Dodaj do ulubionych
dom KATEGORIE

Diagnostyka laboratoryjna helmintoz. Metoda izolowania czystej kultury Leishmania uzyskanej poprzez zeskrobanie tkanek patologicznych

Proste metody

Metoda makroskopowa. Podczas badania kału można znaleźć robaki, ich głowy, segmenty i fragmenty strobil, uwolnione samodzielnie lub po odrobaczeniu. Metoda ta jest szczególnie zalecana do wykrywania enterobiozy, taeniozy i taeniarynchozy.

Małe porcje kału miesza się z wodą w płaskiej wannie lub na szalce Petriego i ogląda dobre oświetlenie na ciemnym tle, w razie potrzeby za pomocą szkła powiększającego, usuń robaki i wszystkie podejrzane białe narośle pęsetą lub pipetą. Pobrany materiał przenosi się do innego naczynia z wodą lub na szkiełko z kroplą rozcieńczonego gliceryny lub izotonicznego roztworu chlorku sodu w celu dalszych badań.

Przy metodzie osadzania całą badaną porcję kału należy zmieszać z wodą w szklanym cylindrze, a następnie dokładnie odsączyć Górna warstwa woda. Powtarza się to kilka razy. Gdy ciecz stanie się klarowna, należy ją spuścić, a osad bada się w małych porcjach w szklanej łaźni lub na szalce Petriego, jak wskazano powyżej.

Metody mikroskopowe są głównym sposobem badania kału w celu wykrycia jaj lub larw robaków. Poniżej opisano różne metody badawcze. W celu zwiększenia wiarygodności badania badania można powtarzać kilka razy dziennie lub w odstępie 1-3 dni.

Natywna metoda rozmazu. Rozmaz natywny jest najczęstszy i technicznie rzecz biorąc dostępna metoda badania kału. W rodzimym rozmazie można wykryć jaja i larwy robaków wszelkiego rodzaju. Jednak przy niewielkiej liczbie jaj w kale nie zawsze można je znaleźć. Dlatego badanie kału wyłącznie rozmazem natywnym nie jest pełne i powinno zostać uzupełnione metodami wzbogacającymi. Skuteczność badania rozmazu natywnego znacznie się poprawia, oglądając cztery szkiełka przygotowane z próbki kału na dwóch szkiełkach bez szkiełek nakrywkowych, co pozwala na zbadanie łącznie w przybliżeniu tej samej ilości kału, co w przypadku metody Kato (patrz poniżej).

Niewielką ilość (wielkości główki zapałki) zmieszanego kału rozprowadza się cienko drewnianym patyczkiem na powierzchni szkiełka w kropli 50% roztworu gliceryny. Zwykle na jednym szkiełku przygotowuje się dwa rozmazy. Rozmaz ogląda się pod mikroskopem o małym powiększeniu (tom 8, ok. 7). W przypadkach wątpliwych przykrywa się je szkiełkiem nakrywkowym i ogląda pod dużym powiększeniem (powiększenie 40).

Aby przygotować duży natywny rozmaz, 200-300 mg kału (wielkości dużego grochu) rozciera się na szkle o wymiarach 6x9 cm w 15-20 kroplach 50% wodnego roztworu gliceryny. Oglądać pod dwuokularowym mikroskopem stereoskopowym (obv. 4, ok. 12,5 lub ob. 2, ok. 17) w świetle przechodzącym, bez okularów nakrywkowych. W wątpliwych przypadkach można przełączyć obiektyw na większe powiększenie. W takich rozmazach wyraźnie widoczne są kolorowe jaja dużych robaków, podczas gdy przezroczyste jaja tasiemca karłowatego są nieco gorsze. Ta metoda nie nadaje się do wykrywania małych jaj. Jednocześnie duża objętość badanego materiału i duże pole widzenia przy dużej głębi ostrości zapewniają znaczną skuteczność tej modyfikacji w porównaniu z konwencjonalną rozmazem natywnym.

Rozmaz gęsty z celofanem (metoda Kato) jest skuteczniejszy niż badanie rozmazu natywnego, ale wymaga również połączenia z metodami wzbogacania. Wykrywane są jaja wszystkich typów robaków, jednak aby wykryć jaja tasiemca karłowatego (jaja przezroczyste) lub opisthorchida (małe jaja), laborant musi zachować szczególną ostrożność, aby ich nie przeoczyć (ryc. 21).

Metoda polega na wykryciu jaj robaków w gęstej mazie kału oczyszczonej gliceryną i zabarwionej zielenią malachitową. Prehydrofilowy celofan pocięto na płytki o wymiarach 20 x 40 mm i zanurzono w mieszaninie Kato (6 ml 3% wodnego roztworu zieleni malachitowej, 500 ml gliceryny, 500 ml 6% roztworu fenolu). 3-5 ml mieszanki wystarcza na 100 płytek, które są gotowe do użycia w ciągu jednego dnia i można je przechowywać w tej samej mieszance w szczelnie zamkniętym pojemniku w temperaturze pokojowej przez 6 miesięcy. W przypadku braku zieleni malachitowej (zalecanej w celu zmniejszenia zmęczenia oczu asystenta laboratoryjnego) i fenolu (środka dezynfekującego) można zastosować wyłącznie 50% wodny roztwór gliceryny, skuteczność badania nie ulega zmniejszeniu.

Ryż. 20. Sposób przygotowania gęstego rozmazu stolca celofanem według Kato

100 mg kału nanosi się na szkiełko szklane, przykrywa się płytką celofanową potraktowaną jak wskazano powyżej i dociska gumowym korkiem, tak aby kał nie rozprzestrzeniał się spod celofanu. Mikroskopię przy małym lub dużym powiększeniu mikroskopu przeprowadza się nie później niż 1 godzinę (w czasie upałów - 30-40 minut) po przygotowaniu rozmazu. Przyczyną nieprzezroczystości leku może być gruba warstwa kału, złe przetwarzanie płytki w mieszaninie Kato lub niewystarczający okres ekspozycji leku pod celofanem. Długotrwałe klarowanie gliceryną i nadmierne wysuszenie preparatu również utrudniają wykrycie jaj.

Metoda skręcania według S.S. Shulmana. Metodę tę zaproponowano do wykrywania larw robaków pasożytniczych, głównie słupkowców, w kale. Badaniom poddaje się wyłącznie świeżo wydalony kał, którego 2-3 g przenosi się do szklanego słoja i miesza okrężnymi ruchami szklanym prętem z 3-5-krotną ilością roztworu fizjologicznego, nie dotykając ścianek naczynia. W środku gromadzą się jaja i larwy robaków. Po zakończeniu mieszania kroplę znajdującą się na końcu sztyftu szybko przenosi się na szkiełko, przykrywa szkiełkiem nakrywkowym i ogląda pod mikroskopem.

Metody wzbogacania. Metody wzbogacania opierają się na różnicy w ciężarze właściwym jaj i zastosowanym roztworze soli, co pozwala na ich wykrycie w małych ilościach. Jeżeli ciężar właściwy jaj jest większy niż ciężar właściwy cieczy, wówczas jaja zagęszcza się w osadzie, który bada się pod mikroskopem. Tę metodę sedymentacji stosuje się w przypadku jaj przywr. Przy większym ciężarze właściwym roztworu jaja unoszą się na powierzchnię cieczy, a następnie bada się film. Są to metody flotacyjne (pływające), najskuteczniejsze w wykrywaniu jaj tęgoryjców, włosogłówków i tasiemców karłowatych.

Metody flotacyjne. Metoda Fulleborna polega na pływaniu jaj robaków pasożytniczych w nasyconym roztworze chlorku sodu, który charakteryzuje się dużą gęstością względną (1,2), co umożliwia wykrycie jaj w małych ilościach. Metoda jest skuteczniejsza niż badanie rozmazu natywnego, chociaż jest bardziej skomplikowana. Zaletami tej metody są niski koszt i dostępność. Zaleca się połączenie badania rozmazu natywnego i metody Fulleborna.

Nasycony roztwór przygotowuje się rozpuszczając podczas wrzenia 400 g chlorku sodu w 1 litrze wody. Gęstość względna roztworu wynosi 1,18-1,22. Roztwór przechowywany jest w zamkniętej butelce. Aby przeprowadzić analizę, 2-3 g kału umieszcza się w słoiku o pojemności 30-50 ml i mieszając patykiem, dodaje się prawie do góry nasycony roztwór chlorku sodu. Pasek papieru służy do szybkiego usuwania dużych cząstek pływających. Po 45-60 minutach. Po osadzeniu drucianą pętlą należy usunąć warstwę powierzchniową i przenieść ją na szkiełko w kropli 50% wodnego roztworu gliceryny. Zamiast zdejmować folię za pomocą pętelki, można dodać roztwór ze słoika na górę, przykryć szklanym szkiełkiem, do powierzchni którego przyklejają się pływające jajka. W przygotowaniu jest kilka preparatów. Dodatkowo bada się 2-4 preparaty z osadu, pobierając go pipetą do oka na 2 szkiełka. Oprócz filmu powierzchniowego konieczne jest również zbadanie osadu, ponieważ w tym roztworze nie pływają jaja przywr, taeniidów i niezapłodnionych jaj glisty. Jaja niektórych robaków nie wypływają natychmiast na powierzchnię w roztworze soli. Tak więc, jeśli maksymalna liczba jaj tasiemca karłowatego pojawi się po 15-20 minutach, wówczas glista - po 1,5-2 godzinach, włosogłówka - po 2-3 godzinach.

Zatem do zalet tej metody zalicza się jej niski koszt i dostępność, wadami jest konieczność oglądania preparatów na powierzchni filmu i osadu, a także czas osiadania.

Metoda E.V. Kalantaryana jest również metodą wzbogacającą, ale jest skuteczniejsza i prostsza niż metoda Fulleborna. Stosuje się nasycony roztwór azotanu sodu o gęstości względnej 1,38. Dlatego jaja większości robaków unoszą się na wodzie i znajdują się w warstwie powierzchniowej; badanie osadu nie jest wymagane.

Aby przygotować nasycony roztwór azotanu sodu, 1 kg azotanu sodu (azotanu sodu) rozpuszcza się w 1 litrze wody i gotuje do całkowitego rozpuszczenia i utworzenia filmu na powierzchni. Bez filtrowania przelać do suchej butelki. W przypadku braku azotanu sodu można go zastąpić azotanem amonu (satarem amonu), rozpuszczając 1,7 kg na 1 litr wody. Gęstość względna powstałego roztworu wynosi 1,3, co nieznacznie zmniejsza wydajność w porównaniu z roztworem azotanu sodu.

Zalety metody: Jaja większości robaków szybko unoszą się na wodzie i znajdują się w błonie powierzchniowej, co eliminuje konieczność badania osadu. Wadą tej metody jest niedobór azotanu sodu, a także fakt, że jaja przywr i onkosfery taeniidów nie unoszą się na wodzie i pozostają w osadzie. Należy wziąć pod uwagę, że gdy odchody są przechowywane w roztworze przez długi czas (ponad 1-2 godziny), jaja niektórych robaków zaczynają pęcznieć i osiadać, znikając z filmu powierzchniowego.

Metody sedymentacji

Metoda P. P. Goryaczewa opiera się na zasadzie sedymentacji jaj. W tym przypadku rozmaz okazuje się lekki, bez grubych zanieczyszczeń, co ułatwia wykrycie małych jaj przywr (opistorchid itp.). Ciężar właściwy jaj opisthorcha jest wysoki, dlatego nie unoszą się one w roztworach soli.

70-100 ml nasyconego roztworu chlorku sodu wlewa się do cylindra o średnicy 2-3 cm. Oddzielnie ostrożnie wymieszać 0,5 g kału w 20-25 ml wody i ostrożnie przesączyć przez lejek z dwiema warstwami gazy do cylindra na roztwór soli, unikając mieszania (aby utworzyły się dwie wyraźnie odgraniczone warstwy). Po 2-3 godzinach wierzchnią warstwę z kałem odsysa się pipetą, a pozostały roztwór soli pozostawia na 12-20 godzin lub odwirowuje. Osad odpipetowuje się na szkiełko, przykrywa szkiełkiem nakrywkowym i bada pod mikroskopem.

Do wykrywania jaj przywrchowatych zaproponowano metodę Goryaczowa, która okazała się skuteczniejsza niż badanie rozmazu rodzimego i metoda Fulleborna. Obecnie do diagnostyki opisthorchiasis (klonorchiasis) zaleca się metody Kato i Kalantaryana jako dość skuteczne i prostsze technicznie.

Metoda Krasilnikowa. Pod wpływem środków powierzchniowo czynnych zawartych w detergentach jaja robaków są uwalniane z kału i gromadzone w osadzie.

Przygotuj 1% roztwór proszku do prania Lotus. W tym celu 10 g proszku rozpuszcza się w 1 litrze wody z kranu. Jeśli Lotus nie jest dostępny, możesz użyć innych proszki do prania, ale trzeba wziąć tyle każdego z nich, ile rozpuści się bez tworzenia osadu w 1 litrze wody kranowej. Do szklanego naczynia o pojemności 30-50 ml wlewa się 20-30 ml roztworu detergentu, umieszcza się w nim niewielką porcję kału i dobrze miesza. Stosunek kału do roztworu powinien wynosić około 1:20. Kał powinien znajdować się w roztworze przez co najmniej 24 godziny. W tym czasie na dnie tworzy się osad składający się z 2-3 warstw. Dolna warstwa składa się z grubych, ciężkich cząstek, w środkowej warstwie gromadzą się jaja robaków, a górna warstwa to białawo-szare płatki. Następnie za pomocą pipety pobierz 2-3 krople płynu ze środkowej warstwy i przenieś je na szkiełko. Na jednym szkiełku przygotowuje się 2 preparaty, przykrywa się szkiełkiem nakrywkowym i ogląda pod mikroskopem.

Metoda Krasilnikowa umożliwia wykrycie jaj wszystkich typów robaków wydalanych z kałem.

Metoda sedymentacji eterowo-formalinowej i metoda sedymentacji chemicznej wysoka wydajność są bardzo pracochłonne, zwłaszcza przy badaniach masowych, dlatego bardziej wskazane jest stosowanie metody eterowo-octowej. Pozwala, po dodatkowej obróbce osadu odczynnikami chemicznymi, uzyskać prawie wyłącznie jaja robaków, co ułatwia identyfikację małych jaj przywr. Metoda ta okazała się uniwersalna, pozwala na wykrycie jaj wszystkich robaków jelitowych, cyst pierwotniaków jelitowych, a także może służyć do ilościowego określenia intensywności inwazji.

Do probówek miarowych wirówkowych wlewa się 7 ml 10% roztworu kwas octowy i dodać 1 g kału do oznaczenia 8 ml. Kał dokładnie miesza się patyczkiem, aż do uzyskania jednorodnej mieszaniny, a następnie przesącza przez dwie warstwy gazy do drugiej probówki wirówkowej (tak, aby nowa probówka przecedzonego roztworu ponownie zawierała 8 ml; jeśli mniej, można dodatkowo przepłukać lejek bandażem 10% roztworem kwasu octowego, przez który przefiltrowano roztwór kału). Do probówki dodać 2 ml eteru (do kreski 10 ml), zamknąć ją i energicznie wstrząsać przez 30 sekund. Mieszaninę wiruje się przy 3000 obr/min przez 1 minutę (lub 2 minuty przy 1500 obr/min). Warstwę koagulantu (w postaci korka w górnej części probówki) oddziela się patyczkiem od ścianek probówki i dokładnie osusza wraz z płynnym supernatantem. Osad (zwykle mały, bezbarwny) odpipetowuje się na szkiełka, przykrywa szkiełkiem nakrywkowym i bada pod mikroskopem.

Pierwotniaki dzielą się na 4 klasy:

Po otorbieniu mikroorganizm nabiera okrągłego kształtu i jest pokryty ochronną powłoką. Pierwotniaki w postaci cysty stają się mniej podatne na niekorzystne czynniki środowiskowe.

Badaniom mogą podlegać:


Notatka:Istnieje wiele rodzajów diagnostyki; rozważymy te typy, które są najbardziej powszechne w klinicznej praktyce laboratoryjnej.

Prywatne rodzaje diagnostyki

W każdym konkretnym przypadku asystent laboratoryjny ma za zadanie znaleźć konkretny patogen; czasami oprócz głównego patogenu odkrywane są inne.

Istnieje 6 gatunków tego mikroorganizmu zdolnych do życia w jelicie człowieka. Znaczenie kliniczne ma jedynie ameba czerwonkowa, która występuje w postaci wegetatywnej i w postaci cyst.

Dodatkowo stosowane są metody immunologiczne:

  • immunofluorescencja pośrednia;
  • aglutynacja pośrednia (INA);
  • promieniowa immunodyfuzja.

Notatka: metody serologiczne nie mają charakteru informacyjnego i są używane jedynie jako dodatek do głównych w wątpliwych przypadkach.

Diagnostyka orzęsków (rzęsków)

Patogenną formą mikroorganizmów tego rodzaju jest balantidium. Jest to drobnoustrój wywołujący balantydiozę, chorobę, której towarzyszy proces wrzodziejący jelita grubego. Patogen wykrywa się w natywnym rozmazie w postaci formy wegetatywnej i cysty. Materiał do wymazu (kał i śluz) pobiera się podczas badania sigmoidoskopowego i wysiewa na specjalne podłoża.

Diagnostyka wiciowców (Leishmania, Giardia, Trypanosomy, Trichomonas)

Leishmania, trypanosomy, lamblia i trichomonas są niebezpieczne dla ludzi.

Leiszmania– drobnoustroje, wywołując leiszmaniozę, są badane w rozmazach krwi, materiałach szpik kostny, zeskrobiny z nacieków skóry. W niektórych przypadkach podczas diagnozowania leiszmanii stosuje się hodowlę na pożywkach.

Trypanosomy– czynniki wywołujące śpiączkę (trypanosomatoza amerykańska/afrykańska lub choroba Chagasa).

Wariant afrykański jest określany w początkowym okresie podczas badania krwi obwodowej. W miarę postępu choroby patologiczne drobnoustroje wykrywane są w materiale nakłuć węzłów chłonnych, a w zaawansowanych stadiach – w płynie mózgowo-rdzeniowym.

Aby zdiagnozować trypanosomy, jeśli podejrzewa się chorobę Chagasa, badany materiał bada się pod mikroskopem przy małym powiększeniu. W tym przypadku rozmazy i gruba kropla są wstępnie barwione.

Trichomonas(jelitowe, ustne) wykrywa się pod mikroskopem materiałów pobranych z dotkniętych błon śluzowych.

Identyfikacja sporozoanów (plazmodium malarii, czynnik sprawczy kokcydozy itp.)

Najbardziej powszechnym i niebezpiecznym gatunkiem dla ludzi jest malaryczny plazmodium, który ma 4 główne typy patogenów: czynnik wywołujący malarię trzydniową, malarię czterodniową, malarię tropikalną i malarię owalną.

Rozwój płciowy Plasmodium (sporogony) ma miejsce u komarów Anopheles. Bezpłciowy (schizogonia tkanek i erytrocytów) - w ludzkiej tkance wątroby i erytrocytach. Te cechy koło życia należy wziąć pod uwagę podczas diagnozowania plazmodu malarii.

W ten sposób we krwi nowo chorego pacjenta można wykryć komórki rozrodcze cyklu sporogonii. Jednak w szczytowym okresie ataków malarii schizonty pojawiają się we krwi w dużych ilościach.

Ponadto w różnych fazach gorączki malarycznej pojawiają się różne formy plazmodu:

  • w okresie chłodu krew wypełnia się merozoitami, rodzajem schizontu;
  • w podwyższonych temperaturach trofozoity w kształcie pierścienia gromadzą się w erytrocytach;
  • spadek temperatury charakteryzuje się przewagą trofozoitów podobnych do ameby;
  • w okresach normalnego stanu krew zawiera dorosłe formy schizontów.

Badanie czynnika wywołującego malarię (plazmodium malarii) przeprowadza się w rozmazie i gęstej kropli.

Notatka:Rozpoznanie malarii na podstawie badania rozmazów i gęstych kropli krwi jest czasami błędne. W niektórych przypadkach płytki krwi można błędnie przypisać patogenowi malarii. Czasami fragmenty leukocytów i innych komórek symulują plazmodium.

Podstawowe metody badania pierwotniaków

Przyjrzyjmy się pokrótce najczęstszym metodom badań na obecność pierwotniaków.

Diagnostyka pierwotniaków za pomocą rozmazu natywnego i rozmazu barwionego roztworem Lugola (w kale)

Lek wytwarza się z emulsji kału w roztworze izotonicznym. Na szkiełko szklane nanosi się dwie krople chloru sodu i roztworu Lugola. Materiał do badań dodaje się do obu kompozycji za pomocą drewnianego patyka i po przykryciu szkłem ogląda się go w różnych rozdzielczościach mikroskopu.

Znalezione pierwotniaki są rejestrowane w oparciu o pewne cechy. Dla dokładności przygotuj 2-3 preparaty z tego samego materiału. W przypadkach wątpliwych analizę powtarza się kilkukrotnie w ciągu 2-3 tygodni.

Metodą można wykryć formy wegetatywne i torbielowate:

  • lamblia;
  • balantyd;
  • ameba czerwonkowa.

Oprócz form chorobotwórczych identyfikuje się także pierwotniaki niepatogenne. Również u zdrowych nosicieli występują formy luminalne i torbielowate.

Ważny:badania należy przeprowadzać wielokrotnie, aby uniknąć nieścisłości i błędów.

Wynik diagnostyki pierwotniaków metodą rozmazu natywnego i barwionego powinien zawierać opis postaci patogenu (luminal, cysta, tkanka).

Wymagania badawcze:

  • materiał pobrany do analizy (płynny kał) bada się nie później niż 30 minut po wypróżnieniu;
  • sformalizowany stolec należy zdiagnozować w ciągu 2 godzin po wypróżnieniu;
  • materiał nie powinien zawierać zanieczyszczeń (środki dezynfekcyjne, woda, mocz);
  • do pracy z materiałem używaj wyłącznie drewnianych patyczków, szklane nie nadają się ze względu na poślizg śluzu;
  • Patyczki należy spalić natychmiast po użyciu.

Metoda konserwacji (badanie kału) w diagnostyce pierwotniaków

Badanie przeprowadza się poprzez utrwalenie pierwotniaków środkiem konserwującym. Różnica między tą metodą a poprzednią polega na tym, że konserwanty pozwalają zachować lek przez długi czas.

Stosowane konserwanty:

  • Kurhan. Zawiera składniki konserwujące: 0,7 ml chlorku sodu, 5 ml formaliny, 12,5 ml 96% alkoholu, 2 g fenolu i 100 ml wody destylowanej. Skład barwiący: 0,01% roztwór tioniny (azura).
  • Rozwiązanie Safarlieva. Składniki: 1,65 g siarczanu cynku, 10 ml formaliny, 2,5 g fenolu krystalicznego, 5 ml kwasu octowego, 0,2 g błękitu metylenowego, 100 ml wody. Ten środek konserwujący stosuje się w przypadkach, gdy materiał musi być przechowywany dłużej niż miesiąc.

Puste butelki napełnia się środkiem konserwującym, przenosi się do nich materiał w stosunku 3:1, po czym w razie potrzeby dodaje się barwnik. Wyniki ocenia się badając 2-3 leki.

Metoda wzbogacania formaliną-eterem (analiza obecności pierwotniaków w kale)

Ta metoda diagnostyczna pozwala na oddzielenie i zagęszczenie cyst pierwotniaków. Do analizy potrzebne są następujące składniki: formaldehyd (10 ml), 0,85 g roztworu izotonicznego, woda destylowana, eter siarkowy, rozwiązanie Lugola.

Mieszankę biomateriału z wymienionymi cieczami miesza się i odwirowuje. Uzyskany na dnie probówki osad barwi się roztworem Lugola i bada na obecność cyst i form wegetatywnych.

Metoda wykrywania Leishmanii (rozmaz szpiku kostnego)

Do diagnozowania leiszmaniozy stosuje się następujące odczynniki: Mieszanka Nikiforowa (eter siarkowy i etanol), bufor fosforanowy, azur-eozyna według Romanowskiego.

Substancję szpiku kostnego po specjalnym przygotowaniu bardzo ostrożnie umieszcza się na szkiełku. Stosowany jest mikroskop z systemem zanurzeniowym.

W ostrym okresie choroby w punktach punktowych stwierdza się dużą liczbę leiszmanii.

Notatka:Czasami krwinki może przypominać przetworzoną Leishmania, dlatego bardzo ważne jest, aby technik laboratoryjny zachował ostrożność i miał wystarczające doświadczenie, aby przeprowadzić niezależne badania.

Metoda wykrywania leiszmanii w rozmazie z nacieku skórnego

Wymagane odczynniki są podobne do poprzedniej analizy.

Materiał do badań pobiera się z istniejącej treści guzkowej lub wrzodziejącej. Jeśli podejrzewa się leiszmaniozę, skrobanie wykonuje się bardzo ostrożnie skalpelem, bez krwi. Następnie preparat przygotowuje się na szkle. Aby zapewnić dokładność uzyskanych wyników, bada się jednocześnie kilka preparatów.

W obecności choroby leiszmanię wykrywa się także wśród makrofagów, fibroblastów i komórek limfoidalnych obecnych w materiale testowym.

Metoda izolowania czystej kultury Leishmania uzyskanej poprzez zeskrobanie tkanek patologicznych

Dzięki tej metodzie diagnozowania pierwotniaków zeskrobiny tkanek umieszcza się w specjalnym pojemniku pożywka, w którym następuje aktywna reprodukcja Leishmanii.

Przed pobraniem zeskrobiny skórę dokładnie poddaje się działaniu alkoholu, następnie wykonuje się nacięcie w guzku, z którego dna pobiera się zawartość i umieszcza w probówce z pożywką. Materiał pobiera się kilka razy, po czym umieszcza się go w różnych probówkach. Następnie uprawa odbywa się w termostacie w temperaturze 22-24 stopni. Wyniki ocenia się pod mikroskopem. Metodę tę stosuje się, gdy inne, tańsze i szybsze metody diagnozowania pierwotniaków są nieskuteczne.

Jak w praktyce rozszyfrowuje się testy na obecność pierwotniaków za pomocą kropli krwi, możesz zobaczyć w recenzji wideo:

Lotin Alexander, felietonista medyczny

Metody badania helmintologiczne dzielą się na bezpośrednie i pośrednie. Metody bezpośrednie: wykrywanie samych robaków, ich fragmentów, jaj, larw w kale, moczu, wydzielinie z dwunastnicy, plwociny, śluzu nosa i pochwy, zawartości przestrzeni podpaznokciowych, pobranych fragmentów tkanek. Metody pośrednie: identyfikacja zmiany wtórne powstające w organizmie człowieka w wyniku życiowej aktywności pasożyta, reakcji serologicznych, badania ogólne krew, mocz. Najczęstszymi metodami badania kału są robako-owoskopia i protozooskopia. Podczas diagnozowania nie można zidentyfikować jaj lub larw wszystkich typów robaków żyjących w układ trawienny osoba. Zatem przy stosowaniu metody flotacji jaja przywr, a w niektórych przypadkach niezapłodnione jaja glisty, nie unoszą się w warstwie powierzchniowej (ze względu na ich wysoki ciężar właściwy). Bardzo rzadko zdarza się znaleźć w kale jaja owsików i onkosfery taeniidów, które wykrywa się specjalnymi metodami badawczymi: zeskrobywaniem fałdów okołoodbytowych w przypadku owsików i taeniidów, metodami sedymentacji przywr (jaja opistorchidów itp.). Dlatego w celu ukierunkowanego badania pacjenta pod kątem infekcji robakami, lekarz na skierowaniu musi wskazać, na które robaki należy się skupić (diagnoza), co pozwoli asystentowi laboratoryjnemu wybrać odpowiednią technikę identyfikacji tego typu robaków. Pobrane odchody różne miejsca Kał w ilości co najmniej 50 gramów (łyżeczka) w czystym szklanym pojemniku należy przesłać do laboratorium nie później niż 24 godziny po wypróżnieniu i zbadać w dniu odbioru. Jeśli konieczne jest zachowanie stolca do Następny dzień umieszcza się go w zimnym miejscu (0-4°C) lub napełnia jednym z konserwantów. Przed badaniem stolec należy wymieszać patyczkiem, aby jaja robaków zostały równomiernie rozłożone masa całkowita. Jeśli w preparacie zostaną znalezione jaja jakiegokolwiek robaka, oglądanie nie zostanie zatrzymane, ponieważ może nastąpić podwójna lub potrójna inwazja. Monitorowanie skuteczności leczenia infekcji robakami pasożytniczymi odbywa się poprzez badanie kału pod kątem jaj robaków pasożytniczych 2-3 tygodnie lub 2-3 miesiące po leczeniu, w zależności od wykrytego robaka. Metody makroskopowe służą do wykrywania całych dojrzałych robaków lub ich fragmentów w kale gołym okiem lub przy użyciu ręcznego szkła powiększającego. Często aktywnie pełzające owsiki można zobaczyć na powierzchni kału po wypróżnieniu; glisty są wydalane z kałem; Czasami ludzie sami zauważają przejście robaków. U chorych na difylobotriozę mogą być wydalane fragmenty tasiemca strobili (w postaci „makaronu”), a u osób zakażonych taeniidami (tasiemiec wieprzowy lub bydlęcy) fragmenty robaków często opuszczają się z kałem (w postaci „białych wycinków ”) lub aktywnie wypełzają z odbytu. Metoda makroskopowa jest główną metodą diagnostyki różnicowej taeniozy i taeniarynchozy (w połączeniu z badaniem ankietowym). Spośród specjalnych metod makroskopowych stosuje się metodę sekwencyjnego płukania kału. Kał miesza się z wodą do uzyskania jednolitej zawiesiny, po czym przy dobrym oświetleniu dokładnie bada się go w oddzielnych małych porcjach w czarnych kuwetach fotograficznych lub na ciemnym tle na szalkach Petriego. Za pomocą pęsety lub igły preparacyjnej usuń wszystkie podejrzane białe cząsteczki, duże formacje podejrzane o fragmenty robaków i zbadaj je pod lupą pomiędzy dwoma szkiełkami. Małe robaki lub głowy tasiemców bada się pod lupą w kropli gliceryny lub pod mikroskopem. Stosując tę ​​metodę do diagnozowania segmentów wieprzowego, bydlęcego i szerokiego tasiemca, umyte segmenty umieszcza się pomiędzy dwiema szklankami i patrząc pod światło pod lupą lub mikroskopem o małym powiększeniu, gatunek określa się na podstawie struktury macica (w dojrzałym segmencie tasiemiec wieprzowy Od pnia centralnego odchodzi 8-12 bocznych gałęzi, a u bydlęcego tasiemca jest ich 18-32, częściej 28-32; u szerokiego tasiemca segmenty są szersze, a macica pośrodku ma kształt „ rozeta"). Jeśli macicę trudno zobaczyć, można ją najpierw przechowywać przez pewien czas w 50% roztworze gliceryny, po czym wyraźnie widać nawet puste pnie macicy. Przy identyfikacji tych tasiemców na podstawie budowy oderwanych główek należy je ostrożnie umieścić wraz z szyjką w kropli gliceryny pomiędzy szkiełkami (lub przykryć szkiełkiem nakrywkowym) i bez ściskania badać pod mikroskopem przy małym powiększeniu.

Metody mikroskopowe dzielą się na proste, złożone i specjalne.

Do prostych należą metody rozmazu natywnego, rozmazu natywnego roztworem Lugola, metody rozmazu grubego pod celofanem według Kato, skręcanie (według Shulmana) i skrobanie okołoodbytowe.

Metody złożone są bardziej skuteczne i opierają się na zawartości jaj w preparatach. Polegają na wstępnej obróbce kału płynnymi odczynnikami, w wyniku czego jaja robaków albo wytrącają się, albo unoszą na powierzchnię cieczy.

DO złożone metody metody wzbogacania obejmują:

a) flotacja (kiedy ciężar właściwy jaj jest mniejszy niż ciężar właściwy roztworu soli i jaja unoszą się w warstwie powierzchniowej);

b) sedymentacja (kiedy ciężar właściwy jaj jest większy od ciężaru właściwego roztworów soli i jaja osiadają w osadzie).

Specjalnymi metodami wykrywania jaj i larw robaków, cyst i form wegetatywnych pierwotniaków są metody zeskrobywania, flotacji, sedymentacji, larwoskopii, protozooskopii, badania żółci oraz metody barwienia rozmazów kału, plwociny itp.

Pobieranie próbek i konserwacja

Do badań kał pobiera się z różnych miejsc w porcjach po 50 g i przesyła do laboratorium w czystym szklanym lub plastikowym pojemniku ze szczelną pokrywką. Badany jest świeży kał (nie starszy niż jeden dzień), a w niektórych przypadkach (przy badaniu na węgorczycę) natychmiast po wypróżnieniu. Zaproponowano szereg środków konserwujących kał zawierających jaja robaków: 4-10% roztwór formaliny, który należy podgrzać do temperatury 50-60°, aby zapobiec rozwojowi jaj tęgoryjców; mieszanina 0,2% wodnego roztworu azotanu sodu (1900 ml), roztworu Lugola (5 g jodu, 10 g jodku potasu, 250 ml wody), formaliny (300 ml) i gliceryny (25 ml), w której zakonserwowane są jaja robaków pasożytniczych 6-8 miesięcy; mieszanina gliceryny (5 ml), formaliny (5 ml) i wody (100 ml); roztwory 1-1,5% detergentów „Lotos”, „Extra”, „Barf”, „Tide” itp. (w stosunku wagowym kału i roztworu detergentu 1: 5); mieszanina mertiolanu 1:1000 (200 ml), formaliny (25 ml), gliceryny (5 ml), wody destylowanej (250 ml) z dodatkiem 0,6 ml roztworu Lugola (w ilości 1 g kału na 10 ml mieszaniny).

Do diagnozowania robaków stosuje się metody makro- i mikrohelmintoskopowe do badania kału.

Badania makrohelmintoskopowe

Metoda osadzania

Dzienną porcję kału dokładnie miesza się z 5-10-krotną ilością wody, wlewa do wysokich szklanych cylindrów (słoików, wiader) i pozostawia do całkowitego opadnięcia zawieszonych cząstek. Górną mętną warstwę ostrożnie odsącza się i na wierzch dodaje się czystą wodę (powtórzyć tę czynność kilka razy, aż woda znad osadu stanie się klarowna). Po odsączeniu wierzchniej warstwy osad przenieść do kuwety lub szalki Petriego i obejrzeć (na ciemnym tle) pod lupą lub gołym okiem.

Metoda przesiewowa

Odchody zmieszane z wodą umieszczane są na górnym sicie urządzenia, składającego się z układu sit z otworami o zmniejszającej się średnicy, urządzenie podłącza się do sieci wodociągowej i po otwarciu kranu z wodą następuje jego umycie, a przepływająca woda ciecz jest spuszczana do kanalizacji. Duże robaki pozostają na górnym sicie, natomiast mniejsze na dolnym. Sita odwraca się i po przepłukaniu zawartości do ciemnych kuwet ogląda się je gołym okiem lub pod lupą.

Badania mikrohelmintoskopowe

Przeprowadza się w celu wykrycia jaj (metody robaków-owoskopowych - kolor. Ryc. 1) lub larw robaków (metody robaków-owoskopowych).

Metody helmintoowoskopowe

Metody jakościowe bez wzbogacania

Rodzimy rozmaz. Niewielką ilość kału rozciera się na szklanym szkiełku w kropli 50% roztworu gliceryny lub przegotowanej wody. Duże cząstki ostrożnie usuwa się, mieszaninę przykrywa szkiełkiem nakrywkowym i bada pod mikroskopem (bada się dwa rozmazy). Wygodniej i łatwiej jest przygotować długie rozmazy pomiędzy dwoma szkiełkami. Rozmaz natywny stosuje się jedynie jako dodatek do metod wzbogacania, ponieważ nie jest wystarczająco skuteczny, szczególnie w przypadku słabych inwazji.

Gruby rozmaz celofanem według Kato(K. Kato, 1954) jest bardzo skuteczna metoda badania. Kawałki hydrofilowego celofanu (o wymiarach 4x2 cm) moczy się przez 24 godziny w mieszaninie gliceryny (50 ml), 6% roztworu fenolu (500 ml) i 3% wodnego roztworu (6 ml) zielonego malachitu (ten ostatni jest opcjonalnie ). OK. 100 mg kału rozmazuje się na szkiełku i przykrywa kawałkiem wilgotnego celofanu, dociska gumowym korkiem nr 5. Preparat bada się po 30-60 minutach, gdy lekko zaschnie i stanie się przezroczysty, jako w wyniku czego jaja robaków są łatwe do wykrycia pod mikroskopem o małym powiększeniu.

Metody jakościowe ze wzbogacaniem (metody pływające i osadnicze)

Pierwsze opierają się na zastosowaniu nasyconych roztworów różnych substancji chemicznych. substancje, w których jaja unoszą się na skutek różnic w ciężarze właściwym.

Metoda Kofoida-Barbera(Ch.A. Kofoid, M.A. Barber) zmodyfikowany przez Fulleborna (F. Fulleborn, 1920). OK. 5 g kału w wysokim i wąskim słoju (objętość 100 ml) miesza się drewnianym patyczkiem ze 100 ml nasyconego roztworu sól kuchenna, pokonać jego waga wynosi 1,18 (400 g soli rozpuszcza się przez gotowanie w 1 litrze wody). Duże cząstki wypływające na powierzchnię można szybko usunąć za pomocą patyka lub kartki papieru. Po osadzeniu mieszaniny na 45-90 minut. Za pomocą drucianej pętelki (o średnicy 0,8–1 cm) usuń całą warstwę powierzchniową i przenieś ją na szkiełko. Podczas badania jaj tęgoryjców mieszaninę pozostawia się na 10–15 minut. Folię można usunąć bezpośrednio za pomocą szkiełka, przykryć słoik tak, aby miał kontakt z płynem (na brzegi słoika dodaje się nasycony roztwór soli). Po osiadaniu szkiełko wyjmuje się, szybko odwraca i film z przylegającymi do niego jajami robaków ogląda się pod mikroskopem (bez szkiełka nakrywkowego). Metoda ta jest dobra w identyfikacji jaj wszystkich nicieni i tasiemców karłowatych. Ciężkie jaja przywry; Większość tasiemców i niezapłodnionych glisty pływa słabo, dlatego bada się również osad. W tym celu po usunięciu folii należy szybko spuścić płyn ze słoja i za pomocą ezy lub pipety pobrać z osadu kilka kropli, przenieść na szkiełko, dodać kroplę gliceryny w celu klaryfikacji i zbadać pod mikroskop.

Metoda E. V. Kalantaryana(1938) Jest skuteczniejszą modyfikacją metody Fulleborna. W nim roztwór soli kuchennej zastępuje się nasyconym roztworem azotanu sodu, sp. waga wynosi 1,39 (jedna objętość azotanu sodu rozpuszcza się w równej objętości wody po ugotowaniu), folię usuwa się po 20-30 minutach.

Stosowane są także metody Fausta (E. S. Faust, 1939), Brudastova i in. (1970) i ​​innych.

Do odkładania jaj robaków pasożytniczych używa się środków chemicznych. substancje rozpuszczające tłuszcze i białka w kale.

Metoda Telemanna (W. Telemann, 1908) zmodyfikowana przez Miyagawę (Y. Miyagawa, 1913). OK. 5 g kału rozciera się w moździerzu lub słoiku, dodając 5 ml eteru etylowego i 50% roztworu soli; mieszaninę przesącza się przez sito druciane lub włosowe do probówki i odwirowuje. W probówce tworzą się 3 warstwy: u góry - eter z rozpuszczonym tłuszczem, poniżej - kwas solny z rozpuszczonymi substancjami białkowymi, w osadzie - nierozpuszczalne części kału i jaja robaków. Górne warstwy odsącza się, do osadu dodaje się wodę i odwirowuje. Kilka kropli osadu przenosi się na szkiełko i bada pod mikroskopem. Ta metoda pozwala wykryć jaja wszystkich typów robaków, ale czasami są one zdeformowane.

Metoda Ritchiego (LS Kitchie, 1948). Formaldehyd i eter służą do rozpuszczania tłuszczów i białek.

Do wytrącenia jaj robaków pasożytniczych można zastosować różne detergenty. Metoda filtracji w specjalnych urządzeniach Bell stała się powszechna za granicą, która służy do badania nie tylko kału, ale także moczu, krwi itp.

Istnieje wiele metod łączących zasady flotacji i sedymentacji jaj. Należą do nich metody S. A. Lane’a, D. Rivasa, Gorkiny i S. T. Darlinga. Jedną z tych metod flotacyjno-sedymentacyjnych, a także metodę kolejnych drenów, zaproponował N.V. Demidov (1963, 1965) do badań nad fascioliazą i dikroceliozą.

Metody ilościowe

Metoda Stolla(NR Stoll, 1926). Do szerokiej probówki lub kolby miarowej (z dwoma oznaczeniami: 56 i 60 ml) wlewa się dziesięcionormalny roztwór wodorotlenku sodu do pierwszej kreski, dodaje kał do poziomu drugiej kreski, dokładnie miesza szklaną laską i, umieszczając 10 szklanych koralików lub małych kamyczków, zatkaj i potrząsaj przez 1 minutę. Szybko, aby zawiesina nie osiadła, pobrać pipetą z podziałką 0,075 ml mieszaniny (0,005 g kału), przenieść na szkiełko z nałożoną kratką, przykryć szkiełkiem nakrywkowym i policzyć jaja robaków w preparacie pod mikroskopem; Mnożąc uzyskaną liczbę przez 200, uzyskuje się liczbę jaj w 1 g kału. Aby uzyskać dokładniejszy wynik, policz jaja w dwóch lub więcej preparatach i weź średnią. Metoda Stolla jest niewrażliwa na łagodne inwazje. Dlatego zaleca się liczenie ilości jaj w przygotowywanych przetworach różne metody flotacja lub sedymentacja, pod warunkiem stałego używania równej porcji odchodów i naczyń o tej samej objętości. Stosuje się również gruby rozmaz Kato.

Metoda bobrowa(RS Beaver, 1950). Przygotowuje się standardowy rozmaz, którego grubość określa się za pomocą elektrofotometru, a następnie liczy się wszystkie znajdujące się w nim jaja robaków.

Metody helmintolarwoskopowe

Metoda Behrmanna(G. Baermann, 1917). 5-10 g świeżo wydalonego kału umieszcza się na metalowej siatce w szklanym lejku z gumową rurką zakończoną zaciskiem na wąskim końcu. Aby uniknąć zanieczyszczenia osadu cząstkami kału, zaleca się ułożyć papier (na siatce) lub dodać do kału węgiel zwierzęcy lub mąkę kukurydzianą. Lejek napełnia się ciepłą wodą (t° 45-50°) do momentu zetknięcia się z kałem. Z powodu termotropizmu larwy aktywnie się przemieszczają ciepła woda i stopniowo gromadzić się w dolnej części lejka, nad zaciskiem. Po 3-4 godzinach otwiera się zacisk, ciecz przelewa się do 1-2 probówek, odwirowuje przez 2-3 minuty, górną warstwę odsącza, a osad bada na szkiełku mikroskopowym.

Metoda identyfikacji miracidii schistosomów. Kał przemywa się w ciemności w temperaturze 8-10°, osad utrzymuje się przez 45 minut. w jasnym świetle w temperaturze t° 28°, następnie przelać do ciemnej kolby ze słomką z boku. Miracidia są skoncentrowane w przezroczystej bocznej probówce, skąd można je wybrać.

Do identyfikacji larw tęgoryjców stosuje się także metody Fulleborna i in.

Metody badania innych wydzielin oraz tkanek i narządów

OK. 100 ml moczu testowego pozostawia się na 30 minut. w cylindrze i po usunięciu wierzchniej warstwy wlać do probówki 10-15 ml osadu, odwirować przy 1500 obr/min przez 1-2 minuty; osad jest badany. Wskazane jest zebranie całej dziennej porcji moczu.

Schistosomatozę układu moczowo-płciowego rozpoznaje się na podstawie miracidii. Porcję świeżego moczu odwirowuje się przez 5 minut, osad przelewa się do pomalowanej na czarno kolby z przylutowaną do góry przezroczystą szklaną rurką. Dodać wodę w proporcjach 1:5, 1:10 i umieścić w termostacie na 25-30°C na 2 godziny. Miracidia wyłaniające się z jaj są widoczne gołym okiem przez przezroczystą rurkę w postaci szybko poruszających się kropek. W przypadku przewlekłej postaci schistosomatozy pacjenci uwalniają krew pod koniec oddawania moczu, ale jaja rzadko znajdują się w moczu, dlatego zaleca się wykonanie biopsji pęcherza moczowego.

Badanie plwociny. W plwocinie mogą znajdować się jaja paragonimusów, schistosomów, tominksów, larw migrujących nicieni i fragmenty pęcherza echinokokowego. Całą dostarczoną porcję plwociny dokładnie ogląda się gołym okiem lub pod lupą, selekcjonuje i bada wszystkie widoczne skrawki tkanek, rdzawe narośla itp.; następnie zeskanuj całą część za pomocą rozmazów. Ropna plwocina wlać równą ilość 0,5% żrącego roztworu alkalicznego, odwirować i zbadać osad.

W niektórych robakach obserwuje się plwocinę charakterystyczne zmiany. Na przykład w przypadku paragonimozy w plwocinie można znaleźć nagromadzenie jaj w postaci żółtawych grudek, a także dużą ilość śluzu, leukocytów, czerwonych krwinek, komórek pęcherzykowych, spirali Kurschmanna, włókien elastycznych, kryształów Charcota-Leydena . Odkryto także charakterystyczne kryształy w kształcie rombu o spiczastych końcach. Dostępność duża liczba eozynofilów pozwala na odróżnienie paragonimozy od gruźlicy.

Badanie zawartości ropni i punktów. W ropna wydzielina ropnie, a także w guzach i cystach usuniętych podczas operacji, można znaleźć robaki, ich fragmenty, larwy i jaja (echinococcus, alveococcus, sparganum, cysticercus, dirofilaria, glisty, toxocara, paragonimus itp.). Technika badawcza jest typowa; w niektórych przypadkach z tkanki nowotworowej przygotowuje się skrawki histologiczne. Treść ropną można leczyć metodą Telemanna; Klarowną ciecz bada się w taki sam sposób jak zawartość dwunastnicy, dodając eter siarkowy. Płyn z echinokokami odwirowuje się, a osad bada na obecność skoleksów i haczyków; Preparaty barwiono karbolfuksyną według Ziehl-Neelsena.

Badanie krwi. We krwi stwierdza się mikrofilarie i larwy migrujących nicieni. Z palca lub płatka ucha pobiera się kroplę krwi i bada na świeżo lub przygotowuje się z niej preparaty.

Kroplę krwi umieszcza się na szkiełku, na które nałożony jest kwadrat wazeliny i lekko dociska się szkiełkiem nakrywkowym. Pod mikroskopem widoczne są mikrofilarie przemieszczające się pomiędzy komórkami krwi. Krew można umieścić pomiędzy dwiema warstwami samoprzylepnej taśmy celulozowej; mikrofilarie pozostają ruchliwe przez 6 godzin; w całkowicie wysuszonym preparacie można je rozróżnić pod mikroskopem w ciągu 30 dni. Gatunki mikrofilarii można zidentyfikować jedynie w zabarwionych rozmazach lub gęstych kroplach. Przygotowane preparaty suszy się, hemolizuje i barwi według metody Romanovsky'ego - Giemsy, Wrighta, Ziehl-Neelsena, Leishmana, Papanicolaou (patrz metoda barwienia Wrighta, metoda Romanovsky'ego-Giemsy, metoda Ziehl-Neelsena). Po wykryciu mikrofilarii w kropli krwi barwionej metodą Romanovsky-Giemsy preparat dodatkowo barwi się hematoksyliną Hansena; za 15-60 minut. myć przez 2 minuty. w bieżącej wodzie. Odbarwiony preparat różnicuje się w 0,2% roztworze soli; Powłoka mikrofilarii jest pomalowana na bladofioletowy kolor, a substancja jądrowa ciała jest ciemnofioletowa.

W przypadku łagodnych inwazji należy zbadać 2-10 kawałków krwi za pomocą antykoagulantu (na przykład 5% roztworu cytrynianu sodowego) przy użyciu jednej z następujących metod.

Metoda Knotta (J. Knott, 1939), zmodyfikowana przez Markella i Voge (E.K. Markell, M. Voge, 1965). 2 ml krwi miesza się w probówce wirówkowej z 10 częściami 1% kwasu octowego i odwirowuje przez 2 minuty. przy 1500 obr./min; warstwa powierzchniowa odsączono, osad rozdzielono na kilka szkiełek i zbadano pod mikroskopem. Preparaty można barwić metodą Romanovsky-Giemsa lub innymi metodami.

Metoda filtrowania Bella (DR Bell, 1967). W aparacie składającym się z lejka ze stali nierdzewnej z prostokątnym otworem i filtrów membranowych o tym samym kształcie, o wymiarach 19 x 42 mm i wielkości porów od 0,8 do 5 µm, krew hemolizowana jest w mieszaninie 1 ml detergentu tipol i 9 ml roztworu fiziolu (w celu przyspieszenia filtracji urządzenie podłącza się do pompy próżniowej). Filtr umieszcza się we wrzącej wodzie destylowanej i barwi gorącą hematoksyliną Romanowskiego-Giemsy lub Ehrlicha. Kolorowy filtr suszy się w eksykatorze lub w alkoholu izopropylowym (kolejno w 3 filiżankach), oczyszcza na szkle z olejkiem immersyjnym i ogląda pod szkiełkiem nakrywkowym. Preparaty kolorowe utrzymują się kilka tygodni. Metoda Bella jest najskuteczniejsza w ilościowym oznaczaniu mikrofilarii we krwi.

Stosowana jest również metoda poliwidonu Goldsmid.

Badanie skóry. W skórze można znaleźć mikrofilarie onchocerci i larwy robaków zwierzęcych, które powodują postać skórna larwy wędrujące(cm.). Z mięśnia uda, łydki, pośladka lub mięśnia naramiennego pobiera się skrawki skóry lub materiał uzyskany w procesie skaryfikacji. Stożkowy fragment naskórka unosi się za pomocą szpilki entomologicznej i odcina brzytwą i ogląda na szkle w kropli roztworu fizolu. Na wynik negatywnyświeży preparat jest ponownie badany po 10 minutach; Larwy są zwykle zlokalizowane na brzegach preparatu. Powstały materiał można przechowywać w 2 ml roztworu fiziolu przez 1-2 godziny. i zbadaj osad. Zaleca się pobranie od pacjenta 5 wycinków skóry.

Preparaty można także przygotować z krwi i płynu tkankowego uwolnionego po silnym ucisku skrawków. Krople barwi się hematoksyliną Mayera, Romanovsky-Giemsa lub Delafielda.

Standardowa metoda ilościowego określania inwazji. Biopsja obszaru skóry śr. 3-5 mm i masie co najmniej 1-4 mg, zważyć, pokroić na małe kawałki i policzyć larwy pod mikroskopem w fizolu. roztwór na szkiełku; 1-4 larwy w polu widzenia są oznaczone znakiem +, 5-9 larw znakiem ++, 10-19 larwami +++, 20 i więcej larwami znakiem +++ +. Wygodniej jest przeprowadzać obliczenia ilościowe na preparatach kolorowych.

Badanie na włośnicę, wągrzycę i schistosomatozę

Wykrywanie larw Trichinella

Metoda kompresji. Kawałek dwugłowego lub mięsień łydki(w pobliżu ścięgna), pobrany chirurgicznie z zachowaniem aseptyki, dzieli się na osobne, cienkie włókna za pomocą igieł preparujących, wyciskanych pomiędzy dwoma szkiełkami w kropli gliceryny, dzięki czemu preparat jest cienki i przezroczysty. Pod mikroskopem o ciemnym polu widzenia wyraźnie widać larwy włosienia. Skuteczne jest badanie kilku fragmentów mięśni w kompresorach stosowanych w weterynarii. praktyki, zwłaszcza w specjalnych trichinelloskopach.

Metoda trawienia Bechmana(GW Bachman, 1928). 1 i rozdrobnione mięśnie zalewa się 60 ml sztucznego soku żołądkowego (0,5 g pepsyny; 0,7 ml stężonego kwasu solnego; 100 ml wody) i pozostawia na 18 godzin. w termostacie w temperaturze 37°; górną warstwę cieczy odsącza się, do osadu dodaje ciepłą wodę (t° 37-45°) i wlewa do aparatu Behrmanna. Po godzinie płyn spuszcza się do probówki, odwirowuje i bada osad. Jeśli larwy są zamknięte w zwapnionych kapsułkach, należy je najpierw odwapnić w roztworze kwasu solnego, azotu lub siarki.

Test biologiczny. Kawałki badanych mięśni karmi się białymi myszami lub szczurami. Po 2-3 dniach w treści dwunastnicy można znaleźć dojrzałą płciowo włośnicę, a po 2-3 tygodniach w mięśniach przepony i języka można znaleźć larwy.

Sekcje histologiczne. Kawałki mięśni utrwala się w płynie Bouina, Zenkera lub innym płynie; w zwykły sposób Skrawki przygotowywano na mikrotomie i barwiono hematoksyliną Delafielda.

Wykrywanie cysticerów

Kawałek wytępionego mięśnia, tkanki łącznej itp. Bada się gołym okiem, ostrożnie izoluje wągrzyka - białawy półprzezroczysty pęcherzyk o wielkości 1-2 cm, rozgniatany pomiędzy dwoma szkiełkami w kropli gliceryny i badany pod mikroskopem . Aby określić żywotność cysticerci wyizolowanych z tkanek, trzyma się je w 50% roztworze żółci w celu uzyskania fizjolu. roztwór w termostacie w temperaturze t° 37°; za 10-60 minut. głowa żywotnego wągrzyka odwraca się na zewnątrz. Zwapnione wągrzyki wstępnie odwapnia się 4% roztworem kwasu azotowego przez godzinę.

Wykrywanie jaj schistosomów

W przypadku postaci schistosomatozy, gdy powstawanie ziarniniaków uniemożliwia uwolnienie jaj z tkanek do światła jelita lub do dróg moczowych, stosuje się biopsję błony śluzowej odbytnicy, którą wykonuje się specjalną łyżką przy użyciu rektoskopu, wybranie obszaru z widoczną zmianą. Pobrany fragment rozgniata się pomiędzy dwoma szkiełkami i bada pod mikroskopem. Jeżeli wynik jest negatywny, kawałki klaruje się w 4% roztworze żrącej zasady i przygotowuje się z nich histol. plasterki. Biopsję błony śluzowej jelita czczego wykonuje się drogą doustną, a uzyskany materiał bada się metodą kompresyjną lub przygotowuje się z niego skrawki histolowe. W niektórych przypadkach schistosomatozy układu moczowo-płciowego rozpoznanie można postawić jedynie na podstawie biopsji endoskopowej. W wątrobowej postaci schistosomatozy wykonuje się biopsję nakłuciową wątroby; Z powstałego materiału przygotowuje się histol i skrawki i bada je pod mikroskopem fluorescencyjnym. Mikroskop fluorescencyjny z ciemnym polem jest również używany do badania tkanki wątroby pod kątem jaj schistosomów. Jeżeli schistosomy zaatakują żeńskie drogi rodne, wydzielinę pobiera się za pomocą wziernika pochwy lub pobiera się fragmenty błony śluzowej szyjki macicy ostrą łyżką; powstały materiał bada się pod mikroskopem na szkle w kropli roztworu fiziolu.

Badanie na enterobiozę i taeniozę

Skrobanie odbytu (zaleca się stosować wieczorem, 1 – 1,5 godziny po pójściu pacjenta spać lub rano przed skorzystaniem z toalety). Za pomocą zapałki, przeciętej ukośnie i zwilżonej w kropli płynu (fizylu, roztworu, przegotowanej wody lub 2% roztworu sody oczyszczonej), nałożonej na szkiełko, starannie to robię? skrobanie z błony śluzowej odbytu i fałd wokół niego (od środka na zewnątrz). Śluz zebrany pod koniec zapałki zdrapuje się krawędzią szkiełka nakrywkowego do kropli płynu na szkiełku i przykryty tym samym szkiełkiem nakrywkowym poddaje się badaniu. Podczas badań masowych, gdy pobierane są zeskrobiny w placówkach dziecięcych lub innych, zużytą zapałkę umieszcza się w kropli płynu na szkiełku, a po wyschnięciu kropli przykrywa się ją drugim szkiełkiem i dostarcza się zawiniętą do laboratorium papierem i zabezpieczoną elastyczną taśmą. Do badania śluzu odbytnicy używają specjalnego urządzenia - rurki Szachmatowa lub Ziemanna, za pomocą którego pobierają śluz z odbytnicy i badają rozmazy pod mikroskopem.

Metoda wacika. Pacjenci otrzymują probówkę z wacikiem na szklanym lub drewnianym patyczku, którą mogą zabrać do domu; rano pacjent przeciera fałdy okołoodbytowe zwilżonym wacikiem gotowana woda i umieszcza go w probówce z niewielką ilością wody. W laboratorium wymazy płucze się w tej samej probówce nową porcją wody, a osad bada się po odwirowaniu.

Metoda celofanowa Halla (M. S. Hall, 1937). Kwadratowy kawałek celofanu zamocowany jest elastyczną opaską na szklanym pręcie. Zeskrobanie wykonuje się suchym celofanem i umieszcza w probówce. W laboratorium celofan lekko odsuwa się od sztyftu i po odcięciu nożyczkami jego końcówki prostuje się na szkiełku; zwilżone dziesięcionormalnym roztworem wodorotlenku sodu, przykryte szkiełkiem nakrywkowym i zbadane pod mikroskopem.

Metoda taśmy celulozowej Grahama (S. F. Graham, 1941). Pasek taśmy celulozowej dociska się stroną klejącą do fałdów okołoodbytowych pacjenta, następnie tą samą stroną do szkiełka szkiełkowego i ogląda bez szkiełka nakrywkowego; Można dodać kroplę toluenu. V. V. Kaledin (1972) zaproponował w tym celu zastosowanie krążków celuloidowych wyciętych z przemytej błony rentgenowskiej i zwilżonych gliceryną; krążki ogląda się na szkiełku w kropli kleju silikatowego. Metodę taśmy celulozowej można także wykorzystać do badania bielizny dziecięcej.

Skrobanie podpaznokciowe. Brzegi paznokcia, łożysko paznokcia i przestrzenie podpaznokciowe zwilża się 0,5-1% roztworem żrącej zasady i przeciera wilgotnymi wacikami. Wymazy umieszcza się w probówkach wirówkowych z tym samym roztworem, odwirowuje i bada osad.

Metody badania obiektów środowisko dla jaj i larw robaków (badania sanitarne i helmintologiczne)

Prowadzone są badania mające na celu określenie stopnia skażenia obiektów jajami i larwami robaków otoczenie zewnętrzne. Uzyskane dane służą ocenie godności. kondycja instytucji i przedsiębiorstw oraz skuteczność działań podejmowanych w celu zwalczania robaczycy.

Badając stopień skażenia różnych obiektów środowiska jajami i larwami robaków oraz oceniając ich rolę w epidemiologii infekcji robakami pasożytniczymi, ważne jest ustalenie nie tylko liczby znalezionych jaj, ale także ich żywotności i inwazyjności, które określa się : a) wyglądem pod mikroskopem; b) barwienie różnymi barwnikami, w tym fluorescencyjnymi; z reguły żywe jaja i larwy nie są malowane; c) hodowlę w optymalnych warunkach aż do etapu inwazyjnego; d) zakażenie zwierząt laboratoryjnych (test biologiczny).

Studia wodno-kanalizacyjne. Do jednego badania należy zużyć 10-25 litrów wody (rzeki, morza, stawy, baseny, wodociągi) i 1-2-5 litrów ścieków.

Metoda 3. G. Wasilkowa (1941). Wodę lub ścieki filtruje się przez ultrafiltry membranowe w aparacie Goldmanna składającym się ze szklanego lub metalowego lejka z filtrami połączonymi za pomocą pierścienia z kolbą Bunsena. Aby przyspieszyć proces filtracji, do urządzenia podłączona jest pompa próżniowa. Po filtracji filtry membranowe bada się pod mikroskopem, oczyszcza 50% roztworem gliceryny; nagromadzony osad jest oczyszczany i badany oddzielnie w postaci rozmazów. Stosowane są również urządzenia filtrujące innych konstrukcji.

Metoda G. Sh. Gudzhabidze i G. A. Yudina (1963) do badania płynu kanalizacyjnego. 1 litr płynu pozostawia się na 2 godziny w cylindrze Lisenki; powstały osad (5-9 ml) poddaje się obróbce jak przy badaniu gleby (patrz poniżej).

Metoda N. A. Romanenko (1967). Do 1 litra cieczy odpadowej umieszczonej w cylindrze szklanym o pojemności 1200-1500 ml dodać 0,4-0,6 g siarczanu glinu lub chlorku żelaza (w celu koagulacji, przyspieszającego proces sedymentacji zawieszonych cząstek) i po 40 minuty. mieszaninę wirowano przez 3 minuty. przy 1000 obr./min; wierzchnią warstwę odsącza się i w celu rozpuszczenia płatków dodaje się 1-2 ml 3% roztworu kwasu solnego, następnie 150 ml nasyconego roztworu azotanu sodu. Osad bada się jak glebę.

Badania gleby

Określa się zanieczyszczenie gleby jajami robaków w celu identyfikacji ognisk robaków pasożytniczych i oceny efektywności prac nad ich zwalczaniem.

Metoda 3. G. Vasilkova i V. A. Gefter (1948). W probówkach (poj. 100 ml) wykonanych ze stali nierdzewnej lub mosiądzu 12,5 g gleby miesza się z 20 ml 5% roztworu żrącej zasady, dodając 10 kulek szklanych lub drobnych kamyków. Probówki zamyka się gumowymi korkami i wytrząsa przez 20 minut. w wytrząsarce lub ręcznie. Po usunięciu zatyczek probówki wiruje się przez 3-5 minut, ciecz powierzchniową odsącza się, do osadu dodaje 60-80 ml nasyconego roztworu azotanu sodu i po dokładnym wymieszaniu ponownie odwirowuje przez 3-5 minut. Tę warstwę powierzchniową z pływającymi jajami usuwa się dotykając powierzchni mieszanki złożoną pętlą (5-6 pętli połączonych na wspólnym pręcie) i przenosi do szklanki wody; wymieszać z tym samym roztworem, odwirować; Całą procedurę powtarza się co najmniej 3 razy. Zawartość kubka, do którego przenosi się folię, rozcieńcza się wodą i filtruje przez filtry membranowe, które bada się pod mikroskopem w kropli gliceryny.

Metoda 3. G. Vasilkova i V. A. Gefter w modyfikacji A. A. Namitokowa (1961) różni się od metody głównej tym, że zamiast badania preparatów filmowych wykorzystuje się połowę zawartości probówki (za każdym razem dodając nową porcję nasycony roztwór azotanu sodu), przefiltrować i zbadać filtry.

N. A. Romanenko (1968) zaleca badanie próbek gleby i osadów ściekowych pod kątem jaj robaków pasożytniczych za pomocą aparatu zaproponowanego przez G. Sh. Gudzhabidze. 50 g gleby dokładnie miesza się przez 1 minutę. w 150 ml wody w probówkach wirówkowych (pojemność 250 ml) ze specjalnymi ostrzami napędzanymi silnikiem elektrycznym. Mieszaninę wiruje się przez 3 minuty. przy 1000 obr/min odlać wodę i dodać 150 ml nasyconego roztworu azotanu sodu, wymieszać i ponownie wirować przez 3 minuty. Probówki z próbkami umieszcza się w stojaku, dodaje się roztwór azotanu sodu aż do powstania wypukłego menisku, przykrywa szkiełkami (10 x 6 cm) i pozostawia na 10-15 minut, po czym szkiełka wyjmuje się i bada; procedurę powtarza się co najmniej 4 razy.

Badania larw robaków pasożytniczych metodą Behrmanna (1917). 200-400 g gleby umieszcza się w kawałku gazy na metalowej siatce (z otworami o średnicy 1-2 mm) umieszczonej na szerokiej części szklanego lejka zamontowanego na statywie. Na wąski koniec lejka naciąga się gumową rurkę z zaciskiem. Lejek napełnia się ciepłą (t° 50°) wodą tak, aby dolna część siatki z ziemią miała kontakt z wodą. Z powodu termotropizmu larwy aktywnie wpełzają do ciepłej wody i osiadając, gromadzą się w dolnej części gumowej rurki nad zaciskiem. Po 3-4 godzinach 50 ml zawartości przelewa się z lejka do probówki, odwirowuje i bada osad.

Badania warzyw, owoców i jagód

Badają głównie warzywa, jagody i owoce spożywane bez nich obróbka cieplna. Metoda 3. G. Wasilkowa (1948). 5-10 sztuk warzyw lub owoców (ok. 0,5 kg) lub 100-200 g warzyw (sałata, cebula) zalewamy wodą na kilka godzin w szklanych słoikach z szeroką szyjką i zmielonymi korkami i wytrząsamy przez 10-20 minut . w wytrząsarce lub ręcznie. Woda jest spuszczana, badane obiekty są płukane czysta woda a cała woda płucząca jest filtrowana w aparacie Goldmanna; Filtry bada się oczyszczając je gliceryną. Filtry można zabarwić 25% roztworem Lugola w glicerynie; w tym przypadku jaja robaków są zabarwione brązowy kolor i łatwo je rozpoznać wśród zabarwionych ziaren skrobi Kolor niebieski. Duże osady traktuje się jak glebę.

Badanie wymywania z przedmiotów gospodarstwa domowego i rąk. Pędzel do kleju (lub wacik owinięty kawałkiem nylonowej tkaniny) nasączony 2% roztworem sody oczyszczonej wielokrotnie przesuwa się po badanym przedmiocie lub dłoniach, a następnie płucze tym samym roztworem wlewanym do probówki. W laboratorium pędzle i waciki płucze się czystą wodą; Całą wodę płuczącą odwirowuje się i bada osad.

Metoda V. A. Geftera (1960). Bardziej efektywne jest zbieranie kurzu z miękkiego sprzętu za pomocą odkurzacza podłączonego do lejka; krawędzie składają się z 2 odłączanych części: na powierzchni dolnej części umieszczony jest filtr membranowy, pokryty metalową lub plastikową siatką i wzmocniony. zakładając to Górna część lejki. Zmontowany lejek łączymy z wężem odkurzacza za pomocą gumowej rurki. Kurz jest zbierany z obiektu przez 3 minuty, po czym filtr jest usuwany i wymieniany na nowy. W laboratorium filtry są badane pod mikroskopem, oczyszczane gliceryną. Jeśli warstwa kurzu na filtrze jest duża, należy ją zeskrobać i obejrzeć w postaci smug lub potraktować jak ziemię.

Immunologiczne metody diagnostyki

Możliwość zastosowania immunolu. Metody diagnozowania robaczycy wynikają ze zdolności robaków do wytwarzania aktywnych antygenów, które wpływają na immunokompetentne komórki żywiciela i stymulują produkcję przeciwciał. Najskuteczniejsze metody immunodiagnostyczne stosuje się w przypadku robaczycy jelitowej, gdy wydzieliny i wydaliny robaków, które mają działanie antygenowe, przedostają się bezpośrednio do krwi żywiciela. Reakcje immunologiczne wykorzystuje się w diagnostyce glistnicy, włośnicy, filariozy, schistosomatozy, bąblowicy i pęcherzyków płucnych, wągrzycy, paragonimiozy, zespołu objawów larwy wędrującej (toksokaroza, angiostrongyloza) itp. Stosuje się różne testy serolowe (reakcje wytrącania, reakcje aglutynacji, wiązanie dopełniacza , przeciwciała ) i śródskórne testy alergiczne. Antygeny przygotowuje się z larw i dojrzałych robaków, stosując ekstrakty solne z homogenatów świeżo mrożonych lub liofilizowanych tkanek, a także różne ciecze biologicznie czynne (płyn z pęcherzy echinokokowych, płyn brzuszny glisty itp.). W związku z tym, że robaki mają bardzo złożoną strukturę antygenową, a ich mozaika antygenowa zawiera składniki i indywidualne determinanty, które reagują krzyżowo z innymi typami robaków, bakteriami i antygenami żywiciela, opracowywane są metody oczyszczania ich ze składników niespecyficznych. Przeprowadza się frakcjonowanie różne metody: filtracja żelowa na kolumnach z Sephadexem, chromatografia jonowymienna na DEAE-Sephadex, traktowanie kwasami itp. Antygeny frakcyjne mają zwykle wyższą specyficzność niż całe ekstrakty, ale ich aktywność jest w przybliżeniu taka sama. Metody immunodiagnostyczne znajdują wszystko większe zastosowanie. Reakcje służą nie tylko do najpełniejszej i wczesnej identyfikacji pacjentów, ale także do badania ognisk i badania epidemiologii robaków.

Reakcje serologiczne. Reakcję mikroprecypitacji na żywych larwach wykorzystuje się do diagnozowania nicieni – przedobrazowej fazy glistnicy, tęgoryjca i włośnicy. Reakcja staje się dodatnia 5-10 dni po zakażeniu (glista, tęgoryjca) i utrzymuje się przez 90-100 dni. Antygenem są żywe larwy nicieni wyizolowane z tkanek zwierząt laboratoryjnych zakażonych doświadczalnie. Wyizolowane larwy dokładnie wypłukuje się z białek żywiciela sterylnym fizolem, roztworem i wodą destylowaną, po 10-15 kopii każda. umieszczano za pomocą pipety Pasteura na sterylnym szkiełku ze studzienką. Nanieść 2-3 krople surowicy testowej, przykryć sterylnym szkiełkiem nakrywkowym, umieścić w wilgotnej komorze (szalka Petriego wyłożona zwilżoną bibułą filtracyjną) i pozostawić na 24-48 godzin. w termostacie w temperaturze 37°. Jeśli reakcja jest pozytywna, pod mikroskopem o małym powiększeniu widoczna jest wokół ust i dziury analne larwy są szarawobiałymi, lekko opalizującymi masami kulistych lub zygzakowatych osadów. Wydajność reakcji sięga 85-95%.

Reakcję strącania pierścienia opracował V.P. Pashuk (1957) do diagnozy włośnicy. Reakcja staje się pozytywna po 2-3 tygodniach choroby. Jego skuteczność sięga 80-90%. Antygen to sproszkowany ekstrakt z larw suszonych w temperaturze 35°C, izolowany z mięśni zakażonych zwierząt. W probówkach śr. 0,5 cm, wlać po 0,1 ml każdego rozcieńczenia antygenu i ostrożnie nałożyć (lub opuścić na dno) równą ilość surowicy testowej, tak aby płyny się nie pomieszały. Probówki przechowuje się przez 30 minut. w termostacie w temperaturze 37°, a następnie 30-60 minut. w temperaturze pokojowej. Przy pozytywnej reakcji na styku antygenu i surowicy pojawia się białawy delikatny pierścień, który łatwo rozpada się po wstrząśnięciu.

Reakcję strącania w żelu według Ouchterlony'ego (O. Ouchterlony, 1949) w mikromodyfikacji A. I. Gusiewa i V. S. Tsvetkova zaproponowali I. A. Ginovker, E. A. Zabozlaeva, A. V. Doronin (1970) do diagnostyki wczesnych faz przywr. Według wstępnych danych jego skuteczność wynosi 87%. Antygen jest ekstraktem homogenatu świeżo mrożonego, dojrzałego płciowo opisthorchis wyizolowanego z wątroby kotów.

Opracowano reakcję hemaglutynacji pośredniej (patrz) z diagnostyką - zawiesiną sformalizowanych i tanizowanych erytrocytów owiec, uczulonych płynem echinokokowym

L.N. Stepankovskaya (1972) w diagnostyce bąblowicy i alweokokozy.

RNGA z diagnostyką ze sformalizowanych erytrocytów owiec, uczulonych ekstraktem homogenatu świeżo mrożonych wągrzyc tasiemca wieprzowego, zaproponowała L. M. Konovalova (1973) do diagnostyki wągrzycy mózgowej; jest skuteczny w 85% przypadków.

Do diagnostyki fazy przedimaginalnej glistnicy proponuje się RNGA z ascaris Diagnosticum.

Reakcję wiązania dopełniacza (patrz) przeprowadza się zgodnie ze zwykłą metodą i stosuje się w diagnostyce włośnicy i wągrzycy.

Metoda przeciwciał luminescencyjnych (metoda pośrednia). Metoda ta, wykorzystująca odtłuszczony, suchy homogenat cysticerci tasiemca wieprzowego jako antygen utrwalony na szkiełku, została opracowana przez JI. M. Konovalova (1973) za diagnostykę wągrzycy u ludzi. Tę samą reakcję z histolem, skrawkami larw Trichinella jako antygenem opracowano do diagnozy włośnicy.

E. S. Leikina, V. A. Gefter.

W przypadku wykrycia jaj robaków na różnych obiektach środowiska (gleba, woda, warzywa itp.) zawsze należy określić ich żywotność poprzez wygląd, wybarwienie farbami witalnymi, hodowlę w optymalnych warunkach i wykonanie testu biologicznego, tj.

Żywienie zwierząt laboratoryjnych.

Określanie żywotności jaj lub larw robaków na podstawie wyglądu. Jaja robaków są pod mikroskopem najpierw przy małym, a następnie przy dużym powiększeniu. W zdeformowanych i martwych jajach robaków skorupa jest rozdarta lub wygięta do wewnątrz, plazma jest mętna i poluzowana. W jajach podzielonych na segmenty kulki miażdżące (blastomery) są nierównej wielkości, mają nieregularny kształt i często są przesunięte w jeden biegun. Czasami zdarzają się nieprawidłowe jaja, które pomimo deformacji zewnętrznych rozwijają się normalnie. U żywych larw glisty drobna ziarnistość występuje tylko w środkowej części ciała; w miarę umierania ziarnistość rozprzestrzenia się po całym ciele i pojawiają się duże, błyszczące, szkliste wakuole - tak zwane sznury pereł.

Aby określić żywotność dojrzałych jaj glisty, włosogłówki, owsika, aktywne ruchy larw należy wywołać przez lekkie podgrzanie leku (do temperatury nie przekraczającej 37 ° C). Żywotność larw glisty i włosogłówki wygodniej jest obserwować po ich wyizolowaniu ze skorupki jaja poprzez naciśnięcie szkiełka nakrywkowego preparatu igłą preparacyjną lub pęsetą.

U inwazyjnych larw glisty często widać złuszczanie się osłonki na czubku głowy, a u larw włosogłówki, które zakończyły rozwój w jaju, w dużym powiększeniu można znaleźć w tym miejscu mandryn. U martwych larw robaków, niezależnie od ich lokalizacji (w jaju lub poza nim), obserwuje się rozkład ciała. W której Struktura wewnętrzna Larwa staje się grudkowata lub ziarnista, a ciało staje się mętne i nieprzejrzyste. W ciele znajdują się wakuole, a na skórze znajdują się pęknięcia.

Żywotność onkosfer taeniidowych (tasiemca bydlęcego, wieprzowego itp.) zależy od ruchu zarodków pod wpływem nich enzymy trawienne. Jaja umieszcza się na szkiełku zegarkowym wraz z sokiem żołądkowym psa lub sztucznym sokiem dwunastniczym. Skład tego ostatniego: pankreatyna 0,5 g, wodorowęglan sodu 0,09 g, woda destylowana 5 ml. Szklanki do zegarków z jajami umieszcza się w termostacie w temperaturze 36-38°C na 4 godziny. W tym samym czasie żywe zarodki są uwalniane ze skorupek. Skorupy żywych onkosfer rozpuszczają się również w zakwaszonej pepsynie i w roztwór alkaliczny trypsynę po 6-8 godzinach w termostacie w temperaturze 38°C.

Jeśli umieścisz jaja taeniidów w 1% roztworze siarczku sodu, 20% roztworze podchlorynu sodu lub 1% roztworze wody chlorowanej w temperaturze 36-38°C, dojrzałe i żywe zarodki zostaną uwolnione z błon i nie nie zmieni się w ciągu 1 dnia. Niedojrzałe i martwe onkosfery kurczą się lub pęcznieją i gwałtownie zwiększają, a następnie „rozpuszczają się” w ciągu 10 minut - 2 godzin. Żywe zarodki taeniidów również aktywnie poruszają się w mieszaninie 1% roztworu chlorku sodu, 0,5% roztworu wodorowęglanu sodu i żółci w temperaturze 36-38°C. °C.

Żywotność scolexów echinokoków określa się przy niskim ogrzewaniu. W tym celu umyte w wodzie kapsułki scolexu lub czerwiu umieszcza się w kropli wody na szkiełku z otworem, przykrywa szkiełkiem nakrywkowym i bada pod mikroskopem w fazie ogrzewania w temperaturze 38-39°C. Jeśli nie ma stołu grzewczego, lek jest podgrzewany przy użyciu dowolnego źródła ciepła. W tym samym czasie żywotny scolex aktywnie się porusza, kurcząc lub rozluźniając przyssawki, wydłużając i skracając trąbkę. Jeśli umieścisz scolex na 0,5-1% roztwór wodny filicilen w temperaturze pokojowej, wówczas wszystkie żywotne scolexy szybko wyjdą i umrą. Nieżywotne scolexy nie są wywinięte.

Żywotność Adolescaria fascioli zebranych na roślinach i innych obiektach zbiorników wodnych sprawdza się badając je na szkiełku w roztworze fizjologicznym pod mikroskopem z podgrzewaniem. Kiedy larwy przywr są podgrzewane, zaczynają się poruszać.

Żywotność jaj tasiemca karłowatego zależy od umiejscowienia haczyków na zarodku.

W żywych jajach tasiemca karłowatego występują powolne, wahadłowe ruchy protoplazmy i prawie niezauważalne rozsuwanie się i przesuwanie zaostrzonych końców bocznej pary haczyków na boki od pary środkowej.

Skurcze protoplazmy zarodka i haczyków embrionalnych pomagają zarodkowi uwolnić się najpierw z błon onkosfery, a następnie z zewnętrznej skorupy jaja.

W żywym jaju środkowa para i boczne pary haczyków są ułożone równolegle; w niektórych jajach ostrza par bocznych są blisko siebie i ustawione pod kątem mniejszym niż 45° w stosunku do środkowej pary haczyków.

Umierający zarodek kurczy się konwulsyjnie i ospale rozsuwa haczyki. W martwym zarodku ruch haczyków zatrzymuje się i są one rozmieszczone w sposób nieuporządkowany; czasami haczyki boczne względem sąsiedniej pary są rozsuwane pod kątem prostym, rozwartym lub ostrym.

Czasami obserwuje się marszczenie zarodka i powstawanie granulacji. Bardziej dokładna metoda opiera się na pojawieniu się ruchów onkosfery podczas gwałtownej zmiany temperatury: od 5-10 do 38-40 ° C.

Oznaczanie żywotności niedojrzałych nicieni należy badać w wilgotnej komorze (płytki Petriego), umieszczając jaja glisty w 3% roztworze formaldehydu przygotowanym w izotonicznym roztworze chlorku sodu w temperaturze 24-30°C, jaja włosogłówki w 3 % rozwiązanie kwasu solnego w temperaturze 30-35°C, jaja owsików w izotonicznym roztworze chlorku sodu w temperaturze 37°C. Szalki Petriego należy otwierać 1-3 razy w tygodniu dla lepszego napowietrzenia, a bibułę filtracyjną należy ponownie zwilżyć czystą wodą.

Obserwacje rozwoju jaj robaków pasożytniczych przeprowadza się co najmniej 2 razy w tygodniu. Brak oznak rozwoju w ciągu 2-3 miesięcy wskazuje na ich niezdolność do życia. Oznakami rozwoju jaj robaków są pierwsze etapy kruszenia, dzielące zawartość jaja na osobne blastomery. Pierwszego dnia rozwija się do 16 blastomerów, które przechodzą do drugiego etapu - moruli itp.

Jaja tęgoryjców hoduje się w szklanym cylindrze (wysokość 50 cm i średnica 7 cm) zamkniętym korkiem. Mieszanka równych objętości sterylnego piasku, węgiel drzewny i odchody z jajami tęgoryjców, rozcieńczone wodą do konsystencji półpłynnej, ostrożnie wylewa się na dno cylindra za pomocą szklanej rurki. W ciągu 1-2 dni przebywania w ciemności w temperaturze 25-30 ° C z jaj wykluwają się larwy rabditiform, które po 5-7 dniach stają się filariformami: larwy wspinają się po ściankach cylindra, gdzie są widoczne nawet gołym okiem. Jaja przywr, takich jak opisthorchiids, diphyllobothriids, fasciolae itp., które naturalnie rozwijają się w wodzie, umieszcza się na szkiełku zegarkowym, szalce Petriego lub w innym naczyniu i zalewa niewielką warstwą zwykłej wody. W hodowli jaj Fasciola należy wziąć pod uwagę, że w ciemności rozwijają się one szybciej, natomiast miracidium tworzy się w żywych jajach w temperaturze 22-24°C już po 9-12 dniach. Podczas mikroskopii rozwijających się jaj przywr wyraźnie widać ruchy miracidium. Miracidium fasciola wyłania się ze skorupki jaja tylko pod wpływem światła. Podczas uprawy wodę wymienia się po 2-3 dniach.

Larwy tęgoryjca i węgorzata hoduje się na agarze na szalce Petriego z węglem zwierzęcym. Po 5-6 dniach przebywania w termostacie w temperaturze 26-30°C larwy pełzają po agarze, pozostawiając po sobie ścieżkę bakterii (metoda Fulleborna).

Metoda Harady i Mori (1955). Do probówek umieszczonych na stojaku dodać 7 ml wody destylowanej. Za pomocą drewnianego patyka pobrać 0,5 g kału i rozmazać na bibule filtracyjnej (15X150 mm) w odległości 5 cm od lewej krawędzi (operację tę wykonuje się na kartce papieru w celu zabezpieczenia powierzchni stołu laboratoryjnego). Następnie do probówki wprowadza się pasek z rozmazem tak, aby lewy koniec wolny od rozmazu sięgał dna probówki. Górny koniec pokryty jest kawałkiem celofanu i szczelnie owinięty gumką. Na probówce zapisywany jest numer i nazwisko osoby badanej. W tym stanie probówki przechowuje się przez 8-10 dni w temperaturze 28°C. Aby zbadać kulturę, należy zdjąć osłonę celofanową i usunąć pęsetą pasek bibuły filtracyjnej. Należy zachować przy tym ostrożność, ponieważ niewielka liczba zakaźnych larw może przedostać się na górny koniec bibuły filtracyjnej lub na bok probówki i przedostać się pod powierzchnię celofanu.

Probówki umieszcza się w gorącej łaźni wodnej o temperaturze 50°C na 15 minut, po czym zawartość wstrząsa i szybko przelewa do 15 ml probówki w celu osadzenia larw. Po odwirowaniu supernatant usuwa się, a osad przenosi się na szkiełko, przykrywa szkiełkiem nakrywkowym i bada pod mikroskopem przy małym powiększeniu.

Do diagnostyki różnicowej larw filariform konieczne jest wykorzystanie danych przedstawionych w tabeli. 13.

Metody barwienia jaj i larw robaków. Martwe tkanki w większości przypadków postrzegają farby szybciej niż żywe. Cechy te są wykorzystywane w helmintologii do określenia żywotności jaj i larw robaków. Jednak w niektórych przypadkach niektóre farby są lepiej postrzegane przez żywe tkanki niż przez martwe.

Tabela 13. Diagnostyka różnicowa larwy filarowate A.duodenale, N.americanus, Strongyloides stercoralis, Trichostrongylus spp.

Do różnicowego rozpoznawania żywych i martwych jaj i larw stosuje się następujące farby i metody.

Błękit metylenowy leukobase służy do barwienia żywych i martwych tkanek. Żywa komórka lub tkanka redukuje błękit metylenowy do bezbarwnej, martwej tkanki, która nie ma tej zdolności, więc nabiera koloru.

Do barwienia jaj glisty można zastosować błękit metylenowy w roztworze kwasu mlekowego z żrącą zasadą (0,05 g błękitu metylenowego, 0,5 g wodorotlenku sodu, 15 ml kwasu mlekowego). Żywe jaja nie dostrzegają koloru; zarodki martwych jaj stają się niebieskie.

Metoda barwienia nie ma zastosowania w przypadku niedojrzałych jaj glisty i włosogłówki; pigmentowana skorupa jest zabarwiona i dlatego nie widać, czy komórka zarodkowa wewnątrz jaja jest zabarwiona.

Larwy glisty barwi się zasadowym roztworem błękitu brylantowo-krezylowego w stężeniu 1:10 000. w następujący sposób: na szkiełko nakłada się kroplę płynu z jajami glisty i kroplę głównego roztworu farby. Preparat przykrywa się szkiełkiem nakrywkowym, które mocno dociska się do preparatu, delikatnie ostukując igłą preparacyjną. Liczbę wyłaniających się larw i stopień ich zabarwienia obserwuje się pod mikroskopem, po czym ten sam preparat bada się ponownie po 2-3 godzinach. Tylko nieodkształcone larwy, które nie barwiły się przez 2 godziny, uważa się za martwe larwy skorupa pęka (częściowo lub całkowicie).

Możliwość barwienia preparatów roztworem jodu wskazuje się przy określaniu żywotności jaj ptasiej glisty. W tym przypadku jako barwnik stosuje się 5% alkoholowy roztwór jodu. Po nałożeniu na preparat zarodki martwych jaj Ascaridii w ciągu 1-3 sekund zmieniają kolor na pomarańczowy. Martwe jaja opisthorchis i onkosfery bydlęcego tasiemca barwi się roztworem błękitu toluidynowego (1:1000), a martwe onkosfery bydlęcego tasiemca barwi się roztworem brylantowego błękitu krezylowego (1:10 000). W tym samym czasie zarodki i skorupy zarówno martwych, jak i żywych jaj nabierają koloru. Dlatego po zabarwieniu jaja i onkosfery są myte czysta woda i dodatkowo barwiony safraniną (rozcieńczoną 1:10 000 w 10% roztworze alkoholu). Alkohol usuwa kolor z muszli, a safranina nadaje im czerwony kolor. W rezultacie żywe jaja stają się czerwone, zarodki martwych stają się niebieskie, a skorupa pozostaje czerwona. Martwe zarodki bydlęcych onkosfer tasiemca szybko, w ciągu kilku minut, barwią się na jaskrawoczerwono lub różowo za pomocą safraniny lub na niebiesko z jaskrawym błękitem krezylowym w rozcieńczeniu 1:4000 lub indygokarminem w rozcieńczeniu 1:1000-1:2000.

Żywe zarodki nie zmieniają się pod wpływem tych barwników nawet po 2-7 godzinach.

Aby określić żywotność jaj tasiemca karłowatego, zaleca się stosowanie następujących farb: 1) brylantowy błękit krezylowy (1:8000) - po 1 godzinie onkosfera martwych jaj staje się szczególnie jaskrawa, co wyraźnie wyróżnia się na tle bladej lub bezbarwne tło reszty jaja; 2) safranina: rozcieńczona 1:8000 przy ekspozycji przez 2 godziny i 1:5000 przez 3-5 godzin; 3) 50% roztwór kwasu pirogalowego w rozcieńczeniu 1:2 - po ekspozycji przez 1 godzinę w temperaturze 29-30°C (im niższa temperatura, tym dłuższy proces barwienia).

Żywe plerocerkoidy tasiemca bardzo dobrze wybarwia się wodnym roztworem (1:1000) neutralrot przez 5-20 minut. Aby uzyskać trwały różowy kolor, który nie znika w ciągu 5 dni i nie wpływa na ruchliwość plerocerkoidów, zwykle wystarcza 10 minut. Stopień wybarwienia kontroluje się obserwując larwy w czystym izotonicznym roztworze chlorku sodu, w tym celu okresowo usuwa się plerocerkoidy z farby. Do barwienia martwych plerocerkoidów zaleca się stosowanie błękitu metylenowego.

R.E. Chobanov i wsp. (1986) zaproponowali metodę określania żywotności jaj i larw robaków przy użyciu barwnika „rubryna” otrzymywanego w wyniku hodowli pleśni Peniciliium rubrum. Aby to zrobić, użyj 3% wodnego roztworu barwnika.

Proces wybarwiania jaj i larw kończy się po 1,5 godzinie. Niezdolne do życia jaja owsików, tasiemców bydlęcych i karłowatych, tęgoryjców, trichostrongylidów uzyskują intensywnie różową barwę, a larwy tęgoryjców i trichostrongylid stają się czerwone. Mniej jasny kolor obserwuje się w jajach glisty i włosogłówki, ponieważ po uwolnieniu z jelit mają już ciemnobrązowy kolor: Żywe jaja i larwy nie są zabarwione.

Fizykochemiczne metody stymulacji uwalniania miraculidu z jaj przywr. Metody zostały opracowane przez S.M. German i SA Beer (1984) w celu określenia żywotności jaj opisthorchidów i dicrocelium poprzez wystawienie jaj na działanie środowiska reakcyjnego. Jeśli żyją, uwalniane jest miracidium. Metody opierają się na fizykochemicznej aktywacji gruczołu wylęgowego miracidium i stymulacji aktywność silnika larwy. Stymulację uzyskuje się poprzez wystawienie jaj przywr na działanie specjalnego ośrodka reakcyjnego w połączeniu z technikami sekwencyjnymi – wytworzenie różnicy temperatur, suszenie zawiesiny jaj, wystawienie na słaby przepływ cieczy w kropli testowej, które przyczyniają się do masowego uwalniania miracidii z jajka.

Oznaczanie żywotności jaj opisthorchidów metodą Hermana i Beera. Zawiesinę jaj w wodzie (kranowej, osiadłej) wstępnie schładza się do temperatury 10–12°C. Wszystkie kolejne operacje przeprowadza się w temperaturze pokojowej (18-22°C). Do probówki wirówkowej dodaje się jedną kroplę (około 0,05 ml) zawiesiny zawierającej 100-400 jaj. Probówki umieszcza się na stojaku na 5-10 minut w celu osadzenia jaj. Następnie wąski pasek Za pomocą bibuły filtracyjnej ostrożnie odessaj nadmiar wody, aż do jej całkowitego usunięcia. Do probówki dodać 2 krople pożywki, wstrząsnąć, przenieść zawartość pipetą na szkiełko i pozostawić na 5-10 minut lekko potrząsając (lub umieścić pod suszarką do włosów), aby w kropli testowej wytworzyć słaby prąd cieczy. zawieszenie. Operacja ta imitująca perystaltykę jelita mięczaka pozwala na aktywację uwalniania miracidii. Następnie do zawiesiny dodaje się 2 kolejne krople pożywki i preparat poddaje się mikroskopii przy użyciu konwencjonalnego mikroskopu świetlnego (X200). W tym czasie pokrywka jaj z żywym miracidium powinna się otworzyć, a larwa aktywnie wynurza się do środowiska. Dzięki obecności w nim etanolu miracidium zostaje unieruchomione po 3-5 minutach, a następnie wybarwione barwnikiem znajdującym się w podłożu. Dzięki temu miracidia można łatwo wykryć i policzyć.

Przygotowanie środowiska reakcyjnego. Pożywkę przygotowuje się w 0,05 M buforze Tris-HCi w optymalnych warunkach pH 8,0-9,5. Do buforu dodaje się etanol w ilości 10-13% oraz barwnik (safraninę, błękit metylenowy i inne działające w zakresie pH) w celu uzyskania słabe zabarwienie płyn (przykładowo dla safraniny jej końcowe stężenie wyniesie 1:50 000). Można użyć innego buforu, który sprawdzi się w pH zasadowym, np. 0,05 M fosforan (pH 8,5). Dlatego pożywka zawiera 96% etanolu - 12 części; barwnik (roztwór macierzysty) - 1-10 części; 0,05 M Tris-NS! bufor (pH 8,5-9,5) - do 100 części. Przykład podłoża: 12 części 96% etanolu, 1 część nasyconego roztworu safraniny, reszta do 100 części - 0,05 M bufor Tris-HCl o pH 9,5.

Oznaczanie żywotności jaj dicrocelium metodą Hermana, Beera, Stratana. Kroplę zawiesiny zawierającej 100-150 jaj przywr umieszcza się w probówce wirówkowej na 1-2 minuty w celu sedymentacji jaj. Następnie ciecz ostrożnie suszy się za pomocą paska bibuły filtracyjnej. Dodać 1-2 krople środowiska reakcyjnego za pomocą pipety Pasteura i inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 28-30°C przez 2-3 minuty. Skład medium: 6 części butanolu, 94 części 0,4% roztworu chlorku sodu lub 0,3% roztworu chlorku potasu w wodzie destylowanej. Jaja w pożywce przenosi się pipetą na szkiełko i pozostawia na 1,5–2 godziny w temperaturze pokojowej (18–22°C), dodając 1–2 krople (0,05) co 25–30 minut (w miarę wysychania). ) ml) roztworu butanolu w wodzie destylowanej. Następnie preparat bada się pod mikroskopem przy powiększeniu 100-200x. Żywotność zależy od liczby otwartych jaj, w których uwolniono miracidie. Butanol przenika przez pory skorupki jaja, dociera do miracidii i aktywuje je. Inkubacja w określonej temperaturze usprawnia ten proces. Butanol w stężeniu 3-7% jest szkodliwy dla miracydium wydobywającego się z jaja. Przeniesienie zawiesiny jaj z probówki na szkiełko pozwala do czasu uwolnienia miracydium (po 30-40 minutach) obniżyć stężenie butanolu na skutek ulatniania się do bezpiecznego poziomu (1,5-0,5%). Obecność w pożywce chlorku sodu w stężeniu 0,1-0,5% (lub chlorku potasu w stężeniu 0,05-0,4%) determinuje aktywność uwolnionego miracydium. W przeciwieństwie do małych przezroczystych jaj opisthorcha, jaja dicrocelium mają ciemną skorupę; mają wyraźnie widoczną czapkę, która otwiera się po wynurzeniu miracidium. Dlatego wygodniej jest ocenić żywotność jaj dicrocelium poprzez zliczenie otwartych jaj, a nie poprzez barwienie i zliczanie miracidii.

Luminescencyjna metoda badania jaj i larw robaków.

Po raz pierwszy w praktyce helmintologicznej metody mikroskopii fluorescencyjnej zastosowano w 1955 roku. Doniesiono, że mikroskopia fluorescencyjna umożliwia rozróżnienie obiektów żywych i martwych bez uszkadzania jaja. Do fluorescencji nie używano promieni UV, ale niebiesko-fioletową część światła widzialnego, przy użyciu konwencjonalnego mikroskopu i szkiełek; nałożony na oświetlacz OI-18 specjalny zestaw filtry kolorowe.

Stwierdzono, że żywe i martwe jaja glisty, owsika, tasiemca karłowatego, tasiemca bydlęcego, tasiemca szerokiego i innych robaków fluoryzują inaczej. Zjawisko to obserwuje się zarówno podczas luminescencji pierwotnej bez użycia barwników, jak i po zabarwieniu fluorochromami (oranż akrydynowy, koryfosfina, primulina, aurolina, siarczan berleryny, trypaflawina, rywanol, chinina itp.).

Niebarwione, żywe, niesegmentowane jaja glisty świecą jasnozielono z żółtawym odcieniem; w martwych jajach skorupa promieniuje zielone światło znacznie jaśniejszy niż ciemnozielony zarodkowy; W jajach glisty z larwą pojawia się tylko skorupa, a w martwych jajach zarówno skorupa, jak i larwa są jasnożółte.

Niepigmentowane i niesegmentowane żywe jaja owsików i tasiemców karłowatych emitują zielonkawo-żółte światło; W martwych jajach skorupa świeci intensywnie na tle ciemnozielonej masy embrionalnej. Przy wtórnej luminescencji (po barwieniu oranżem akrydynowym w rozcieńczeniu 1:10 000 i 1:50 000 od 30 minut do 2 godzin) skorupa żywych i martwych nicieni, przywr i tasiemców świeci inaczej.

Skorupa żywych i martwych Ascaris lumbricoides, Toxocara leonina, Enterobius vermcularis, Hymenolepis nana, H.fraterna, H. diminuta, T.saginatus, D.latum ma kolor pomarańczowo-czerwony. Zarodki życia Asc. lumbricoides, T.leonina, H.diminuta, D.latum i onkosfery tasiemca bydlęcego fluoryzują w matowym ciemnozielonym lub szarozielonym kolorze. Martwe zarodki tych jaj robaków emitują „płonące” pomarańczowo-czerwone światło. Żywe larwy owsików i toxocara (uwolnione skorupki jaj) emitują przyćmione szaro-zielone światło; po śmierci kolor zmienia się z czubka głowy na „płonący” jasnozielony, następnie żółty, pomarańczowy i wreszcie jasnopomarańczowy.

Po zabarwieniu fluorochromami - coryfosfilusem, primuliną - martwe jaja glisty i włosogłówki wykazują blask od liliowo-żółtego do miedziano-czerwonego. Żywe jaja nie świecą, ale są pomalowane na kolor ciemnozielony. Żywe jaja przywr Paragonimus westermani i Clonorchis sinensis nie świecą po zabarwieniu oranżem akrydynowym, ale martwe jaja emitują żółtawo-zielone światło.

Metodę luminescencji można również zastosować do określenia żywotności larw robaków pasożytniczych. Zatem larwy strongylanowe i rhabditatus fluorochromowane roztworem oranżu akrydynowego (1:2000) świecą: żywe - zielone (z odcieniem), martwe - jasnym pomarańczowym światłem. Żywe larwy włosieni nie świecą lub dają słaby blask, gdy są traktowane przez 10 minut roztworami izotiocyjanianu fluoresceiny, auraminy itp. Martwe larwy fluorochromowane (w stężeniu 1:5000) dają jasny blask.

Wyłaniające się z muszli żywe miracydia emitują słabe, niebieskawe światło z ledwo zauważalną jasnożółtą koroną rzęsek, ale 10-15 minut po śmierci pojawiają się z jasnym „płonącym” jasnozielonym, a następnie pomarańczowo-czerwonym światłem.
KATEGORIE
Ekranizacja
KATEGORIE
Rodzaje ultradźwięków
USG kończyn
USG jamy brzusznej

POPULARNE ARTYKUŁY
Jakie są terminy wpłaty zaliczek na podatek gruntowy?

Jakie są terminy wpłaty zaliczek na podatek gruntowy?
Procedura obliczania i wpłacania zaliczek na podatek dochodowy

Procedura obliczania i wpłacania zaliczek na podatek dochodowy
Odliczenie VAT Udział odliczeń VAT

Odliczenie VAT Udział odliczeń VAT
Sałatka witaminowa z kapusty i marchewki z octem jak w stołówce. Jak przyprawić sałatkę witaminową?

Sałatka witaminowa z kapusty i marchewki z octem jak w stołówce. Jak przyprawić sałatkę witaminową?
Szybka kapusta kiszona: gotuj w pośpiechu

Szybka kapusta kiszona: gotuj w pośpiechu

2024 „kingad.ru” - badanie ultrasonograficzne narządów ludzkich