Analýza zmiešanej kultúry lymfocytov skl. Zmiešaná kultúra lymfocytov

Každý webový vývojár potrebuje poznať SQL, aby mohol písať databázové dotazy. A aj keď phpMyAdmin nebol zrušený, na písanie nízkoúrovňového SQL je často potrebné zašpiniť si ruky.

Preto sme pripravili krátku prehliadku základov SQL. Začnime!

1. Vytvorte tabuľku

Príkaz CREATE TABLE sa používa na vytváranie tabuliek. Argumenty musia byť názvy stĺpcov, ako aj ich dátové typy.

Vytvorme si jednoduchú tabuľku s názvom mesiac. Pozostáva z 3 stĺpcov:

• id– Číslo mesiaca v kalendárnom roku (celé číslo).
• názov– Názov mesiaca (reťazec, maximálne 10 znakov).
• dni– Počet dní v tomto mesiaci (celé číslo).

Takto by vyzeral zodpovedajúci SQL dotaz:

CREATE TABLE mesiace (id int, meno varchar(10), dni int);

Taktiež pri vytváraní tabuliek je vhodné pridať primárny kľúč pre jeden zo stĺpcov. Vďaka tomu budú záznamy jedinečné a urýchlia sa požiadavky na načítanie. V našom prípade nech je názov mesiaca jedinečný (stĺpec názov)

CREATE TABLE months (id int, name varchar(10), days int, PRIMARY KEY (name));

dátum a čas

Dátový typ	Popis
DÁTUM	Hodnoty dátumu
DÁTUM ČAS	Hodnoty dátumu a času s presnosťou na minútu
ČAS	Časové hodnoty

2. Vkladanie riadkov

Teraz vyplňte našu tabuľku mesiacov užitočná informácia. Pridávanie záznamov do tabuľky sa vykonáva pomocou príkazu INSERT. Sú dva spôsoby, ako napísať tento návod.

Prvým spôsobom nie je špecifikovať názvy stĺpcov, do ktorých sa budú údaje vkladať, ale zadať iba hodnoty.

Táto metóda zaznamenávania je jednoduchá, ale nebezpečná, pretože nie je zaručené, že pri rozširovaní projektu a úprave tabuľky budú stĺpce v rovnakom poradí ako predtým. Bezpečný (a zároveň ťažkopádnejší) spôsob písania príkazu INSERT vyžaduje zadanie hodnôt aj poradia stĺpcov:

Tu je prvá hodnota v zozname HODNOTY sa zhoduje s prvým zadaným názvom stĺpca atď.

3. Extrahovanie údajov z tabuliek

Príkaz SELECT je náš najlepší priateľ keď chceme získať údaje z databázy. Používa sa veľmi často, preto tejto časti venujte veľkú pozornosť.

Najjednoduchším použitím príkazu SELECT je dotaz, ktorý vráti všetky stĺpce a riadky z tabuľky (napríklad tabuľky podľa názvu postavy):

VYBERTE * Z "znakov"

Symbol hviezdičky (*) znamená, že chceme získať údaje zo všetkých stĺpcov. Keďže SQL databázy zvyčajne pozostávajú z viac ako jednej tabuľky, je potrebné špecifikovať kľúčové slovo FROM, za ktorým nasleduje názov tabuľky oddelený medzerou.

Niekedy nechceme získať údaje z nie všetkých stĺpcov v tabuľke. Aby sme to dosiahli, musíme namiesto hviezdičky (*) zapísať názvy požadovaných stĺpcov oddelené čiarkami.

VYBERTE ID, názov FROM mesiac

Okrem toho v mnohých prípadoch chceme, aby boli výsledné výsledky zoradené v určitom poradí. V SQL to robíme pomocou ORDER BY. Môže akceptovať voliteľný modifikátor - ASC (predvolené) triedenie vo vzostupnom poradí alebo DESC, triedenie v zostupnom poradí:

VYBERTE id, meno OD mesiaca ORDER BY name DESC

Pri použití príkazu ORDER BY sa uistite, že je v príkaze SELECT na poslednom mieste. V opačnom prípade sa zobrazí chybové hlásenie.

4. Filtrovanie údajov

Naučili ste sa, ako vybrať konkrétne stĺpce z databázy pomocou dotazu SQL, ale čo ak potrebujeme získať aj konkrétne riadky? Na pomoc tu prichádza klauzula WHERE, ktorá nám umožňuje filtrovať údaje v závislosti od stavu.

V tomto dopyte vyberáme z tabuľky len tie mesiace mesiac, v ktorých je viac ako 30 dní s použitím operátora väčší ako (>).

SELECT id, name FROM month WHERE days > 30

5. Pokročilé filtrovanie údajov. operátory AND a OR

Predtým sme používali filtrovanie údajov pomocou jediného kritéria. Pre komplexnejšie filtrovanie údajov môžete použiť operátory AND a OR a operátory porovnávania (=,<,>,<=,>=,<>).

Tu máme tabuľku obsahujúcu štyri najpredávanejšie albumy všetkých čias. Vyberme si tie, ktoré sú klasifikované ako rockové a predalo sa z nich menej ako 50 miliónov kópií. To sa dá ľahko dosiahnuť umiestnením operátora AND medzi tieto dve podmienky.

VYBERTE * Z albumov WHERE žáner = "rock" A predaj_v_miliónoch<= 50 ORDER BY released

6. Medzi/medzi/páči sa mi

WHERE podporuje aj niekoľko špeciálnych príkazov, ktoré vám umožňujú rýchlo skontrolovať najčastejšie používané dotazy. Tu sú:

• IN – slúži na označenie rozsahu podmienok, z ktorých môže byť splnená ktorákoľvek
• BETWEEN – kontroluje, či je hodnota v zadanom rozsahu
• LIKE – hľadá konkrétne vzory

Napríklad, ak chceme vybrať albumy s pop A duša hudba, môžeme použiť IN("value1","value2") .

SELECT * FROM albumov WHERE žáner IN ("pop","soul");

Ak chceme získať všetky albumy vydané v rokoch 1975 až 1985, musíme napísať:

SELECT * FROM albumy WHERE vydané BETWEEN 1975 AND 1985;

7. Funkcie

SQL je nabitý funkciami, ktoré robia najrôznejšie užitočné veci. Tu sú niektoré z najčastejšie používaných:

• COUNT() – vráti počet riadkov
• SUM() - vráti celkový súčet číselného stĺpca
• AVG() - vráti priemer množiny hodnôt
• MIN() / MAX() – získa minimálnu/maximálnu hodnotu zo stĺpca

Ak chcete získať posledný rok v našej tabuľke, musíme napísať nasledujúci SQL dotaz:

SELECT MAX (vydané) FROM albumov;

8. Poddotazy

V predchádzajúcom odseku sme sa naučili robiť jednoduché výpočty s údajmi. Ak chceme použiť výsledok z týchto výpočtov, bez vnorených dopytov sa nezaobídeme. Povedzme, že chceme výstup umelec, album A rok vydania pre najstarší album v tabuľke.

Vieme, ako získať tieto konkrétne stĺpce:

SELECT interpret, album, vydané FROM albumov;

Vieme tiež, ako získať najskorší rok:

SELECT MIN(vydané) Z albumu;

Všetko, čo je teraz potrebné, je skombinovať tieto dva dotazy pomocou WHERE:

VYBRAŤ interpreta,album,vydané FROM albumov WHERE vydané = (SELECT MIN(vydané) FROM albumov);

9. Spájanie stolov

V zložitejších databázach existuje viacero vzájomne súvisiacich tabuliek. Nižšie sú napríklad dve tabuľky o videohrách ( video hry) a vývojári videohier ( game_developers).

V tabulke video hry existuje stĺpec vývojára ( developer_id), ale obsahuje celé číslo, nie meno vývojára. Toto číslo predstavuje identifikátor ( id) príslušného vývojára z tabuľky vývojárov hier ( game_developers), ktoré logicky spája dva zoznamy, čo nám umožňuje používať informácie uložené v oboch súčasne.

Ak chceme vytvoriť dotaz, ktorý vráti všetko, čo potrebujeme vedieť o hrách, môžeme použiť INNER JOIN na prepojenie stĺpcov z oboch tabuliek.

SELECT video_games.name, video_games.genre, game_developers.name, game_developers.country FROM video_games INNER JOIN game_developers ON video_games.developer_id = game_developers.id;

Toto je najjednoduchší a najbežnejší typ JOIN. Existuje niekoľko ďalších možností, ktoré sa však týkajú menej bežných prípadov.

10. Prezývky

Ak sa pozriete na predchádzajúci príklad, všimnete si, že sú tam dva stĺpce tzv názov. Je to mätúce, takže nastavme alias na jeden z opakujúcich sa stĺpcov, ako je tento názov od stola game_developers bude zavolaný vývojár.

Dotaz môžeme tiež skrátiť aliasom názvov tabuliek: video hry zavolajme si hry, game_developers - devs:

SELECT games.name, games.genre, devs.name AS developer, devs.country FROM video_games AS games INNER JOIN game_developers AS devs ON games.developer_id = devs.id;

11. Aktualizácia údajov

Často potrebujeme zmeniť údaje v niektorých riadkoch. V SQL sa to robí pomocou príkazu UPDATE. Vyhlásenie UPDATE pozostáva z:

• Tabuľka, v ktorej sa nachádza náhradná hodnota;
• Názvy stĺpcov a ich nové hodnoty;
• Riadky vybraté pomocou WHERE, ktoré chceme aktualizovať. Ak tak neurobíte, všetky riadky v tabuľke sa zmenia.

Nižšie je tabuľka TV_series s televíznymi seriálmi a ich hodnoteniami. Do tabuľky sa však vkradla malá chybička: hoci séria Hra o tróny a je opísaná ako komédia, to naozaj nie je. Poďme to napraviť!

Údaje tabuľky tv_series AKTUALIZÁCIA TV_series SET žáner = "dráma" WHERE id = 2;

12. Vymazanie údajov

Odstránenie riadku tabuľky pomocou SQL je veľmi jednoduchý proces. Všetko, čo musíte urobiť, je vybrať tabuľku a riadok, ktoré chcete odstrániť. Z predchádzajúceho príkladu vymažeme posledný riadok tabuľky TV_series. To sa vykonáva pomocou inštrukcie >DELETE.

DELETE FROM tv_series WHERE id = 4

Buďte opatrní pri písaní príkazu DELETE a uistite sa, že je prítomná klauzula WHERE, inak budú všetky riadky v tabuľke vymazané!

13. Vymažte tabuľku

Ak chceme vymazať všetky riadky, ale opustiť samotnú tabuľku, použijeme príkaz TRUNCATE:

TRUNCATE TABLE názov_tabuľky;

V prípade, že skutočne chceme vymazať údaje aj samotnú tabuľku, potom sa nám bude hodiť príkaz DROP:

DROP TABLE názov_tabuľky;

Pri týchto príkazoch buďte veľmi opatrní. Nedajú sa zrušiť!/p>

Toto končí náš SQL tutoriál! Je toho veľa, čo sme nepokryli, ale to, čo už viete, by vám malo stačiť na to, aby ste získali praktické zručnosti pre vašu webovú kariéru.

Kokultivácia lymfocytov s molekulami MHC-II rôznych haplotypov spôsobuje ich blastickú transformáciu a proliferáciu. Reagujúce bunky patria k T-lymfocytom a sú stimulované cudzími MHC-II determinantmi umiestnenými na B-lymfocytoch a makrofágoch. Sila reakcie závisí od stupňa rozdielu medzi histokompatibilnými antigénmi. Na vyhodnotenie reaktivity jedinca na alelický variant MHC sa pripraví jednosmerná kultúra lymfocytov. Na tento účel sa stimulujúce bunky vopred ošetria mitomycínom alebo sa ožarujú, zatiaľ čo stimulujúce bunky strácajú schopnosť deliť sa, ale zostávajú životaschopné.

Reaktivita v zmiešanej kultúre lymfocytov je jedným z kritérií hodnotenia bunkovej imunity. SCL vám umožňuje vykonávať HLA typizácia vybrať pár darca-príjemca na transplantáciu tkanív a orgánov a vykonať koreláciu medzi antigénmi HLA a určitými chorobami.

Na štádium reakcie sa používa suspenzia lymfocytov izolovaných z krvi pacientov (darcu a príjemcu). Premyté reagujúce bunky sa suspendujú v malom množstve média 199 (0,5 ml) a po spočítaní počtu buniek sa upraví na 0,6 x 106 buniek/ml. Suspenzia stimulujúcich buniek sa pripraví podobne s pridaním roztoku mitomycínu C (500 μg mitomycínu C v 1 ml pufrovaného fyziologického roztoku) v množstve 0,1 ml na 1 ml suspenzie. Bunková zmes sa inkubuje 40 minút pri 37 °C vo vodnom kúpeli za miešania, potom sa k suspenzii pridá studené médium 199 a bunky sa trikrát premyjú centrifugáciou. Sediment je suspendovaný v živné médium kultiváciou, čím sa počet buniek zvýši na 0,6 x 106 buniek/ml.

0,1 ml bunkovej suspenzie v Hanksovom roztoku sa pridá do jamiek sterilnej imunologickej platne s okrúhlym dnom a pridá sa 0,1 ml bunkovej suspenzie nesúcej MHC alelické varianty. Rovnaké množstvo Hanksovho roztoku sa pridá ku kontrole.

Výsledky sa zaznamenávajú po inkubácii buniek pri 37 °C počas 3 až 5 dní v závislosti od nastavenia reakcie pomocou morfologickej alebo izotopovej metódy (pozri RBTL).

Počas transplantácie kostná dreň výber histokompatibilného darcu sa uskutočňuje na základe výsledkov HLA typizácie darcu a príjemcu, ako aj pri stanovení kompatibility vybraných HLA-identických párov darca-príjemca v SCL, čo je záverečná fáza hodnotenia kompatibility. Na tento účel sa používa obojsmerná SCL reakcia s použitím kultivačnej mikrometódy v 96-jamkovej platni s hodnotením množstva proliferácie zahrnutím rádioaktívneho H3-tymidínu do DNA proliferujúcich lymfocytov.

Výskumu roly sa v súčasnosti venuje veľká pozornosť imunitných mechanizmov v reprodukčnom procese, pretože ich porušenie vedie k rozvoju neplodnosti a predčasnému ukončeniu tehotenstva. Štúdie imunologických parametrov a ich vzťahu s reprodukčné procesy nám umožnilo dospieť k záveru, že reštrukturalizácia bola nevyhnutná imunitný systém pri príprave tela matky na tehotenstvo, počnúc ovulačné obdobie, v čase implantácie embrya a v skoré obdobie tehotenstva.

Jednou z najzložitejších a ťažko diagnostikovateľných príčin neplodnosti a opakovaných spontánnych potratov je imunitná dysfunkcia.

S cieľom včasné odhalenie imunologické vyšetrenie neplodnosti sa vykonáva v laboratóriu imunológie reprodukcie manželské páry použitím nasledujúce metódy diagnostika:

• štúdium úrovne proliferačnej odpovede ženských lymfocytov na antigény partnera (v zmiešanej kultúre lymfocytov)
• stanovenie aktivity blokujúcich faktorov v ženskom krvnom sére.
• hodnotenie kvantitatívneho obsahu subpopulácií prirodzených cytotoxických buniek v periférna krvženy.
• rozšírený imunogram
• štúdium obsahu regulačných buniek so supresorovou aktivitou v periférnej krvi.
• pri identifikácii klinických a laboratórne príznaky Odporúča sa podstúpiť imunologické vyšetrenie pacientok s neplodnosťou lekársky postup- aloimunizácia manželovými lymfocytmi, ktorá sa vykonáva podľa individuálneho plánu.

Vyžaduje sa konzultácia:

• ak pri absencii gynekologických a endokrinné ochorenia Pri pravidelnej sexuálnej aktivite po dobu jedného roka nie je tehotenstvo.
• pri opakovaných (viac ako raz) spontánnych prerušeniach tehotenstva (potrat).
• pri neúspešné IVF v anamnéze.
• keď hrozí prerušenie skutočného tehotenstva.

Pri zistení porúch je predpísaný postup za účelom imunokorekcie porúch aloimunizácia partnerskými lymfocytmi (AIL). Táto metóda ošetrenie schválené na použitie Federálna služba pre výkon dohľadu v oblasti zdravotníctva (licencia FS č. 2009/179 zo dňa 7.2.2009)

Postup sa vykonáva iba vtedy, ak má partner negatívne výsledky analýza na infekciu HIV, syfilis a vírusová hepatitída(B, C). Pri AIL neboli identifikované žiadne komplikácie. Metóda AIL má výrazný imunokorekčný účinok, zvyšuje účinnosť liečby neplodnosti, ako napr prirodzený cyklus a s mimotelové oplodnenie(ECO). Predpísané aj pri neúspešných pokusoch o oplodnenie in vitro.

AIL sa vykonáva raz za 28-30 dní (v súlade s menštruačný cyklusženy) v 1. fáze cyklu. Prvý kurz zahŕňa 3 procedúry AIL. Po 2. procedúre pár opäť absolvuje kontrolný test. Ak existuje pozitívna dynamika, tretí postup AIL je posledný. Ak nie je žiadna dynamika, dávka buniek na imunizáciu sa zvýši a uskutoční sa 2. kurz vrátane 2 procedúr. Po kontrolnom rozbore je v niektorých prípadoch potrebné predpísať 3. imunizáciu so zvýšením dávky buniek. Po dosiahnutí štandardných hodnôt pretrváva pozitívny efekt 6-8 mesiacov.

Za obdobie rokov 2003 až 2013. V laboratóriu bunkovej imunoterapie bolo vykonaných asi 3000 aloimunizačných procedúr s partnerskými lymfocytmi. Pri tomto postupe sa z krvi partnera izolujú iba lymfocyty, ktoré sú vždy prítomné v semennej tekutine. V iných krajinách* sa už 20 rokov vykonáva aj aloimunizačná procedúra, ktorá pomáha žene vynosiť a porodiť zdravé dieťa.

Typ služby	cena, rub.
Test transformácie lymfocytov (Detekcia sesibilizácie v 1. storočí)	1650
Test transformácie lymfocytov (detekcia sesibilizácie na 2b-va)	2 900
Test transformácie lymfocytov (detekcia sesibilizácie na 3b-va)	3 900
Test transformácie lymfocytov (imunologické vyšetrenie na neplodnosť)	3 200
Rozšírený imunogram s aktivačnými markermi	4 625
Komplexná štúdia imunitného stavu	4 125
Očkovanie (aloimunizácia partnerskými lymfocytmi 1 dávka)	1 900
Očkovanie (aloimunizácia partnerskými lymfocytmi, 2. dávka)	2 750
Očkovanie (aloimunizácia partnerskými lymfocytmi, 3. dávka)	3 400
Štúdium CD16+/CD56+ lymfocytov (imunologické vyšetrenie na neplodnosť len NK bunky)	1 250
Štúdium aktivity makrofágov (kondicionované makrofágové médiá)	9 400
Štúdium aktivity makrofágov (kondicionované médiá)	1 500
Kryokonzervácia mononukleárnych buniek na aloimunizáciu	650

2.2. Metódy bunkových interakcií

Takmer všetky metódy bunkových interakcií používané v klinickej imunogenetike sú založené na fenoméne tvorby blastov v zmiešanej kultúre lymfocytov, ktorý objavila kanadská výskumníčka Barbara Bain. Reakcia zmiešanej kultúry lymfocytov (MLC) umožnila uskutočniť jemne diferencovanú štúdiu komplexu HLA a najmä jednej z jeho podjednotiek - lokusu HLA-D. Množstvo ďalších metód bunkových interakcií - bunkami sprostredkovaná lymfolýza (CML), lymfocytový priming test (Primed Lymphocyte Typing) - je založených na metóde MLC alebo ju obsahuje ako integrálnu súčasť.

2.2.1. Zmiešaná kultúra lymfocytov (MCL)

Princíp metódy je znázornený na obr. 10, z ktorého je zrejmé, že dve populácie geneticky odlišných lymfocytov navzájom interagujú v in vitro kultúre. Jedna z populácií je liečená mitomycínom C alebo ožarovaná, v dôsledku čoho stráca schopnosť vytvárať blasty a inkorporovať tymidín (3 HT), avšak bez straty antigénnych vlastností si zachováva schopnosť stimulácie (stimulanty; S -populácia).

Bunky, ktoré reagujú na stimuláciu (respondenti, R-populácia), sa po niekoľkých dňoch transformujú na blasty a zahŕňajú tymidín pridaný do kultúry. Intenzita reakcie sa meria pomocou indikátora žiarenia na inkorporáciu3H-tymidínu.

Je známych niekoľko variantov reakcie zmiešanej kultúry lymfocytov, z ktorých sú tu navrhnuté dva: tradičný a mikrovariant implementovaný do Cookových tabliet (obr. 11).

Ryža. 11. Zariadenie pre mikrovarianty MLC a CML. 1 - tableta s okrúhlym dnom s 96 otvormi; 2-automatická pipeta („Pipetman“) s programom pre rôzne objemy; 3 - automatická pipeta ("Sigma") pre určitý objem; 4 - špička pipety na jedno použitie; 5 - box s laminárnym tokom

Tradičná verzia MLC (úprava F. S. Baranovej):

Lymfocyty sa izolujú na Ficoll-urografinovom gradiente, ako je opísané vyššie. Prvé premytie sa uskutoční v PBS (NaCl - 8,0 g, Na2HP04 - 1,15 g, KH2P04 - 0,2 g, KCl - 0,2 g na 1 liter H20); ďalšie dva sa vyrábajú v médiu 199 s 5 % AB sérom (súbor od 15 darcov);

Reagujúce bunky sa resuspendujú v médiu 199 s 10 % AB sérom a koncentrácia buniek sa upraví na 0,6 x 106 na ml;

Stimulačné bunky izolované rovnakým spôsobom v koncentrácii 5 - 106 na 1 ml sa ošetria mitomycínom C (60 y/ml) od spoločnosti Serva a inkubujú sa 40 minút pri 37 °C vo vodnom kúpeli. Po inkubácii sa bunky 3-krát premyjú médiom 199 s 5 % AB sérom, resuspendujú sa v médiu 199 s 10 % AB sérom, čím sa koncentrácia zvýši na 0,6 x 106 v 1 ml;

0,5 ml reagujúcich buniek a 0,5 ml stimulujúcich buniek sa zmieša v centrifugačnej skúmavke, pridá sa 0,04 ml 10 ml roztoku Hepes (Serva) a inkubuje sa 144 hodín; skúsenosť je umiestnená v troch paralelách (triplet);

24 hodín pred koncom inkubácie pridajte 3H-tymidín 1μCi (3,7x104 BC) do skúmaviek na vzorku konkrétnu činnosť 5 mCi/mmol (18,5 x 107 BC/mmol) a pokračuje sa v inkubácii;

Na konci inkubácie sa bunky prenesú na millipore filtre (0,6 - 0,9 mikrónov) a premyjú sa soľný roztok(37 °C) a ochladený 5 % roztok kyseliny trichlóroctovej (4 °C). Filtre sa vysušia a umiestnia sa do liekoviek s 5 ml scintilačnej kvapaliny (5 g PPO a 0,5 g POPOP - na 1 liter toluénu) *. Aktivita inkorporácie3H-tymidínu sa meria v P-počítači; výsledok je vyjadrený v absolútnych inklúziách rádioaktívnej značky za 1 min alebo v stimulačnom indexe (SI) podľa vzorca:

* (PPO - 2,5-fenol-oxazol; POPOR - (1,4-di-2-15-fenoloxazolitbenzén).)

Priemerná hodnota CPM v troch prototypoch

SI = Priemerná hodnota CPM v troch kontrolných vzorkách/Spontánne kultúry reagujúcich buniek slúžia ako kontrolné vzorky.

Mikro verzia MLC v tabletách Cook. Na 8. workshope boli vyvinuté požiadavky, ktoré štandardizujú mikromožnosť MLC, v súlade s ktorou je uvedená nižšie:

Lymfocyty sa izolujú v gradiente isopaque-ficoll a resuspendujú sa v médiu RPMJ-1640*, čím sa koncentrácia zvýši na 5x105 v 1 ml;

* (Môže sa použiť médium 199 zmiešané s ľudským sérom skupiny AB (5 % sérum odobraté od niekoľkých jedincov).)

Stimulačné bunky sa ošetria mitomycínom C alebo tréningom;

5x104 respondérov a rovnaký počet stimulátorov sa umiestni pomocou mikropipety typu Pipetman do každej jamky Cookovej mikroplatničky s okrúhlym dnom;

Platne sa inkubujú v termostate s automatickým dodávaním 5 % CO 2 počas 120 hodín; potom sa do každej jamky pridá 1 μmCi3H-tymidínu so špecifickou aktivitou tymidínu 6 Ci/mmol; všetky manipulácie sa vykonávajú pomocou pipety Pipetman;

16 hodín po pridaní tymidínu sa kultúry z každej jamky prenesú na millipore filtre pomocou automatickej pipety a premyjú sa fyziologickým roztokom a potom 5 % kyselinou trichlóroctovou; je vhodné použiť špeciálne „kombajny“ na prenos kultúry do millipore filtrov;

Aktivita inkorporácie tymidínu bola stanovená tak, ako je opísané vyššie.

2.2.2. Bunkami sprostredkovaná lymfolýza (CML)

CML sa v imunogenetických štúdiách používa relatívne nedávno (od roku 1972), ale v r V poslednej dobe je stále viac a viac populárna technológia, umožňujúce detailné štúdium úlohy eferentného spojenia transplantačnej imunity a získanie uznania ako informatívna metóda imunologické sledovanie. Princíp metódy je znázornený na obr. 12. Metóda je založená na technike navrhnutej J. Lightbodyom (1971), ktorá je stručne zhrnutá nasledovne.

1. CML začína konvenčným HLC testom, v ktorom odpovedajúce bunky rozpoznávajú „stimulátory“, senzibilizujú odpovedajúce bunky a vytvárajú senzibilizované zabíjačské bunky.

2. Druhá fáza, v ktorej sa senzibilizované zabíjačské bunky zmiešajú s cieľovými bunkami značenými51Cr, pozostáva z ich deštrukcie efektorovými zabíjačskými bunkami; cieľové bunky môžu mať rovnaký genotyp ako „stimulátory“ v prvej fáze MLC, alebo to môžu byť bunky „tretieho“ partnera, vybaveného antigénnymi determinantami spoločnými pre „stimulátory“ alebo bez nich.

3. Množstvo rádioaktívneho chrómu uvoľneného zo zničených cieľových buniek a uvoľneného do kultivačného média slúži ako miera intenzity zabíjacieho účinku.

Ryža. 12. Princíp bunkami sprostredkovanej lymfolýzy (CML). I. rad - senzibilizácia reagujúcich buniek, tvorba zabíjačských buniek; Riadok II - interakcia vrahov s cieľom; Riadok III - deštrukcia cieľovej bunky; výťažok 51Cr kultivačného média

Sú tu opísané tri varianty CML: tradičná verzia upravená L. P. Alekseevom (1979), mikrovariant v Cookových tabletách, priama CML (Direct-CML -D-CML.

Tradičná možnosť[Alekseev L.P., 1979].

Metóda je rozdelená do niekoľkých etáp.

Získavanie nájomných vrahov:

Periférne lymfocyty oboch populácií (R-bunky a S-bunky) sa izolujú obvyklým spôsobom, premyjú sa trikrát v hustotnom gradiente v médiu 199 s 5% AB sérom (10 min, 150 g);

1x106 R buniek (0,8 ml) sa zmieša v centrifugačných skúmavkách s 2x106 S bunkami (0,2 ml) ošetrenými mitomycínom C a inkubuje sa 144 hodín pri 37 °C;

Bunky sa centrifugujú pri 150 g počas 10 minút a sediment sa resuspenduje v médiu 199 s pridaním 20 % teľacieho séra (médium 199 + t.j.), čím sa koncentrácia zvýši na 1 x 106 v 1 ml;

Jedna zo vzoriek je ponechaná na štúdium úrovne MLC, zvyšok sa používa ako hotoví zabijaci.

Získavanie cieľov:

Lymfocyty izolované zvyčajným spôsobom sa resuspendujú v médiu 199 s 20 % AB sérom a inkubujú sa s fytohemaglutinínom (0,003 mg/ml Wellcome) počas 72 hodín pri 37 °C; koncentrácia buniek 1x106 v 1 ml;

Bunky sa centrifugujú 10 minút pri 150 g, sediment sa resuspenduje v médiu 199 s 5 % AB sérom a koncentrácia buniek sa upraví na 2x104 v 1 ml;

K suspenzii sa pridá51Cr 100 uCi/ml (3,7x106 BC/ml) a inkubuje sa 40 minút pri 37 °C;

Bunky sa premyjú trikrát v médiu 199 s prídavkom 5 % AB séra (150 g, 10 minút) a sediment sa resuspenduje v médiu 199 s 5 % AB sérom. zvýšenie koncentrácie na 2x104 v 1 ml.

Nastavenie reakcií:

5 x 105 zabíjačov (0,5 ml) sa zmieša s 1 x 104 terčov (0,5 ml), inkubuje sa 4 hodiny (37 °C) a centrifuguje sa pri 150 g počas 10 minút;

Supernatant sa odsaje a impulz spôsobený 51Cr sa spočíta na počítadle; počítanie sa uskutoční v 0,5 ml supernatantu;

Úroveň cytolýzy sa vypočíta podľa nasledujúceho vzorca:

Ekper. výstup 51 Cr - spontánny výstup 51 Cr/max, výstup 51 Cr - spontánny výstup 41 Cr × 100.

Spontánne uvoľňovanie chrómu sa meria na cieľoch inkubovaných počas 4 hodín (37 °C) bez zabíjačských buniek; maximálna výťažnosť chrómu - na cieľoch úplne zničených zmrazením a rozmrazením; Všetky testy sa vykonávajú v trojiciach.

Mikrovariant CML v tabletách [podľa Mawasa S., 1976]:

Fáza získania zabíjačov sa uskutočňuje ako MLC na doštičkách s okrúhlym dnom, ale R- a S-bunky sa zmiešajú v rovnakých množstvách, 2x105 pa v každej jamke a inkubujú sa pri 37 °C;

Po 5 dňoch sa bunky odoberú Pasteurovou pipetou do skúmavky, počet živých sa spočíta pomocou trypánovej modrej a koncentrácia sa upraví na 10x106 v 1 ml;

Cieľové bunky sa kultivujú s PHA počas 3 dní;

V deň reakcie sa cieľové bunky premyjú (300 g) a resuspendujú v kultivačnom médiu, pričom sa 1 ml rozdelí do skúmaviek a upraví sa na 1 x 106 v 1 ml;

Pridajte 200 μCi 51 Cr (7,4 x 106 BC) do každej skúmavky s cieľovými bunkami a inkubujte 1 hodinu pri 37 °C; umyte bunky 3 krát; sediment sa resuspenduje a upraví na koncentráciu 1 x 10 v 1 ml (živý);

Test sa vykonáva v mikroplatniach s okrúhlym dnom; na tento účel sa do každej jamky rozdelí 0,7 - 1x106 zabíjačských buniek (0,1 ml) a 1x104 cieľových buniek (0,1 ml); celkový objem suspenzie v každej jamke je 0,2 ml, do každej jamky sa pridá 0,05 ml média a inkubuje sa (37 °C) počas 4 hodín;

Doštičky sa centrifugujú pri 800 g na centrifúge Beckman počas 10 minút; supernatant z každej jamky sa prenesie do skúmaviek a spočíta sa na y-počítači;

Fáza produkcie zabíjačských buniek (MLC) sa uskutočňuje na médiu RPMJ-1640 s prídavkom 20 % ľudskej plazmy; pre fázu usmrcovania použite médium MEM s prídavkom 20 % ľudskej plazmy, predhriate.

Priama CML (D-CML). Direct CML je technika vyvinutá špeciálne na klinické účely, ktorá našla využitie pri imunologickom monitorovaní. Schéma tejto reakcie je znázornená na obr. 13.

Hlavným rozdielom od tradičnej CML je, že štádium tvorby zabíjačských buniek (fáza senzibilizácie) sa nevyskytuje in vitro, ale in vivo, teda v ľudskom tele senzibilizovanom transplantáciou alogénneho orgánu alebo tkaniva. Vplyvom alogénneho tkaniva sú lymfocyty príjemcu senzibilizované na tkanivové antigény darcu a nevyžadujú špeciálne ošetrenie in vitro, doba trvania testu sa výrazne skracuje, pretože sa musia najskôr pripraviť len terčíky.

Používanými cieľmi sú lymfocyty získané z periférnej krvi alebo častejšie zo sleziny darcu (pozri 2.1.2) a zmrazené ktoroukoľvek z metód opísaných vyššie (pozri 2.1.3).

2.2.3. Cytotoxicita sprostredkovaná bunkami závislá od protilátky (ADCC)

Tento typ bunkovej odpovede je podobný v mechanizme účinku ako CML opísaná vyššie. Princíp reakcie je znázornený na obr. 14. Zložkami reakcie sú cieľové bunky (darcovské bunky alebo alogénne lymfocyty), sérum (alogénne alebo recipientné), pravdepodobne obsahujúce protilátky namierené proti determinantom cieľových buniek, a efektorové bunky (recipientné lymfocyty alebo alogénne lymfocyty).

Efektorové bunky v tomto type interakcie sú takzvané K-bunky umiestnené v periférnej krvi. Na rozdiel od zabíjačských buniek v CML vykonávajú cytotoxický účinok bez predchádzajúcej senzibilizácie, manifestácia cytotoxického účinku K buniek je však možná len prostredníctvom protilátok nasmerovaných na determinanty cieľových buniek. Špecifická lýza sa meria uvoľňovaním51Cr, ak testované sérum obsahuje protilátky proti cieľovým determinantom.

Cieľovými determinantami v ADCC môžu byť prakticky špecifiká všetkých HLA lokusov, vrátane HLA-D, HLA-DR, ako aj determinantov ležiacich mimo HLA systému.

Najrozšírenejšie Táto komplexná reakcia sa získala pri imunologickom monitorovaní na detekciu protilátok B-buniek. V tomto ohľade bolo navrhnutých niekoľko modifikácií, ktoré poskytujú obohatenie suspenzie cieľových buniek B lymfocytmi, adsorpciu séra na krvné doštičky atď.

Okrem toho sa v tomto systéme zohľadňuje množstvo ďalších funkcií odozvy. Testované sérum musí byť dekomplementované, inak môže byť reakciou protilátkou sprostredkovaná cytotoxicita závislá od komplementu. Tiež sa predpokladá, že efektorové bunky môžu spôsobiť určitú deštrukciu cieľov podľa typu CML.

V konečnom dôsledku je celý súbor vzoriek v teste bunkami sprostredkovanej lymfocytotoxicity závislej od protilátky nasledovný:

Terče + efektory + testovacie sérum (experimentálna vzorka);

Ciele (kontrolná vzorka, t.j. spontánne uvoľnenie51Cr);

Ciele + efektory (kontrolný test efektorovej aktivity);

Ciele + testovacie sérum (kontrolné sérum).

Lymfocyty sa rutinne izolovali a resuspendovali v RPMI-1640 + 10 % fetálneho hovädzieho séra; ošetrenie suspenzie karbonylovým železom na odstránenie monocytov; pridajte chlorid amónny alebo H 2 O na lýzu zostávajúcich červených krviniek;

51Cr vo forme roztoku Na2Cr04 100 - 200 uCi ml (3,7 x 106 - 7,4 x 106 BC/ml) sa pridá k suspenzii cieľových buniek a inkubuje sa 40 - 60 minút;

Bunky sa premyjú trikrát v RPMI + 0,1 % HSA, resuspendujú sa v rovnakom médiu a upravia sa na 2 x 108 v 1 ml; 50 ul suspenzie označených buniek sa umiestni do skúmavky a aktivita izotopu sa následne vypočíta na y-počítači, aby sa identifikovala úplná izotopová „asimilácia“; zvyšok sa naleje do jamiek platne, 50 ul suspenzie (1x105 buniek na jamku);

Suspenzia efektorových buniek sa upraví na 2x107 buniek v 1 ml a c. každá jamka je naplnená 50 ul suspenzie (alebo 100 ul), pomer efektorov k cieľom je 10:1 (alebo 20:1);

Inkubácia pokračuje 4 hodiny vo vlhkej termostatickej atmosfére s 5 % CO 2 (dobu inkubácie možno predĺžiť až na 8 hodín);

Pripravte niekoľko riedení testovacieho séra v skúmavkách (1:25; 1:100) a pridajte až 50 µl každého riedenia do jamiek: a neriedené sérum; konečné nastavenie testu vyzerá tak, ako je uvedené v tabuľke. 23.

Tabuľka 23

inscenácia ADCC. Všetky možnosti vzoriek, µl

* (Namiesto testovacieho séra sa nakvapká zmes AB sér.)

** (Namiesto testovacieho séra sa nakvapká monošpecifické sérum HLA namierené proti cieľom (nie efektorom).)

Inkubácia panelov pokračuje počas 4 hodín vo zvlhčenej atmosfére so 4 % C02; doba inkubácie sa môže predĺžiť až na 8 hodín;

Po inkubácii sa polovica objemu z každej jamky (100 μl) opatrne odsaje automatickou pipetou a umiestni sa do 51 Cr skúmaviek na počítanie impulzov; aktivita sa počíta na γ-počítači;

Výpočty sú nasledovné:

% uvoľnenia51Cr = 2 x A op - aktivita pozadia/B - aktivita pozadia x 100;

% cytotoxicity = Aop - Asp/100 - Asp x 100, kde Aop je % uvoľnenia51Cr v experimentálnych vzorkách; A sp - % spontánneho uvoľnenia; B - úplná asimilácia izotopu.

Ako pozitívny výsledok 5 % alebo vyššia cytotoxicita sa zvažuje po 4 hodinách inkubácie.