Analiza skl miješane kulture limfocita. Mješovita kultura limfocita

Svaki web programer treba poznavati SQL kako bi mogao pisati upite bazi podataka. I, iako phpMyAdmin nije otkazan, često je potrebno zaprljati ruke za pisanje SQL-a niske razine.

Zato smo pripremili kratki vodič kroz osnove SQL-a. Započnimo!

1. Napravite tablicu

Naredba CREATE TABLE koristi se za kreiranje tablica. Argumenti moraju biti nazivi stupaca, kao i njihovi tipovi podataka.

Kreirajmo jednostavnu tablicu pod nazivom mjesec. Sastoji se od 3 stupca:

• iskaznica– Broj mjeseca u kalendarskoj godini (cijeli broj).
• Ime– Naziv mjeseca (string, maksimalno 10 znakova).
• dana– Broj dana u ovom mjesecu (cijeli broj).

Evo kako bi izgledao odgovarajući SQL upit:

CREATE TABLE mjeseci (id int, name varchar(10), days int);

Također, prilikom izrade tablica, poželjno je dodati primarni ključ za jedan od stupaca. Time će zapisi biti jedinstveni i ubrzat će selektirani upiti. Neka u našem slučaju naziv mjeseca bude jedinstven (kolona Ime)

CREATE TABLE mjeseci (id int, name varchar(10), days int, PRIMARY KEY (name));

Datum i vrijeme

Tip podataka	Opis
DATUM	Vrijednosti datuma
DATUM VRIJEME	Vrijednosti datuma i vremena s preciznošću do minute
VRIJEME	Vremenske vrijednosti

2. Umetnite retke

Sada popunimo našu tablicu mjeseca korisna informacija. Dodavanje zapisa u tablicu vrši se naredbom INSERT. Postoje dva načina za pisanje ove upute.

Prvi način nije navesti nazive stupaca u koje će se umetnuti podaci, već navesti samo vrijednosti.

Ovaj zapis je jednostavan, ali nesiguran, jer nema jamstva da će, kako se projekt bude širio i tablica uređivala, stupci biti u istom redoslijedu kao prije. Sigurniji (i ujedno nezgrapniji) način pisanja izjave INSERT zahtijeva navođenje i vrijednosti i redoslijeda stupaca:

Ovdje je prva vrijednost na popisu VRIJEDNOSTI odgovara prvom navedenom nazivu stupca i tako dalje.

3. Izdvajanje podataka iz tablica

Naredba SELECT je naša najbolji prijatelj kada želimo dobiti podatke iz baze podataka. Koristi se vrlo često, stoga pažljivo pročitajte ovaj odjeljak.

Najjednostavnija upotreba naredbe SELECT je upit koji vraća sve stupce i retke iz tablice (na primjer, tablica pod nazivom likovi):

SELECT * FROM "znakovi"

Znak zvjezdice (*) znači da želimo dobiti podatke iz svih stupaca. Budući da se SQL baze podataka obično sastoje od više od jedne tablice, potrebno je navesti ključna riječ FROM , nakon čega slijedi razmak nakon kojeg slijedi naziv tablice.

Ponekad ne želimo dobiti podatke iz svih stupaca u tablici. Da bismo to učinili, umjesto zvjezdice (*) moramo napisati nazive željenih stupaca odvojene zarezima.

ODABERITE id, naziv IZ mjeseca

Također, u mnogim slučajevima želimo da rezultati budu poredani određenim redoslijedom. U SQL-u to radimo s ORDER BY. Može uzeti izborni modifikator - ASC (zadano) za sortiranje uzlaznim redoslijedom ili DESC za sortiranje silaznim redoslijedom:

SELECT id, naziv OD mjeseca ORDER BY name DESC

Kada koristite ORDER BY, provjerite je li na zadnjem mjestu u izjavi SELECT. U protivnom će se prikazati poruka o pogrešci.

4. Filtriranje podataka

Naučili ste kako odabrati određene stupce iz baze podataka pomoću SQL upita, ali što ako želimo dohvatiti i određene retke? Ovdje u pomoć dolazi klauzula WHERE koja nam omogućuje filtriranje podataka na temelju uvjeta.

U ovom upitu odabiremo samo te mjesece iz tablice mjesec koji su duži od 30 dana korištenjem operatora veće od (>).

SELECT id, naziv FROM mjesec WHERE dana > 30

5. Napredno filtriranje podataka. operatori I i ILI

Ranije smo podatke filtrirali prema jednom kriteriju. Za složenije filtriranje podataka možete koristiti operatore I i ILI te operatore usporedbe (=,<,>,<=,>=,<>).

Ovdje imamo tablicu koja sadrži četiri najprodavanija albuma svih vremena. Izaberimo one koji se svrstavaju u rock i imaju manje od 50 milijuna prodanih primjeraka. To se lako može učiniti postavljanjem operatora AND između ova dva uvjeta.

SELECT * FROM albumi WHERE žanr = "rock" AND prodaja_u_milijunima<= 50 ORDER BY released

6. U/Između/Sviđa mi se

WHERE također podržava nekoliko posebnih naredbi, omogućujući vam da brzo provjerite najčešće korištene upite. Evo ih:

• IN - koristi se za određivanje raspona uvjeta od kojih se svaki može ispuniti
• BETWEEN - Provjerava je li vrijednost u navedenom rasponu
• LIKE - traži određene uzorke

Na primjer, ako želimo odabrati albume sa pop I duša glazbe, možemo koristiti IN("vrijednost1","vrijednost2") .

SELECT * FROM albuma WHERE žanr IN ("pop","soul");

Ako želimo dobiti sve albume izdane između 1975. i 1985., napisali bismo:

ODABERITE * IZ albuma GDJE objavljeni IZMEĐU 1975. I 1985.;

7. Funkcije

SQL je prepun funkcija koje rade svakakve korisne stvari. Evo nekih od najčešće korištenih:

• COUNT() - vraća broj redaka
• SUM() - vraća ukupni zbroj numeričkog stupca
• AVG() - vraća prosječnu vrijednost iz skupa vrijednosti
• MIN() / MAX() - dobiva minimalnu / maksimalnu vrijednost iz stupca

Da bismo dobili posljednju godinu u našoj tablici, moramo napisati sljedeći SQL upit:

SELECT MAX(released) FROM albuma;

8. Podupiti

U prethodnom odlomku naučili smo kako napraviti jednostavne izračune s podacima. Ako želimo koristiti rezultat ovih izračuna, ne možemo bez ugniježđenih upita. Recimo da želimo ispisati umjetnik, album I godina izdanja za najstariji album u tablici.

Znamo kako dobiti ove specifične stupce:

ODABIR izvođača, albuma, objavljenog FROM albuma;

Također znamo kako dobiti najraniju godinu:

SELECT MIN(released) FROM album;

Sve što je sada potrebno je kombinirati dva upita s WHERE:

SELECT izvođač,album,izdan FROM albuma WHERE objavljen = (SELECT MIN(izdano) FROM albuma);

9. Spajanje tablica

U složenijim bazama podataka postoji više tablica koje su međusobno povezane. Na primjer, u nastavku su dvije tablice o videoigrama ( video igre) i programeri videoigara ( game_developers).

Stol video igre postoji stupac programera ( programer_id), ali sadrži cijeli broj, a ne ime programera. Ovaj broj je identifikator ( iskaznica) odgovarajućeg programera iz tablice programera igara ( game_developers) logički povezujući dva popisa, omogućujući nam da koristimo informacije pohranjene u oba u isto vrijeme.

Ako želimo stvoriti upit koji vraća sve što trebamo znati o igrama, možemo koristiti INNER JOIN za povezivanje stupaca iz obje tablice.

SELECT video_games.name, video_games.genre, game_developers.name, game_developers.country FROM video_games INNER JOIN game_developers ON video_games.developer_id = game_developers.id;

Ovo je najjednostavniji i najčešći tip JOIN-a. Postoji nekoliko drugih opcija, ali one se odnose na rjeđe slučajeve.

10. Aliasi

Ako pogledate prethodni primjer, primijetit ćete da postoje dva stupca tzv Ime. Ovo je zbunjujuće, pa postavimo alias na jedan od ponovljenih stupaca, na primjer, Ime sa stola game_developers bit će pozvan programer.

Također možemo skratiti upit dodavanjem alijasa nazivima tablica: video igre nazovimo igre, game_developers - programeri:

SELECT games.name, games.genre, devs.name AS developer, devs.country FROM video_games AS games INNER JOIN game_developers AS devs ON games.developer_id = devs.id;

11. Ažuriranje podataka

Često moramo promijeniti podatke u nekim redovima. U SQL-u se to radi naredbom UPDATE. Izjava UPDATE sastoji se od:

• Tablica koja sadrži zamjensku vrijednost;
• Nazivi stupaca i njihove nove vrijednosti;
• Reci odabrani s WHERE koje želimo ažurirati. Ako se to ne učini, promijenit će se svi redci u tablici.

Dolje je tablica TV serije sa serijama sa svojom ocjenom. Međutim, u tablicu se uvukla mala greška: iako serija Igra prijestolja i opisana je kao komedija, zapravo nije. Popravimo ovo!

podaci tablice tv_series UPDATE tv_series SET žanr = "drama" WHERE id = 2;

12. Brisanje podataka

Brisanje retka tablice pomoću SQL-a vrlo je jednostavan postupak. Sve što trebate učiniti je odabrati tablicu i redak koji želite obrisati. Uklonimo posljednji red u tablici iz prethodnog primjera TV serije. To se radi pomoću naredbe >DELETE.

DELETE FROM tv_series WHERE id = 4

Budite oprezni kada pišete naredbu DELETE i provjerite je li klauzula WHERE prisutna, inače će svi redovi tablice biti izbrisani!

13. Brisanje tablice

Ako želimo ukloniti sve retke, ali ostaviti samu tablicu, tada upotrijebimo naredbu TRUNCATE:

TRUNCATE TABLE ime_tablice;

U slučaju kada baš želimo obrisati i podatke i samu tablicu, dobro će nam doći naredba DROP:

DROP TABLE ime_tablice;

Budite vrlo oprezni s ovim naredbama. Ne mogu se poništiti!/p>

Ovo zaključuje naš SQL vodič! Nismo puno pokrili, ali ono što već znate trebalo bi biti dovoljno da vam pruži neke praktične vještine u vašoj web karijeri.

Kokultivacija limfocita s MHC-II molekulama različitog haplotipa uzrokuje njihovu blast transformaciju i proliferaciju. Reagirajuće stanice pripadaju T-limfocitima i stimuliraju ih strane MHC-II determinante smještene na B-limfocitima, makrofazima. Snaga reakcije ovisi o stupnju razlike između antigena histokompatibilnosti. Za procjenu reaktivnosti pojedinca u odnosu na alelnu varijantu MHC-a priprema se jednosmjerna kultura limfocita. Da bi se to postiglo, stanice stimulatora su prethodno tretirane mitomicinom ili ozračene, dok stimulirajuće stanice gube svoju sposobnost diobe, ali ostaju održive.

Reaktivnost u miješanoj kulturi limfocita jedan je od kriterija u procjeni stanični imunitet. SKL omogućuje izvođenje HLA tipizacija, odabrati par davatelj-primatelj za transplantaciju tkiva i organa, napraviti korelaciju između HLA antigena i određenih bolesti.

Za postavljanje reakcije koristi se suspenzija limfocita izoliranih iz krvi bolesnika (donora i primatelja). Isprane stanice koje reagiraju suspendiraju se u maloj količini medija 199 (0,5 ml) i, nakon prebrojavanja broja stanica, namjesti se na 0,6 x 106 stanica/ml. Suspenzija stimulirajućih stanica priprema se na sličan način uz dodatak otopine mitomicina C (500 μg mitomicina C u 1 ml puferirane fiziološke otopine) u količini od 0,1 ml na 1 ml suspenzije. Stanična smjesa se inkubira 40 minuta na 37°C u vodenoj kupelji uz miješanje, zatim se u suspenziju doda hladni medij 199 i stanice se isperu tri puta centrifugiranjem. Talog se suspendira u Srednja Kultura uzgojem, dovodeći broj stanica na 0,6 * 10 6 stanica/ml.

0,1 ml stanične suspenzije u Hankovoj otopini doda se u jažice sterilne imunološke ploče s okruglim dnom i doda se 0,1 ml stanične suspenzije koja nosi MHC alelne varijante. Ista količina Hankove otopine dodana je kontroli.

Računovodstvo za rezultate provodi se nakon inkubacije stanica na 37 ° C tijekom 3-5 dana, ovisno o formulaciji reakcije pomoću morfološke ili izotopske metode (vidi RBTL).

Prilikom presađivanja koštana srž izbor histokompatibilnog darivatelja temelji se na rezultatima HLA tipizacije darivatelja i primatelja, kao i prilikom utvrđivanja kompatibilnosti odabranih HLA-identičnih parova darivatelj-primatelj u SCL-u, što je završna faza procjene kompatibilnosti. Za to se koristi dvosmjerna SCL reakcija uporabom metode mikrokulture u ploči s 96 jažica uz procjenu veličine proliferacije ugradnjom radioaktivnog H3-timidina u DNA proliferirajućih limfocita.

Trenutno se puno pažnje posvećuje proučavanju uloge imunološki mehanizmi u reproduktivnom procesu, budući da njihovo kršenje dovodi do razvoja neplodnosti i ranog prekida trudnoće. Studije imunoloških parametara i njihova povezanost s reproduktivni procesi dovela do zaključka da je potrebno restrukturiranje imunološki sustav u pripremi majčinog tijela za trudnoću, počevši od ovulacijsko razdoblje, u vrijeme implantacije embrija i kod rano razdoblje trudnoća.

Jedan od najsloženijih i najtežih za dijagnosticiranje uzroka neplodnosti i ponovljenih spontanih pobačaja je imunološka disfunkcija.

S ciljem pravovremeno otkrivanje ispituje se imunološka neplodnost u laboratoriju za imunologiju reprodukcije parovi korištenjem sljedeće metode dijagnostika:

• proučavanje razine proliferativnog odgovora limfocita žene na partnerske antigene (u mješovitoj kulturi limfocita)
• određivanje aktivnosti blokirajućih čimbenika u krvnom serumu žene.
• procjena kvantitativnog sadržaja subpopulacija prirodnih citotoksičnih stanica u periferne krvižene.
• prošireni imunogram
• proučavanje sadržaja regulatornih stanica s supresorskom aktivnošću u perifernoj krvi.
• pri identificiranju kliničkih i laboratorijski znakovi imunološke neplodnosti, pacijentima se preporuča podvrgnuti medicinski postupak- aloimunizacija limfocitima supruga koja se provodi prema individualnom rasporedu.

Potrebne konzultacije:

• ako u nedostatku ginekoloških i endokrine bolesti uz redoviti spolni život tijekom godine nema trudnoća.
• u slučaju ponovljenih (više od 1 puta) spontanih pobačaja (pobačaja).
• na neuspješan IVF u povijesti.
• uz prijetnju prekida prave trudnoće.

Ako se otkriju kršenja, propisuje se postupak u svrhu imunokorekcije kršenja. aloimunizacija s partnerskim limfocitima (AIL). Ova metoda tretmani su odobreni Savezna služba o nadzoru u oblasti zdravstva (licenca FS br. 2009/179 od 02.07.2009.)

Postupak se provodi samo ako partner ima negativni rezultati testiranje na HIV infekciju, sifilis i virusni hepatitis(B, C). Komplikacije AIL-a nisu identificirane. AIL metoda ima izražen imunokorektivni učinak, povećava učinkovitost liječenja neplodnosti, kao kod prirodni ciklus, kao i in vitro oplodnja(EKO). Također se propisuje za neuspješne pokušaje in vitro oplodnje.

AIL se provodi 1 put u 28-30 dana (u skladu s menstrualnog ciklusažene) u 1. fazi ciklusa. Prvi tečaj uključuje 3 AIL postupka. Nakon 2. postupka, par ponovno polaže kontrolnu analizu. U prisustvu pozitivne dinamike, treći AIL postupak je posljednji. U nedostatku dinamike, povećava se doza stanica za imunizaciju i provodi se 2. tečaj koji uključuje 2 postupka. Nakon kontrolne analize, u nekim slučajevima, potrebno je propisati 3. tijek imunizacije s povećanjem doze stanica. Nakon postizanja standardnih vrijednosti pozitivan učinak traje 6-8 mjeseci.

Za razdoblje od 2003. do 2013. godine. u laboratoriju stanične imunoterapije provedeno je oko 3000 postupaka aloimunizacije limfocitima partnera. Za ovaj se postupak iz partnerove krvi izoliraju samo limfociti koji su uvijek prisutni u sjemenu. U drugim zemljama* također se već 20 godina provodi postupak aloimunizacije koji pomaže ženi da nosi i rađa zdravo dijete.

Vrsta usluge	cijena, utrljati.
Test transformacije limfocita	1650
Test transformacije limfocita (Detekcija sesibilizacije na 2v-va)	2 900
Test transformacije limfocita (Detekcija sesibilizacije na 3v-va)	3 900
Test transformacije limfocita (imunološki pregled na neplodnost)	3 200
Prošireni imunogram s aktivacijskim markerima	4 625
Sveobuhvatna studija imunološkog statusa	4 125
Cijepljenje (aloimunizacija limfocitima partnera 1 doza)	1 900
Cijepljenje (aloimunizacija limfocitima partnera 2 doze)	2 750
Cijepljenje (aloimunizacija limfocitima partnera 3 doze)	3 400
Ispitivanje CD16+/CD56+ limfocita (imunološki pregled na neplodnost samo NK stanice)	1 250
Proučavanje aktivnosti makrofaga (kondicionirano okruženje makrofaga)	9 400
Studija aktivnosti makrofaga (uvjetni medij)	1 500
Krioprezervacija mononuklearnih stanica za aloimunizaciju	650

2.2. Metode staničnih interakcija

Gotovo sve metode staničnih interakcija koje se koriste u kliničkoj imunogenetici temelje se na fenomenu stvaranja blasta u miješanoj kulturi limfocita, koji je otkrila kanadska istraživačica Barbara Bain. Reakcija miješane kulture limfocita (MLC) omogućila je fino diferencirano proučavanje HLA kompleksa i, posebno, jedne od njegovih podjedinica, HLA-D lokusa. Niz drugih metoda staničnih interakcija - stanično posredovana limfoliza (Cell-mediated Lympholysis - CML), test početnih limfocita (Primed Lymphocyte Typing) - temelji se na MLC metodi ili je sadrži kao sastavni dio.

2.2.1. Mješovita kultura limfocita (MCL)

Princip metode prikazan je na sl. 10, koji pokazuje da dvije populacije genetski različitih limfocita međusobno djeluju u in vitro kulturi. Jedna od populacija je tretirana mitomicinom C ili ozračena, zbog čega gubi sposobnost stvaranja blasta i inkorporacije timidina (3 HT), međutim, bez gubitka antigenskih svojstava, zadržava sposobnost stimulacije (stimulansi; S- populacija).

Stanice koje reagiraju na stimulaciju (odgovarajuće, R-populacija) transformiraju se u blaste nakon nekoliko dana i uključuju timidin dodan kulturi. Intenzitet reakcije se mjeri upotrebom oznake zračenja ugradnjom 3H-timidina.

Poznato je nekoliko varijanti reakcije mješovite kulture limfocita, od kojih su ovdje predložene dvije: tradicionalna i mikrovarijanta implementirana u Cookove ploče (slika 11).

Riža. 11. Oprema za mikrovarijante MLC i CML. 1 - tableta okruglog dna e 96 rupa; 2-automatska pipeta ("Pipetman") s programom za različite volumene; 3 - automatska pipeta ("Sigma") za određeni volumen; 4 - jednokratni vrh pipete; 5 - laminarna kutija

Tradicionalna verzija MLC-a (modificirana od strane F. S. Baranova):

Limfociti su izolirani na fikol-urografin gradijentu kako je gore opisano. Prvo ispiranje se provodi u PBS (NaCl - 8,0 g, Na 2 HP0 4 - 1,15 g, KH 2 PO 4 - 0,2 g, KCl - 0,2 g na 1 litru H 2 O); sljedeća dva su proizvedena u mediju 199 s 5% AB seruma (pool od 15 donora);

Stanice koje reagiraju resuspendiraju se u mediju 199 s 10% AB seruma i koncentracija stanica se podesi na 0,6 x 106 u 1 ml;

Stimulirajuće stanice izolirane na isti način u koncentraciji od 5 - 10 6 po 1 ml tretiraju se mitomicinom C (60 γ/ml) tvrtke Serva i inkubiraju 40 minuta na 37°C u vodenoj kupelji. Nakon inkubacije, stanice se isperu 3 puta s medijem 199 s 5% seruma AB, resuspendiraju u mediju 199 s 10% seruma AB, dovodeći koncentraciju do 0,6 x 106 u 1 ml;

0,5 ml stanica koje reagiraju i 0,5 ml stimulirajućih stanica pomiješa se u epruveti za centrifugiranje, doda se 0,04 ml od 10 ml Hepes otopine (Serva) i inkubira 144 sata; iskustvo se stavlja u tri paralele (triplet);

24 sata prije kraja inkubacije u epruvete se dodaje 3H-timidin 1μCi (3,7x10 4 BC), po uzorku specifična djelatnost 5mSi/mmol (18,5x107 Bq/mmol) i nastaviti inkubaciju;

Na kraju inkubacije, stanice se prenose u milipore filtere (0,6 - 0,9 mikrona), isperu fiziološka otopina(37°C) i ohlađenu 5% otopinu trikloroctene kiseline (4°C). Filteri se osuše i stave u bočice s 5 ml scintilacijske tekućine (5 g PPO i 0,5 g POPOP na 1 litru toluena)*. Aktivnost inkorporacije 3H-timidina mjeri se na β-brojaču; rezultat se izražava u apsolutnim inkluzijama radioaktivne oznake u 1 minuti ili u indeksu stimulacije (SI) prema formuli:

* (PPO - 2,5-fenol-oksazol; POPOP - (1,4-di-2-15-fenol oksazolitbenzen).)

Prosječna vrijednost CPM-a u tri prototipa

SI = Srednji CPM tri kontrole/Kontrole su spontane kulture stanica koje reagiraju.

MLC mikro varijanta u Cook tabletama. Na 8. radionici razvijeni su zahtjevi koji standardiziraju MLC mikrovarijantu, u skladu s kojima je ona prikazana u nastavku:

Limfociti su izolirani u gradijentu izopac-fikola i resuspendirani u RPMJ-1640* mediju, dovodeći koncentraciju do 5x10 5 u 1 ml;

* (Može se koristiti medij 199 pomiješan s ljudskim serumom skupine AB (5% seruma uzetog od nekoliko pojedinaca).)

Stanice stimulatora tretiraju se mitomicinom C ili treningom;

5x10 4 repondera i isti broj stimulansa se stavi pomoću mikropipete tipa Pipetman u svaku jažicu Cook mikropločice s okruglim dnom;

Ploče su inkubirane u termostatu s automatskim dovodom 5% CO2 tijekom 120 h; zatim se lµmCi 3 H-timidin doda u svaku jažicu pri specifičnoj aktivnosti timidina od 6 Ci/mmol; sve manipulacije provode se pipetom Pipetman;

16 sati nakon dodavanja timidina, kulture iz svake jažice se prenesu u milipore filtere s automatskom pipetom i isperu fiziološkom otopinom i zatim s 5% trikloroctene kiseline; prikladno je koristiti posebne "žetelice" za prijenos kulture u milipore filtere;

Aktivnost ugradnje timidina određena je kako je gore opisano.

2.2.2. Stanično posredovana limfoliza (CML)

CML se u imunogenetskim studijama koristi relativno nedavno (od 1972.), ali u U zadnje vrijeme postaje sve više i više popularna tehnika, što vam omogućuje detaljno proučavanje uloge eferentne veze transplantacijskog imuniteta i dobivanje priznanja kao informativna metoda imunološki monitoring. Princip metode prikazan je na sl. 12. Metoda se temelji na tehnici koju je predložio J. Lightbody (1971.), a koja je sažeta kako slijedi.

1. CML počinje konvencionalnim HLC testom u kojem stanice koje odgovaraju prepoznaju "stimulatore", senzibiliziraju stanice koje odgovaraju i stvaraju senzibilizirane ubojice.

2. Druga faza, u kojoj se senzibilizirani ubojice miješaju s 51 Cr-obilježenim ciljnim stanicama, sastoji se u uništavanju potonjih pomoću efektorskih stanica ubojica; ciljne stanice mogu imati isti genotip kao "stimulatori" u prvoj fazi MLC, ili mogu biti stanice "trećeg" partnera, obdarene antigenskim determinantama zajedničkim sa "stimulatorima" ili bez njih.

3. Količina radioaktivnog kroma otpuštenog iz uništenih ciljnih stanica i otpuštenog u medij kulture služi kao mjera intenziteta ubojitog učinka.

Riža. 12. Princip stanično posredovane limfolize (CML). I red - senzibilizacija stanica koje reagiraju, stvaranje ubojica; II red - interakcija ubojica s metom; III red - uništavanje ciljne stanice; izlaz 51 Cr medij kulture

Ovdje su opisane tri varijante CML-a: tradicionalna verzija koju je modificirao L.P. Alekseev (1979.), mikro-varijanta u Cook pločama, izravni CML (Direct-CML -D-CML.

Tradicionalna opcija[Alekseev L.P., 1979].

Metoda je podijeljena u nekoliko faza.

Dobivanje ubojica:

Periferni limfociti obiju populacija (R-stanice i S-stanice) izolirani su na uobičajeni način, isprani u gradijentu gustoće tri puta u mediju 199 s 5% AB serumom (10 min, 150 g);

1x106 R stanica (0,8 ml) pomiješano je u centrifugalnim epruvetama s 2x106 S stanicama (0,2 ml) tretiranih mitomicinom C i inkubirano 144 h na 37°C;

Stanice se centrifugiraju na 150 g tijekom 10 minuta, a talog se resuspendira u mediju 199 uz dodatak 20% telećeg seruma (medij 199 + tj.), dovodeći koncentraciju do 1x106 u 1 ml;

Jedan od uzoraka ostavljen je za proučavanje razine MLC-a, ostali se koriste kao gotove ubojice.

Primanje ciljeva:

Konvencionalno izolirani limfociti se resuspendiraju u 199 mediju s 20% AB seruma i inkubiraju s fitohemaglutininom (0,003 mg/ml Wellcome) 72 sata na 37°C; koncentracija stanica 1x10 6 u 1 ml;

Stanice se centrifugiraju 10 minuta na 150 g, talog se resuspendira u mediju 199 s 5% AB seruma, a koncentracija stanica se podesi na 2x104 u 1 ml;

51 Cr 100 μCi/ml (3,7x10 6 Bq/ml) doda se u suspenziju i inkubira 40 min na 37°C;

Stanice se isperu tri puta u mediju 199 s 5% AB seruma (150 g, 10 min) i talog se resuspendira u mediju 199 s 5% AB seruma. dovodeći koncentraciju na 2x10 4 u 1 ml.

Izjava o reakcijama:

5x105 ubojica (0,5 ml) pomiješano je s 1x104 meta (0,5 ml), inkubirano 4 sata (37°C) i centrifugirano na 150 g 10 minuta;

Supernatant se isiše i impuls izazvan 51Cr se broji na a-brojaču; brojanje se provodi u 0,5 ml supernatanta;

Razina citolize izračunava se prema sljedećoj formuli:

ekeper. izlaz 51 Cr - spontani izlaz 51 Cr/max, izlaz 51 Cr - spontani izlaz 41 Cr × 100.

Spontano otpuštanje kroma mjeri se na metama inkubiranim 4 sata (37°C) bez stanica ubojica; maksimalni prinos kroma - na ciljevima potpuno uništenim smrzavanjem-otapanjem; Svi testovi se provode u tripletima.

Mikrovarijanta CML-a u tabletama [prema Mawas S., 1976.]:

Faza proizvodnje ubojica provodi se kao MLC u pločama s okruglim dnom, ali R- i S-stanice se miješaju u jednakim količinama u 2x10 5 PA svaka jažica i inkubiraju se na 37°C;

Nakon 5 dana, stanice se sakupe Pasteur-ovom pipetom u epruvetu, izbroji se broj živih stanica s tripan plavim, a koncentracija se podesi na 10x10 6 u 1 ml;

Ciljne stanice se uzgajaju s PHA 3 dana;

Na dan reakcije, ciljne stanice se isperu (300 g) i resuspendiraju u mediju kulture, raspoređujući 1 ml u epruvete i dovodeći do 1x10 6 u 1 ml;

200 μCi 51 Cr (7,4x10 6 BK) dodano je u svaku epruvetu s ciljnim stanicama i inkubirano 1 h na 37°C; oprati ćelije 3 puta; sediment se resuspendira i namjesti na koncentraciju 1x10 u 1 ml (živo);

Test se provodi u mikropločicama s okruglim dnom; za to, 0,7 - 1x106 stanica ubojica (0,1 ml) i 1x104 ciljnih stanica (0,1 ml) raspoređeno je u svaku jažicu; ukupni volumen suspenzije u svakoj jažici je 0,2 ml, 0,05 ml medija se doda u svaku jažicu i inkubira (37°C) 4 sata;

Ploče su centrifugirane na 800 g u Beckman centrifugi 10 minuta; supernatant iz svake jažice se prenese u epruvete i broji na γ-brojaču;

Faza proizvodnje ubojica (MLC) provodi se na mediju RPMJ-1640 s dodatkom 20% ljudske plazme; za fazu ubijanja koristi se MEM medij s dodatkom 20% ljudske plazme, prethodno zagrijane.

Izravni CML (D-CML). Izravni CML je tehnika razvijena posebno za kliničke svrhe koja se koristi u imunološkom praćenju. Shema ove reakcije prikazana je na sl. 13.

Glavna razlika u odnosu na tradicionalni CML je u tome što se faza stvaranja ubojice (faza senzibilizacije) ne događa in vitro, već in vivo, tj. u ljudskom tijelu senzibiliziranom transplantacijom alogenog organa ili tkiva. Zbog utjecaja alogenog tkiva, limfociti primatelja su senzibilizirani na tkivne antigene davatelja i ne zahtijevaju poseban in vitro tretman, trajanje testa je vremenski značajno skraćeno, budući da se prvo trebaju pripremiti samo mete.

Ciljevi su limfociti dobiveni iz periferne krvi ili, češće, iz slezene donora (vidi 2.1.2) i zamrznuti bilo kojom od gore opisanih metoda (vidi 2.1.3).

2.2.3. Citotoksičnost posredovana stanicama ovisna o antitijelima (ADCC)

Ova vrsta staničnog odgovora po mehanizmu djelovanja slična je gore opisanom CML-u. Princip reakcije prikazan je na sl. 14. Komponente reakcije su ciljne stanice (donorske stanice ili alogeni limfociti), serum (alogeni ili primateljski), koji vjerojatno sadrži protutijela usmjerena na ciljne stanične determinante, i efektorske stanice (primateljski limfociti ili alogeni limfociti).

Efektorske stanice u ovoj vrsti interakcije su takozvane K-stanice koje se nalaze u perifernoj krvi. Za razliku od stanica ubojica u CML-u, one provode citotoksični učinak bez prethodne senzibilizacije, međutim, očitovanje citotoksičnog učinka K stanica moguće je samo putem protutijela usmjerenih na determinante ciljnih stanica. Specifična liza mjeri se otpuštanjem 51 Cr ako ispitivani serum sadrži protutijela na ciljne determinante.

Ciljne determinante u ADCC mogu biti specifičnosti gotovo svih HLA lokusa, uključujući HLA-D, HLA-DR, kao i determinante izvan HLA sustava.

Najrašireniji ova složena reakcija dobivena je u imunološkom praćenju za otkrivanje antitijela B-stanica. U tom smislu, predloženo je nekoliko modifikacija, uključujući obogaćivanje suspenzije ciljnih stanica B-limfocitima, adsorpciju seruma na trombocite itd.

Osim toga, uzimaju se u obzir i brojne druge karakteristike odgovora u ovom sustavu. Testni serum mora biti dekomplementiran, inače se reakcija može odvijati kao citotoksičnost ovisna o komplementu posredovana protutijelima. Također se pretpostavlja da efektorske stanice mogu uzrokovati određenu destrukciju meta tipom CML.

U konačnici, cijeli niz uzoraka u testu stanično posredovane limfocitotoksičnosti ovisne o antitijelima je sljedeći:

Mete + efektori + ispitivani serum (pokusni uzorak);

Mete (kontrolni uzorak, tj. spontano otpuštanje 51 Cr);

Mete + efektori (kontrolni test za aktivnost efektora);

Mete + test serum (kontrola seruma).

Limfociti su izolirani na uobičajeni način i resuspendirani u RPMI-1640 + 10% fetalnog goveđeg seruma; tretiranje suspenzije karbonilnim željezom za uklanjanje monocita; dodati amonijev klorid ili H 2 O za lizu preostalih eritrocita;

51Cr se dodaje u suspenziju ciljnih stanica u obliku otopine Na 2 CrO 4 100 - 200 µCi ml (3,7x106 - 7,4x106 BK / ml) i inkubira se 40 - 60 minuta;

Stanice su isprane tri puta u RPMI + 0,1% HSA, resuspendirane u istom mediju i podešene na 2x108 u 1 ml; 50 µl suspenzije obilježenih stanica stavi se u epruvetu, a izotopska aktivnost se zatim broji na γ-brojaču kako bi se detektirao potpuni "uptake" izotopa; ostatak se ukapa u jažice tablete u 50 µl suspenzije (1x105 stanica po jažici);

Suspenzija stanica-efektora se dovede do 2x10 7 stanica u 1 ml i u. stavite 50 µl suspenzije (ili 100 µl) u svaku jažicu, omjer efektora i cilja 10:1 (ili 20:1);

Inkubacija traje 4 sata u inkubatoru u vlažnoj atmosferi s 5% CO 2 (trajanje inkubacije može se produžiti do 8 sati);

U epruvetama pripremite nekoliko razrjeđenja ispitnog seruma (1:25; 1:100) i dodajte u jažice do 50 µl svakog razrjeđenja: i nerazrijeđenog seruma; Konačna postavka testa izgleda kao što je prikazano u tablici. 23.

Tablica 23

Postavljanje ADCC. Sve opcije uzorka, µl

* (Umjesto testnog seruma ukapa se pul AV seruma.)

** (Umjesto testnog seruma ukapa se monospecifični HLA serum usmjeren protiv ciljeva (ne efektora).)

Ploče se inkubiraju 4 sata u vlažnoj atmosferi s 4% CO2; trajanje inkubacije može se produžiti do 8 sati;

Nakon inkubacije, pola volumena iz svake jažice (100 μl) pažljivo se aspirira automatskom pipetom i stavi u epruvete za brojanje 51 Cr impulsa; aktivnost se broji na γ-brojaču;

Izračuni su sljedeći:

% oslobađanja 51 Cr = 2 × A op - pozadinska aktivnost/B - pozadinska aktivnost × 100;

% citotoksičnosti = A op - A sp /100 - A sp × 100, gdje je A op - % oslobađanja 51 Cr u pokusnim uzorcima; I cn -% spontano oslobađanje; B - potpuna asimilacija izotopa.

Kako pozitivan rezultat Razmatra se 5% ili viša citotoksičnost nakon 4 sata inkubacije.