Анализ на skl смесена култура на лимфоцити. Смесена култура на лимфоцити

Всеки уеб разработчик трябва да знае SQL, за да пише заявки към бази данни. И въпреки че phpMyAdmin не е отменен, често е необходимо да си изцапате ръцете, за да пишете SQL на ниско ниво.

Ето защо сме подготвили кратка обиколка на основите на SQL. Да започваме!

1. Създайте таблица

Операторът CREATE TABLE се използва за създаване на таблици. Аргументите трябва да бъдат имената на колоните, както и техните типове данни.

Нека създадем проста таблица с име месец. Състои се от 3 колони:

• документ за самоличност– Номер на месеца в календарната година (цяло число).
• име– Име на месеца (низ, максимум 10 знака).
• дни– Брой дни в този месец (цяло число).

Ето как би изглеждала съответната SQL заявка:

CREATE TABLE месеци (id int, име varchar(10), дни int);

Също така, когато създавате таблици, е препоръчително да добавите първичен ключ за една от колоните. Това ще запази записите уникални и ще ускори заявките за извличане. В нашия случай нека името на месеца е уникално (колона име)

CREATE TABLE месеци (id int, name varchar(10), days int, PRIMARY KEY (име));

дата и час

Тип данни	Описание
ДАТА	Стойности на датата
ВРЕМЕ ЗА СРЕЩА	Стойностите на датата и часа са точни до минута
ВРЕМЕ	Времеви стойности

2. Вмъкване на редове

Сега нека попълним нашата таблица месеца полезна информация. Добавянето на записи към таблица се извършва с помощта на израза INSERT. Има два начина да напишете тази инструкция.

Първият метод не е да посочите имената на колоните, в които ще се вмъкват данните, а да посочите само стойностите.

Този метод на запис е прост, но несигурен, тъй като няма гаранция, че когато проектът се разшири и таблицата се редактира, колоните ще бъдат в същия ред както преди. Безопасен (и в същото време по-тромав) начин за писане на оператор INSERT изисква указване както на стойностите, така и на реда на колоните:

Ето първата стойност в списъка СТОЙНОСТИсъответства на първото посочено име на колона и т.н.

3. Извличане на данни от таблици

Операторът SELECT е наш най-добър приятелкогато искаме да получим данни от базата данни. Използва се много често, така че обърнете много внимание на този раздел.

Най-простото използване на оператора SELECT е заявка, която връща всички колони и редове от таблица (например таблици по име герои):

ИЗБЕРЕТЕ * ОТ "знаци"

Символът звездичка (*) означава, че искаме да получим данни от всички колони. Тъй като SQL базите данни обикновено се състоят от повече от една таблица, е необходимо да се уточни ключова дума FROM , последвано от името на таблицата, разделено с интервал.

Понякога не искаме да получаваме данни от не всички колони в таблицата. За целта вместо звездичка (*) трябва да запишем имената на желаните колони, разделени със запетаи.

ИЗБЕРЕТЕ id, име ОТ месец

Освен това в много случаи искаме получените резултати да бъдат сортирани в определен ред. В SQL правим това с помощта на ORDER BY. Може да приеме незадължителен модификатор - ASC (по подразбиране) сортиране във възходящ ред или DESC, сортиране в низходящ ред:

ИЗБЕРЕТЕ id, име FROM месец ПОРЪЧАЙТЕ ПО име DESC

Когато използвате ORDER BY, уверете се, че е на последно място в оператора SELECT. В противен случай ще се покаже съобщение за грешка.

4. Филтриране на данни

Научихте как да избирате конкретни колони от база данни с помощта на SQL заявка, но какво ще стане, ако трябва да извлечем и конкретни редове? Тук на помощ идва клаузата WHERE, която ни позволява да филтрираме данните в зависимост от условието.

В тази заявка ние избираме само тези месеци от таблицата месец, в които има повече от 30 дни с използване на оператора по-голямо от (>).

ИЗБЕРЕТЕ id, име FROM месец WHERE дни > 30

5. Разширено филтриране на данни. Оператори И и ИЛИ

Преди използвахме филтриране на данни, използвайки един критерий. За по-сложно филтриране на данни можете да използвате операторите И и ИЛИ и операторите за сравнение (=,<,>,<=,>=,<>).

Тук имаме таблица, съдържаща четирите най-продавани албума на всички времена. Нека изберем тези, които се класифицират като рок и са продадени под 50 милиона копия. Това може лесно да се направи чрез поставяне на оператор И между тези две условия.

ИЗБЕРЕТЕ * ОТ албуми WHERE жанр = "рок" И продажби_в_милиони<= 50 ORDER BY released

6. В/Между/Харесвам

WHERE поддържа и няколко специални команди, които ви позволяват бързо да проверявате най-често използваните заявки. Ето ги и тях:

• IN – служи за указване на набор от условия, всяко от които може да бъде изпълнено
• BETWEEN – проверява дали дадена стойност е в посочения диапазон
• LIKE – търси конкретни модели

Например, ако искаме да изберем албуми с попИ душамузика, можем да използваме IN("value1","value2") .

ИЗБЕРЕТЕ * ОТ албуми WHERE жанр IN ("поп","соул");

Ако искаме да получим всички албуми, издадени между 1975 и 1985 г., трябва да напишем:

ИЗБЕРЕТЕ * ОТ албуми WHERE, издадени МЕЖДУ 1975 И 1985;

7. Функции

SQL е пълен с функции, които правят всякакви полезни неща. Ето някои от най-често използваните:

• COUNT() – връща броя на редовете
• SUM() - връща общата сума на числова колона
• AVG() - връща средната стойност на набор от стойности
• MIN() / MAX() – Получава минималната/максималната стойност от колона

За да получим най-новата година в нашата таблица, трябва да напишем следната SQL заявка:

ИЗБЕРЕТЕ МАКСИМУМ (издадени) ОТ албуми;

8. Подзаявки

В предишния параграф научихме как да правим прости изчисления с данни. Ако искаме да използваме резултата от тези изчисления, не можем без вложени заявки. Да кажем, че искаме да изведем художник, албумИ година на издаванеза най-стария албум в таблицата.

Ние знаем как да получим тези конкретни колони:

ИЗБЕРЕТЕ изпълнител, албум, издаден ОТ албуми;

Ние също знаем как да получим най-ранната година:

ИЗБЕРЕТЕ МИН.(освободен) ОТ албум;

Всичко, което е необходимо сега, е да комбинирате двете заявки, като използвате WHERE:

ИЗБЕРЕТЕ изпълнител, албум, издаден ОТ албуми WHERE издаден = (ИЗБЕРЕТЕ МИН. (издадени) ОТ албуми);

9. Свързване на маси

В по-сложните бази данни има множество таблици, свързани една с друга. Например по-долу има две таблици за видеоигрите ( видео игри) и разработчици на видеоигри ( разработчици на игри).

На масата видео игриима колона за разработчици ( developer_id), но съдържа цяло число, а не името на разработчика. Това число представлява идентификатора ( документ за самоличност) на съответния разработчик от таблицата на разработчиците на игри ( разработчици на игри), логически свързвайки два списъка, което ни позволява да използваме информацията, съхранена и в двата едновременно.

Ако искаме да създадем заявка, която връща всичко, което трябва да знаем за игрите, можем да използваме INNER JOIN, за да свържем колони от двете таблици.

ИЗБЕРЕТЕ video_games.name, video_games.genre, game_developers.name, game_developers.country ОТ video_games INNER JOIN game_developers ON video_games.developer_id = game_developers.id;

Това е най-простият и често срещан тип JOIN. Има няколко други опции, но те се отнасят за по-рядко срещани случаи.

10. Псевдоними

Ако погледнете предишния пример, ще забележите, че има две колони, наречени име. Това е объркващо, така че нека зададем псевдоним на една от повтарящите се колони, като тази имеот масата разработчици на игрище се нарича разработчик.

Можем също да съкратим заявката, като сложим псевдоними на имената на таблиците: видео игрида се обадим игри, разработчици на игри - разработчици:

ИЗБЕРЕТЕ games.name, games.genre, devs.name AS разработчик, devs.country ОТ video_games AS games INNER JOIN game_developers AS devs ON games.developer_id = devs.id;

11. Актуализация на данните

Често трябва да променим данните в някои редове. В SQL това се прави с помощта на оператора UPDATE. Изявлението UPDATE се състои от:

• Таблицата, в която се намира заместващата стойност;
• Имена на колони и техните нови стойности;
• Редовете, избрани чрез WHERE, които искаме да актуализираме. Ако това не бъде направено, всички редове в таблицата ще се променят.

По-долу е таблицата телевизионен сериалс телевизионни сериали и техните рейтинги. В таблицата обаче се промъкна малка грешка: въпреки че серията Игра на троновеи е описан като комедия, но всъщност не е. Нека поправим това!

Таблица с данни tv_series UPDATE tv_series SET genre = "драма" WHERE id = 2;

12. Изтриване на данни

Изтриването на ред от таблица с помощта на SQL е много прост процес. Всичко, което трябва да направите, е да изберете таблицата и реда, които искате да изтриете. Нека изтрием последния ред в таблицата от предишния пример телевизионен сериал. Това се прави с помощта на инструкцията >DELETE.

ИЗТРИВАНЕ ОТ tv_series WHERE id = 4

Бъдете внимателни, когато пишете командата DELETE и се уверете, че клаузата WHERE присъства, в противен случай всички редове в таблицата ще бъдат изтрити!

13. Изтриване на таблица

Ако искаме да изтрием всички редове, но да оставим самата таблица, използвайте командата TRUNCATE:

TRUNCATE TABLE име_на_таблица;

В случай, че всъщност искаме да изтрием както данните, така и самата таблица, тогава командата DROP ще ни бъде полезна:

DROP TABLE table_name;

Бъдете много внимателни с тези команди. Те не могат да бъдат отменени!/p>

Това приключва нашия урок по SQL! Има много неща, които не сме покрили, но това, което вече знаете, трябва да е достатъчно, за да ви даде някои практически умения за вашата уеб кариера.

Ко-култивирането на лимфоцити, притежаващи МНС-II молекули от различни хаплотипове, предизвиква тяхната бластна трансформация и пролиферация. Отговарящите клетки принадлежат към Т-лимфоцитите и се стимулират от чужди MHC-II детерминанти, разположени върху В-лимфоцити и макрофаги. Силата на реакцията зависи от степента на разлика между антигените на хистосъвместимостта. За да се оцени реактивността на индивида към MHC алелен вариант, се приготвя еднопосочна лимфоцитна култура. За да направите това, стимулиращите клетки се третират предварително с митомицин или се облъчват, докато стимулиращите клетки губят способността си да се делят, но остават жизнеспособни.

Реактивността при смесена култура от лимфоцити е един от критериите при оценката клетъчен имунитет. SCL ви позволява да извършвате HLA типизиране, изберете двойка донор-реципиент за трансплантация на тъкани и органи и провеждайте корелация между HLA антигени и определени заболявания.

За поставяне на реакцията се използва суспензия от лимфоцити, изолирани от кръвта на пациенти (донор и реципиент). Промитите реагиращи клетки се суспендират в малко количество среда 199 (0.5 ml) и след преброяване на броя на клетките се регулира до 0.6 * 106 клетки/ml. Суспензия от стимулиращи клетки ще бъде приготвена по подобен начин с добавяне на разтвор на митомицин С (500 μg митомицин С в 1 ml буфериран физиологичен разтвор) със скорост 0,1 ml на 1 ml суспензия. Клетъчната смес се инкубира в продължение на 40 минути при 37 °C във водна баня, като се разбърква, след това към суспензията се добавя студена среда 199 и клетките се промиват три пъти чрез центрофугиране. Утайката се суспендира хранителна средакултивиране, довеждайки броя на клетките до 0.6 * 106 клетки/ml.

0.1 ml клетъчна суспензия в разтвор на Ханкс се добавя към ямките на стерилна облодънна имунологична плака и се добавя 0.1 ml клетъчна суспензия, носеща МНС алелни варианти. Същото количество разтвор на Ханкс се добавя към контролата.

Резултатите се записват след инкубиране на клетките при 37 °C в продължение на 3-5 дни, в зависимост от настройката на реакцията, като се използва морфологичен или изотопен метод (вижте RBTL).

По време на трансплантация костен мозъкизборът на хистосъвместим донор се извършва въз основа на резултатите от HLA типизирането на донора и реципиента, както и при определяне на съвместимостта на избрани HLA-идентични двойки донор-реципиент в SCL, което е последният етап от оценката на съвместимостта. За тази цел се използва двупосочна SCL реакция, като се използва културен микрометод в 96-ямкова плака с оценка на количеството на пролиферация чрез включването на радиоактивен Н3-тимидин в ДНК на пролифериращи лимфоцити.

В момента се обръща голямо внимание на изследването на ролята имунни механизмив репродуктивния процес, тъй като тяхното нарушение води до развитие на безплодие и ранно прекъсване на бременността. Изследвания на имунологичните параметри и тяхната връзка с репродуктивни процесини позволи да заключим, че преструктурирането е необходимо имунна системапри подготовката на тялото на майката за бременност, като се започне с овулационен период, в момента на имплантиране на ембриона и в ранен периодбременност.

Една от най-сложните и трудни за диагностициране причини за безплодие и повтарящи се спонтанни аборти е имунната дисфункция.

С цел на своевременно откриванеимунологичното изследване за безплодие се извършва в лабораторията по имунология на репродукцията семейни двойкиизползвайки следните методидиагностика:

• изследване на нивото на пролиферативен отговор на лимфоцитите на жената към антигените на партньора (в смесена култура на лимфоцити)
• определяне на активността на блокиращите фактори в кръвния серум на жената.
• оценка на количественото съдържание на субпопулации от естествени цитотоксични клетки в периферна кръвЖени.
• разширена имунограма
• изследване на съдържанието на регулаторни клетки с супресорна активност в периферната кръв.
• при идентифициране на клинични и лабораторни признациПрепоръчва се имунологично изследване на пациенти с безплодие медицинска процедура– алоимунизация с лимфоцити на съпруга, която се извършва по индивидуална схема.

Необходима консултация:

• ако при липса на гинекологични и ендокринни заболяванияПри редовна полова активност в продължение на една година няма бременност.
• при повтарящи се (повече от веднъж) спонтанни прекъсвания на бременността (спонтанен аборт).
• при неуспешно IVFв анамнезата.
• когато има заплаха от прекъсване на истинска бременност.

Ако се открият нарушения, се предписва процедура за имунокорекция на нарушенията алоимунизация с партньорски лимфоцити (AIL). Този метододобрено за употреба лечение Федерална службаза надзор в областта на здравеопазването (лиценз ФС № 2009/179 от 07.02.2009 г.)

Процедурата се извършва само ако партньорът има отрицателни резултатианализ за HIV инфекция, сифилис и вирусен хепатит(B, C). Не са установени усложнения при AIL. Методът AIL има изразен имунокорективен ефект, повишава ефективността на лечението на безплодието, както при естествен цикъл, и със ин витро оплождане(ЕКО). Също така се предписва при неуспешни опити за ин витро оплождане.

AIL се провежда веднъж на всеки 28-30 дни (в съответствие с менструален цикължени) в първата фаза на цикъла. Първият курс включва 3 AIL процедури. След 2-рата процедура двойката отново се явява на контролен тест. Ако има положителна динамика, третата процедура на AIL е последна. Ако няма динамика, дозата на клетките за имунизация се увеличава и се провежда 2-ри курс, включващ 2 процедури. След контролен анализ в някои случаи е необходимо да се предпише 3-ти курс на имунизация с увеличаване на дозата на клетките. След достигане на стандартните стойности положителният ефект продължава 6-8 месеца.

За периода от 2003 до 2013г. В лабораторията по клетъчна имунотерапия са извършени около 3000 алоимунизационни процедури с партньорски лимфоцити. За тази процедура от кръвта на партньора се изолират само лимфоцити, които винаги присъстват в семенната течност. В други страни* от 20 години също се провежда процедурата по алоимунизация, която помага на жената да износи и роди здраво дете.

Вид услуга	цена, търкайте.
Тест за трансформация на лимфоцити (откриване на сесибилизация на 1 век)	1650
Тест за трансформация на лимфоцити (Откриване на сесибилизация на 2b-va)	2 900
Тест за трансформация на лимфоцити (Откриване на сесибилизация на 3b-va)	3 900
Тест за лимфоцитна трансформация (имунологично изследване за безплодие)	3 200
Разширена имунограма с маркери за активиране	4 625
Цялостно изследване на имунния статус	4 125
Ваксинация (алоимунизация с лимфоцити на партньора 1 доза)	1 900
Ваксинация (алоимунизация с лимфоцити на партньора, 2-ра доза)	2 750
Ваксинация (алоимунизация с лимфоцити на партньора, 3-та доза)	3 400
Изследване на CD16+/CD56+ лимфоцити (имунологично изследване за безплодие само NK клетки)	1 250
Изследване на активността на макрофагите (кондиционирана среда на макрофагите)	9 400
Изследване на активността на макрофагите (кондиционирана среда)	1 500
Криоконсервация на мононуклеарни клетки за алоимунизация	650

2.2. Методи за клетъчни взаимодействия

Почти всички методи за клетъчни взаимодействия, използвани в клиничната имуногенетика, се основават на феномена на образуване на бласт в смесена култура от лимфоцити, открит от канадския изследовател Барбара Бейн. Реакцията на смесена лимфоцитна култура (MLC) направи възможно извършването на фино диференцирано изследване на HLA комплекса и по-специално на една от неговите субединици - HLA-D локуса. Редица други методи за клетъчни взаимодействия - клетъчно-медиирана лимфолиза (CML), тест за праймиране на лимфоцити (Primed Lymphocyte Typing) - се основават на метода MLC или го съдържат като неразделна част.

2.2.1. Смесена лимфоцитна култура (MCL)

Принципът на метода е показан на фиг. 10, от който става ясно, че две популации от генетично различни лимфоцити взаимодействат помежду си в in vitro култура. Една от популациите се третира с митомицин С или се облъчва, в резултат на което губи способността да образува бласти и да включва тимидин (3 НТ), но без да губи антигенните си свойства, запазва способността да стимулира (стимуланти; S -население).

Клетки, които реагират на стимулация (респонденти, R-популация), се трансформират в бласти след няколко дни и включват тимидин, добавен към културата. Интензитетът на реакцията се измерва с помощта на радиационен индикатор за включването на 3Н-тимидин.

Известни са няколко варианта на реакция на смесена култура от лимфоцити, от които тук са предложени два: традиционен и микровариант, приложен в таблетки на Кук (фиг. 11).

Ориз. 11. Оборудване за микроварианти MLC и CML. 1 - таблетка с кръгло дъно с 96 дупки; 2-автоматична пипета (“Pipetman”) с програма за различни обеми; 3 - автоматична пипета ("Sigma") за определен обем; 4 - накрайник за пипета за еднократна употреба; 5 - кутия с ламинарен поток

Традиционна версия на MLC (модификация от F. S. Baranova):

Лимфоцитите се изолират върху градиент на Ficoll-urografin, както е описано по-горе. Първото промиване се извършва в PBS (NaCl - 8,0 g, Na 2 HP0 4 - 1,15 g, KH 2 PO 4 - 0,2 g, KCl - 0,2 g на 1 литър вода); следващите две се произвеждат в среда 199 с 5% АВ серум (пул от 15 донора);

Отговарящите клетки се ресуспендират в среда 199 с 10% АВ серум и клетъчната концентрация се регулира до 0.6 х 106 на ml;

Стимулиращи клетки, изолирани по същия начин в концентрация от 5 - 106 на 1 ml се третират с митомицин С (60 y/ml) от Serva и се инкубират за 40 минути при 37°С във водна баня. След инкубиране, клетките се промиват 3 пъти със среда 199 с 5% АВ серум, ресуспендират се в среда 199 с 10% АВ серум, довеждайки концентрацията до 0.6 х 106 в 1 ml;

0.5 ml от реагиращи клетки и 0.5 ml от стимулиращи клетки се смесват в центрофужна епруветка, добавят се 0.04 ml от 10 ml разтвор на Hepes (Serva) и се инкубират в продължение на 144 часа; опитът е поставен в три паралела (триплет);

24 часа преди края на инкубацията добавете 3 Н-тимидин 1μCi (3,7x10 4 BC) към епруветките за всяка проба специфична дейност 5mCi/mmol (18.5x107 BC/mmol) и продължете инкубацията;

В края на инкубацията клетките се прехвърлят в милипорни филтри (0,6 - 0,9 микрона) и се промиват физиологичен разтвор(37°С) и охладен 5% разтвор на трихлороцетна киселина (4°С). Филтрите се изсушават и се поставят във флакони с 5 ml сцинтилационна течност (5 g PPO и 0,5 g POPOP - на 1 литър толуен) *. Активността на включване на ЗН-тимидин се измерва в β-брояч; резултатът се изразява в абсолютни включвания на радиоактивния етикет за 1 минута или в индекса на стимулация (SI) по формулата:

* (PPO - 2,5-фенол-оксазол; POPOR - (1,4-ди-2-15-фенолоксазолитбензен).)

Средна стойност на CPM в три прототипа

SI = Средна стойност на CPM в три контролни проби/Спонтанни култури от реагиращи клетки служат като контролни проби.

Микро версия на MLC в таблети Cook. На 8-ия семинар бяха разработени изисквания, които стандартизират микроопцията на MLC, в съответствие с която тя е изложена по-долу:

Лимфоцитите се изолират в isopaque-ficoll градиент и се ресуспендират в RPMJ-1640 * среда, довеждайки концентрацията до 5x10 5 в 1 ml;

* (Може да се използва среда 199, смесена с човешки серум от група АВ (5% серум, взет от няколко индивида).)

Стимулаторните клетки се третират с митомицин С или обучение;

5x10 4 реагиращи и същия брой стимулатори се поставят с помощта на микропипета тип Pipetman във всяка ямка на облодънна микроплака на Cook;

Плаките се инкубират в термостат с автоматично подаване на 5% CO 2 за 120 часа; след това lµmCi 3 Н-тимидин се добавя към всяка ямка при специфична активност на тимидин 6 Ci/mmol; всички манипулации се извършват с пипета Pipetman;

16 часа след добавяне на тимидин, културите от всяка ямка се прехвърлят в милипорови филтри с помощта на автоматична пипета и се промиват с физиологичен разтвор и след това с 5% трихлороцетна киселина; удобно е да се използват специални „комбайни“ за прехвърляне на културата в милипорни филтри;

Активността на включване на тимидин се определя, както е описано по-горе.

2.2.2. Клетъчно-медиирана лимфолиза (CML)

ХМЛ се използва в имуногенетични изследвания сравнително наскоро (от 1972 г.), но в напоследъкстава все повече и повече популярна технология, което позволява подробно изследване на ролята на еферентната връзка на трансплантационния имунитет и получаване на признание като информативен методимунологичен мониторинг. Принципът на метода е показан на фиг. 12. Методът се основава на техниката, предложена от J. Lightbody (1971), която е обобщена накратко, както следва.

1. ХМЛ започва с конвенционален HLC тест, при който реагиращите клетки разпознават „стимулатори“, сенсибилизират реагиращите клетки и образуват сенсибилизирани клетки убийци.

2. Втората фаза, в която сенсибилизираните клетки убийци се смесват с белязани с 51 Cr прицелни клетки, се състои от унищожаването на последните от ефекторни клетки убийци; прицелните клетки могат да имат същия генотип като "стимулаторите" в първата фаза на MLC или могат да бъдат клетки на "трети" партньор, надарени с антигенни детерминанти, общи за "стимулаторите" или без тях.

3. Количеството радиоактивен хром, освободен от унищожените целеви клетки и освободен в културалната среда, служи като мярка за интензивността на ефекта убиец.

Ориз. 12. Принцип на клетъчно-медиираната лимфолиза (CML). Ред I - сенсибилизация на реагиращите клетки, образуване на клетки убийци; Ред II - взаимодействие на убийците с целта; Ред III - разрушаване на таргетната клетка; добив 51 Cr културална среда

Тук са описани три варианта на CML: традиционната версия, модифицирана от L.P. Alekseev (1979), микровариантът в таблетки на Cook, директен CML (Direct-CML -D-CML.

Традиционен вариант[Алексеев L.P., 1979].

Методът е разделен на няколко етапа.

Набиране на убийци:

Периферните лимфоцити от двете популации (R-клетки и S-клетки) се изолират по обичайния начин, промиват се три пъти в градиент на плътност в среда 199 с 5% АВ серум (10 минути, 150 g);

1x106 R клетки (0.8 ml) се смесват в центрофужни епруветки с 2x106 S клетки (0.2 ml), третирани с митомицин С и се инкубират в продължение на 144 часа при 37°С;

Клетките се центрофугират при 150 g за 10 минути и утайката се ресуспендира в среда 199 с добавяне на 20% телешки серум (среда 199 + т.е.), довеждайки концентрацията до 1x106 в 1 ml;

Една от пробите се оставя за изследване на нивото на MLC, останалите се използват като готови убийци.

Получаване на цели:

Лимфоцитите, изолирани по обичайния начин, се ресуспендират в среда 199 с 20% АВ серум и се инкубират с фитохемаглутинин (0.003 mg/ml Wellcome) в продължение на 72 часа при 37°С; клетъчна концентрация 1x10 6 в 1 ml;

Клетките се центрофугират в продължение на 10 минути при 150 g, утайката се ресуспендира в среда 199 с 5% АВ серум и клетъчната концентрация се регулира до 2x104 в 1 ml;

51 Cr 100 μCi/ml (3.7x106 BC/ml) се добавя към суспензията и се инкубира за 40 минути при 37°C;

Клетките се промиват три пъти в среда 199 с добавяне на 5% АВ серум (150 g, 10 минути) и утайката се ресуспендира в среда 199 с 5% АВ серум. довеждане на концентрацията до 2x10 4 в 1 ml.

Настройка на реакциите:

5x105 убийци (0.5 ml) се смесват с 1x104 мишени (0.5 ml), инкубират се за 4 часа (37°С) и се центрофугират при 150 g за 10 минути;

Супернатантът се аспирира и импулсът, причинен от 51 Cr, се отчита на брояч; преброяването се извършва в 0,5 ml супернатант;

Нивото на цитолиза се изчислява по следната формула:

Екпер. изход 51 Cr - спонтанен изход 51 Cr/max, изход 51 Cr - спонтанен изход 41 Cr × 100.

Спонтанното освобождаване на хром се измерва върху мишени, инкубирани в продължение на 4 часа (37°C) без клетки убийци; максимален добив на хром - върху цели, напълно унищожени от замразяване и размразяване; Всички тестове се провеждат в триплети.

Микровариант на CML в таблетки [според Mawas S., 1976]:

Фазата на получаване на убийци се провежда като MLC в плаки с кръгло дъно, но R- и S-клетките се смесват в равни количества, 2x10 5 pa всяка ямка и се инкубират при 37°С;

След 5 дни клетките се събират с пастьорска пипета в епруветка, броят на живите клетки се преброява с трипаново синьо и концентрацията се довежда до 10x106 в 1 ml;

Прицелните клетки се култивират с PHA в продължение на 3 дни;

В деня на реакцията прицелните клетки се промиват (300 g) и се ресуспендират в културална среда, като 1 ml се разпределя в епруветки и се регулира до 1x106 в 1 ml;

Добавете 200 μCi 51 Cr (7,4x106 BC) към всяка епруветка с прицелни клетки и инкубирайте за 1 час при 37°C; измийте клетките 3 пъти; утайката се ресуспендира и се довежда до концентрация 1x10 в 1 ml (живо);

Тестът се извършва в микроплаки с кръгло дъно; за това 0.7 - 1x106 клетки убийци (0.1 ml) и 1x104 целеви клетки (0.1 ml) се разпределят във всяка ямка; общият обем на суспензията във всяка ямка е 0,2 ml, добавете 0,05 ml среда към всяка ямка и инкубирайте (37°C) в продължение на 4 часа;

Плаките се центрофугират при 800 g на Beckman центрофуга за 10 минути; супернатантата от всяка ямка се прехвърля в епруветки и се отчита на γ-брояч;

Фазата на производство на клетки убийци (MLC) се провежда в среда RPMJ-1640 с добавяне на 20% човешка плазма; за фазата на умъртвяване използвайте среда MEM с добавяне на 20% човешка плазма, предварително загрята.

Директен CML (D-CML).Директният CML е техника, разработена специално за клинични цели, която намира приложение в имунологичния мониторинг. Схемата на тази реакция е показана на фиг. 13.

Основната разлика от традиционната CML е, че етапът на образуване на клетки убийци (фаза на сенсибилизация) се случва не in vitro, а in vivo, т.е. в човешкото тяло, сенсибилизирано чрез трансплантация на алогенен орган или тъкан. Благодарение на ефекта на алогенната тъкан, лимфоцитите на реципиента са сенсибилизирани към тъканните антигени на донора и не изискват специално лечение in vitro; продължителността на теста е значително намалена във времето, тъй като първо трябва да се подготвят само мишените.

Използваните мишени са лимфоцити, получени от периферна кръв или по-често от далака на донора (вижте 2.1.2) и замразени по който и да е от методите, описани по-горе (вижте 2.1.3).

2.2.3. Антитяло-зависима клетъчно медиирана цитотоксичност (ADCC)

Този тип клетъчен отговор е подобен по механизъм на действие на CML, описан по-горе. Принципът на реакцията е показан на фиг. 14. Компонентите на реакцията са прицелни клетки (донорни клетки или алогенни лимфоцити), серум (алогенен или реципиент), вероятно съдържащ антитела, насочени към детерминанти на прицелните клетки, и ефекторни клетки (реципиентни лимфоцити или алогенни лимфоцити).

Ефекторните клетки при този вид взаимодействие са така наречените К-клетки, разположени в периферната кръв. За разлика от клетките убийци в CML, те извършват цитотоксичен ефект без предварителна сенсибилизация, но проявата на цитотоксичния ефект на К клетките е възможна само чрез антитела, насочени към детерминантите на целевите клетки. Специфичният лизис се измерва чрез освобождаването на 51 Cr, ако тестовият серум съдържа антитела към целевите детерминанти.

Целевите детерминанти в ADCC могат да бъдат практически спецификите на всички HLA локуси, включително HLA-D, HLA-DR, както и детерминанти, лежащи извън HLA системата.

Най-разпространениТази сложна реакция е получена при имунологичен мониторинг за откриване на В-клетъчни антитела. В тази връзка са предложени няколко модификации, осигуряващи обогатяване на таргетната клетъчна суспензия с В-лимфоцити, адсорбция на серум върху тромбоцитите и др.

Освен това се вземат предвид редица други характеристики на реакцията в тази система. Тестовият серум трябва да бъде декомплементиран, в противен случай реакцията може да бъде антитяло-медиирана комплемент-зависима цитотоксичност. Предполага се също, че ефекторните клетки могат да причинят известно унищожаване на мишени според вида на CML.

В крайна сметка, целият набор от проби в антитяло-зависимия клетъчно-медииран тест за лимфоцитотоксичност е както следва:

Мишени + ефектори + тестов серум (експериментална проба);

Мишени (контролна проба, т.е. спонтанно освобождаване на 51 Cr);

Мишени + ефектори (контролен тест за ефекторна активност);

Цели + тест серум (серумен контрол).

Лимфоцитите се изолират рутинно и се ресуспендират в RPMI-1640 + 10% фетален говежди серум; третиране на суспензията с карбонилно желязо за отстраняване на моноцитите; добавете амониев хлорид или H 2 O за лизиране на останалите червени кръвни клетки;

51Cr под формата на разтвор на Na2CrO4 100 - 200 uCi ml (3.7x106 - 7.4x106 BC/ml) се добавя към суспензията на целевите клетки и се инкубира за 40 - 60 минути;

Клетките се промиват три пъти в RPMI + 0.1% HSA, ресуспендират се в същата среда и се регулират до 2x108 в 1 ml; 50 µl суспензия от белязани клетки се поставя в епруветка и впоследствие изотопната активност се изчислява на γ-брояч, за да се идентифицира пълно изотопно „асимилиране“; останалата част се излива в ямките на плаката, 50 µl суспензия (1x105 клетки на ямка);

Суспензията от ефекторни клетки се довежда до 2x107 клетки в 1 ml и c. всяка ямка се пълни с 50 µl суспензия (или 100 µl), съотношението на ефекторите към мишените е 10:1 (или 20:1);

Инкубацията продължава 4 часа във влажна термостатна атмосфера с 5% CO 2 (продължителността на инкубацията може да бъде удължена до 8 часа);

Пригответе няколко разреждания на тестовия серум в епруветки (1:25; 1:100) и добавете до 50 µl от всяко разреждане към ямките: и неразреден серум; окончателната тестова настройка изглежда както е показано в таблицата. 23.

Таблица 23

Постановка на ADCC. Всички опции за проби, µl

* (Вместо тест серум се накапва пул от AB серуми.)

** (Вместо тест серум се влива моноспецифичен HLA серум, насочен срещу мишени (не ефектори).)

Инкубацията на панелите продължава 4 часа във влажна атмосфера с 4% CO 2 ; продължителността на инкубацията може да бъде удължена до 8 часа;

След инкубиране, половината обем от всяка ямка (100 μl) внимателно се аспирира с автоматична пипета и се поставя в 51 Cr епруветки за броене на импулси; активността се отчита на γ-брояч;

Изчисленията са както следва:

% освобождаване на 51 Cr = 2 × A op - фонова активност/B - фонова активност × 100;

% цитотоксичност = A op - A sp /100 - A sp × 100, където A op е % освобождаване на 51 Cr в експериментални проби; A sp - % спонтанно освобождаване; B - пълно усвояване на изотопа.

как положителен резултат 5% или по-висока цитотоксичност се счита след 4 часа инкубация.