Лабораторна диагностика на хелминтоза. Метод за изолиране на чиста култура от лайшмания, получена чрез изстъргване на патологични тъкани

Прости методи

Макроскопски метод. При изследване на изпражненията можете да намерите хелминти, техните глави, сегменти и фрагменти от стробили, освободени независимо или след обезпаразитяване. Този метод се препоръчва особено за идентифициране на ентеробиоза, тениаза и тениаринхоза.

Малки порции изпражнения се смесват с вода в плоска вана или в петриево блюдо и се гледат добро осветлениена тъмен фон, с помощта на лупа, ако е необходимо, отстранете хелминтите и всички подозрителни бели образувания с пинсети или пипета. Събраният материал се прехвърля в друга чаша с вода или върху предметно стъкло в капка разреден глицерол или изотоничен разтвор на натриев хлорид за по-нататъшно изследване.

При метода на утаяване цялата част от изпражненията, които се изследват, трябва да се смеси с вода в стъклен цилиндър, след което внимателно да се отцеди горен слойвода. Това се повтаря няколко пъти. Когато течността стане бистра, тя се отцежда и утайката се изследва на малки порции в стъклена баня или петриево блюдо, както е посочено по-горе.

Микроскопските методи са основният начин за изследване на изпражненията за откриване на яйца или ларви на хелминти. Различните методи на изследване са описани по-долу. За да се повиши надеждността на изследването, тестовете могат да се повтарят няколко пъти дневно или с интервал от 1-3 дни.

Метод нативна цитонамазка. Нативната цитонамазка е най-разпространената и технически наличен методфекални изследвания. В нативна намазка можете да откриете яйца и ларви на всички видове хелминти. Въпреки това, ако броят на яйцата в изпражненията е малък, те не винаги могат да бъдат открити. Следователно изследването на изпражненията само с нативна цитонамазка не е пълно и трябва да бъде допълнено с методи за обогатяване. Ефективността на изследване на нативна цитонамазка е значително подобрена чрез гледане на четири предметни стъкла, приготвени от проба от изпражнения върху две предметни стъкла без покривни стъкла, което позволява да се изследва общо приблизително същото количество изпражнения, както при метода Kato (вижте по-долу).

Малко количество (с размер на кибритена глава) смесени изпражнения се намазва тънко с дървена пръчка върху повърхността на предметно стъкло в капка 50% разтвор на глицерин. Обикновено се приготвят две намазки на едно предметно стъкло. Натривката се разглежда под микроскоп с ниско увеличение (том 8, прибл. 7). В съмнителни случаи се покрива с покривно стъкло и се изследва при голямо увеличение (увеличение 40).

За приготвяне на голяма нативна намазка 200-300 mg изпражнения (колкото грахово зърно) се смилат върху стъкло с размери 6x9 cm в 15-20 капки 50% воден разтвор на глицерин. Поглед под бинокулярен стереоскопичен микроскоп (об. 4, прибл. 12,5 или об. 2, прибл. 17) в пропускаща светлина без покривни стъкла. В съмнителни случаи можете да превключите обектива на по-голямо увеличение. В такива намазки оцветените големи яйца на хелминти са ясно видими, докато прозрачните яйца на джуджето тения са малко по-лоши. Този метод не е подходящ за откриване на малки яйца. В същото време големият обем на изследвания материал и голямото зрително поле с висока дълбочина на полето осигуряват значителна ефективност на тази модификация в сравнение с конвенционалната нативна намазка.

Плътната намазка с целофан (метод Като) е по-ефективна от изследването на нативна намазка, но също така изисква комбинация с методи за обогатяване. Откриват се яйца от всички видове хелминти, но за да се открият яйца от тения джудже (прозрачни яйца) или описторхид (малки яйца), лаборантът трябва да бъде особено внимателен да не ги пропусне (фиг. 21).

Методът се основава на откриването на яйца на хелминти в дебела натривка от изпражнения, изчистена с глицерин и оцветена с малахитово зелено. Предхидрофилният целофан се нарязва на плочи с размери 20 х 40 mm и се потапя в Kato смес (6 ml 3% воден разтвор на малахитово зелено, 500 ml глицерин, 500 ml 6% разтвор на фенол). 3-5 ml от сместа са достатъчни за 100 плочки, които са готови за употреба след един ден и могат да се съхраняват в същата смес в добре затворен съд на стайна температура 6 месеца. При липса на малахитово зелено (препоръчва се за намаляване на умората на очите на лаборанта) и фенол (дезинфектант), можете да използвате само 50% воден разтвор на глицерол, ефективността на изследването не се намалява.

Ориз. 20. Метод за приготвяне на дебела натривка с целофан по Kato

100 mg изпражнения се нанасят върху предметно стъкло, покрито с целофанова пластина, обработена, както е посочено по-горе, и притисната надолу с гумена запушалка, така че изпражненията да не се разпространяват изпод целофана. Микроскопията при ниско или високо увеличение на микроскопа се извършва не по-късно от 1 час (при горещо време - 30-40 минути) след приготвяне на намазката. Причината за непрозрачността на лекарството може да бъде дебел слой изпражнения, лоша обработка на плочата в сместа Kato или недостатъчен период на излагане на лекарството под целофан. Продължителното изчистване с глицерин и прекомерното изсушаване на препарата също затрудняват откриването на яйца.

Метод на усукване според S.S. Шулман. Методът е предложен за откриване на ларви на хелминти, предимно стронгилоиди, в изпражненията. Изследват се само прясно отделени изпражнения, като 2-3 g от тях се прехвърлят в стъклен буркан, разбъркват се със стъклена пръчка с кръгови движения с 3-5-кратно количество физиологичен разтвор, без да се докосват стените на съда. В центъра се натрупват яйца и ларви на хелминти. След приключване на смесването, капката в края на пръчката бързо се прехвърля върху предметно стъкло, покрива се с покривно стъкло и се изследва под микроскоп.

Методи за обогатяване. Методите за обогатяване се основават на разликата в специфичното тегло на яйцата и използвания физиологичен разтвор, което им позволява да бъдат открити в малки количества. Ако специфичното тегло на яйцата е по-голямо от специфичното тегло на течността, тогава яйцата се концентрират в утайка, която се изследва под микроскоп. Този метод на утаяване се използва за яйца на трематоди. При по-голямо специфично тегло на разтвора яйцата изплуват на повърхността на течността и след това филмът се изследва. Това са флотационни (плаващи) методи, те са най-ефективни за откриване на яйца от анкилостоми, камшични червеи и джуджета.

Флотационни методи. Методът на Fulleborn се основава на плаване на яйца от хелминти в наситен разтвор на натриев хлорид, който има висока относителна плътност (1,2), което позволява откриването на яйца в малки количества. Методът е по-ефективен от изследването на нативна цитонамазка, но е по-сложен. Предимствата на метода са ниска цена и достъпност. Препоръчително е да се комбинира изследването на нативната цитонамазка и метода на Фулеборн.

Наситен разтвор се приготвя чрез разтваряне на 400 g натриев хлорид в 1 литър вода при кипене. Относителната плътност на разтвора е 1,18-1,22. Разтворът се съхранява в затворена бутилка. За извършване на анализа 2-3 g изпражнения се поставят в буркан с обем 30-50 ml и при разбъркване с пръчка се добавя наситен разтвор на натриев хлорид почти до върха. Използва се лента хартия за бързо отстраняване на големи плаващи частици. След 45-60 минути. След утаяване с телена примка, отстранете повърхностния филм и го прехвърлете върху предметно стъкло в капка 50% воден разтвор на глицерол. Вместо да отстранявате филма с примка, можете да добавите разтвора в буркана до върха, покрийте с предметно стъкло, към чиято повърхност се залепват плаващите яйца. Подготвят се няколко препарата. Допълнително се изследват 2-4 препарата от утайката, като се събира с очна пипета върху 2 предметни стъкла. В допълнение към повърхностния филм е необходимо да се изследва и утайката, тъй като яйцата на трематоди, тениди и неоплодени яйца на кръгли червеи не плуват в този разтвор. Яйцата на редица хелминти не изплуват веднага на повърхността в солен разтвор. Така че, ако максималният брой яйца на джудже тения се появяват след 15-20 минути, тогава ascaris - след 1,5-2 часа, камшичен червей - след 2-3 часа.

По този начин предимствата на този метод включват неговата ниска цена и достъпност, недостатъците са необходимостта от преглед на препаратите върху повърхностния филм и утайката, както и продължителността на утаяване.

Методът на E.V. Kalantaryan също е метод за обогатяване, но е по-ефективен и по-прост от метода на Fulleborn. Използва се наситен разтвор на натриев нитрат с относителна плътност 1,38. Поради това яйцата на повечето хелминти плават и се намират в повърхностния филм; не е необходимо изследване на утайката.

За да се приготви наситен разтвор на натриев нитрат, 1 kg сол на натриев нитрат (натриев нитрат) се разтваря в 1 литър вода и се вари, докато се разтвори напълно и се образува филм на повърхността. Без да се филтрира се налива в суха бутилка. При липса на натриев нитрат може да се замени с амониев нитрат (амониева селитра), като се разтварят 1,7 kg на 1 литър вода. Относителната плътност на получения разтвор е 1,3, което леко намалява ефективността в сравнение с разтвор на натриев нитрат.

Предимства на метода: яйцата на повечето хелминти плават бързо и се намират в повърхностния филм, което елиминира необходимостта от изследване на утайката. Недостатъците на метода са дефицитът на натриев нитрат, както и фактът, че яйцата на трематодите и онкосферите на тенидите не плават и остават в утайката. Трябва да се има предвид, че когато изпражненията се държат в разтвор за дълго време (повече от 1-2 часа), яйцата на някои хелминти започват да набъбват и да се утаяват, изчезвайки от повърхностния филм.

Седиментационни методи

Методът на П. П. Горячев се основава на принципа на утаяването на яйцата. В този случай намазката се оказва лека, без груби примеси, което улеснява откриването на малки яйца от трематоди (описторхид и др.). Специфичното тегло на яйцата на описторх е високо, така че те не плуват в солеви разтвори.

70-100 ml наситен разтвор на натриев хлорид се налива в цилиндър с диаметър 2-3 cm. Отделно внимателно се разбърква 0,5 g изпражнения в 20-25 ml вода и внимателно се филтрира през фуния с два слоя марля в цилиндър за физиологичен разтвор, като се избягва разбъркването (така че да се образуват два ясно разграничени слоя). След 2-3 часа горният слой с изпражненията се изсмуква с пипета, а останалият физиологичен разтвор се оставя да престои 12-20 часа или се центрофугира. Утайката се пипетира върху предметно стъкло, покрива се с покривно стъкло и се изследва под микроскоп.

Методът на Goryachev е предложен за откриване на описторхидни яйца и се оказва по-ефективен от изследването на нативна намазка и метода на Fulleborn. Понастоящем за диагностициране на описторхоза (клонорхиаза) се препоръчват методите на Като и Калантарян като доста ефективни и технически по-прости.

Методът на Красилников. Под въздействието на повърхностноактивни вещества, включени в детергентите, яйцата на хелминтите се освобождават от изпражненията и се концентрират в утайка.

Предварително пригответе 1% разтвор на прах за пране Lotus. За да направите това, 10 g прах се разтварят в 1 литър чешмяна вода. Ако Lotus не е наличен, можете да използвате други прахове за пране, но трябва да вземете толкова от всеки от тях, колкото да се разтвори без образуване на утайка в 1 литър чешмяна вода. В стъклен съд с вместимост 30-50 ml се изсипват 20-30 ml разтвор на почистващ препарат, поставя се малка част от изпражненията и се разбърква добре. Съотношението на изпражненията към разтвора трябва да бъде приблизително 1:20. Изпражненията трябва да бъдат в разтвора най-малко 24 часа. През това време на дъното се образува утайка от 2-3 слоя. Долният слой се състои от груби, тежки частици, яйца на хелминти се събират в средния слой, а горният слой е белезникаво-сиви люспи. След това с помощта на пипета вземете 2-3 капки течност от средния слой и я прехвърлете върху предметно стъкло. Приготвят се 2 препарата на едно предметно стъкло, покриват се с покривно стъкло и се изследват под микроскоп.

Методът на Красилников дава възможност за откриване на яйца от всички видове хелминти, екскретирани с изпражненията.

Метод на утаяване с етер-формалин и метод на химическо утаяване висока ефективностса много трудоемки, особено по време на масови прегледи, поради което е по-препоръчително да се използва етерно-оцетният метод. Позволява, след допълнителна обработка на утайката с химически реактиви, да се получат почти само яйца от хелминти, което улеснява идентифицирането на малки яйца от трематоди. Този метод се оказа универсален, като открива яйца на всички чревни хелминти, цисти на чревни протозои, а също така може да се използва за количествено определяне на интензивността на инвазията.

7 ml от 10% разтвор се излива в центрофужни градуирани епруветки оцетна киселинаи добавете 1 g изпражнения до марката 8 ml. Изпражненията се разбъркват старателно с пръчка, докато се образува хомогенна смес, след което се филтрират през два слоя марля в друга центрофужна епруветка (така че новата епруветка с прецедения разтвор отново да съдържа 8 ml; ако е по-малко, можете допълнително изплакнете фунията с превръзка с 10% разтвор на оцетна киселина, през която филтрирайте разтвора на изпражненията). Добавете 2 ml етер към тази епруветка (до маркировката 10 ml), запушете я и разклатете енергично в продължение на 30 секунди. Сместа се центрофугира при 3000 rpm за 1 минута (или 2 минути при 1500 rpm). Коагулантният слой (под формата на тапа в горната част на епруветката) се отделя от стените на епруветката с клечка и внимателно се отцежда заедно със супернатантната течност. Утайката (обикновено малка, безцветна) се пипетира върху предметни стъкла, покрива се с покривно стъкло и се изследва под микроскоп.

Протозоите са разделени на 4 класа:

При енцистиране микроорганизмът придобива кръгла форма и се покрива със защитна обвивка. Под формата на киста протозоите стават по-малко податливи на неблагоприятни фактори на околната среда.

Следното може да бъде обект на изследване:

Забележка:Има много видове диагностика, ще разгледаме тези видове, които са най-често срещани в клиничната лабораторна практика.

Индивидуални видове диагностика

Във всеки конкретен случай лаборантът има за задача да открие конкретен патоген, понякога заедно с основния се откриват и други.

Има 6 вида от този микроорганизъм, способен да живее в червата на човека. Клинично значение има само дизентерийната амеба, която се среща във вегетативна форма и под формата на цисти.

Освен това се използват имунологични методи:

• индиректна имунофлуоресценция;
• индиректна аглутинация (INA);
• радиална имунодифузия.

Забележка: серологични методиса неинформативни и се използват само като допълнение към основните в съмнителни случаи.

Диагностика на ресничести (ресничести)

Патогенната форма на микроорганизмите от този род е балантидий. Това е микроб, който причинява балантидиаза, заболяване, придружено от язвен процес на дебелото черво. Патогенът се открива в нативната намазка под формата на вегетативна форма и киста. Материалът за намазката (изпражнения и слуз) се взема по време на сигмоидоскопско изследване и се засява върху специални среди.

Диагностика на камшичести (лайшмания, лямблия, трипанозома, трихомонада)

Лайшманията, трипанозомите, ламблиите и трихомонадите са опасни за хората.

Лайшмания– микроби, причиняващи лайшманиоза, се изследват в кръвни натривки, материали костен мозък, изстъргвания от кожни инфилтрати. В някои случаи при диагностициране на лейшмания се използва култура върху хранителни среди.

Трипанозоми– причинители на сънна болест (американска/африканска трипанозомоза или болест на Шагас).

Африканският вариант се определя в началния период по време на изследването на периферната кръв. С напредване на заболяването патологични микроби се откриват в материала от пункции на лимфни възли, а в напреднал стадий - в цереброспиналната течност.

За диагностициране на трипанозоми, ако има съмнение за болест на Chagas, изследваният материал се изследва под микроскоп при ниско увеличение. В този случай петната и дебелата капка се оцветяват предварително.

Трихомонада(чревни, орални,) се откриват чрез микроскопия на материали, взети от засегнатите лигавици.

Идентифициране на спорозои (малариен плазмодий, причинител на кокцидоза и др.)

Най-често срещаният и опасен вид за хората е маларийният плазмодий, който има 4 основни вида патогени: причинител на тридневна малария, четиридневна малария, тропическа малария и овална малария.

Сексуалното развитие на плазмодия (спорогония) протича при комарите Anopheles. Безполов (тъканна и еритроцитна шизогония) – в чернодробната тъкан и еритроцитите на човека. Тези функции жизнен цикълтрябва да се има предвид при диагностицирането на малариен плазмодий.

По този начин в кръвта на новоболен пациент могат да бъдат открити зародишни клетки от спорогониевия цикъл. Но в разгара на маларийните атаки шизонтите се появяват в големи количества в кръвта.

Освен това в различни фази на маларийна треска се появяват различни форми на плазмодий:

• по време на студения период кръвта се изпълва с мерозоити, вид шизонт;
• при повишени температури в еритроцитите се натрупват пръстеновидни трофозоити;
• понижаването на температурата се характеризира с преобладаване на амебоподобни трофозоити;
• в периоди на нормално състояние кръвта съдържа възрастни форми на шизонти.

Изследването на причинителя на маларията (маларичен плазмодий) се извършва в намазка и в дебела капка.

Забележка:Диагнозата на малария чрез изследване на петна и дебели капки кръв понякога е погрешна. Тромбоцитите в кръвта в някои случаи могат погрешно да бъдат приписани на маларийния патоген. Също така понякога фрагменти от левкоцити и други клетки симулират плазмодий.

Основни методи за изследване на протозоите

Нека разгледаме накратко най-често срещаните методи за изследване на наличието на протозои.

Диагностика на протозои чрез нативна цитонамазка и цитонамазка, оцветена с разтвор на Лугол (в изпражнения)

Лекарството се приготвя от емулсия на изпражнения в изотоничен разтвор. Две капки натриев хлор и разтвор на Лугол се нанасят върху предметно стъкло. Тестовият материал се добавя към двата състава с дървена пръчица и след покриване със стъкло се разглежда при различни разделителни способности на микроскопа.

Намерените протозои се записват въз основа на определени характеристики. За точност пригответе 2-3 препарата от един и същи материал. В съмнителни случаи анализът се повтаря няколко пъти в продължение на 2-3 седмици.

Методът може да открие вегетативни и кистозни форми:

• ламблия;
• балантидий;
• дизентерийна амеба.

Наред с патогенните форми се идентифицират и непатогенни протозои. Също така при здрави носители има луминални и кистозни форми.

Важно:изследванията трябва да се извършват многократно, за да се избегнат неточности и грешки.

Резултатът от диагностицирането на протозои с помощта на нативния и оцветен метод на намазка трябва да съдържа описание на формата на патогена (луминал, киста, тъкан).

Изисквания за изследване:

• материалът, взет за анализ (течни изпражнения), се изследва не по-късно от 30 минути след дефекацията;
• формализираните изпражнения трябва да бъдат диагностицирани в рамките на 2 часа след дефекация;
• материалът не трябва да съдържа примеси (дезинфектанти, вода, урина);
• за работа с материала използвайте само дървени пръчки, стъклените не са подходящи поради подхлъзване на слуз;
• Пръчките трябва да се изгорят веднага след употреба.

Метод за запазване (изследване на изпражненията) за диагностициране на протозои

Изследването се провежда чрез фиксиране на протозои с консервант. Разликата между този метод и предишния е, че консервантите ви позволяват да запазите лекарството за дълъг период от време.

Използвани консерванти:

• Бароу. Съдържа консерванти: 0,7 ml натриев хлорид, 5 ml формалин, 12,5 ml 96% алкохол, 2 g фенол и 100 ml дестилирана вода. Състав на оцветителя: 0,01% разтвор на тионин (азура).
• Решението на Сафарлиев. Състав: 1,65 g цинков сулфат, 10 ml формалин, 2,5 g кристален фенол, 5 ml оцетна киселина, 0,2 g метиленово синьо, 100 ml вода. Този консервант се използва в случаите, когато материалът трябва да се съхранява повече от месец.

Празните бутилки се пълнят с консервант, материалът се прехвърля в тях в съотношение 3:1, след което се добавя оцветител, ако е необходимо. Резултатите се оценяват чрез изследване на 2-3 лекарства.

Метод за обогатяване на формалин-етер (анализ за наличие на протозои в изпражненията)

Този диагностичен метод ви позволява да отделите и концентрирате протозойни кисти. За анализа са необходими следните съставки: формалдехид (10 ml), 0,85 g изотоничен разтвор, дестилирана вода, серен етер, разтвор на Лугол.

Сместа от биоматериал с изброените течности се смесва и центрофугира. Получената утайка на дъното на епруветката се оцветява с разтвор на Лугол и се изследва за наличие на цисти и вегетативни форми.

Метод за откриване на лайшмания (намазка от костен мозък)

За диагностициране на лайшманиозата се използват следните реактиви: смес на Никифоров (серен етер и етанол), фосфатен буфер, азур-еозин по Романовски.

Субстанцията от костен мозък се поставя много внимателно върху предметно стъкло след специална подготовка. Използва се микроскоп с имерсионна система.

По време на острия период на заболяването в пунктата се откриват голям брой лайшмании.

Забележка:Понякога кръвни клеткиможе да наподобява преработена лайшмания, така че е много важно лабораторният техник да бъде внимателен и да има достатъчно опит за провеждане на независими изследвания.

Метод за откриване на лайшмания в цитонамазка от кожен инфилтрат

Необходимите реактиви са подобни на предишния анализ.

Материалът за изследване се получава от съществуващото туберкулозно или язвено съдържание. При съмнение за лайшманиоза изстъргването се прави много внимателно със скалпел, без кръв. След това препаратът се приготвя върху стъкло. За да се гарантира точността на получените резултати, няколко препарата се изследват едновременно.

При наличие на заболяването лейшмания се открива и сред макрофагите, фибробластите и лимфоидните клетки, присъстващи в тестовия материал.

Метод за изолиране на чиста култура от лайшмания, получена чрез изстъргване на патологични тъкани

С този метод за диагностициране на протозои тъканните изстъргвания се поставят в специален хранителна среда, при които се извършва активно размножаване на Leishmania.

Преди да вземете остъргването, кожата се третира старателно с алкохол, след което се прави разрез на туберкула, от дъното на което се отстранява съдържанието и се поставя в епруветка със среда. Материалът се взема няколко пъти, след което се поставя в различни епруветки. След това се извършва култивиране в термостат при температура 22-24 градуса. Резултатите се оценяват под микроскоп. Този метод се използва, когато други, по-евтини и по-бързи методи за диагностициране на протозои са неефективни.

Можете да видите как тестовете за наличие на протозои с помощта на капка кръв се дешифрират на практика, като гледате видео прегледа:

Лотин Александър, медицински колумнист

Методи хелминтологични изследваниясе делят на преки и непреки. Директни методи: откриване на самите хелминти, техните фрагменти, яйца, ларви в изпражнения, урина, дуоденални секрети, храчки, назална и вагинална слуз, съдържание на поднокътни пространства, биопсирани парчета тъкан. Косвени методи: идентификация вторични промени, възникващи в човешкото тяло в резултат на жизнената активност на паразита, серологични реакции, общи изследваниякръв, урина. Най-често срещаните методи за изследване на изпражненията са хелминто-овоскопски и протозооскопски. При диагностицирането е невъзможно да се идентифицират яйца или ларви на всички видове хелминти, живеещи в храносмилателната системачовек. По този начин, когато се използва методът на флотация, яйцата на трематодите и в някои случаи неоплодените яйца на кръгли червеи не изплуват в повърхностния филм (поради високото им специфично тегло). Много рядко се откриват яйца от острици и онкосфери от тениди в изпражненията, които се откриват с помощта на специални методи за изследване: изстъргване от перианалните гънки за острици и тенииди, методи на утаяване за трематоди (яйца от описторхид и др.). Следователно, за целенасочен преглед на пациент за хелминтни инфекции, лекарят в препоръката трябва да посочи върху кои хелминти трябва да се насочи (диагноза), което ще позволи на лаборанта да избере подходящата техника за идентифициране на този тип хелминти. Изпражнения взети от различни местаизпражненията в количество най-малко 50 грама (чаена лъжичка) в чист стъклен съд трябва да бъдат изпратени в лабораторията не по-късно от 24 часа след дефекация и изследвани в деня на получаване. Ако е необходимо да се запазят изпражненията до следващия денпоставя се на студено място (0-4°C) или се залива с някой от консервантите. Преди прегледа изпражненията се разбъркват с пръчка, така че яйцата на хелминтите да се разпределят равномерно в обща маса. Ако в препарата се открият яйца от някакъв хелминт, гледането не се спира, т.к може да има двойна или тройна инвазия. Проследяването на ефективността на лечението на хелминтни инфекции се извършва чрез изследване на изпражненията за хелминтни яйца 2-3 седмици или 2-3 месеца след лечението, в зависимост от открития хелминт. Макроскопските методи се използват за откриване на цели зрели хелминти или техни фрагменти в изпражненията с просто око или с помощта на ръчна лупа. Често на повърхността на изпражненията след дефекация могат да се видят активно пълзящи острици; аскаридите се отделят с изпражненията; Понякога хората сами забелязват преминаването на хелминти. При пациенти с дифилоботриоза могат да се отделят фрагменти от стробили на тения (под формата на „юфка“), а при тези, заразени с тении (свинска или говежда тения), сегменти от хелминти често излизат с изпражнения (под формата на „бели изрезки“ ”) или те активно изпълзяват от ануса. Макроскопският метод е основният за диференциална диагноза на тениаза и тениаринхоза (в комбинация с изследване). От специалните макроскопски методи се използва методът на последователно измиване на изпражненията. Изпражненията се смесват във вода до получаване на еднородна суспензия, след което при добро осветление внимателно се изследват на отделни малки порции в черни фотографски кювети или на тъмен фон в петриеви панички. С помощта на пинсети или дисекционна игла отстранете всички подозрителни бели частици, големи образувания, подозрителни за фрагменти от хелминти, и ги разгледайте под лупа между две предметни стъкла. Малките хелминти или глави на цестоди се изследват под лупа в капка глицерин или под микроскоп. При използване на този метод за диагностика на сегментите на свинска, говежда тения и широка тения, измитите сегменти се поставят между две чаши и при осветяване под лупа или микроскоп с малко увеличение се определя видът по структурата на матката (в зрял сегмент свинска тенияОт централния ствол се простират 8-12 странични клона, а в говеждия тения има 18-32, по-често 28-32; в широката тения сегментите са по-широки и матката в центъра е под формата на „ розетка”). Ако матката е трудно да се види, тогава тя може първо да се държи известно време в 50% разтвор на глицерин, след което дори празните стволове на матката могат да се видят ясно. При идентифициране на тези цестоди по структурата на отделените глави, те се поставят внимателно с шията в капка глицерин между предметните стъкла (или се покриват с покривно стъкло) и, без да се притискат, се изследват под микроскоп при слабо увеличение.

Микроскопските методи се делят на прости, сложни и специални.

Простите включват методите на нативна намазка, нативна намазка с разтвор на Лугол, методи на дебела намазка под целофан по Като, усукване (по Шулман) и перианално изстъргване.

Комплексните методи са по-ефективни и се основават на концентрацията на яйца в препаратите. Те включват предварителна обработка на изпражненията с течни реактиви, в резултат на което яйцата на хелминтите се утаяват или изплуват на повърхността на течността.

ДА СЕ комплексни методиМетодите за обогатяване включват:

а) флотация (когато специфичното тегло на яйцата е по-малко от специфичното тегло на солевия разтвор и яйцата плуват в повърхностния филм);

б) утаяване (когато специфичното тегло на яйцата е по-голямо от специфичното тегло на солевите разтвори и яйцата се утаяват в утайка).

Специални методи за откриване на яйца и ларви на хелминти, кисти и вегетативни форми на протозои са методи за остъргване, флотация, утаяване, ларвоскопия, протозооскопия, изследване на жлъчката и методи за оцветяване на петна от изпражнения, храчки и др.

Вземане на проби и консервиране

За изследване изпражненията се вземат от различни места на порции от 50 g и се изпращат в лабораторията в чист стъклен или пластмасов контейнер с плътен капак. Изследват се пресни изпражнения (не повече от един ден), а в някои случаи (при тестване за стронгилоидоза) веднага след дефекация. Предложени са редица фекални консерванти, съдържащи яйца от хелминти: 4-10% разтвор на формалин, който трябва да се нагрее до температура 50-60 °, за да се предотврати развитието на яйца от анкилостома; смес от 0,2% воден разтвор на натриев нитрат (1900 ml), разтвор на Лугол (5 g йод, 10 g калиев йодид, 250 ml вода), формалин (300 ml) и глицерин (25 ml), в които се съхраняват яйца от хелминти. 6-8 месеца; смес от глицерин (5 ml), формалин (5 ml) и вода (100 ml); разтвори на 1-1,5% детергенти „Лотос“, „Екстра“, „Барф“, „Тайд“ и др. (в тегловно съотношение на изпражненията и разтвора на детергента 1: 5); смес от мертиолат 1: 1000 (200 ml), формалин (25 ml), глицерин (5 ml), дестилирана вода (250 ml) с добавяне на 0,6 ml разтвор на Лугол (със скорост 1 g изпражнения на 10 мл от сместа).

За диагностициране на хелминтиази се използват макро- и микрохелминтоскопски методи за изследване на изпражненията.

Макрохелминтоскопски изследвания

Метод на уреждане

Една дневна порция изпражнения се смесва добре с 5-10 пъти количество вода, излива се във високи стъклени цилиндри (буркани, кофи) и се оставя до пълното утаяване на суспендираните частици. Горният мътен слой се отцежда внимателно и се добавя чиста вода към върха (повторете няколко пъти, докато водата над утайката стане бистра). След отцеждане на горния слой, прехвърлете утайката в кювета или петриево блюдо и я огледайте (на тъмен фон) под лупа или с невъоръжено око.

Метод на скрининг

Изпражненията, смесени с вода, се поставят върху горното сито на устройството, състоящо се от система от сита с отвори с намаляващ диаметър, устройството се свързва към водопроводната мрежа и чрез отваряне на крана за вода се измива и тече течността се оттича в канализацията. Големите хелминти остават на горното сито, а по-малките се задържат на долното. Ситата се обръщат и след измиване на съдържанието в тъмни кювети се изследват с просто око или под лупа.

Микрохелминтоскопски изследвания

Извършва се с цел откриване на яйца (хелминто-овоскопски методи - цвят. Фиг. 1) или ларви на хелминти (хелминто-овоскопски методи).

Хелминтоовоскопски методи

Качествени методи без обогатяване

Нативна цитонамазка. Малко количество изпражнения се смила върху предметно стъкло в капка 50% разтвор на глицерин или преварена вода. Едрите частици се отстраняват внимателно, сместа се покрива с покривно стъкло и се изследва под микроскоп (изследват се две петна). По-удобно и по-лесно е да се приготвят дълги петна между две предметни стъкла. Нативната цитонамазка се използва само като допълнение към методите за обогатяване, тъй като не е достатъчно ефективна, особено при слаби инвазии.

Дебело намазване с целофан по Като(K. Kato, 1954) е много ефективен методизследвания. Парчета хидрофилен целофан (с размери 4х2 см) се накисват за 24 часа в смес от глицерин (50 мл), 6% разтвор на фенол (500 мл) и 3% воден разтвор (6 мл) зелен малахит (последният е по избор). ). ДОБРЕ. 100 mg изпражнения се намазват върху предметно стъкло и се покриват с парче влажен целофан, притискат се с гумена запушалка № 5. Препаратът се изследва след 30-60 минути, когато леко изсъхне и се избистри, като в резултат на което яйцата на хелминтите се откриват лесно под микроскоп с ниско увеличение.

Качествени методи с обогатяване (методи на плаване и утаяване)

Първите се основават на използването на наситени разтвори на различни химикали. вещества, в които яйцата плуват поради разликите в специфичното тегло.

Метод на Кофоид-Барбър(Ch.A. Kofoid, M.A. Barber), модифициран от Фулеборн (F. Fulleborn, 1920). ДОБРЕ. 5 g изпражнения във висок и тесен буркан (обем 100 ml) се разбъркват с дървена пръчка в 100 ml наситен разтвор. готварска сол, победи теглото му е 1,18 (400 г сол се разтварят при кипене в 1 л вода). Големите частици, които изплуват на повърхността, се отстраняват бързо с клечка или лист хартия. След утаяване на сместа за 45-90 минути. Използвайте телена примка (0,8-1 см в диаметър), за да отстраните целия повърхностен филм и да го прехвърлите върху предметно стъкло. При изследване за яйца на анкилостоми сместа се оставя да престои 10-15 минути. Можете да отстраните филма директно с предметно стъкло, да покриете буркана, така че да влезе в контакт с течността (към краищата на буркана се добавя наситен разтвор на сол). След утаяване предметното стъкло се отстранява, бързо се обръща и филмът с прилепналите към него яйца на хелминти се изследва под микроскоп (без покривно стъкло). Този метод е добър за идентифициране на яйца от всички нематоди и джуджета. Тежки яйца на метил; Повечето цестоди и неоплодените кръгли червеи плуват зле, така че утайката също се изследва. За да направите това, след отстраняване на филма, течността от буркана бързо се отцежда и няколко капки се вземат от утайката с примка или пипета, прехвърлят се върху предметно стъкло, добавя се капка глицерол за избистряне и се изследва под микроскоп.

Метод Е. В. Калантарян(1938) е по-ефективна модификация на метода на Фулеборн. В него разтворът на готварската сол се заменя с наситен разтвор на натриев нитрат, sp. теглото е 1,39 (един обем натриев нитрат се разтваря в равен обем вода при варене), филмът се отстранява след 20-30 минути.

Използват се и методите на Фауст (Е. С. Фауст, 1939), Брудастова и др. (1970) и др.

За отлагане на яйца от хелминти се използват химикали. вещества, които разтварят мазнините и протеините в изпражненията.

Метод на Телеман (W. Telemann, 1908), модифициран от Миягава (Y. Miyagawa, 1913). ДОБРЕ. 5 g изпражнения се смилат в хаван или буркан, като се добавят 5 ml етилов етер и 50% физиологичен разтвор; сместа се филтрира през телено или космено сито в епруветка и се центрофугира. В епруветката се образуват 3 слоя: отгоре - етер с разтворена мазнина, отдолу - солна киселина с разтворени протеинови вещества, в утайката - неразтворими части от изпражнения и яйца на хелминти. Горните слоеве се отцеждат, към утайката се добавя вода и се центрофугира. Няколко капки утайка се прехвърлят върху предметно стъкло и се изследват под микроскоп. Този метод може да открие яйца от всички видове хелминти, но понякога те са деформирани.

Метод на Ричи (L. S. Kitchie, 1948).Формалдехидът и етерът се използват за разтваряне на мазнини и протеини.

За утаяване на яйца от хелминти могат да се използват различни детергенти. Методът на филтриране в специални устройства на Bell стана широко разпространен в чужбина, който се използва за изследване не само на изпражненията, но и на урината, кръвта и др.

Съществуват редица методи, съчетаващи принципите на флотацията и утаяването на яйцата. Те включват методите на S. A. Lane, D. Rivas, Gorkina и S. T. Darling. Един от тези методи на флотация-утаяване, както и методът на последователните дренажи, е предложен от Н. В. Демидов (1963, 1965) за изследване на фасциолиаза и дикроцелиоза.

Количествени методи

Метод на Стол(N. R. Stoll, 1926). Децинормален разтвор на натриев хидроксид се излива в градуирана широка епруветка или колба (с две маркировки: 56 и 60 ml) до първата маркировка, добавят се изпражнения, докато нивото на течността достигне втората маркировка, разбърква се старателно със стъклена пръчка и , като се поставят 10 стъклени перли или малки камъчета, запушват се и се разклащат за 1 минута. Бързо, за да не се утаи суспензията, вземете 0,075 ml от сместа (0,005 g изпражнения) с градуирана пипета, прехвърлете я върху предметно стъкло с поставена върху него решетка, покрийте го с покривно стъкло и пребройте яйцата на хелминтите. в препарата под микроскоп; Като се умножи полученото число по 200, се получава броят на яйцата в 1 g изпражнения. За по-точен резултат пребройте яйцата в две или повече приготовления и вземете средната стойност. Методът на Stoll е нечувствителен към леки инвазии. Поради това се препоръчва да се преброи броят на яйцата в приготвените препарати различни методифлотация или утаяване, при постоянно използване на еднаква част от изпражненията и ястия със същия обем. Използва се и дебел цитонамазка.

Метод на Бобър(R. S. Beaver, 1950). Приготвя се стандартна намазка, чиято дебелина се определя с помощта на електрофотометър и след това се преброяват всички яйца на хелминти в нея.

Хелминтоларвоскопски методи

Метод на Берман(G. Baermann, 1917). 5-10 g прясно отделени изпражнения се поставят върху метална мрежа в стъклена фуния, с гумена тръбичка със скоба в тесния край. За да се избегне замърсяване на утайката с частици от изпражненията, се препоръчва да се постави хартия (върху мрежата) или да се добави животински въглен или царевично брашно към изпражненията. Фунията се напълва с топла вода (t° 45-50°), докато влезе в контакт с изпражненията. Благодарение на термотропизма, ларвите активно се движат в топла водаи постепенно се натрупват в долната част на фунията, над скобата. След 3-4 часа скобата се отваря, течността се отцежда в 1-2 епруветки, центрофугира се 2-3 минути, горният слой се отцежда и утайката се изследва върху предметно стъкло под микроскоп.

Метод за идентифициране на шистозомна мирацидия. Изпражненията се измиват на тъмно при температура 8-10°, утайката се държи 45 минути. на ярка светлина при t° 28°, след което се изсипва в тъмна колба със сламка отстрани. Мирацидиите са концентрирани в прозрачна странична епруветка, откъдето могат да се избират.

За идентифициране на ларвите на анкилостомите се използват и методите на Fulleborn et al.

Методи за изследване на други секрети, както и на тъкани и органи

ДОБРЕ. 100 ml изследвана урина се оставя да престои 30 минути. в цилиндър и след отстраняване на горния слой, изсипете 10-15 ml утайка в епруветка, центрофугирайте при 1500 rpm за 1-2 минути; изследва се утайката. Препоръчително е да се събере цялата дневна порция урина.

Урогениталната шистозомиаза се диагностицира чрез идентифициране на мирацидия. Порция прясна урина се центрофугира в продължение на 5 минути, утайката се излива в боядисана в черно колба, към върха на която е запоена прозрачна стъклена тръба. Добавя се вода в съотношение 1:5, 1:10 и се поставя в термостат на 25-30° за 2 часа. Мирацидиите, излизащи от яйцата, се виждат през прозрачна тръба с просто око под формата на бързо движещи се точки. При хронична форма на шистозомиаза пациентите отделят кръв към края на уринирането, но рядко се откриват яйца в урината, така че се препоръчва да се прибегне до биопсия на пикочния мехур.

Изследване на храчки.Храчките могат да съдържат яйца от парагонимус, шистозоми, томинкси, ларви на мигриращи нематоди и фрагменти от ехинококов пикочен мехур. Цялата отделена порция храчка се изследва внимателно с невъоръжено око или под лупа, избират се и се изследват всички видими остатъци от тъкан, ръждиви натрупвания и др.; след това сканирайте цялата част с петна. Гнойни храчкиналейте равно количество 0,5% алкален разтвор на каустик, центрофугирайте и изследвайте утайката.

При някои хелминтиази се наблюдава отделяне на храчки характерни промени. При парагонимиаза, например, в храчките могат да се намерят натрупвания на яйца под формата на жълтеникави бучки, както и голямо количество слуз, левкоцити, червени кръвни клетки, алвеоларни клетки, спирали на Kurschmann, еластични влакна, кристали на Charcot-Leyden . Разкрити са и характерни диамантени кристали със заострени краища. Наличност голямо числоеозинофилите позволяват да се диференцира парагонимозата от туберкулозата.

Изследване на съдържанието на абсцеси и пунктати. IN гноен секретабсцеси, както и в тумори и кисти, отстранени по време на операция, могат да се открият хелминти, техни фрагменти, ларви и яйца (ехинококи, алвеококи, спарганум, цистицерки, дирофиларии, кръгли червеи, токсокари, парагонимус и др.). Техниката на изследване е обичайна; в някои случаи хистологичните срезове се приготвят от туморна тъкан. Гнойното съдържание може да се лекува с помощта на метода на Телеман; Прозрачната течност се изследва по същия начин като съдържанието на дванадесетопръстника, като се добавя серен етер. Ехинококовата течност се центрофугира и седиментът се изследва за наличие на сколекси и кукички; Препаратите се оцветяват с карболфуксин по Ziehl-Neelsen.

Кръвен тест.В кръвта се откриват микрофиларии и ларви на мигриращи нематоди. Взема се капка кръв от пръст или ушна мида и се изследва прясна или се приготвят препарати от нея.

Капка кръв се поставя върху предметно стъкло с нанесено квадратче вазелин и леко се притиска с покривно стъкло. Под микроскоп се виждат микрофилариите, движещи се между кръвните клетки. Кръвта може да се постави между два слоя залепваща целулозна лента; микрофилариите остават подвижни в продължение на 6 часа; в напълно изсъхнал препарат се различават под микроскоп в рамките на 30 дни. Видовете микрофиларии могат да бъдат идентифицирани само в оцветени петна или плътни капки. Приготвените препарати се изсушават, хемолизират и оцветяват по Романовски - Гимза, Райт, Зил-Нилсен, Лайшман, Папаниколау (виж метода на оцветяване по Райт, метода на Романовски-Гимза, метода на Цил-Нилсен). След откриване на микрофиларии в капка кръв, оцветена по Romanovsky-Giemsa, препаратът се оцветява допълнително с хематоксилин на Hansen; за 15-60 минути. измийте за 2 минути. в течаща вода. Преоцветеният препарат се диференцира в 0,2% физиологичен разтвор; Обвивката на микрофилария е боядисана в бледо виолетово, а ядрената субстанция на тялото е тъмно виолетова.

При леки инвазии е необходимо да се изследват 2-10 парчета кръв с антикоагулант (например с 5% разтвор натриев цитрат), като използвате един от следните методи.

Метод на Knott (J. Knott, 1939), модифициран от Markell и Voge (E.K. Markell, M. Voge, 1965). 2 ml кръв се смесват в центрофужна епруветка с 10 части 1% оцетна киселина, центрофугират се 2 минути. при 1500 оборота в минута; повърхностен слойотцежда се, утайката се разпределя върху няколко предметни стъкла и се изследва под микроскоп. Препаратите могат да бъдат оцветени с помощта на Романовски-Гимза или други методи.

Метод на филтриране на Bell (D. R. Bell, 1967). В апарат, състоящ се от фуния от неръждаема стомана с правоъгълен отвор и мембранни филтри със същата форма, с размери 19 х 42 mm, с размер на порите от 0,8 до 5 μm, кръвта се хемолизира в смес от 1 ml детергент типол и 9 мл разтвор на физиол (за ускоряване на филтрирането, уредът е свързан към вакуумна помпа). Филтърът се фиксира във вряща дестилирана вода и се оцветява с горещ хематоксилин по Романовски-Гимза или Ерлих. Оцветеният филтър се изсушава в ексикатор или в изопропилов алкохол (последователно в 3 чаши), избистря се върху стъкло с имерсионно масло и се изследва под покривно стъкло. Цветните препарати издържат няколко седмици. Методът на Bell е най-ефективен за количествено отчитане на микрофилариите в кръвта.

Използва се и поливидоновият метод на Goldsmid.

Изследване на кожата.В кожата можете да намерите микрофиларии на онхоцерци и ларви на животински хелминти, които причиняват кожна форма larva migrans(см.). Кожни срезове или материал, получен чрез скарификация, се вземат от бедрото, прасеца, седалището или делтоидния мускул. Конусовидно парче от епидермиса се повдига с ентомологичен щифт и се отрязва с бръснач и се изследва върху стъкло в капка физиолен разтвор. При отрицателен резултатнов препарат се изследва отново след 10 минути; Обикновено ларвите са локализирани по краищата на препарата. Полученият материал се съхранява в 2 ml разтвор на физиол за 1-2 часа. и изследвайте утайката. Препоръчва се да се вземат 5 кожни среза от пациента.

Препарати могат да се приготвят и от кръв и тъканна течност, освободени след силно компресиране на срезовете. Капките се оцветяват според Mayer, Romanovsky-Giemsa или хематоксилин на Delafield.

Стандартен метод за количествено определяне на инвазиите. Диам. на биопсирана кожна област. 3-5 mm и тегло най-малко 1-4 mg, претеглят се, нарязват се на малки парченца и се преброяват ларвите под микроскоп във физиол. разтвор върху предметно стъкло; 1-4 ларви в зрителното поле са обозначени със знак +, 5-9 ларви със знак ++, 10-19 със знак +++, 20 или повече със знак + + + +. По-удобно е да се извършват количествени изчисления върху цветни препарати.

Изследване за трихинелоза, цистицеркоза и шистозомиаза

Откриване на ларви на трихинела

Метод на компресия.Парче двуглава или мускул на прасеца(в близост до сухожилието), взет хирургически с асептика, се разделя на отделни тънки влакна с дисекционни игли, изстисква се между две предметни стъкла в капка глицерин, така че препаратът да е тънък и прозрачен. Под микроскоп с тъмно зрително поле ларвите на трихинелата се виждат ясно. Ефективно е да се изследват няколко парчета мускул в компресории, използвани във ветеринарната медицина. практика, особено в специални трихинелоскопи.

Метод на храносмилане на Бехман(G. W. Bachman, 1928 г.). 1 и натрошени мускули се заливат с 60 ml изкуствен стомашен сок (0,5 g пепсин; 0,7 ml концентрирана солна киселина; 100 ml вода) и се оставят за 18 часа. в термостат при t° 37°; горният слой течност се отцежда, към утайката се добавя топла вода (t ° 37-45 °) и се излива в апарат на Behrmann. След един час течността се отцежда в епруветка, центрофугира се и се изследва утайката. Ако ларвите са затворени в калцирани капсули, те първо се декалцират в разтвор на солна, азотна или сярна киселина.

Биологичен анализ. Части от изследваните мускули се дават на бели мишки или плъхове. След 2-3 дни в дуоденалното съдържимо се откриват полово зрели трихинели, а след 2-3 седмици ларви в мускулите на диафрагмата и езика.

Хистологични срезове.Мускулни части се фиксират в течност на Bouin, Zenker или друга; по обичайния начинСрезовете се приготвят на микротом и се оцветяват с хематоксилин на Delafield.

Откриване на цистицерки

С невъоръжено око се изследва парче екстирпиран мускул, съединителна тъкан и др., внимателно се изолира цистицеркът - белезникаво полупрозрачно мехурче с големина 1-2 см, натрошено между две предметни стъкла в капка глицерин и изследвано под микроскоп. . За да се определи жизнеспособността на цистицерките, изолирани от тъканите, те се държат в 50% жлъчен разтвор за физиол. разтвор в термостат при t° 37°; за 10-60 минути. главата на жизнеспособния цистицерк се обръща навън. Калцифицираните цистицерки се декалцират предварително с 4% разтвор на азотна киселина за един час.

Откриване на шистозомни яйца

При хронични форми на шистозомиаза, когато образуването на грануломи предотвратява освобождаването на яйца от тъканите в чревния лумен или в пикочните пътища, се използва биопсия на ректалната лигавица, която се извършва със специална лъжица с помощта на ректоскоп, избиране на зона с видима лезия. Биопсираното парче се смачква между две предметни стъкла и се изследва под микроскоп. Ако резултатът е отрицателен, парчетата се избистрят в 4% разтвор на каустик и от тях се приготвя хистол. филийки. Орално се извършва биопсия на лигавицата на йеюнума и полученият материал се изследва по метода на компресия или от него се приготвят хистолни срезове. В някои случаи на пикочно-половата шистозомиаза диагнозата може да се постави само въз основа на ендовезикална биопсия. При хепатолиеналната форма на шистозомиаза се извършва пункционна биопсия на черния дроб; От получения материал се приготвят хистол и срезове, които се изследват под флуоресцентен микроскоп. Флуоресцентен микроскоп с тъмно поле също се използва за изследване на чернодробна тъкан за шистозомни яйца. Ако женските генитални пътища са засегнати от шистозоми, секретът се събира с помощта на вагинален спекулум или парчета от лигавицата на шийката на матката се вземат с остра лъжица; полученият материал се изследва под микроскоп върху стъкло в капка разтвор на физиол.

Тестване за ентеробиоза и тениоза

Перианално изстъргване (препоръчително е да се вземе вечер, 1 - 1,5 часа след лягане на пациента или сутрин преди тоалетна). С кибрит, срязан под наклон и навлажнен в капка течност (физиол, разтвор, преварена вода или 2% разтвор на сода бикарбонат), нанесен върху предметно стъкло, внимателно правя това? изстъргване от лигавицата на ануса и гънките около него (от центъра навън). Слузта, събрана в края на мача, се почиства с ръба на покривно стъкло в капка течност върху предметно стъкло и, покрито със същото покривно стъкло, се изследва. При масови прегледи, когато се вземат остъргвания в детски или други заведения, използваният кибрит се поставя в капка течност върху предметно стъкло, след като капката изсъхне, се покрива с друго предметно стъкло и се доставя в лабораторията, опаковано в хартия и закрепена с еластична лента. За изследване на ректалната слуз те използват специално устройство - тръба на Шахматов или Циман, с която вземат слуз от ректума и изследват намазките под микроскоп.

Метод с памучен тампон. На пациентите се дава епруветка с памучен тампон върху стъклена или дървена пръчица за вкъщи; сутрин пациентът избърсва перианалните гънки с навлажнен тампон сварена вода, и го поставя в епруветка с малко количество вода. В лабораторията тампоните се изплакват в същата епруветка с нова порция вода и утайката се изследва след центрофугиране.

Целофанов метод на Хол (M. S. Hall, 1937). Квадратно парче целофан е закрепено с еластична лента върху стъклена пръчка. Остъргването се прави със сух целофан и се поставя в епруветка. В лабораторията целофанът леко се отмества от клечката и след отрязване на върха му с ножица се изправя върху предметно стъкло; навлажнени с децинормален разтвор на натриев хидроксид, покрити с покривно стъкло и изследвани под микроскоп.

Методът на Греъм с целулозна лента (S. F. Graham, 1941). Ивица от целулозна лента се притиска с адхезивната страна към перианалните гънки на обекта, след това със същата страна към предметно стъкло и се изследва без покривно стъкло; Можете да добавите капка толуен. В. В. Каледин (1972) предлага за тези цели да се използват целулоидни дискове, изрязани от измит рентгенов филм и навлажнени с глицерин; дисковете се изследват върху предметно стъкло в капка силикатно лепило. Методът с целулозната лента може да се използва и за изследване на детското бельо.

Поднокътно остъргване. Краищата на нокътя, нокътното легло и поднокътните пространства се навлажняват с 0,5-1% разтвор на разяждаща основа и се избърсват с влажни памучни тампони. Тампоните се поставят в центрофужни епруветки със същия разтвор, центрофугират се и се изследва утайката.

Методи за изследване на обекти заобикаляща средаза яйца и ларви на хелминти (санитарни и хелминтологични изследвания)

Провеждат се изследвания за определяне на степента на замърсяване на обекти с яйца и ларви на хелминти външна среда. Получените данни се използват за оценка на достойнството. състоянието на институциите и предприятията и ефективността на предприетите мерки за борба с хелминтиозите.

При изучаване на степента на замърсяване на различни обекти на околната среда с яйца и ларви на хелминти и оценка на тяхната роля в епидемиологията на хелминтните инфекции е важно да се установи не само броят на намерените яйца, но и тяхната жизнеспособност и инвазивност, които се определят : а) по външен вид, под микроскоп; б) оцветяване с различни багрила, включително луминесцентни; като правило живите яйца и ларви не се боядисват; в) култивиране при оптимални условия до инвазивен стадий; г) инфекция на лабораторни животни (биологичен анализ).

ВиК проучвания. За едно изследване използвайте 10-25 литра вода (реки, морета, езера, басейни, водоснабдяване) и 1-2-5 литра канализация.

Метод 3. Г. Василкова (1941). Водата или отпадните води се филтрират през мембранни ултрафилтри в апарат на Голдман, състоящ се от стъклена или метална фуния с филтри, свързани чрез пръстеновидна дюза към Бунзенова колба. За да се ускори процеса на филтриране, към устройството е свързана вакуумна помпа. След филтруване мембранните филтри се изследват под микроскоп, прочистват се с 50% разтвор на глицерин; натрупаната утайка се почиства и изследва отделно под формата на натривки. Използват се и филтриращи устройства с други конструкции.

Метод на Г. Ш. Гуджабидзе и Г. А. Юдин (1963) за изследване на канализационна течност. 1 литър течност се оставя за 2 часа в цилиндър Лисенко; получената утайка (5-9 ml) се обработва както при тестване на почвата (виж по-долу).

Метод Н. А. Романенко (1967). Към 1 литър отпадъчна течност, поставена в стъклен цилиндър с вместимост 1200-1500 ml, добавете 0,4-0,6 g алуминиев сулфат или железен хлорид (с цел коагулация, ускоряване на процеса на утаяване на суспендираните частици) и след 40 минути. сместа се центрофугира за 3 минути. при 1000 оборота в минута; горният слой се отцежда и за разтваряне на люспите се добавят 1-2 ml 3% разтвор на солна киселина, след това 150 ml наситен разтвор на натриев нитрат. Седиментът се изследва като почвата.

Изследване на почвата

Замърсяването на почвата с яйца от хелминти се определя, за да се идентифицират огнищата на хелминтиаза и да се оцени ефективността на работата по тяхното подобряване.

Метод 3. Г. Василкова и В. А. Гефтер (1948). 12,5 g почва се смесват в епруветки (обем 100 ml), изработени от неръждаема стомана или месинг, с 20 ml 5% разтвор на алкален каустик, като се добавят 10 стъклени перли или малки камъчета. Епруветките се затварят с гумени запушалки и се разклащат в продължение на 20 минути. в разклащащ апарат или ръчно. След отстраняване на запушалките, епруветките се центрофугират в продължение на 3-5 минути, повърхностната течност се отцежда, към утайката се добавят 60-80 ml наситен разтвор на натриев нитрат и след старателно смесване се центрофугират отново в продължение на 3-5 минути. Този повърхностен филм с плаващи яйца се отстранява чрез докосване на повърхността на сместа със сложна примка (5-6 бримки, свързани на обща пръчка) и се прехвърля в чаша с вода; смесете със същия разтвор, центрофугирайте; Цялата процедура се повтаря поне 3 пъти. Съдържанието на чашата, в която се прехвърля филмът, се разрежда с вода и се филтрира през мембранни филтри, които се изследват под микроскоп в капка глицерин.

Метод 3. Г. Василкова и В. А. Гефтер, модифициран от А. А. Намитоков (1961), се различава от основния метод по това, че вместо да се изследват филмови препарати, се използва половината от съдържанието на епруветката (всеки път се добавя нова порция от наситен разтвор на натриев нитрат), филтрува се и се проверяват филтрите.

Н. А. Романенко (1968) препоръчва изследване на почвени проби и утайки от отпадъчни води за яйца на хелминти с помощта на апарата, предложен от Г. Ш. Гуджабидзе. 50 g почва се разбърква старателно в продължение на 1 минута. в 150 ml вода в центрофужни епруветки (вместимост 250 ml) със специални лопатки, задвижвани от електродвигател. Сместа се центрофугира за 3 минути. при 1000 rpm, източете водата и добавете 150 ml наситен разтвор на натриев нитрат, разбъркайте и отново центрофугирайте за 3 минути. Епруветките с проби се поставят в стойка, добавя се разтвор на натриев нитрат до образуване на изпъкнал менискус, покриват се с предметни стъкла (10 х 6 cm) и се оставят за 10-15 минути, след което очилата се отстраняват и се изследват; процедурата се повтаря поне 4 пъти.

Изследване на ларви на хелминти по метода на Behrmann (1917). 200-400 g пръст се поставят в парче марля върху метална мрежа (с отвори 1-2 mm в диаметър), поставена върху широката част на стъклена фуния, монтирана на статив. На тесния край на фунията се опъва гумена тръба със скоба. Фунията се напълва с топла (t° 50°) вода, така че долната част на мрежата с почвата да влезе в контакт с водата. Благодарение на термотропизма, ларвите активно пълзят в топла вода и, утаявайки се, се натрупват в долната част на гумената тръба над скобата. След 3-4 часа 50 ml от съдържанието се освобождават от фунията в епруветка, центрофугират се и се изследва утайката.

Изследване на зеленчуци, плодове и плодове

Те изучават предимно зеленчуци, горски плодове и плодове, които се консумират без топлинна обработка. Метод 3. Г. Василкова (1948). 5-10 броя зеленчуци или плодове (около 0,5 кг) или 100-200 г зеленчуци (маруля, зелен лук) се заливат с вода за няколко часа в стъклени буркани с широко гърло и шлифовани запушалки и се разклащат за 10-20 минути. . в разклащащ апарат или ръчно. Водата се източва, изследваните обекти се изплакват чиста водаи цялата промивна вода се филтрира в апарат на Goldmann; Филтрите се проверяват, като се изчистват с глицерин. Можете да оцветявате филтри с 25% разтвор на Лугол в глицерин; в този случай яйцата на хелминтите се оцветяват кафяв цвяти лесно се разпознават сред оцветените нишестени зърна Син цвят. Голямата утайка се третира като почва.

Проучване на измивания от домакински предмети и ръце. Четка за лепило (или памучен тампон, увит в парче найлон), напоен с 2% разтвор на сода бикарбонат, се прекарва многократно върху обекта или ръцете, които се изследват, след което се изплаква със същия разтвор, излят в епруветка. В лабораторията четките и тампоните се изплакват с чиста вода; Всички промивни води се центрофугират и утайката се изследва.

Метод V. A. Gefter (1960). По-ефективно е да се събира прах от меко оборудване с помощта на прахосмукачка, свързана с фуния; ръбовете се състоят от 2 отделящи се части: мембранен филтър се поставя върху повърхността на долната част, покрита с метална или пластмасова мрежа и укрепена като го поставите горна частфунии. Сглобената фуния е свързана към маркуча на прахосмукачката с гумена тръба. Прахът се събира от обекта за 3 минути, след което филтърът се отстранява и се заменя с нов. В лабораторията филтрите се изследват под микроскоп, избистрени с глицерин. Ако слоят прах върху филтъра е голям, той се изстъргва и се разглежда под формата на петна или се третира като пръст.

Имунологични диагностични методи

Възможност за използване на имунол. Методите за диагностициране на хелминтиаза се дължат на способността на хелминтите да произвеждат активни антигени, които засягат имунокомпетентните клетки на гостоприемника и стимулират производството на антитела. Най-ефективните имунодиагностични методи са при чревни хелминтози, когато секретите и екскретите на хелминтите, които имат антигенна активност, навлизат директно в кръвта на гостоприемника. Имунологичните реакции се използват за диагностициране на аскариаза, трихинелоза, филариаза, шистозомиаза, ехинококоза и алвеококоза, цистицеркоза, парагонимоза, симптомокомплекс на larva migrans (токсокароза, ангиостронгилоза) и др. Използват се различни серолни тестове (реакции на утаяване, реакции на аглутинация, фиксиране на комплемента). действие , флуоресцентни антитела) и интрадермални тестове за алергия. Антигените се приготвят от ларви и зрели хелминти, като се използват солни екстракти от хомогенати от прясно замразени или лиофилизирани тъкани, както и различни биологично активни течности (течност от ехинококови мехурчета, коремна течност от кръгли червеи и др.). Поради факта, че хелминтите имат много сложна антигенна структура и тяхната антигенна мозайка съдържа компоненти и отделни детерминанти, които реагират кръстосано с други видове хелминти, бактерии и антигени на гостоприемника, се разработват методи за тяхното пречистване от неспецифични компоненти. Извършва се фракциониране различни методи: гел филтрация в колони със Sephadex, йонообменна хроматография на DEAE-Sephadex, третиране с киселини и др. Фракционните антигени обикновено имат по-висока специфичност от целите екстракти, но тяхната активност е приблизително еднаква. Имунодиагностичните методи откриват всичко по-голямо приложение. Реакциите се използват не само за най-пълна и ранна идентификация на пациентите, но и за изследване на огнища и изучаване на епидемиологията на хелминтиазите.

Серологични реакции.Реакцията на микропреципитация върху живи ларви се използва за диагностициране на нематоди - преимагиналната фаза на аскаридоза, анкилостомоза и трихинелоза. Реакцията става положителна 5-10 дни след заразяването (аскариаза, анкилостомоза) и продължава 90-100 дни. Антигенът е живи ларви на нематоди, изолирани от тъканите на експериментално заразени лабораторни животни. Изолираните ларви се отмиват старателно от белтъците на гостоприемника със стерилен физиол, разтвор и дестилирана вода и по 10-15 бр. поставени с помощта на пипета на Пастьор върху стерилно предметно стъкло с ямка. Нанесете 2-3 капки от тестовия серум, покрийте със стерилно покривно стъкло, поставете го във влажна камера (блюдо на Петри, покрито с навлажнена филтърна хартия) и оставете за 24-48 часа. в термостат при t° 37°. Ако реакцията е положителна, под микроскоп с малко увеличение, видим около устата и анални дупкиларвите са сиво-бели, леко опалесциращи маси от сферични или зигзагообразни утайки. Ефективността на реакцията достига 85-95%.

Реакцията на пръстеновидно утаяване е разработена от V.P. Pashuk (1957) за диагностика на трихинелоза. Реакцията става положителна на 2-3 седмица от заболяването. Ефективността му достига 80-90%. Антигенът е прахообразен екстракт от ларви, изсушени при 35°, изолирани от мускулите на заразени животни. В епруветки диам. 0,5 cm, изсипете 0,1 ml от всяко разреждане на антигена и внимателно наслоете върху него (или го спуснете до дъното) равно количество от тестовия серум, така че течностите да не се смесват. Епруветките се държат 30 минути. в термостат при t° 37° и след това 30-60 минути. при стайна температура. При положителна реакция на границата между антигена и серума се появява белезникав деликатен пръстен, който лесно се разпада при разклащане.

Реакцията на утаяване в гел според Оухтерлони (O. Ouchterlony, 1949) в микромодификация от А. И. Гусев и В. С. Цветков е предложена от И. А. Гиновкер, Е. А. Забозлаева, А. В. Доронин (1970) за диагностика на ранните фази на описторхоза. По предварителни данни ефективността му е 87%. Антигенът е екстракт от хомогенат на прясно замразен полово зрял описторхис, изолиран от черен дроб на котки.

Разработена е реакцията на индиректна хемаглутинация (виж) с диагностикум - суспензия от формалинизирани и танизирани овчи еритроцити, сенсибилизирани с ехинококова течност.

Л. Н. Степанковская (1972) за диагностика на ехинококоза и алвеококоза.

RNGA с диагностикум от формалинизирани овчи еритроцити, сенсибилизирани с екстракт от хомогенат от прясно замразени цистицерки на свинска тения, е предложен от Л. М. Коновалова (1973) за диагностика на церебрална цистицеркоза; той е ефективен в 85% от случаите.

RNGA с ascaris diagnosticum се предлага за диагностициране на преимагиналната фаза на аскаридозата.

Реакцията на фиксиране на комплемента (виж) се извършва по обичайния метод и се използва за диагностика на трихинелоза и цистицеркоза.

Метод на луминесцентни антитела (индиректен метод). Този метод с обезмаслен сух хомогенат от цистицерци на свинска тения като антиген, фиксиран върху предметно стъкло, е разработен от JI. М. Коновалова (1973) за диагностика на човешката цистицеркоза. Същата реакция с хистол, срезове от ларви на трихинела като антиген е разработена за диагностика на трихинелоза.

Е. С. Лейкина, В. А. Гефтер.

При откриване на яйца на хелминти върху различни обекти на околната среда (почва, вода, зеленчуци и др.) Винаги е необходимо да се определи тяхната жизнеспособност по външен вид, оцветяване с витални бои, култивиране в оптимални условия и извършване на биологичен тест, т.е.

Хранене на лабораторни животни.

Определяне на жизнеспособността на яйца или ларви на хелминти по външен вид. Яйцата на хелминтите се микроскопират първо при ниско, след това при голямо увеличение. При деформирани и мъртви яйца на хелминти черупката е разкъсана или огъната навътре, плазмата е мътна и разхлабена. При сегментираните яйца раздробяващите топки (бластомери) са с различни размери, неправилна форма и често изместени към единия полюс. Понякога има анормални яйца, които въпреки външните деформации се развиват нормално. При живите ларви на кръгли червеи фина грануларност присъства само в средната част на тялото; когато умират, грануларността се разпространява по цялото тяло и се появяват големи блестящи хиалинни вакуоли - така наречените низове от перли.

За да се определи жизнеспособността на зрелите яйца на кръгли червеи, камшични червеи, острици, активните движения на ларвите трябва да бъдат предизвикани чрез леко нагряване на лекарството (до температура не по-висока от 37 ° C). По-удобно е да се наблюдава жизнеспособността на ларвите на аскариди и червеи след изолирането им от черупката на яйцето чрез натискане върху покривното стъкло на препарата с дисекционна игла или пинсети.

При инвазивните ларви на кръгли червеи често се вижда обвивка, която се отлепва в края на главата, а при ларвите на камшичен червей, които са завършили развитието си в яйцето, на това място се открива стилет при голямо увеличение. При мъртвите ларви на хелминти, независимо от тяхното местоположение (в яйцето или извън него), се забелязва разпадане на тялото. При което вътрешна структураЛарвата става бучка или гранулирана, а тялото става мътна и непрозрачна. В тялото се намират вакуоли, а на кутикулата се откриват счупвания.

Жизнеспособността на тениидните онкосфери (говежда, свинска тения и др.) се определя от движението на ембрионите, когато са изложени на тях храносмилателни ензими. Яйцата се поставят върху часовниково стъкло със стомашен сок на кучето или изкуствен дуоденален сок. Съставът на последния: панкреатин 0,5 g, натриев бикарбонат 0,09 g, дестилирана вода 5 ml. Часовниците с яйца се поставят в термостат при 36-38 "С за 4 часа. В същото време живите ембриони се освобождават от черупките им. Обвивките на живите онкосфери също се разтварят в подкиселен пепсин и в алкален разтвортрипсин след 6-8 часа в термостат при 38 °C.

Ако поставите яйцата на taeniid в 1% разтвор на натриев сулфид, или 20% разтвор на натриев хипохлорид, или в 1% разтвор на хлорирана вода при 36-38 ° C, зрелите и живи ембриони се освобождават от мембраните и правят не се променя в рамките на 1 ден. Незрелите и мъртви онкосфери се свиват или набъбват и се увеличават рязко и след това се "разтварят" в рамките на 10 минути - 2 часа.Живите ембриони на taeniid също активно се движат в смес от 1% разтвор на натриев хлорид, 0,5% разтвор на натриев бикарбонат и жлъчка при 36-38 °C.

Жизнеспособността на сколекса на ехинококите се определя при слабо нагряване. За целта измити във вода сколекси или разплодни капсули се поставят в капка вода върху предметно стъкло с дупка, покриват се с покривно стъкло и се изследват под микроскоп с нагряващ етап при температура 38-39 °C. Ако няма нагревателна маса, лекарството се нагрява с помощта на произволен източник на топлина. В същото време жизнеспособните сколекси активно се движат, свивайки или отпускайки смукателите, удължавайки и скъсявайки хоботчето. Ако поставите сколекса на 0,5-1% воден разтвор filicilene при стайна температура, тогава всички жизнеспособни сколекси бързо ще се окажат и ще умрат. Нежизнеспособните сколекси не се извиват.

Жизнеспособността на Adolescaria fascioli, събрана върху растения и други обекти от водни обекти, се проверява чрез изследването им върху предметно стъкло във физиологичен разтвор под микроскоп с нагряващ етап. Когато ларвите на трематодите се нагреят, те започват да се движат.

Жизнеспособността на яйцата на тенията джудже се определя от разположението на кукичките на ембриона.

В живите яйца на тенията джудже се наблюдават бавни махалообразни движения на протоплазмата и почти незабележимо раздалечаване и преместване на заострените краища на страничната двойка куки встрани от средната двойка.

Контракциите на протоплазмата на ембриона и ембрионалните кукички помагат на ембриона да се освободи първо от мембраните на онкосферата, а след това от външната обвивка на яйцето.

В живо яйце средната двойка и страничните двойки куки са разположени успоредно; в някои яйца остриетата на страничните двойки са близо една до друга и са разположени под ъгъл по-малък от 45 ° по отношение на средната двойка куки.

Умиращият ембрион се свива конвулсивно и бавно раздалечава куките. При мъртъв ембрион движението на куките спира и те са разположени безредно; понякога куките отстрани на съседната двойка се раздалечават под прав, тъп или остър ъгъл.

Понякога се наблюдава набръчкване на ембриона и образуване на гранулация. По-точен метод се основава на появата на движения на онкосферата по време на рязка промяна на температурата: от 5-10 до 38-40 ° C.

Определянето на жизнеспособността на незрелите нематоди трябва да се изследва във влажна камера (блюда на Петри), като яйцата на кръглите червеи се поставят в 3% разтвор на формалдехид, приготвен в изотоничен разтвор на натриев хлорид при температура 24-30 ° C, яйцата на червеите в 3 % решение на солна киселинапри температура 30-35 °C, яйца на острици в изотоничен разтвор на натриев хлорид при температура 37 °C. Петриевите блюда трябва да се отварят 1-3 пъти седмично за по-добра аерация и филтърната хартия трябва да се намокри отново с чиста вода.

Наблюденията за развитието на яйцата на хелминтите се извършват най-малко 2 пъти седмично. Липсата на признаци на развитие в рамките на 2-3 месеца показва тяхната нежизнеспособност. Признаци за развитието на яйца от хелминти са първите етапи на раздробяване, разделяне на съдържанието на яйцето на отделни бластомери. През първото денонощие се развиват до 16 бластомера, които преминават във втори стадий – морула и т.н.

Яйцата на анкилостомите се култивират в стъклен цилиндър (висок 50 cm и диаметър 7 cm), затворен със запушалка. Смес от равни обеми стерилен пясък, дървени въглищаи изпражненията с яйца от анкилостоми, разредени с вода до полутечна консистенция, внимателно се изсипват върху дъното на цилиндъра с помощта на стъклена тръба. По време на 1-2 дни утаяване на тъмно при температура 25-30 ° C, рабдитиформните ларви се излюпват от яйцата и след 5-7 дни те стават филариформени: ларвите пълзят нагоре по стените на цилиндъра, където са видими дори с невъоръжено око. Яйцата на трематоди, като описторхии, дифилоботрииди, фасциоли и др., Естествено развиващи се във вода, се поставят върху часовниково стъкло, петриево блюдо или в друг съд и се налива малък слой обикновена вода. При култивирането на яйцата на Fasciola трябва да се има предвид, че те се развиват по-бързо на тъмно, докато мирацидият се образува в живи яйца при температура 22-24 ° C след 9-12 дни. При микроскопиране на развиващите се яйца на трематоди движенията на мирацидиума са ясно видими. Miracidium fasciola излиза от черупката на яйцето само на светлина. По време на култивирането водата се сменя след 2-3 дни.

Анкилостомата и стронгилоидните ларви се култивират върху агар в петриево блюдо с животински въглен. След като са били в термостат при температура 26-30 ° C в продължение на 5-6 дни, ларвите пълзят по агара, оставяйки след себе си пътека от бактерии (метод на Fulleborn).

Метод на Харада и Мори (1955). Добавете 7 ml дестилирана вода към епруветките, поставени в стойка. С помощта на дървена пръчка се вземат 0,5 g изпражнения и се прави петно ​​върху филтърна хартия (15X150 mm) на 5 cm от левия ръб (тази операция се извършва върху лист хартия, за да се предпази повърхността на лабораторната маса). След това лентата с цитонамазката се вкарва в епруветката така, че левият край, свободен от цитонамазката, да стига до дъното на епруветката. Горният край се покрива с парче целофан и се увива плътно с ластик. Върху епруветката се изписват номерът и фамилията на изследваното лице. В това състояние епруветките се съхраняват 8-10 дни при температура 28 °C. За да изследвате културата, отстранете целофановото покритие и отстранете лента от филтърна хартия с пинсети. Трябва да се внимава, когато се прави това, тъй като малък брой инфекциозни ларви могат да се преместят в горния край на филтърната хартия или отстрани на тръбата и да проникнат под повърхността на целофана.

Епруветките се поставят в гореща водна баня при температура 50 °C за 15 минути, след което съдържанието им се разклаща и бързо се излива в 15-милилитрова епруветка за утаяване на ларвите. След центрофугиране супернатантата се отстранява и утайката се прехвърля върху предметно стъкло, покрива се с покривно стъкло и се изследва под микроскоп при слабо увеличение.

За диференциална диагноза на филариформени ларви е необходимо да се използват данните, представени в табл. 13.

Методи за оцветяване на яйца и ларви на хелминти. Мъртвите тъкани в повечето случаи възприемат боите по-бързо от живите. Тези характеристики се използват в хелминтологията за определяне на жизнеспособността на яйцата и ларвите на хелминтите. В някои случаи обаче някои бои се възприемат по-добре от живите тъкани, отколкото от мъртвите.

Таблица 13. Диференциална диагнозанишковидни ларви на A.duodenale, N.americanus, Strongyloides stercoralis, Trichostrongylus spp.

За диференциално разпознаване на живи и мъртви яйца и ларви се използват следните бои и методи.

Leukobase метиленово синьо се използва за оцветяване на живи и мъртви тъкани. Жива клетка или тъкан редуцира метиленово синьо в безцветна левкобаза; мъртвата тъкан няма тази способност, така че придобива цвят.

За оцветяване на яйца от кръгли червеи можете да използвате метиленово синьо в разтвор на млечна киселина с каустик алкали (0,05 g метиленово синьо, 0,5 g натриев хидроксид, 15 ml млечна киселина). Живите яйца не възприемат цвят, ембрионите на мъртвите яйца стават сини.

Методът на оцветяване не е приложим за незрели яйца на аскариди и камшичести червеи; пигментираната черупка е оцветена и следователно не се вижда дали зародишната клетка вътре в яйцето е оцветена.

Ларвите на Ascaris се оцветяват с основен разтвор на брилянтно крезил синя боя в концентрация 1:10 000. по следния начин: капка течност с яйца на кръгли червеи и капка от основния разтвор на боята се нанасят върху предметно стъкло. Препаратът се покрива с покривно стъкло, което се притиска плътно към препарата с леко почукване с дисекционна игла. Броят на появилите се ларви и степента на тяхното оцветяване се наблюдават под микроскоп, след което същият препарат се изследва отново след 2-3 часа.За живи се считат само недеформирани ларви, които не са оцветени 2 часа.Мъртвите ларви се оцветяват, когато черупката се счупва (частично или напълно).

Възможността за оцветяване на препарати с йоден разтвор е показана при определяне на жизнеспособността на яйцата на птичи кръгли червеи. В този случай като багрило се използва 5% алкохолен разтвор на йод. Когато се нанесе върху препарата, ембрионите на мъртвите яйца на Ascaridia стават оранжеви в рамките на 1-3 s. Мъртвите яйца на описторхиса и онкосферите на говежди тения се оцветяват с разтвор на толуидиново синьо (1:1000), а мъртвите онкосфери на говежди тения се оцветяват с разтвор на брилянтно крезилово синьо (1:10 000). В същото време ембрионите и черупките на мъртвите и живите яйца придобиват цвят. Следователно, след оцветяване, яйцата и онкосферите се измиват чиста водаи допълнително оцветени със сафранин (разреден 1:10 000 в 10% алкохолен разтвор). Алкохолът премахва цвета от черупките, а сафранинът им придава червен цвят. В резултат на това живите яйца стават червени, ембрионът на мъртвите става син, а черупката остава червена. Мъртвите ембриони на онкосфери от говежда тения бързо, в рамките на няколко минути, се оцветяват в ярко червено или розово със сафранин или синьо с брилянтно крезил синьо в разреждане 1:4000 или с индигокармин в разреждане 1:1000-1:2000.

Живите ембриони не се променят под въздействието на тези багрила дори след 2-7 часа.

За да се определи жизнеспособността на яйцата на тения джудже, се препоръчва използването на следните бои: 1) брилянтно крезилово синьо (1: 8000) - след 1 час онкосферата на мъртвите яйца става особено ярко оцветена, което се откроява рязко на фона на бледото или безцветен фон на останалата част от яйцето; 2) сафранин: разреден 1:8000 с експозиция за 2 часа и 1:5000 за 3-5 часа; 3) 50% разтвор на пирогалова киселина в разреждане 1: 2 - при излагане в продължение на 1 час при температура 29-30 ° C (колкото по-ниска е температурата, толкова по-дълъг е процесът на боядисване).

Живите плероцеркоиди на тенията се оцветяват много добре с воден разтвор (1: 1000) на неутрален глист за 5-20 минути. За да се получи устойчив розов цвят, който не изчезва в рамките на 5 дни и не засяга подвижността на плероцеркоидите, обикновено са достатъчни 10 минути. Степента на оцветяване се контролира чрез гледане на ларвите в чист изотоничен разтвор на натриев хлорид, като за целта плероцеркоидите периодично се отстраняват от боята. Препоръчително е да използвате метиленово синьо за оцветяване на мъртви плероцеркоиди.

Р. Е. Чобанов и др.. (1986) предложиха метод за определяне на жизнеспособността на яйца и ларви на хелминти, използвайки пигмент "рубрин", получен чрез култивиране на плесен Penicilium rubrum, като багрило. За да направите това, използвайте 3% воден разтвор на багрило.

Процесът на оцветяване на яйца и ларви завършва след 1,5 ч. Нежизнеспособните яйца на острици, говежди и джуджета тении, анкилостоми, трихостронгилиди придобиват интензивен розов цвят, анкилостоми и ларви на трихостронгилиди стават червени. По-малко ярък цвят се наблюдава в яйцата на кръгли червеи и червеи, тъй като при освобождаване от червата те вече имат тъмнокафяв цвят: Жизнеспособните яйца и ларвите не са оцветени.

Физико-химични методи за стимулиране на освобождаването на миракулид от яйца на трематоди. Методите са разработени от S.M. German и S.A. Beer (1984) за определяне на жизнеспособността на яйцата от описторхид и дикроцелиум чрез излагане на яйцата на реакционна среда. Ако са живи, мирацидият се освобождава. Методите се основават на физикохимичното активиране на жлезата за люпене на мирацидиум и стимулация двигателна активностларви. Стимулирането се постига чрез излагане на трематодни яйца на специална реакционна среда в комбинация с последователни техники - създаване на температурна разлика, изсушаване на суспензия от яйца, излагане на слаб поток от течност в тестовата капка, което допринася за масивно освобождаване на мирацидии от яйцата.

Определяне на жизнеспособността на яйцата на описторхидите по метода на Herman и Beer. Суспензия от яйца във вода (чешмяна, утаена) предварително се охлажда до 10-12 ° C. Всички последващи операции се извършват при стайна температура (18-22 °C). Една капка (приблизително 0,05 ml) от суспензия, съдържаща 100-400 яйца, се добавя към центрофужна епруветка. Епруветките се поставят в решетка за 5-10 минути, за да се утаят яйцата. Тогава тясна ивицаС филтърна хартия внимателно изсмучете излишната вода, докато се отстрани напълно. Добавете 2 капки среда към епруветката, разклатете, прехвърлете съдържанието с пипета върху предметно стъкло и оставете за 5-10 минути, като леко разклатите (или поставете под сешоар), за да създадете слаби течни течения в тестовата капка суспензия . Тази операция, която имитира перисталтиката на червата на мекотелото, позволява да се активира освобождаването на мирацидия. След това към суспензията се добавят още 2 капки от средата и след това препаратът се микроскопира с помощта на конвенционален светлинен микроскоп (Х200). През това време капакът на яйцата с жизнеспособен мирацидий трябва да се отвори и ларвата активно излиза в околната среда. Благодарение на наличието на етанол в него, мирацидият се имобилизира след 3-5 минути и след това се оцветява с багрило, намиращо се в средата. В резултат на това мирацидиите лесно се откриват и преброяват.

Приготвяне на реакционната среда. Средата се приготвя в 0.05 М Tris-HCi буфер при оптимални условия на рН 8.0-9.5. Към буфера се добавя етанол до 10-13% и багрило (сафранин, метиленово синьо и други, които действат в диапазона на рН) до слабо оцветяванетечност (например за сафранин крайната му концентрация ще бъде 1:50 000). Можете да използвате друг буфер, който работи в граници на алкално рН, например 0,05 М фосфат (рН 8,5). Следователно средата съдържа 96% етанол - 12 части; багрило (маточен разтвор) - 1-10 части; 0,05 M Tris-NS! буфер (pH 8,5-9,5) - до 100 части. Пример за среда: 12 части 96% етанол, 1 част наситен разтвор на сафранин, останалите до 100 части - 0,05 М Tris-HCl буфер, pH 9,5.

Определяне на жизнеспособността на яйца от дикроцелиум по метода на Herman, Beer, Stratan. Капка суспензия, съдържаща 100-150 яйца на трематоди, се поставя в центрофужна епруветка за 1-2 минути, за да се утаят яйцата. След това течността внимателно се изсушава с помощта на лента от филтърна хартия. Добавете 1-2 капки от реакционната среда с помощта на пипета на Пастьор и инкубирайте във водна баня при 28-30 °C за 2-3 минути. Състав на средата: 6 части бутанол, 94 части 0,4% разтвор на натриев хлорид или 0,3% разтвор на калиев хлорид в дестилирана вода. Яйцата в средата се прехвърлят с пипета върху предметно стъкло и се оставят за 1,5-2 часа на стайна температура (18-22 °C), като се добавят 1-2 капки (0,05) на всеки 25-30 минути (докато изсъхнат ). ml) разтвор на бутанол в дестилирана вода. След това препаратът се изследва под микроскоп при 100-200x увеличение. Жизнеспособността се определя от броя на отворените яйца с освободени мирацидии. Бутанолът прониква през порите на яйчната черупка, достига до мирацидиите и ги активира. Инкубацията при отбелязаната температура усилва този процес. Бутанолът в концентрация 3-7% е вреден за мирацидия, излизащ от яйцето. Прехвърлянето на суспензия от яйца от епруветка в предметно стъкло позволява, до момента на освобождаване на мирацидия (след 30-40 минути), да се намали концентрацията на бутанол поради изпаряване до безопасно ниво (1,5-0,5%). Наличието на натриев хлорид в средата в концентрация 0,1-0,5% (или калиев хлорид в концентрация 0,05-0,4%) определя активността на освободения мирацидий. За разлика от малките прозрачни яйца на описторха, яйцата на дикроцелия имат тъмно оцветена черупка, имат ясно видима капачка, която се отваря след появата на мирацидия. Следователно е по-удобно да се оцени жизнеспособността на яйцата на дикроцелиум чрез преброяване на отворените яйца, отколкото чрез оцветяване и преброяване на мирацидиите.

Луминесцентен метод за изследване на яйца и ларви на хелминти.

За първи път в хелминтологичната практика методите на флуоресцентна микроскопия са използвани през 1955 г. Съобщава се, че флуоресцентната микроскопия позволява да се разграничат живи и мъртви обекти, без да се повреди яйцето. За флуоресценция не са използвани UV лъчи, а синьо-виолетовата част на видимата светлина, с конвенционален микроскоп и предметни стъкла; приложен към осветителя OI-18 специален комплектцветни филтри.

Установено е, че живите и мъртвите яйца на кръгли червеи, острици, тении джуджета, говежди тении, широки тении и други хелминти флуоресцират по различен начин. Това явление се наблюдава както по време на първична луминесценция без използване на багрила, така и при оцветяване с флуорохроми (акридин оранжево, корифосфин, примулин, ауролин, берлерин сулфат, трипафлавин, риванол, хинин и др.).

Неоцветени, живи, несегментирани яйца на кръгли червеи светят ярко зелено с жълтеникав оттенък; в мъртвите яйца черупката излъчва зелена светлинамного по-ярка от тъмнозелената зародишна; При яйцата на кръглите червеи с ларва се появява само черупката, а при мъртвите яйца и черупката, и ларвата са ярко жълти.

Непигментираните и несегментираните живи яйца на острици и тении джуджета излъчват зеленикаво-жълта светлина; В мъртвите яйца черупката свети интензивно на фона на тъмнозелена ембрионална маса. С вторична луминесценция (при оцветяване с акридиново оранжево в разреждане 1: 10 000 и 1: 50 000 от 30 минути до 2 часа) черупката на живи и мъртви нематоди, трематоди и цестоди луминесцира по различен начин.

Черупката на живи и мъртви Ascaris lumbricoides, Toxocara leonina, Enterobius vermicularis, Hymenolepis nana, H.fraterna, H. diminuta, T.saginatus, D.latum е оцветена в оранжево-червено. Ембриони на живи Asc. lumbricoides, T.leonina, H.diminuta, D.latum и онкосферите на говежди тения флуоресцират в матов тъмнозелен или сиво-зелен цвят. Мъртвите ембриони на тези яйца на хелминти излъчват "горяща" оранжево-червена светлина. Живите ларви на острици и токсокари (освободени яйчни черупки) излъчват слаба сиво-зелена светлина; когато умрат, цветът се променя от края на главата до „горящо“ светлозелено, след това жълто, оранжево и накрая ярко оранжево.

При оцветяване с флуорохроми - корифосфилус, примулин - мъртвите яйца на кръгли червеи и червеи проявяват блясък от лилаво-жълто до медно-червено. Жизнеспособните яйца не луминесцират, а са боядисани в тъмно зелено. Живите яйца на трематодите Paragonimus westermani и Clonorchis sinensis не луминесцират при оцветяване с акридиново оранжево, но мъртвите яйца излъчват жълтеникаво-зелена светлина.

Методът на луминесценция може да се използва и за определяне на жизнеспособността на ларвите на хелминтите. По този начин ларвите на стронгилат и рабдитатус, флуорохромирани с разтвор на акридиново оранжево (1: 2000), светят: живи - зелени (с оттенък), мъртви - с ярко оранжева светлина. Живите ларви на Trichinella не светят или дават слаб блясък, когато се третират в продължение на 10 минути с разтвори на флуоресцеин изотиоцианат, аурамин и др. Флуорохромираните мъртви ларви (в концентрация 1:5000) дават ярка светлина.

Живите мирацидии, излизащи от черупката, излъчват слаба синкава светлина с едва забележимо светло жълто венче от реснички, но 10-15 минути след смъртта те се появяват с ярка „горяща“ светлозелена и след това оранжево-червена светлина.