicu, tada upotrijebimo naredbu TRUNCATE:

TRUNCATE TABLE ime_tablice;

U slučaju kada zapravo želimo obrisati i podatke i samu tablicu, tada će nam koristiti naredba DROP:

DROP TABLE ime_tablice;

Budite vrlo oprezni s ovim naredbama. Ne mogu se otkazati!/p>

Ovo zaključuje naš SQL vodič! Ima mnogo toga što nismo pokrili, ali ono što već znate trebalo bi biti dovoljno da vam pruži neke praktične vještine za vašu web karijeru.

Kokultiviranje limfocita koji imaju MHC-II molekule različitih haplotipova uzrokuje njihovu blast transformaciju i proliferaciju. Stanice koje odgovaraju pripadaju T-limfocitima i stimulirane su stranim MHC-II determinantama smještenim na B-limfocitima i makrofagima. Snaga reakcije ovisi o stupnju razlike između antigena histokompatibilnosti. Za procjenu reaktivnosti pojedinca na varijantu alela MHC-a priprema se jednosmjerna kultura limfocita. Da bi se to postiglo, stimulirajuće stanice su prethodno tretirane mitomicinom ili ozračene, dok stimulirajuće stanice gube sposobnost diobe, ali ostaju održive.

Reaktivnost u mješovitoj kulturi limfocita jedan je od kriterija u procjeni stanični imunitet. SCL vam omogućuje izvođenje HLA tipizacija, odabrati par davatelj-primatelj za transplantaciju tkiva i organa te provesti korelaciju između HLA antigena i određenih bolesti.

Za postavljanje reakcije koristi se suspenzija limfocita izoliranih iz krvi bolesnika (donora i primatelja). Isprane stanice koje reagiraju suspendiraju se u maloj količini medija 199 (0,5 ml) i, nakon prebrojavanja broja stanica, namjesti se na 0,6 x 106 stanica/ml. Suspenziju stimulirajućih stanica pripremit ćemo na sličan način uz dodatak otopine mitomicina C (500 μg mitomicina C u 1 ml puferirane fiziološke otopine) u omjeru od 0,1 ml na 1 ml suspenzije. Stanična smjesa se inkubira 40 minuta na 37 °C u vodenoj kupelji, uz miješanje, zatim se u suspenziju doda hladni medij 199 i stanice se isperu tri puta centrifugiranjem. Sediment je suspendiran u hranjivi medij uzgojem, dovodeći broj stanica na 0,6 * 10 6 stanica/ml.

0,1 ml stanične suspenzije u Hanksovoj otopini doda se u jažice sterilne imunološke ploče s okruglim dnom i doda se 0,1 ml stanične suspenzije koja nosi MHC alelne varijante. Ista količina Hanksove otopine dodaje se kontroli.

Rezultati se bilježe nakon inkubacije stanica na 37 °C tijekom 3-5 dana, ovisno o postavci reakcije, morfološkom ili izotopskom metodom (vidi RBTL).

Tijekom transplantacije koštana srž izbor histokompatibilnog darivatelja provodi se na temelju rezultata HLA tipizacije darivatelja i primatelja, kao i prilikom utvrđivanja kompatibilnosti odabranih HLA-identičnih parova darivatelj-primatelj u SCL-u, što je završna faza procjene kompatibilnosti. U tu svrhu koristi se dvosmjerna SCL reakcija mikrometodom kulture u ploči s 96 jažica uz procjenu količine proliferacije uključivanjem radioaktivnog H 3 -timidina u DNA proliferirajućih limfocita.

Trenutačno se puno pažnje posvećuje istraživanju uloge imunološki mehanizmi u reproduktivnom procesu, budući da njihovo kršenje dovodi do razvoja neplodnosti i ranog prekida trudnoće. Studije imunoloških parametara i njihova povezanost s reproduktivni procesi omogućilo nam je da zaključimo da je restrukturiranje nužno imunološki sustav kada se priprema majčino tijelo za trudnoću, počevši od ovulacijsko razdoblje, u vrijeme implantacije embrija i u rano razdoblje trudnoća.

Jedan od najsloženijih i najtežih za dijagnosticiranje uzroka neplodnosti i ponovljenih spontanih pobačaja je imunološka disfunkcija.

S ciljem pravovremeno otkrivanje imunološki pregled neplodnosti provodi se u laboratoriju za imunologiju reprodukcije bračni parovi korištenjem sljedeće metode dijagnostika:

• proučavanje razine proliferativnog odgovora limfocita žene na antigene partnera (u mješovitoj kulturi limfocita)
• određivanje aktivnosti blokirajućih čimbenika u krvnom serumu žene.
• procjena kvantitativnog sadržaja subpopulacija prirodnih citotoksičnih stanica u periferne krvižene.
• prošireni imunogram
• proučavanje sadržaja regulatornih stanica s supresorskom aktivnošću u perifernoj krvi.
• pri identificiranju kliničkih i laboratorijski znakovi Preporuča se imunološki pregled pacijenata s neplodnošću medicinski postupak– aloimunizacija limfocitima supruga, koja se provodi prema individualnom rasporedu.

Potrebna konzultacija:

• ako u nedostatku ginekoloških i endokrine bolesti Uz redovitu spolnu aktivnost godinu dana nema trudnoće.
• u slučaju ponovljenih (više puta) spontanih prekida trudnoće (pobačaja).
• na neuspješan IVF u anamnezi.
• kada prijeti prekid stvarne trudnoće.

Ako se otkriju poremećaji, propisuje se postupak u svrhu imunokorekcije poremećaja aloimunizacija s partnerskim limfocitima (AIL). Ova metoda tretman odobren za upotrebu Savezna služba za nadzor u oblasti zdravstva (licenca FS br. 2009/179 od 02.07.2009.)

Postupak se provodi samo ako partner ima negativni rezultati analiza za HIV infekciju, sifilis i virusni hepatitis(B, C). Nisu identificirane komplikacije s AIL-om. AIL metoda ima izražen imunokorektivni učinak, povećava učinkovitost liječenja neplodnosti, kao kod prirodni ciklus, i sa in vitro oplodnja(EKO). Također propisano za neuspješne pokušaje in vitro oplodnje.

AIL se provodi jednom svakih 28-30 dana (u skladu s menstrualnog ciklusažene) u 1. fazi ciklusa. Prvi tečaj uključuje 3 AIL postupka. Nakon 2. postupka par ponovno radi kontrolni test. Ako postoji pozitivna dinamika, treći AIL postupak je posljednji. Ako nema dinamike, doza stanica za imunizaciju se povećava i provodi se drugi tečaj koji uključuje 2 postupka. Nakon kontrolne analize, u nekim slučajevima potrebno je propisati 3. tijek imunizacije s povećanjem doze stanica. Nakon postizanja standardnih vrijednosti pozitivan učinak traje 6-8 mjeseci.

Za razdoblje od 2003. do 2013. godine. U laboratoriju stanične imunoterapije provedeno je oko 3000 postupaka aloimunizacije s partnerskim limfocitima. Za ovaj postupak iz partnerove krvi izoliraju se samo limfociti koji su uvijek prisutni u sjemenoj tekućini. U drugim zemljama* također se već 20 godina provodi postupak aloimunizacije koji pomaže ženi da nosi i rodi zdravo dijete.

Vrsta usluge	cijena, utrljati.
Test transformacije limfocita (Detekcija sesibilizacije u 1. stoljeću)	1650
Test transformacije limfocita (Detekcija sesibilizacije na 2b-va)	2 900
Test transformacije limfocita (Detekcija sesibilizacije na 3b-va)	3 900
Test transformacije limfocita (imunološki pregled na neplodnost)	3 200
Prošireni imunogram s aktivacijskim markerima	4 625
Sveobuhvatna studija imunološkog statusa	4 125
Cijepljenje (aloimunizacija limfocitima partnera 1 doza)	1 900
Cijepljenje (aloimunizacija limfocitima partnera, 2. doza)	2 750
Cijepljenje (aloimunizacija limfocitima partnera, 3. doza)	3 400
Ispitivanje CD16+/CD56+ limfocita (imunološki pregled na neplodnost samo NK stanice)	1 250
Studija aktivnosti makrofaga (kondicionirani mediji makrofaga)	9 400
Studija aktivnosti makrofaga (kondicionirani mediji)	1 500
Krioprezervacija mononuklearnih stanica za aloimunizaciju	650

2.2. Metode staničnih interakcija

Gotovo sve metode staničnih interakcija koje se koriste u kliničkoj imunogenetici temelje se na fenomenu stvaranja blasta u miješanoj kulturi limfocita, koji je otkrila kanadska istraživačica Barbara Bain. Reakcija miješane kulture limfocita (MLC) omogućila je provođenje fino diferenciranog istraživanja kompleksa HLA i, posebno, jedne od njegovih podjedinica - lokusa HLA-D. Niz drugih metoda staničnih interakcija - stanično posredovana limfoliza (CML), limfocitni početni test (Primed Lymphocyte Typing) - temelji se na MLC metodi ili je sadrži kao sastavni dio.

2.2.1. Miješana kultura limfocita (MCL)

Princip metode prikazan je na sl. 10, iz koje je jasno da dvije populacije genetski različitih limfocita međusobno djeluju u in vitro kulturi. Jedna od populacija je tretirana mitomicinom C ili ozračena, zbog čega gubi sposobnost stvaranja blasta i inkorporacije timidina (3 HT), međutim, bez gubitka antigenskih svojstava, zadržava sposobnost stimulacije (stimulansi; S -populacija).

Stanice koje reagiraju na stimulaciju (odgovarajuće, R-populacija) transformiraju se u blaste nakon nekoliko dana i uključuju timidin dodan kulturi. Intenzitet reakcije se mjeri uporabom radijacijskog tragača za ugradnju 3H-timidina.

Poznato je nekoliko varijanti reakcije mješovite kulture limfocita, od kojih su ovdje predložene dvije: tradicionalna i mikrovarijanta implementirana u Cookove tablete (slika 11).

Riža. 11. Oprema za mikrovarijante MLC i CML. 1 - tableta s okruglim dnom s 96 rupa; 2-automatska pipeta (“Pipetman”) s programom za različite volumene; 3 - automatska pipeta ("Sigma") za određeni volumen; 4 - jednokratni vrh pipete; 5 - kutija s laminarnim protokom

Tradicionalna verzija MLC-a (modifikacija F. S. Baranova):

Limfociti su izolirani na Ficoll-urografin gradijentu kako je gore opisano. Prvo ispiranje se provodi u PBS (NaCl - 8,0 g, Na 2 HP0 4 - 1,15 g, KH 2 PO 4 - 0,2 g, KCl - 0,2 g na 1 litru H 2 O); sljedeća dva su proizvedena u mediju 199 s 5% AB seruma (pool od 15 donora);

Stanice koje reagiraju resuspendiraju se u mediju 199 s 10% AB seruma i koncentracija stanica se podesi na 0,6 x 106 po ml;

Stimulirajuće stanice izolirane na isti način u koncentraciji od 5 - 10 6 po 1 ml tretiraju se mitomicinom C (60 γ/ml) tvrtke Serva i inkubiraju 40 minuta na 37°C u vodenoj kupelji. Nakon inkubacije, stanice se isperu 3 puta s medijem 199 s 5% AB seruma, resuspendiraju u mediju 199 s 10% AB seruma, dovodeći koncentraciju do 0,6 x 106 u 1 ml;

0,5 ml stanica koje reagiraju i 0,5 ml stimulirajućih stanica pomiješa se u epruveti za centrifugiranje, doda se 0,04 ml od 10 ml Hepes otopine (Serva) i inkubira 144 sata; iskustvo je smješteno u tri paralele (triplet);

24 sata prije kraja inkubacije dodajte 3 H-timidin 1μCi (3,7x10 4 BC) u epruvete, po uzorku specifična djelatnost 5mCi/mmol (18,5x107 BC/mmol) i nastaviti inkubaciju;

Na kraju inkubacije, stanice se prenose u milipore filtere (0,6 - 0,9 mikrona) i isperu slana otopina(37°C) i ohlađenu 5% otopinu trikloroctene kiseline (4°C). Filteri se osuše i stave u bočice s 5 ml scintilacijske tekućine (5 g PPO i 0,5 g POPOP - na 1 litru toluena) *. Aktivnost inkorporacije 3H-timidina mjeri se u β-brojaču; rezultat se izražava u apsolutnim uključivanjima radioaktivne oznake po 1 minuti ili u indeksu stimulacije (SI) prema formuli:

* (PPO - 2,5-fenol-oksazol; POPOR - (1,4-di-2-15-fenoloksazolitbenzen).)

Prosječna CPM vrijednost u tri prototipa

SI = Prosječna vrijednost CPM u tri kontrolna uzorka/Spontane kulture stanica koje reagiraju služe kao kontrolni uzorci.

Mikro verzija MLC-a u Cook tabletima. Na 8. radionici razvijeni su zahtjevi koji standardiziraju mikroopciju MLC-a, u skladu s kojima je ista navedena u nastavku:

Limfociti se izoliraju u isopaque-fikol gradijentu i resuspendiraju u RPMJ-1640 * mediju, dovodeći koncentraciju do 5x10 5 u 1 ml;

* (Može se koristiti medij 199 pomiješan s ljudskim serumom skupine AB (5% seruma uzetog od nekoliko pojedinaca).)

Stanice stimulatora tretiraju se mitomicinom C ili treningom;

5x10 4 respondera i isti broj stimulatora se stavlja pomoću mikropipete tipa Pipetman u svaku jažicu Cook mikropločice s okruglim dnom;

Ploče su inkubirane u termostatu s automatskim dovodom 5% CO2 tijekom 120 sati; zatim se u svaku jažicu doda lμmCi 3 H-timidin pri specifičnoj aktivnosti timidina od 6 Ci/mmol; sve manipulacije provode se pipetom Pipetman;

16 sati nakon dodavanja timidina, kulture iz svake jažice su prebačene u millipore filtere pomoću automatske pipete i isprane fiziološkom otopinom i zatim s 5% trikloroctene kiseline; prikladno je koristiti posebne "žetelice" za prijenos kulture u milipore filtere;

Aktivnost inkorporacije timidina određena je kako je gore opisano.

2.2.2. Stanično posredovana limfoliza (CML)

CML se u imunogenetskim studijama koristi relativno nedavno (od 1972.), ali u U zadnje vrijeme postaje sve više i više popularna tehnologija, što omogućuje detaljno proučavanje uloge eferentne veze transplantacijskog imuniteta i dobivanje priznanja kao informativna metoda imunološki monitoring. Princip metode prikazan je na sl. 12. Metoda se temelji na tehnici koju je predložio J. Lightbody (1971.), a koja je ukratko sažeta kako slijedi.

1. CML počinje konvencionalnim HLC testom, u kojem stanice koje reagiraju prepoznaju "stimulatore", senzibiliziraju stanice koje reagiraju i formiraju senzibilizirane stanice ubojice.

2. Druga faza, u kojoj se senzibilizirane stanice ubojice miješaju s 51 Cr-označenim ciljnim stanicama, sastoji se od uništavanja potonjih pomoću efektorskih stanica ubojica; ciljne stanice mogu imati isti genotip kao "stimulatori" u prvoj fazi MLC-a ili mogu biti stanice "trećeg" partnera, obdarene antigenskim determinantama zajedničkim "stimulatorima" ili bez njih.

3. Količina radioaktivnog kroma otpuštenog iz uništenih ciljnih stanica i otpuštenog u medij kulture služi kao mjera intenziteta ubojitog učinka.

Riža. 12. Princip stanično posredovane limfolize (CML). Redak I - senzibilizacija stanica koje reagiraju, stvaranje stanica ubojica; Red II - interakcija ubojica s metom; Red III - uništenje ciljne stanice; prinos 51 Cr medija kulture

Ovdje su opisane tri varijante CML-a: tradicionalna verzija koju je modificirao L.P. Alekseev (1979.), mikrovarijanta u Cookovim tabletama, izravni CML (Direct-CML -D-CML.

Tradicionalna opcija[Alekseev L.P., 1979].

Metoda je podijeljena u nekoliko faza.

Dobivanje ubojica:

Periferni limfociti obiju populacija (R-stanice i S-stanice) izolirani su na uobičajeni način, isprani tri puta u gradijentu gustoće u mediju 199 s 5% AB serumom (10 min, 150 g);

1x106 R stanica (0,8 ml) pomiješano je u centrifugalnim epruvetama s 2x106 S stanicama (0,2 ml) tretiranih mitomicinom C i inkubirano 144 sata na 37°C;

Stanice se centrifugiraju na 150 g 10 minuta, a sediment se resuspendira u mediju 199 uz dodatak 20% telećeg seruma (medij 199 + tj.), dovodeći koncentraciju do 1x106 u 1 ml;

Jedan od uzoraka ostavljen je za proučavanje razine MLC-a, ostali se koriste kao gotove ubojice.

Dobijanje ciljeva:

Limfociti izolirani na uobičajeni način resuspendirani su u mediju 199 s 20% AB seruma i inkubirani s fitohemaglutininom (0,003 mg/ml Wellcome) 72 sata na 37°C; koncentracija stanica 1x10 6 u 1 ml;

Stanice se centrifugiraju 10 minuta na 150 g, sediment se resuspendira u mediju 199 s 5% AB seruma i koncentracija stanica se podesi na 2x10 4 u 1 ml;

51 Cr 100 μCi/ml (3,7x10 6 BC/ml) se doda u suspenziju i inkubira 40 minuta na 37°C;

Stanice se isperu tri puta u mediju 199 uz dodatak 5% AB seruma (150 g, 10 min) i sediment se resuspendira u mediju 199 s 5% AB seruma. dovodeći koncentraciju na 2x10 4 u 1 ml.

Postavljanje reakcija:

5x105 ubojica (0,5 ml) pomiješano je s 1x104 meta (0,5 ml), inkubirano 4 sata (37°C) i centrifugirano na 150 g 10 minuta;

Supernatant se aspirira i impuls uzrokovan 51 Cr se broji na brojaču; brojanje se provodi u 0,5 ml supernatanta;

Razina citolize izračunava se prema sljedećoj formuli:

Ekper. izlaz 51 Cr - spontani izlaz 51 Cr/max, izlaz 51 Cr - spontani izlaz 41 Cr × 100.

Spontano otpuštanje kroma mjeri se na metama inkubiranim 4 sata (37°C) bez stanica ubojica; maksimalni prinos kroma - na ciljevima potpuno uništenim smrzavanjem i odmrzavanjem; Svi testovi se provode u tripletima.

Mikrovarijanta CML-a u tabletama [prema Mawas S., 1976.]:

Faza dobivanja killera provodi se kao MLC u pločama s okruglim dnom, ali se R- i S-stanice miješaju u jednakim količinama, 2x10 5 pa svaka jažica i inkubiraju na 37°C;

Nakon 5 dana, stanice se sakupe Pasteur-ovom pipetom u epruvetu, izbroji se broj živih pomoću tripan plavetnila i podesi koncentracija na 10x10 6 u 1 ml;

Ciljne stanice se uzgajaju s PHA 3 dana;

Na dan reakcije, ciljne stanice se isperu (300 g) i resuspendiraju u mediju kulture, raspoređujući 1 ml u epruvete i podešavajući na 1x10 6 u 1 ml;

Dodajte 200 μCi 51 Cr (7,4x10 6 BC) u svaku epruvetu s ciljnim stanicama i inkubirajte 1 sat na 37°C; oprati ćelije 3 puta; sediment se resuspendira i namjesti na koncentraciju 1x10 u 1 ml (živo);

Test se provodi u mikropločicama s okruglim dnom; za to, 0,7 - 1x106 stanica ubojica (0,1 ml) i 1x104 ciljnih stanica (0,1 ml) raspoređeno je u svaku jažicu; ukupni volumen suspenzije u svakoj jažici je 0,2 ml, dodajte 0,05 ml medija u svaku jažicu i inkubirajte (37°C) 4 sata;

Ploče su centrifugirane na 800 g na Beckman centrifugi 10 minuta; supernatant iz svake jažice se prenese u epruvete i broji na γ-brojaču;

Faza proizvodnje stanica ubojica (MLC) provodi se na mediju RPMJ-1640 uz dodatak 20% humane plazme; za fazu ubijanja koristite MEM medij s dodatkom 20% ljudske plazme, prethodno zagrijane.

Izravni CML (D-CML). Izravni CML je tehnika razvijena posebno za kliničke svrhe koja se koristi u imunološkom praćenju. Shema ove reakcije prikazana je na sl. 13.

Glavna razlika od tradicionalnog CML-a je u tome što se faza stvaranja stanica ubojica (faza senzibilizacije) ne događa in vitro, već in vivo, tj. u ljudskom tijelu senzibiliziranom transplantacijom alogenog organa ili tkiva. Zbog djelovanja alogenog tkiva, limfociti primatelja su senzibilizirani na tkivne antigene davatelja i ne zahtijevaju poseban tretman in vitro, trajanje testa je značajno vremenski skraćeno, jer se prethodno moraju pripremiti samo mete.

Upotrijebljene mete su limfociti dobiveni iz periferne krvi ili, češće, iz slezene davatelja (vidi 2.1.2) i zamrznuti bilo kojom od gore opisanih metoda (vidi 2.1.3).

2.2.3. Citotoksičnost posredovana stanicama ovisna o antitijelima (ADCC)

Ova vrsta staničnog odgovora po mehanizmu djelovanja slična je gore opisanom CML-u. Princip reakcije prikazan je na sl. 14. Komponente reakcije su ciljne stanice (donorske stanice ili alogeni limfociti), serum (alogeni ili primateljski), koji vjerojatno sadrži antitijela usmjerena na determinante ciljnih stanica, i efektorske stanice (primateljski limfociti ili alogeni limfociti).

Efektorske stanice u ovoj vrsti interakcije su takozvane K-stanice koje se nalaze u perifernoj krvi. Za razliku od stanica ubojica u CML-u, one provode citotoksični učinak bez prethodne senzibilizacije, međutim, očitovanje citotoksičnog učinka K stanica moguće je samo putem protutijela usmjerenih na determinante ciljnih stanica. Specifična liza mjeri se otpuštanjem 51 Cr ako ispitivani serum sadrži protutijela na ciljne determinante.

Ciljne determinante u ADCC mogu biti praktički specifičnosti svih HLA lokusa, uključujući HLA-D, HLA-DR, kao i determinante koje leže izvan HLA sustava.

Najrašireniji Ova složena reakcija dobivena je u imunološkom praćenju za otkrivanje antitijela B-stanica. S tim u vezi, predloženo je nekoliko modifikacija, koje predviđaju obogaćivanje suspenzije ciljnih stanica B limfocitima, adsorpciju seruma na trombocite itd.

Uz to, u obzir se uzimaju i brojne druge karakteristike odziva u ovom sustavu. Ispitni serum mora biti dekomplementiran, inače bi reakcija mogla biti citotoksičnost ovisna o komplementu posredovana protutijelima. Također se pretpostavlja da efektorske stanice mogu uzrokovati određenu destrukciju meta prema tipu CML-a.

U konačnici, cjelokupni skup uzoraka u stanično-posredovanom limfocitotoksičnom testu ovisnom o antitijelima je sljedeći:

Mete + efektori + ispitni serum (pokusni uzorak);

Mete (kontrolni uzorak, tj. spontano otpuštanje 51 Cr);

Mete + efektori (kontrolni test za aktivnost efektora);

Mete + test serum (kontrola seruma).

Limfociti su izolirani rutinski i resuspendirani u RPMI-1640 + 10% fetalnog goveđeg seruma; tretiranje suspenzije karbonilnim željezom za uklanjanje monocita; dodati amonijev klorid ili H 2 O za lizu preostalih crvenih krvnih stanica;

51Cr u obliku otopine Na2CrO4 100 - 200 µCi ml (3,7x106 - 7,4x106 BC/ml) doda se u suspenziju ciljnih stanica i inkubira 40 - 60 minuta;

Stanice su isprane tri puta u RPMI + 0,1% HSA, resuspendirane u istom mediju i podešene na 2x108 u 1 ml; 50 µl suspenzije obilježenih stanica stavi se u epruvetu i zatim se izračuna aktivnost izotopa na γ-brojaču kako bi se identificirala potpuna izotopska "asimilacija"; ostatak se izlije u jažice ploče, 50 µl suspenzije (1x10 5 stanica po jažici);

Suspenzija efektorskih stanica se dovede do 2x107 stanica u 1 ml i c. svaka jažica je napunjena sa 50 µl suspenzije (ili 100 µl), omjer efektora i ciljeva je 10:1 (ili 20:1);

Inkubacija se nastavlja 4 sata u vlažnoj atmosferi termostata s 5% CO 2 (trajanje inkubacije može se produžiti do 8 sati);

Pripremite nekoliko razrjeđenja ispitnog seruma u epruvetama (1:25; 1:100) i dodajte do 50 µl svakog razrjeđenja u jažice: i nerazrijeđeni serum; konačna postavka testa izgleda kao što je prikazano u tablici. 23.

Tablica 23

ADCC staging. Sve opcije uzorka, µl

* (Umjesto testnog seruma ukapa se pul AB seruma.)

** (Umjesto testnog seruma ukapa se monospecifični HLA serum usmjeren protiv ciljeva (ne efektora).)

Inkubacija ploča nastavlja se 4 sata u vlažnoj atmosferi s 4% CO 2 ; trajanje inkubacije može se produžiti do 8 sati;

Nakon inkubacije, pola volumena iz svake jažice (100 μl) pažljivo se aspirira automatskom pipetom i stavi u 51 Cr epruvete za brojanje pulsa; aktivnost se broji na γ-brojaču;

Izračuni su sljedeći:

% oslobađanja 51 Cr = 2 × A op - pozadinska aktivnost/B - pozadinska aktivnost × 100;

% citotoksičnosti = A op - A sp /100 - A sp × 100, gdje je A op % otpuštanja 51 Cr u pokusnim uzorcima; A sp - % spontanog otpuštanja; B - potpuna asimilacija izotopa.

Kako pozitivan rezultat Citotoksičnost od 5% ili viša smatra se nakon 4 sata inkubacije.