Analiza culturii mixte skl de limfocite. Cultură mixtă de limfocite

Fiecare dezvoltator web trebuie să cunoască SQL pentru a scrie interogări de baze de date. Și, deși phpMyAdmin nu a fost anulat, este adesea necesar să vă murdărești mâinile pentru a scrie SQL de nivel scăzut.

De aceea am pregătit un scurt tur al elementelor de bază ale SQL. Să începem!

1. Creați un tabel

Instrucțiunea CREATE TABLE este folosită pentru a crea tabele. Argumentele trebuie să fie numele coloanelor, precum și tipurile de date ale acestora.

Să creăm un tabel simplu numit lună. Este format din 3 coloane:

• id– Numărul lunii din anul calendaristic (întreg).
• Nume– Numele lunii (șir, maximum 10 caractere).
• zile– Numărul de zile din această lună (întreg).

Iată cum ar arăta interogarea SQL corespunzătoare:

CREATE TABLE luni (id int, nume varchar(10), zile int);

De asemenea, la crearea tabelelor, este recomandabil să adăugați o cheie primară pentru una dintre coloane. Acest lucru va păstra înregistrările unice și va accelera cererile de preluare. În cazul nostru, să fie numele lunii unic (coloana Nume)

CREATE TABLE luni (id int, name varchar(10), days int, PRIMARY KEY (nume));

data si ora

Tip de date	Descriere
DATA	Valori date
DATETIME	Valori date și ore exacte la minut
TIMP	Valori de timp

2. Inserarea rândurilor

Acum să ne completăm tabelul luni Informatii utile. Adăugarea înregistrărilor la un tabel se face folosind instrucțiunea INSERT. Există două moduri de a scrie această instrucțiune.

Prima metodă nu este de a specifica numele coloanelor în care vor fi inserate datele, ci de a specifica doar valorile.

Această metodă de înregistrare este simplă, dar nesigură, deoarece nu există nicio garanție că, pe măsură ce proiectul se extinde și tabelul este editat, coloanele vor fi în aceeași ordine ca înainte. O modalitate sigură (și în același timp mai greoaie) de a scrie o instrucțiune INSERT necesită specificarea atât a valorilor, cât și a ordinii coloanelor:

Iată prima valoare din listă VALORI se potrivește cu primul nume de coloană specificat etc.

3. Extragerea datelor din tabele

Declarația SELECT este a noastră cel mai bun prieten când dorim să obținem date din baza de date. Este folosit foarte des, așa că acordați o atenție deosebită acestei secțiuni.

Cea mai simplă utilizare a instrucțiunii SELECT este o interogare care returnează toate coloanele și rândurile dintr-un tabel (de exemplu, tabelele după nume personaje):

SELECTAȚI * DIN „personaje”

Simbolul asterisc (*) înseamnă că dorim să obținem date din toate coloanele. Deoarece bazele de date SQL constau de obicei din mai mult de un tabel, este necesar să se specifice cuvânt cheie FROM , urmat de numele tabelului separat de un spațiu.

Uneori nu dorim să obținem date de la toate coloanele dintr-un tabel. Pentru a face acest lucru, în loc de asterisc (*), trebuie să notăm numele coloanelor dorite, separate prin virgulă.

SELECT ID, numele FROM luna

În plus, în multe cazuri dorim ca rezultatele rezultate să fie sortate într-o anumită ordine. În SQL facem acest lucru folosind ORDER BY. Poate accepta un modificator opțional - sortarea ASC (implicit) în ordine crescătoare sau DESC, sortarea în ordine descrescătoare:

SELECT ID, nume FROM luna ORDEREA DUPĂ nume DESC

Când utilizați ORDER BY, asigurați-vă că este ultimul în instrucțiunea SELECT. În caz contrar, va fi afișat un mesaj de eroare.

4. Filtrarea datelor

Ați învățat cum să selectați anumite coloane dintr-o bază de date folosind o interogare SQL, dar ce se întâmplă dacă trebuie să recuperăm și anumite rânduri? Clauza WHERE vine în ajutor aici, permițându-ne să filtram datele în funcție de condiție.

În această interogare, selectăm doar acele luni din tabel lună, în care există mai mult de 30 de zile folosind operatorul mai mare decât (>).

SELECT ID, nume FROM luna WHERE zile > 30

5. Filtrare avansată a datelor. operatori AND și SAU

Anterior, am folosit filtrarea datelor folosind un singur criteriu. Pentru o filtrare mai complexă a datelor, puteți utiliza operatorii AND și SAU și operatorii de comparație (=,<,>,<=,>=,<>).

Aici avem un tabel care conține cele patru albume cele mai vândute din toate timpurile. Să le alegem pe cele care sunt clasificate ca rock și s-au vândut în mai puțin de 50 de milioane de exemplare. Acest lucru se poate face cu ușurință prin plasarea unui operator AND între aceste două condiții.

SELECT * FROM albume WHERE gen = „rock” AND sales_in_millions<= 50 ORDER BY released

6. În/Între/Like

WHERE acceptă, de asemenea, mai multe comenzi speciale, permițându-vă să verificați rapid interogările cele mai frecvent utilizate. Aici sunt ei:

• IN – servește pentru a indica o serie de condiții, dintre care oricare poate fi îndeplinită
• BETWEEN – verifică dacă o valoare se află în intervalul specificat
• LIKE – caută modele specifice

De exemplu, dacă vrem să selectăm albume cu popȘi suflet muzica, putem folosi IN("value1","value2") .

SELECTAȚI * DIN albumele WHERE genre IN ("pop","soul");

Dacă vrem să obținem toate albumele lansate între 1975 și 1985, trebuie să scriem:

SELECTAȚI * DIN albumele WHERE lansate ÎNTRE 1975 ȘI 1985;

7. Funcții

SQL este plin de funcții care fac tot felul de lucruri utile. Iată câteva dintre cele mai frecvent utilizate:

• COUNT() – returnează numărul de rânduri
• SUM() - returnează suma totală a unei coloane numerice
• AVG() - returnează media unui set de valori
• MIN() / MAX() – Obține valoarea minimă/maximă dintr-o coloană

Pentru a obține cel mai recent an în tabelul nostru, trebuie să scriem următoarea interogare SQL:

SELECTARE MAX (lansat) FROM albume;

8. Subinterogări

În paragraful anterior, am învățat cum să facem calcule simple cu date. Dacă dorim să folosim rezultatul din aceste calcule, nu ne putem lipsi de interogări imbricate. Să presupunem că vrem să ieșim artist, albumȘi anul lansării pentru cel mai vechi album din tabel.

Știm cum să obținem aceste coloane specifice:

SELECT artist, album, lansat DIN albume;

De asemenea, știm cum să obținem cel mai devreme an:

SELECT MIN (lansat) FROM album;

Tot ce este nevoie acum este să combinați cele două interogări folosind WHERE:

SELECT artist,album,released FROM albums WHERE lansat = (SELECT MIN(released) FROM albums);

9. Îmbinarea meselor

În bazele de date mai complexe, există mai multe tabele legate între ele. De exemplu, mai jos sunt două tabele despre jocuri video ( jocuri video) și dezvoltatori de jocuri video ( game_developers).

In masa jocuri video există o coloană pentru dezvoltatori ( developer_id), dar conține un număr întreg, nu numele dezvoltatorului. Acest număr reprezintă identificatorul ( id) a dezvoltatorului corespunzător din tabelul dezvoltatorilor de jocuri ( game_developers), legând logic două liste, permițându-ne să folosim informațiile stocate în ambele în același timp.

Dacă vrem să creăm o interogare care să returneze tot ce trebuie să știm despre jocuri, putem folosi un INNER JOIN pentru a lega coloanele din ambele tabele.

SELECT video_games.name, video_games.genre, game_developers.name, game_developers.country FROM video_games INNER JOIN game_developers ON video_games.developer_id = game_developers.id;

Acesta este cel mai simplu și mai comun tip JOIN. Există mai multe alte opțiuni, dar acestea se aplică cazurilor mai puțin frecvente.

10. Aliasuri

Dacă te uiți la exemplul anterior, vei observa că sunt numite două coloane Nume. Acest lucru este confuz, așa că să setăm un alias la una dintre coloanele care se repetă, astfel Nume de la masă game_developers va fi chemat dezvoltator.

De asemenea, putem scurta interogarea prin aliasarea numelor tabelelor: jocuri video Hai sa sunăm jocuri, game_developers - dezvoltatori:

SELECT games.name, games.genre, devs.name AS dezvoltator, devs.country FROM video_games AS jocuri INNER JOIN game_developers AS devs ON games.developer_id = devs.id;

11. Actualizarea datelor

Adesea trebuie să schimbăm datele în unele rânduri. În SQL acest lucru se face folosind instrucțiunea UPDATE. Declarația UPDATE constă din:

• Tabelul în care se află valoarea de înlocuire;
• Numele coloanelor și noile lor valori;
• Rândurile selectate folosind WHERE pe care dorim să le actualizăm. Dacă nu se face acest lucru, toate rândurile din tabel se vor schimba.

Mai jos este tabelul Seriale TV cu serialele TV și ratingurile acestora. Cu toate acestea, o mică eroare s-a strecurat în tabel: deși seria Game of Thronesși este descrisă ca o comedie, chiar nu este. Să reparăm asta!

Date de tabel tv_series UPDATE tv_series SET gen = "drama" WHERE id = 2;

12. Ștergerea datelor

Ștergerea unui rând de tabel folosind SQL este un proces foarte simplu. Tot ce trebuie să faceți este să selectați tabelul și rândul pe care doriți să le ștergeți. Să ștergem ultimul rând din tabel din exemplul anterior Seriale TV. Acest lucru se face folosind instrucțiunea >DELETE.

DELETE FROM tv_series WHERE id = 4

Aveți grijă când scrieți instrucțiunea DELETE și asigurați-vă că este prezentă clauza WHERE, altfel toate rândurile din tabel vor fi șterse!

13. Ștergeți un tabel

Dacă vrem să ștergem toate rândurile, dar să părăsim tabelul în sine, atunci folosiți comanda TRUNCATE:

TRUNCATE TABLE nume_tabel;

În cazul în care dorim efectiv să ștergem atât datele, cât și tabelul în sine, atunci comanda DROP ne va fi utilă:

DROP TABLE nume_tabel;

Fii foarte atent cu aceste comenzi. Nu pot fi anulate!/p>

Aceasta încheie tutorialul nostru SQL! Sunt multe pe care nu le-am acoperit, dar ceea ce știți deja ar trebui să fie suficient pentru a vă oferi niște abilități practice pentru cariera dvs. pe web.

Co-cultivarea limfocitelor având molecule MHC-II de diferite haplotipuri determină transformarea și proliferarea blastică a acestora. Celulele care răspund aparțin limfocitelor T și sunt stimulate de determinanți străini MHC-II localizați pe limfocitele B și macrofage. Puterea reacției depinde de gradul de diferență dintre antigenele de histocompatibilitate. Pentru a evalua reactivitatea unui individ la o variantă alelica MHC, se prepară o cultură de limfocite unidirecționale. Pentru a face acest lucru, celulele stimulatoare sunt pre-tratate cu mitomicina sau iradiate, în timp ce celulele stimulatoare își pierd capacitatea de a se diviza, dar rămân viabile.

Reactivitatea într-o cultură mixtă de limfocite este unul dintre criteriile de evaluare imunitatea celulară. SCL vă permite să efectuați Tastarea HLA, selectează o pereche donor-recipient pentru transplanturi de țesuturi și organe și realizează o corelație între antigenele HLA și anumite boli.

Pentru etapa reacției se folosește o suspensie de limfocite izolate din sângele pacienților (donator și primitor). Celulele care răspund spălate sunt suspendate într-o cantitate mică de mediu 199 (0,5 ml) şi, după numărarea numărului de celule, sunt ajustate la 0,6 x 106 celule/ml. O suspensie de celule stimulatoare va fi preparată în mod similar cu adăugarea unei soluții de mitomicina C (500 μg de mitomicina C în 1 ml de soluție salină tamponată) la o rată de 0,1 ml per 1 ml de suspensie. Amestecul de celule este incubat timp de 40 de minute la 37 °C într-o baie de apă, agitând, apoi mediu rece 199 este adăugat la suspensie şi celulele sunt spălate de trei ori prin centrifugare. Sedimentul este suspendat în mediu nutritiv cultivare, aducând numărul de celule la 0,6 * 106 celule/ml.

Se adaugă 0,1 ml de suspensie celulară în soluție Hanks la godeurile unei plăci imunologice sterile cu fund rotund și se adaugă 0,1 ml suspensie celulară care poartă variante alelice MHC. La control se adaugă aceeași cantitate de soluție Hanks.

Rezultatele sunt înregistrate după incubarea celulelor la 37 °C timp de 3-5 zile, în funcție de configurația reacției folosind metoda morfologică sau izotopică (vezi RBTL).

În timpul transplantului măduvă osoasă selecția unui donator histocompatibil se efectuează pe baza rezultatelor tipării HLA a donatorului și a primitorului, precum și atunci când se determină compatibilitatea perechilor donor-receptor HLA-identice selectate în SCL, care este etapa finală a evaluării compatibilității. În acest scop, se utilizează o reacție SCL bidirecțională folosind o micrometodă de cultură într-o placă cu 96 de godeuri cu o evaluare a cantității de proliferare prin includerea de H3-timidină radioactivă în ADN-ul limfocitelor în proliferare.

În prezent, se acordă multă atenție cercetării rolului mecanisme imunitareîn procesul de reproducere, deoarece încălcarea lor duce la dezvoltarea infertilității și întreruperea timpurie a sarcinii. Studii ale parametrilor imunologici și relația acestora cu procesele reproductive ne-a permis să concluzionam că restructurarea era necesară sistem imunitar la pregătirea corpului mamei pentru sarcină, începând cu perioada ovulatorie, la momentul implantării embrionului și în perioada timpurie sarcina.

Una dintre cele mai complexe și dificil de diagnosticat cauze ale infertilității și avorturilor spontane recurente este disfuncția imunitară.

Cu scopul de a detectarea în timp util examenul imunologic al infertilității se efectuează în laboratorul de imunologie a reproducerii cuplurile căsătorite folosind următoarele metode diagnosticare:

• studiul nivelului de răspuns proliferativ al limfocitelor unei femei la antigenele partenerului (într-o cultură mixtă de limfocite)
• determinarea activității factorilor de blocare din serul de sânge al unei femei.
• evaluarea conţinutului cantitativ al subpopulaţiilor de celule citotoxice naturale în sânge periferic femei.
• imunograma extinsă
• studiul conținutului de celule reglatoare cu activitate supresoare din sângele periferic.
• la identificarea clinică şi semne de laborator Se recomandă examinarea imunologică a pacienților cu infertilitate procedura medicala– aloimunizarea cu limfocitele soțului, care se efectuează în conformitate cu un program individual.

Consultație necesară:

• dacă în absenţa ginecologică şi boli endocrine Cu activitate sexuală regulată timp de un an, nu există sarcină.
• în caz de întreruperi spontane repetate (de mai multe ori) de sarcină (avort spontan).
• la FIV nereușităîn anamneză.
• când există amenințarea întreruperii unei sarcini reale.

Dacă sunt detectate tulburări, este prescrisă o procedură în scopul imunocorecției tulburărilor aloimunizare cu limfocite partenere (AIL). Aceasta metoda tratament aprobat pentru utilizare Serviciul federal pentru supraveghere in domeniul sanatatii (licenta FS nr. 2009/179 din 07.02.2009)

Procedura se efectuează numai dacă partenerul are rezultate negative analize pentru infecția HIV, sifilis și hepatita virala(B, C). Nu au fost identificate complicații cu AIL. Metoda AIL are un efect imunocorector pronunțat, crește eficacitatea tratamentului infertilității, ca în ciclu natural, si cu fertilizare in vitro(ECO). De asemenea, prescris pentru încercările nereușite de fertilizare in vitro.

AIL se efectuează o dată la 28-30 de zile (în conformitate cu ciclu menstrual femei) în prima fază a ciclului. Primul curs include 3 proceduri AIL. După a 2-a procedură, cuplul face din nou un test de control. Dacă există o dinamică pozitivă, a treia procedură AIL este ultima. Dacă nu există dinamică, doza de celule pentru imunizare este crescută și se efectuează un al doilea curs, inclusiv 2 proceduri. După o analiză de control, în unele cazuri este necesar să se prescrie un al treilea curs de imunizare cu o creștere a dozei de celule. După atingerea valorilor standard, efectul pozitiv durează 6-8 luni.

Pentru perioada 2003-2013. În laboratorul de imunoterapie celulară au fost efectuate aproximativ 3000 de proceduri de aloimunizare cu limfocite partenere. Pentru această procedură, din sângele partenerului sunt izolate doar limfocitele, care sunt întotdeauna prezente în lichidul seminal. În alte țări*, de 20 de ani se desfășoară și procedura de aloimunizare, care ajută o femeie să poarte și să nască un copil sănătos.

Tipul serviciului	preț, freacă.
Test de transformare a limfocitelor (Detecția sesibilizării în secolul I)	1650
Test de transformare a limfocitelor (Detecția sesibilizării pe 2b-va)	2 900
Test de transformare a limfocitelor (Detecția sesibilizării pe 3b-va)	3 900
Test de transformare a limfocitelor (examen imunologic pentru infertilitate)	3 200
Imunogramă extinsă cu markeri de activare	4 625
Studiu cuprinzător al stării imune	4 125
Vaccinarea (aloimunizare cu limfocitele partenerului 1 doză)	1 900
Vaccinarea (aloimunizare cu limfocitele partenerului, a doua doză)	2 750
Vaccinarea (aloimunizare cu limfocitele partenerului, a treia doză)	3 400
Studiul limfocitelor CD16+/CD56+ (examen imunologic pentru infertilitate numai celule NK)	1 250
Studiul activității macrofagelor (medii de macrofage condiționate)	9 400
Studiul activității macrofagelor (medii condiționate)	1 500
Crioconservarea celulelor mononucleare pentru aloimunizare	650

2.2. Metode de interacțiuni celulare

Aproape toate metodele de interacțiuni celulare utilizate în imunogenetica clinică se bazează pe fenomenul de formare a blastului într-o cultură mixtă de limfocite, descoperit de cercetătoarea canadiană Barbara Bain. Reacția unei culturi mixte de limfocite (MLC) a făcut posibilă realizarea unui studiu fin diferențiat al complexului HLA și, în special, a uneia dintre subunitățile sale - locusul HLA-D. O serie de alte metode de interacțiuni celulare - limfoliza mediată celular (CML), testul de amorsare a limfocitelor (Primed Lymphocyte Typing) - se bazează pe metoda MLC sau o conțin ca parte integrantă.

2.2.1. Cultură de limfocite mixte (MCL)

Principiul metodei este prezentat în Fig. 10, din care reiese clar că două populații de limfocite genetic diferite interacționează între ele în cultura in vitro. Una dintre populații este tratată cu mitomicina C sau iradiată, în urma căreia își pierde capacitatea de a forma blasturi și de a încorpora timidina (3 HT), însă, fără a-și pierde proprietățile antigenice, își păstrează capacitatea de stimulare (stimulente; S; -populatie).

Celulele care răspund la stimulare (respondenții, populația R) se transformă în blasturi după câteva zile și includ timidina adăugată în cultură. Intensitatea reacției este măsurată cu ajutorul unui trasor de radiații pentru încorporarea 3H-timidinei.

Sunt cunoscute mai multe variante ale reacției unei culturi mixte de limfocite, dintre care două sunt propuse aici: tradiționalul și microvariantul implementat în tabletele Cook (Fig. 11).

Orez. 11. Echipamente pentru microvariante MLC și CML. 1 - tabletă cu fund rotund cu 96 de găuri; 2-pipetă automată („Pipetman”) cu program pentru diferite volume; 3 - pipeta automata ("Sigma") pentru un anumit volum; 4 - vârf de pipetă de unică folosință; 5 - cutie cu flux laminar

Versiunea tradițională a MLC (modificare de F. S. Baranova):

Limfocitele sunt izolate pe un gradient Ficoll-urografin așa cum este descris mai sus. Prima spălare este efectuată în PBS (NaCI - 8,0 g, Na2HP04 - 1,15 g, KH2PO4 - 0,2 g, KC1 - 0,2 g per 1 litru de H20); următoarele două sunt produse în mediu 199 cu ser AB 5% (pool de la 15 donatori);

Celulele care răspund sunt resuspendate în mediu 199 cu ser AB 10% şi concentraţia celulară este ajustată la 0,6 x 106 per ml;

Celulele stimulatoare izolate în același mod la o concentrație de 5 - 106 per 1 ml sunt tratate cu mitomicină C (60 y/ml) de la Serva și incubate timp de 40 minute la 37°C într-o baie de apă. După incubare, celulele sunt spălate de 3 ori cu mediu 199 cu ser AB 5%, resuspendate în mediu 199 cu ser AB 10%, aducând concentrația la 0,6 x 106 în 1 ml;

0,5 ml de celule care răspund și 0,5 ml de celule stimulatoare sunt amestecate într-un tub de centrifugă, se adaugă 0,04 ml de 10 ml de soluție Hepes (Serva) și se incubează timp de 144 de ore; experiența este plasată în trei paralele (triplet);

Cu 24 de ore înainte de sfârșitul incubației, adăugați 3 H-timidină 1μCi (3,7x104 BC) în eprubete, per probă activitate specifică 5mCi/mmol (18,5x107 BC/mmol) şi se continuă incubarea;

La sfârșitul incubării, celulele sunt transferate în filtre millipore (0,6 - 0,9 microni) și spălate. soluție salină(37°C) și o soluție 5% răcită de acid tricloracetic (4°C). Filtrele se usucă și se pun în flacoane cu 5 ml lichid de scintilație (5 g PPO și 0,5 g POPOP - la 1 litru de toluen) *. Activitatea de încorporare a timidinei 3H este măsurată într-un contor p; rezultatul este exprimat în incluziuni absolute ale etichetei radioactive la 1 min sau în indicele de stimulare (SI) conform formulei:

* (PPO - 2,5-fenol-oxazol; POPOR - (1,4-di-2-15-fenoloxazolitbenzen).)

Valoarea CPM medie în trei prototipuri

SI = Valoarea medie a CPM în trei probe de control/Culturi spontane de celule care răspund servesc ca probe de control.

Versiune micro a MLC în tabletele Cook. La cel de-al 8-lea Atelier au fost elaborate cerințe care standardizează microopțiunea MLC, în conformitate cu care este prezentată mai jos:

Limfocitele sunt izolate într-un gradient izopac-ficoll și resuspendate în mediu RPMJ-1640*, aducând concentrația la 5x105 în 1 ml;

* (Mediul 199 amestecat cu ser uman din grupa AB (ser 5% luat de la mai multe persoane) poate fi utilizat.)

Celulele stimulatoare sunt tratate cu mitomicina C sau antrenament;

5x104 respondenți și același număr de stimulatoare sunt plasate folosind o micropipetă de tip Pipetman în fiecare godeu al unei microplăci cu fund rotund Cook;

Plăcile sunt incubate într-un termostat cu alimentare automată de 5% CO 2 timp de 120 de ore; apoi se adaugă lμmCi 3H-timidină în fiecare godeu la o activitate specifică a timidinei 6 Ci/mmol; toate manipulările sunt efectuate cu o pipetă Pipetman;

La 16 ore după adăugarea timidinei, culturile din fiecare godeu sunt transferate în filtre millipore folosind o pipetă automată și spălate cu soluție salină și apoi cu acid tricloracetic 5%; este convenabil să folosiți „recoltatoare” speciale pentru a transfera cultura în filtre millipore;

Activitatea de încorporare a timidinei a fost determinată așa cum este descris mai sus.

2.2.2. Limfoliza mediată celular (LMC)

LMC a fost utilizată în studiile imunogenetice relativ recent (din 1972), dar în În ultima vreme devine din ce în ce mai mult tehnologie populară, permițând un studiu detaliat al rolului legăturii eferente a imunității la transplant și câștigând recunoașterea ca metoda informativă monitorizarea imunologică. Principiul metodei este prezentat în Fig. 12. Metoda se bazează pe tehnica propusă de J. Lightbody (1971), care este rezumată pe scurt după cum urmează.

1. LMC începe cu un test HLC convențional, în care celulele care răspund recunosc „stimulatori”, sensibilizează celulele care răspund și formează celule ucigașe sensibilizate.

2. A doua fază, în care celulele ucigașe sensibilizate se amestecă cu celule țintă marcate cu 51 Cr, constă în distrugerea acestora din urmă de către celulele ucigașe efectoare; celulele țintă pot avea același genotip ca „stimulatorii” din prima fază a MLC, sau pot fi celule ale unui „al treilea” partener, dotate cu determinanți antigenici comuni „stimulatorilor” sau fără aceștia.

3. Cantitatea de crom radioactiv eliberată din celulele țintă distruse și eliberată în mediul de cultură servește ca măsură a intensității efectului ucigaș.

Orez. 12. Principiul limfolizei mediate celular (LMC). Rândul I - sensibilizarea celulelor care răspund, formarea celulelor ucigașe; Rândul II - interacțiunea ucigașilor cu ținta; Rândul III - distrugerea celulei țintă; se obţine mediu de cultură 51 Cr

Trei variante ale LMC sunt descrise aici: versiunea tradițională, așa cum a fost modificată de L.P. Alekseev (1979), microvarianta în tabletele Cook, CML direct (Direct-CML -D-CML.

Opțiune tradițională[Alekseev L.P., 1979].

Metoda este împărțită în mai multe etape.

Primesc asasini:

Limfocitele periferice ale ambelor populații (celule R și celule S) sunt izolate în mod obișnuit, spălate de trei ori în gradient de densitate în mediu 199 cu ser AB 5% (10 min, 150 g);

1x106 celule R (0,8 ml) sunt amestecate în tuburi de centrifugă cu 2x106 celule S (0,2 ml) tratate cu mitomicină C şi incubate timp de 144 ore la 37°C;

Celulele sunt centrifugate la 150 g timp de 10 minute, iar sedimentul este resuspendat în mediu 199 cu adăugare de ser de viţel 20% (mediu 199 + adică), aducând concentraţia la 1x106 în 1 ml;

Unul dintre eșantioane este lăsat să studieze nivelul MLC, restul sunt folosite ca ucigași gata făcut.

Obținerea țintelor:

Limfocitele izolate în mod obișnuit sunt resuspendate în mediu 199 cu ser AB 20% și incubate cu fitohemaglutinină (0,003 mg/ml Wellcome) timp de 72 de ore la 37°C; concentrația celulară 1x106 în 1 ml;

Celulele sunt centrifugate timp de 10 min la 150 g, sedimentul este resuspendat în mediu 199 cu 5% ser AB și concentrația celulară este ajustată la 2x104 în 1 ml;

51 Cr 100 uCi/ml (3,7x106 BC/ml) este adăugat la suspensie şi incubat timp de 40 minute la 37°C;

Celulele sunt spălate de trei ori în mediu 199 cu adăugare de 5% ser AB (150 g, 10 min) și sedimentul este resuspendat în mediu 199 cu 5% ser AB. aducând concentraţia la 2x10 4 în 1 ml.

Stabilirea reacțiilor:

5x105 killers (0,5 ml) sunt amestecate cu 1x104 ţinte (0,5 ml), incubate timp de 4 ore (37°C) şi centrifugate la 150 g timp de 10 minute;

Supernatantul este aspirat și impulsul cauzat de 51 Cr este numărat pe un numărător; numărarea se efectuează în 0,5 ml de supernatant;

Nivelul de citoliză se calculează folosind următoarea formulă:

Ekper. ieșire 51 Cr - ieșire spontană 51 Cr/max, ieșire 51 Cr - ieșire spontană 41 Cr × 100.

Eliberarea spontană de crom este măsurată pe ținte incubate timp de 4 ore (37°C) fără celule ucigașe; randament maxim de crom - pe ținte complet distruse prin îngheț și dezgheț; Toate testele sunt efectuate în tripleți.

Microvarianta LMC în tablete [după Mawas S., 1976]:

Faza de obținere a ucigașilor este efectuată ca MLC în plăci cu fund rotund, dar celulele R și S sunt amestecate în cantități egale, 2x105 pa fiecare godeu și incubate la 37°C;

După 5 zile, celulele sunt colectate cu o pipetă Pasteur într-o eprubetă, numărul celor vii este numărat cu albastru de tripan și concentrația este ajustată la 10x10 6 în 1 ml;

Celulele țintă sunt cultivate cu PHA timp de 3 zile;

în ziua reacţiei, celulele ţintă sunt spălate (300 g) şi resuspendate într-un mediu de cultură, distribuind 1 ml în eprubete şi ajustând la 1x106 în 1 ml;

Se adaugă 200 μCi 51 Cr (7,4x10 6 BC) în fiecare tub cu celule țintă și se incubează timp de 1 oră la 37°C; spălați celulele de 3 ori; sedimentul este resuspendat și ajustat la o concentrație de 1x10 în 1 ml (viu);

Testul este implementat în microplăci cu fund rotund; pentru aceasta, în fiecare godeu sunt distribuite 0,7 - 1x106 celule killer (0,1 ml) şi 1x104 celule ţintă (0,1 ml); volumul total al suspensiei din fiecare godeu este de 0,2 ml, se adaugă 0,05 ml de mediu în fiecare godeu și se incubează (37°C) timp de 4 ore;

Plăcile sunt centrifugate la 800 g pe o centrifugă Beckman timp de 10 minute; supernatantul din fiecare godeu este transferat în eprubete și numărat pe un contor y;

Faza de producere a celulelor ucigașe (MLC) este efectuată pe mediu RPMJ-1640 cu adăugarea de 20% plasmă umană; pentru faza de ucidere, utilizați mediu MEM cu adăugare de 20% plasmă umană, preîncălzită.

CML direct (D-CML). LMC directă este o tehnică dezvoltată special în scopuri clinice care și-a găsit utilizare în monitorizarea imunologică. Schema acestei reacții este prezentată în Fig. 13.

Principala diferență față de LMC tradițională este că stadiul formării celulelor ucigașe (faza de sensibilizare) nu are loc in vitro, ci in vivo, adică în corpul uman sensibilizat prin transplantul unui organ sau țesut alogen. Datorită efectului țesutului alogenic, limfocitele primitorului sunt sensibilizate la antigenele tisulare ale donatorului și nu necesită tratament special in vitro; durata testului se reduce semnificativ în timp, deoarece doar țintele trebuie pregătite mai întâi.

Țintele utilizate sunt limfocitele obținute din sângele periferic sau, mai des, din splina donatorului (vezi 2.1.2) și congelate prin oricare dintre metodele descrise mai sus (vezi 2.1.3).

2.2.3. Citotoxicitate mediată de celule dependente de anticorpi (ADCC)

Acest tip de răspuns celular este similar ca mecanism de acțiune cu CML descris mai sus. Principiul reacției este prezentat în fig. 14. Componentele reacției sunt celulele țintă (celule donatoare sau limfocite alogene), serul (alogene sau primitoare), care conțin probabil anticorpi direcționați către determinanții celulelor țintă și celule efectoare (limfocite receptor sau limfocite alogene).

Celulele efectoare din acest tip de interacțiune sunt așa-numitele celule K situate în sângele periferic. Spre deosebire de celulele ucigașe din LMC, acestea efectuează un efect citotoxic fără sensibilizare prealabilă, totuși, manifestarea efectului citotoxic al celulelor K este posibilă numai prin anticorpi direcționați către determinanții celulelor țintă. Liza specifică este măsurată prin eliberarea de 51 Cr dacă serul de testat conține anticorpi la determinanții țintă.

Determinanții țintă în ADCC pot fi practic specificitățile tuturor loci HLA, inclusiv HLA-D, HLA-DR, precum și determinanții aflați în afara sistemului HLA.

Cel mai răspândit Această reacție complexă a fost obținută în monitorizarea imunologică pentru a detecta anticorpii celulelor B. În acest sens, au fost propuse mai multe modificări care prevăd îmbogățirea suspensiei de celule țintă cu limfocite B, adsorbția serului pe trombocite etc.

În plus, sunt luate în considerare o serie de alte caracteristici de răspuns din acest sistem. Serul de testat trebuie să fie decomplementat, altfel reacția poate fi citotoxicitate dependentă de complement mediată de anticorpi. De asemenea, se presupune că celulele efectoare pot provoca o anumită distrugere a țintelor în funcție de tipul de LMC.

În cele din urmă, întregul set de probe din testul de limfocitotoxicitate mediată celular dependent de anticorpi este după cum urmează:

Ținte + efectori + ser de testare (probă experimentală);

Ținte (proba de control, adică eliberarea spontană de 51 Cr);

Ținte + efectori (test de control pentru activitatea efectorului);

Ținte + ser de testare (control ser).

Limfocitele au fost izolate în mod obișnuit și resuspendate în RPMI-1640 + 10% ser fetal bovin; tratarea suspensiei cu fier carbonil pentru îndepărtarea monocitelor; se adaugă clorură de amoniu sau H2O pentru a liza celulele roșii rămase;

Se adaugă 51 Cr sub formă de soluţie de Na2Cr04 100 - 200 uCi ml (3,7x106 - 7,4x106 BC/ml) la suspensia de celule ţintă şi se incubează timp de 40 - 60 minute;

Celulele sunt spălate de trei ori în RPMI + 0,1% HSA, resuspendate în același mediu și ajustate la 2x108 în 1 ml; 50 µl dintr-o suspensie de celule marcate sunt plasați într-o eprubetă și apoi activitatea izotopică este calculată pe un contor γ pentru a identifica „asimilarea” izotopică completă; restul se toarnă în godeurile plăcii, 50 pl de suspensie (1x105 celule per godeu);

Suspensia de celule efectoare este adusă la 2x107 celule în 1 ml şi c. fiecare godeu este umplut cu 50 pl de suspensie (sau 100 pl), raportul dintre efectori la ţinte este 10:1 (sau 20:1);

Incubarea continuă timp de 4 ore într-o atmosferă de termostat umedă cu 5% CO 2 (durata de incubație poate fi prelungită până la 8 ore);

Se prepară mai multe diluții ale serului de testat în eprubete (1:25; 1:100) și se adaugă până la 50 µl din fiecare diluție în godeuri: și ser nediluat; configurația finală a testului arată așa cum se arată în tabel. 23.

Tabelul 23

Stadializarea ADCC. Toate opțiunile de probă, µl

* (În loc de serul de testare, este instilat un grup de seruri AB.)

** (În locul serului de testare, se instilează un ser HLA monospecific îndreptat împotriva țintelor (nu a efectorilor).)

Incubarea panourilor continuă timp de 4 ore într-o atmosferă umidificată cu 4% CO2; durata incubației poate fi prelungită până la 8 ore;

După incubare, jumătate din volumul din fiecare godeu (100 μl) este aspirat cu atenție cu o pipetă automată și plasat în tuburi de numărare a impulsurilor de 51 Cr; activitatea se numără pe un contor γ;

Calculele sunt după cum urmează:

% eliberare de 51 Cr = 2 × A op - activitate de fundal/B - activitate de fundal × 100;

% citotoxicitate = A op - A sp /100 - A sp × 100, unde A op este procentul de eliberare de 51 Cr în probele experimentale; A sp - % eliberare spontană; B - asimilarea completă a izotopului.

Cum rezultat pozitiv Se consideră citotoxicitate de 5% sau mai mare după 4 ore de incubare.