Diagnosi di laboratorio delle elmintiasi. Metodo per isolare una coltura pura di Leishmania ottenuta raschiando tessuti patologici

Metodi semplici

metodo macroscopico. Quando si esaminano le feci, si possono rilevare elminti, le loro teste, segmenti, frammenti di strobili, che si distinguono da soli o dopo la sverminazione. Questo metodo è particolarmente indicato per la rilevazione di enterobiasi, taeniasi e taeniarhynchosis.

Piccole porzioni di feci vengono mescolate con acqua in un bagno piatto o in una capsula di Petri e, guardando buona illuminazione su fondo scuro, eventualmente utilizzando una lente d'ingrandimento, rimuovere gli elminti e tutte le formazioni bianche sospette con una pinzetta o una pipetta. Il materiale raccolto viene trasferito in un'altra tazza con acqua o su un vetrino in una goccia di glicerina diluita o soluzione isotonica di cloruro di sodio per ulteriori studi.

Nel metodo di sedimentazione, l'intera porzione di prova delle feci deve essere mescolata con acqua in un cilindro di vetro, quindi accuratamente drenata strato superiore acqua. Questo viene ripetuto più volte. Quando il liquido diventa trasparente, viene drenato e il precipitato viene visualizzato in piccole porzioni in un bagno di vetro o in una capsula di Petri, come indicato sopra.

I metodi microscopici sono il metodo principale per esaminare le feci per rilevare uova o larve di elminti. Di seguito sono descritti vari metodi di ricerca. Per aumentare l'affidabilità dell'esame, le analisi possono essere ripetute più volte al giorno o con un intervallo di 1-3 giorni.

Metodo di striscio nativo. Lo striscio nativo è il più comune e tecnicamente metodo disponibile studi fecali. In uno striscio nativo si possono trovare uova e larve di elminti di ogni tipo. Tuttavia, con un piccolo numero di uova nelle feci, non sempre vengono trovate. Pertanto, lo studio delle feci solo con l'aiuto di uno striscio nativo non è completo e dovrebbe essere integrato con metodi di arricchimento. L'efficienza dell'esame dello striscio nativo è nettamente migliorata quando si osservano quattro preparazioni preparate da un campione fecale su due vetrini senza coprioggetto, che consente di esaminare un totale di circa la stessa quantità di feci del metodo Kato (vedi sotto).

Una piccola quantità (delle dimensioni di una testa di fiammifero) di feci mescolate viene spalmata sottilmente con un bastoncino di legno sulla superficie di un vetrino in una goccia di soluzione di glicerina al 50%. Di solito vengono preparati due strisci su un bicchiere. Lo striscio viene visualizzato al microscopio a basso ingrandimento (ob. 8, app. 7). Nei casi dubbi viene coperto con un vetrino coprioggetto ed esaminato ad alto ingrandimento (ob. 40).

Per preparare un grosso striscio nativo, 200-300 mg di feci (delle dimensioni di un grosso pisello) vengono macinati su un bicchiere di 6x9 cm in 15-20 gocce di una soluzione acquosa al 50% di glicerolo. Visto al microscopio stereoscopico binoculare (vol. 4, circa 12,5 o vol. 2, circa 17) in luce trasmessa senza vetrini coprioggetto. In casi dubbi, puoi tradurre l'obiettivo in un ingrandimento maggiore. In tali macchie sono chiaramente visibili grandi uova di elminto colorate e le uova trasparenti della tenia pigmea sono leggermente peggiori. Questo metodo non è adatto per rilevare piccole uova. Allo stesso tempo, un grande volume del materiale studiato e un ampio campo visivo con un'elevata profondità di campo forniscono un'efficienza significativa di questa modifica rispetto a uno striscio nativo convenzionale.

Lo striscio di cellophane spesso (metodo Kato) è più efficace dell'esame dello striscio nativo, ma deve anche essere combinato con metodi di arricchimento. Vengono rilevate uova di tutti i tipi di elminti, tuttavia, per rilevare le uova della tenia pigmea (uova trasparenti) o dell'opisthorchis (piccole uova), l'assistente di laboratorio deve prestare particolare attenzione a non perderle (Fig. 21).

Il metodo si basa sul rilevamento delle uova di elminti in uno spesso striscio di feci, chiarificato con glicerina e colorato con verde malachite. Il cellophane idrofilo viene preliminarmente tagliato in lastre da 20 x 40 mm ed immerso in una miscela Kato (6 ml di una soluzione acquosa al 3% di verde malachite, 500 ml di glicerolo, 500 ml di una soluzione di fenolo al 6%). 3-5 ml della miscela sono sufficienti per 100 piatti, che sono pronti all'uso in un giorno e possono essere conservati nella stessa miscela in un contenitore ben chiuso a temperatura ambiente per 6 mesi. In assenza di verde malachite (consigliato per ridurre l'affaticamento degli occhi dell'assistente di laboratorio) e fenolo (disinfettante), può essere utilizzata solo una soluzione acquosa al 50% di glicerina, l'efficacia dello studio non è ridotta.

Riso. 20. Metodo per preparare uno spesso striscio di feci con cellophane secondo Kato

100 mg di escrementi vengono applicati su un vetrino, coperto con una lastra di cellophane trattata come sopra, e pressato con un tappo di gomma in modo che gli escrementi non si diffondano da sotto il cellophane. La microscopia a basso o alto ingrandimento del microscopio viene eseguita entro e non oltre 1 ora (nella stagione calda - 30-40 minuti) dopo la preparazione dello striscio. Il motivo dell'opacità del preparato potrebbe essere uno spesso strato di feci, una scarsa lavorazione della piastra nella miscela Kato, un tempo di esposizione insufficiente del preparato sotto cellophane. Anche la pulizia prolungata con glicerina e l'eccessiva essiccazione del preparato rendono difficile il rilevamento delle uova.

Metodo di torcitura secondo S.S. Shulman. Il metodo è stato proposto per il rilevamento di larve di elminti nelle feci, principalmente Strongyloid. Vengono esaminate solo le feci appena escrete, di cui 2-3 g vengono trasferite in un barattolo di vetro, agitate con una bacchetta di vetro con un movimento circolare con 3-5 volte la quantità di soluzione fisiologica, senza toccare le pareti del vaso. Al centro si accumulano uova e larve di elminti. Dopo la miscelazione, la goccia all'estremità del bastoncino viene rapidamente trasferita su un vetrino, coperta con un coprioggetto ed esaminata al microscopio.

metodi di arricchimento. I metodi di arricchimento si basano sulla differenza del peso specifico delle uova e della soluzione salina utilizzata, che consente di rilevarne una piccola quantità. Se il peso specifico delle uova è maggiore del peso specifico del liquido, le uova si concentrano nel sedimento, che viene esaminato al microscopio. Questo metodo di sedimentazione viene utilizzato per le uova di trematodi. Con un peso specifico più elevato della soluzione, le uova galleggiano sulla superficie del liquido, quindi viene esaminato il film. Questi sono metodi di galleggiamento (galleggianti), sono più efficaci per rilevare uova di anchilostoma, tricocefali e tenia pigmeo.

metodi di galleggiamento. Il metodo Fulleborn si basa sul galleggiamento delle uova di elminti in una soluzione satura di cloruro di sodio, che ha un'elevata densità relativa (1,2), che consente di rilevare le uova con un piccolo numero di esse. Il metodo è più efficace dello studio di uno striscio nativo, sebbene sia più difficile. I vantaggi del metodo sono l'economicità e la disponibilità. Si consiglia di combinare lo studio dello striscio nativo e il metodo Fülleborn.

Si prepara una soluzione satura sciogliendo 400 g di cloruro di sodio in 1 litro di acqua durante l'ebollizione. La densità relativa della soluzione è 1,18-1,22. La soluzione è conservata in una bottiglia chiusa. Per l'analisi, 2-3 g di feci vengono posti in un barattolo con un volume di 30-50 ml e, mescolando con un bastoncino, viene aggiunta quasi fino in cima una soluzione satura di cloruro di sodio. Una striscia di carta rimuove rapidamente le grandi particelle galleggianti. Dopo 45-60 min. assestandosi con un'ansa metallica, rimuovere la pellicola superficiale e trasferirla su un vetrino in una goccia di soluzione acquosa di glicerolo al 50%. Invece di rimuovere la pellicola con un cappio, puoi aggiungere la soluzione nel barattolo verso l'alto, coprire con un vetrino, sulla cui superficie si attaccano le uova galleggianti. Sono in preparazione diversi preparativi. Inoltre, dal sedimento vengono visualizzate 2-4 preparazioni, prelevandole con una pipetta oculare su 2 vetrini. Oltre al film superficiale, è necessario esaminare anche il sedimento, poiché le uova di trematodi, taeniidi, uova non fecondate di ascaridi non galleggiano in questa soluzione. Le uova di un certo numero di elminti non galleggiano immediatamente in una soluzione salina. Quindi, se il numero massimo di uova della tenia pigmea galleggia dopo 15-20 minuti, allora ascaridi - dopo 1,5-2 ore, tricocefali - dopo 2-3 ore.

Pertanto, i vantaggi di questo metodo includono la sua economicità e disponibilità, gli svantaggi sono la necessità di visualizzare i preparati sul film superficiale e sul sedimento, nonché la durata della sedimentazione.

Anche il metodo di E. V. Kalantaryan è un metodo di arricchimento, ma è più efficiente e più semplice del metodo Fülleborn. Viene utilizzata una soluzione satura di nitrato di sodio con una densità relativa di 1,38. Pertanto, le uova della maggior parte degli elminti galleggiano e si trovano nella pellicola superficiale; non è richiesto l'esame dei sedimenti.

Per preparare una soluzione satura di nitrato di sodio, 1 kg di sale di nitrato di sodio (nitrato di sodio) viene sciolto in 1 litro di acqua e fatto bollire fino a completa dissoluzione e si forma una pellicola sulla superficie. Senza filtrazione, versare in una bottiglia asciutta. In assenza di nitrato di sodio, può essere sostituito con nitrato di ammonio (nitrato di ammonio), sciogliendo 1,7 kg per 1 litro di acqua. La densità relativa della soluzione risultante è 1,3, il che riduce in qualche modo l'efficienza rispetto alla soluzione di nitrato di sodio.

Vantaggi del metodo: le uova della maggior parte degli elminti emergono rapidamente e si trovano nel film superficiale, il che elimina la necessità di studiare il sedimento. Gli svantaggi del metodo sono la carenza di nitrato di sodio, nonché il fatto che le uova di trematodi, le oncosfere di taeniidi non galleggiano e rimangono nel sedimento. Va tenuto presente che con un'esposizione prolungata (più di 1-2 ore) delle feci in una soluzione, le uova di alcuni elminti iniziano a gonfiarsi e depositarsi, scomparendo dal film superficiale.

metodi di sedimentazione

Il metodo di P. P. Goryachev si basa sul principio della deposizione delle uova. Lo striscio in questo caso è leggero, senza impurità grossolane, che facilita il rilevamento di piccole uova di trematodi (opisthorchia, ecc.). Il peso specifico delle uova di opisthorch è elevato, quindi non galleggiano in soluzioni saline.

70-100 ml di una soluzione satura di cloruro di sodio vengono versati in un cilindro con un diametro di 2-3 cm. Separatamente, mescolare accuratamente 0,5 g di feci in 20-25 ml di acqua e filtrare accuratamente attraverso un imbuto con due strati di garza in un cilindro su soluzione salina, evitando di mescolare (in modo che si formino due strati chiaramente delimitati). Dopo 2-3 ore, lo strato superiore con le feci viene aspirato con una pipetta e la restante soluzione salina viene lasciata riposare per 12-20 ore o centrifugata. Il precipitato viene pipettato su un vetrino, coperto con un coprioggetto e microscopico.

Il metodo di Goryachev è stato proposto per il rilevamento delle uova di opistorch e si è rivelato più efficace dell'esame dello striscio nativo e del metodo Fülleborn. Attualmente, per la diagnosi di opistorchiasi (clonorchiasi), i metodi di Kato e Kalantaryan sono raccomandati come abbastanza efficaci e tecnicamente più semplici.

Metodo Krasilnikov. Sotto l'azione dei tensioattivi che fanno parte dei detergenti (detergenti), le uova di elminti vengono rilasciate dalle feci e concentrate nel sedimento.

Preliminarmente viene preparata una soluzione all'1% di detersivo in polvere Lotus. Per fare questo, 10 g di polvere vengono sciolti in 1 litro di acqua di rubinetto. In assenza di "Lotus" puoi usarne altri detersivi in ​​polvere, ma ognuno di essi deve essere preso tanto quanto si dissolverà senza la formazione di un precipitato in 1 litro di acqua di rubinetto. 20-30 ml di soluzione detergente vengono versati in un recipiente di vetro con una capacità di 30-50 ml, una piccola porzione di escrementi viene posta lì e mescolata bene. Il rapporto tra feci e soluzione dovrebbe essere di circa 1:20. Le feci devono essere nella soluzione per almeno un giorno. Durante questo periodo, sul fondo si forma un sedimento di 2-3 strati. Lo strato inferiore è costituito da particelle pesanti grossolane, le uova di elminti si raccolgono nello strato intermedio, lo strato superiore è costituito da scaglie grigio-biancastre. Quindi, con una pipetta, vengono raccolte 2-3 gocce di liquido dallo strato intermedio e trasferite su un vetrino. Vengono preparate 2 preparazioni su un vetro, coperte con un vetrino coprioggetti e microscopiche.

Il metodo Krasilnikov consente di rilevare le uova di tutti i tipi di elminti escreti con le feci.

Metodo di sedimentazione etere-formalina e metodo di sedimentazione chimica per alta efficienza richiedono molto tempo, soprattutto durante gli esami di massa, a questo proposito è più opportuno utilizzare il metodo etere-acetico. Consente, dopo un'ulteriore elaborazione del sedimento con reagenti chimici, di ottenere praticamente solo uova di elminti, il che facilita l'identificazione di piccole uova di trematodi. Questo metodo si è rivelato universale, rivelando le uova di tutti gli elminti intestinali, le cisti dei protozoi intestinali, può essere utilizzato anche per quantificare l'intensità dell'invasione.

Versare 7 ml di una soluzione al 10% in provette graduate da centrifuga. acido acetico e aggiungere 1 g di feci alla tacca degli 8 ml. Le feci vengono accuratamente mescolate con un bastoncino fino a formare una miscela omogenea, quindi filtrate attraverso due strati di garza in un'altra provetta da centrifuga (in modo che la nuova provetta della soluzione filtrata abbia di nuovo 8 ml, se inferiore, quindi è possibile risciacquare ulteriormente l'imbuto con una benda con una soluzione al 10% di acido acetico, attraverso chi ha filtrato la soluzione fecale). A questa provetta aggiungere 2 ml di etere (fino alla tacca dei 10 ml), tappare e agitare vigorosamente per 30 sec. La miscela viene centrifugata a 3000 rpm per 1 minuto (o 2 minuti a 1500 rpm). Lo strato coagulante (a forma di tappo nella parte superiore della provetta) viene separato dalle pareti della provetta con un bastoncino e accuratamente drenato insieme al supernatante. Il precipitato (solitamente piccolo, incolore) viene applicato ai vetrini con una pipetta, coperto con un vetrino coprioggetti e microscopico.

I più semplici sono divisi in 4 classi:

Quando incistato, il microrganismo acquisisce una forma arrotondata e si ricopre di un guscio protettivo. Sotto forma di cisti, i protozoi diventano meno suscettibili a fattori ambientali avversi.

La ricerca può includere:

Nota:Esistono molte varietà di diagnostica, considereremo quei tipi che sono più comuni nella pratica del laboratorio clinico.

Tipi privati ​​di diagnostica

In ogni caso specifico, l'assistente di laboratorio ha il compito di trovare un patogeno specifico, a volte se ne trovano altri insieme a quello principale.

Esistono 6 specie di questo microrganismo in grado di vivere nell'intestino umano. Solo l'ameba dissenteria, che si presenta in forma vegetativa e sotto forma di cisti, è di importanza clinica.

Inoltre, vengono utilizzati metodi immunologici:

• immunofluorescenza indiretta;
• agglutinazione indiretta (PHA);
• immunodiffusione radiale.

Nota: metodi sierologici sono poco informativi e vengono utilizzati solo come aggiunta a quelli principali in casi dubbi.

Diagnosi di ciliare (ciliati)

La forma patogena dei microrganismi di questo genere è balantidia. Questo è un microbo che causa la balantidiasi, una malattia accompagnata da un processo ulcerativo dell'intestino crasso. L'agente eziologico si trova in uno striscio nativo sotto forma di una forma vegetativa e una cisti. Il materiale per lo striscio (feci e muco) viene prelevato durante un esame di sigmoidoscopia e seminato su supporti speciali.

Diagnostica dei flagellati (leishmania, giardia, tripanosomi, tricomonadi)

Leishmania, tripanosoma, giardia, trichomonad sono pericolosi per l'uomo.

Leishmaniosi- microbi causando la leishmaniosi, sono esaminati in strisci di sangue, materiali midollo osseo, raschiature da infiltrati cutanei. In alcuni casi, nella diagnosi di Leishmania, viene utilizzata la semina su terreni nutritivi.

Tripanosomi- agenti causali della malattia del sonno (tripanosomiasi americana/africana o malattia di Chagas).

La variante africana è determinata nel periodo iniziale nello studio del sangue periferico. I microbi patologici durante la progressione della malattia si trovano nel materiale delle punture dei linfonodi, nelle fasi avanzate - nel liquido cerebrospinale.

Per diagnosticare i tripanosomi in caso di sospetta malattia di Chagas, il materiale di prova viene esaminato al microscopio a basso ingrandimento. In questo caso, le macchie e una goccia spessa sono pre-colorate.

Trichomonas(intestinali, orali) vengono rilevati mediante microscopia di materiali prelevati dalle mucose interessate.

Identificazione degli sporozoi (plasmodio malarico, agente eziologico della coccidosi, ecc.)

La specie più comune e pericolosa per l'uomo è il plasmodio malarico, che ha 4 varietà principali dell'agente patogeno: l'agente eziologico della malaria di tre giorni, della malaria di quattro giorni, della malaria tropicale e della malaria ovale.

Lo sviluppo sessuale del Plasmodium (sporogonia) avviene nelle zanzare Anopheles. Asessuale (schizogonia tissutale ed eritrocitaria) - nel tessuto epatico e negli eritrociti umani. Queste caratteristiche ciclo vitale deve essere preso in considerazione nella diagnosi del plasmodio malarico.

Quindi, nel sangue di un paziente appena malato, si possono trovare cellule germinali del ciclo della sporogonia. Ma al culmine degli attacchi malarici, gli schizonti compaiono in gran numero nel sangue.

Inoltre, in diverse fasi della febbre malarica, compaiono varie forme di plasmodio:

• durante il periodo di freddo il sangue si riempie di merozoiti, una specie di schizonte;
• al culmine della temperatura, i trofozoiti a forma di anello si accumulano negli eritrociti;
• la diminuzione della temperatura è caratterizzata dalla predominanza di trofozoiti ameboidi;
• durante i periodi di condizioni normali, il sangue contiene forme adulte di schizonti.

Lo studio dell'agente eziologico della malaria (plasmodio malarico) viene effettuato in uno striscio e in una goccia spessa.

Nota:la diagnosi di malaria nello studio di strisci e gocce di sangue denso a volte è errata. Le piastrine del sangue in alcuni casi possono essere erroneamente classificate come agenti patogeni della malaria. Inoltre, frammenti di leucociti e altre cellule a volte simulano il plasmodio.

Metodi di ricerca di base per i protozoi

Diamo un breve sguardo ai metodi di ricerca più comuni per la presenza di protozoi.

Diagnosi di protozoi utilizzando uno striscio nativo e uno striscio colorato con soluzione di Lugol (nelle feci)

Il farmaco viene preparato da un'emulsione di feci in una soluzione isotonica. Due gocce di cloruro di sodio e soluzione di Lugol vengono applicate su un vetrino. Il materiale di prova viene aggiunto a entrambe le composizioni con un bastoncino di legno e, dopo essere stato ricoperto di vetro, viene visualizzato a diverse risoluzioni del microscopio.

Secondo alcuni segni, i protozoi trovati sono registrati. Per precisione, vengono preparate 2-3 preparazioni da un materiale. Nei casi dubbi, l'analisi viene ripetuta più volte nell'arco di 2-3 settimane.

Il metodo può rilevare forme vegetative e cistiche:

• lamblia;
• balantidia;
• dissenteria ameba.

Insieme alle forme patogene, vengono determinati anche i protozoi non patogeni. I portatori sani hanno anche forme luminali e cistiche.

Importante:la ricerca al fine di evitare inesattezze ed errori dovrebbe essere effettuata ripetutamente.

Il risultato della diagnosi di protozoi con il metodo di uno striscio nativo e macchiato dovrebbe contenere una descrizione della forma dell'agente patogeno (traslucido, cisti, tessuto).

Requisiti di ricerca:

• il materiale prelevato per l'analisi (feci liquide) viene esaminato entro e non oltre 30 minuti dalla defecazione;
• le feci formate devono essere diagnosticate entro 2 ore dalla defecazione;
• il materiale non deve contenere impurità (disinfettanti, acqua, urina);
• si usano solo bastoncini di legno per lavorare il materiale, quelli di vetro non sono adatti a causa dello scivolamento del muco;
• I bastoncini devono essere bruciati immediatamente dopo l'uso.

Metodo di conservazione (esame delle feci) nella diagnosi dei protozoi

Lo studio viene effettuato fissando i protozoi con un conservante. La differenza tra questo metodo e il precedente è che i conservanti consentono di conservare il farmaco per un lungo periodo.

Conservanti usati:

• Carriola. Contiene ingredienti conservanti: 0,7 ml di cloruro di sodio, 5 ml di formalina, 12,5 ml di alcool al 96%, 2 g di fenolo e 100 ml di acqua distillata. Composizione colorante: soluzione allo 0,01% di tionina (azzurro).
• La soluzione di Safarliev. Composizione: 1,65 g di solfato di zinco, 10 ml di formalina, 2,5 g di fenolo cristallino, 5 ml di acido acetico, 0,2 g di blu di metilene, 100 ml di acqua. Questo conservante viene utilizzato nei casi in cui il materiale deve essere conservato per più di un mese.

Le bottiglie vuote vengono riempite con un conservante, il materiale viene trasferito al loro interno, in proporzioni di 3: 1, quindi, se necessario, viene aggiunto un colorante. La valutazione dei risultati viene effettuata nello studio di 2-3 farmaci.

Metodo di arricchimento in formalina-etere (analisi per la presenza di protozoi nelle feci)

Questo metodo diagnostico consente di separare e concentrare le cisti protozoiche. Per l'analisi sono necessari i seguenti ingredienti: formalina (10 ml), 0,85 g di soluzione isotonica, acqua distillata, etere solforico, soluzione di Lugol.

Una miscela di biomateriale con i liquidi elencati viene miscelata e centrifugata. Il precipitato ottenuto sul fondo della provetta viene colorato con soluzione di Lugol ed esaminato per la presenza di cisti e forme vegetative.

Metodo di rilevamento della leishmania (striscio di midollo osseo)

Per la diagnosi della leishmaniosi vengono utilizzati i reagenti: una miscela di Nikiforov (etere solforico e etanolo), tampone fosfato, Azur-eosina secondo Romanovsky.

La sostanza del midollo osseo viene posizionata con molta attenzione su un vetrino dopo una preparazione speciale. Viene utilizzato un microscopio con un sistema di immersione.

Nel periodo acuto della malattia, nel punteggiato si trova un gran numero di Leishmania.

Nota:A volte cellule del sangue può assomigliare alla leishmania trasformata, quindi è molto importante che il tecnico di laboratorio sia attento e abbia esperienza sufficiente per l'autoesame.

Metodo per rilevare la leishmania in uno striscio da un infiltrato cutaneo

I reagenti richiesti sono simili al dosaggio precedente.

Il materiale di prova è ottenuto dal tubercolo esistente o dal contenuto ulceroso. La raschiatura con sospetto di leishmaniosi viene eseguita con molta attenzione con un bisturi, senza sangue. Quindi la preparazione viene preparata su vetro. Per l'accuratezza dei risultati ottenuti, vengono esaminati contemporaneamente diversi preparati.

In presenza di una malattia, tra i macrofagi, i fibroblasti e le cellule linfoidi presenti nel materiale in esame, viene determinata anche la Leishmania.

Metodo per isolare una coltura pura di Leishmania ottenuta raschiando tessuti patologici

Con questo metodo di diagnosi, i raschiamenti dei tessuti più semplici vengono inseriti in uno speciale mezzo nutritivo, in cui si verifica la riproduzione attiva della Leishmania.

Prima di effettuare un raschiamento, la pelle viene accuratamente trattata con alcool, quindi viene praticata un'incisione nel tubercolo, dal fondo del quale viene prelevato il contenuto e posto in una provetta con il mezzo. Il materiale viene prelevato più volte, dopodiché viene posto in diverse provette. Quindi, in un termostato a una temperatura di 22-24 gradi, avviene la coltivazione. I risultati vengono valutati al microscopio. Questo metodo viene utilizzato quando altri metodi più economici e veloci per diagnosticare i protozoi sono inefficaci.

Puoi vedere come i test per la presenza di protozoi vengono decifrati in pratica da una goccia di sangue guardando una recensione video:

Lotin Alexander, editorialista medico

Metodi ricerca elmintologica diviso in diretto e indiretto. Metodi diretti: rilevazione degli elminti stessi, dei loro frammenti, uova, larve nelle feci, urina, secrezione duodenale, espettorato, muco nasale e vaginale, contenuto degli spazi subungueali, pezzi di tessuto sottoposti a biopsia. Metodi indiretti: rilevamento modifiche secondarie derivanti nel corpo umano a seguito dell'attività vitale del parassita, reazioni sierologiche, ricerca generale sangue, urina. I metodi più comuni per esaminare le feci sono l'elmintoovoscopico e il protozooscopico. Durante la diagnosi, è impossibile identificare con un metodo le uova o le larve di tutti i tipi di elminti che vivono in apparato digerente persona. Pertanto, quando si utilizza il metodo di flottazione, le uova di trematodi e, in alcuni casi, le uova di ascaridi non fecondate non galleggiano nel film superficiale (a causa dell'elevato peso specifico). Nelle feci è molto raro trovare uova di ossiuri, oncosfere tenidi, che vengono rilevate con speciali metodi di ricerca: raschiatura dalle pieghe perianali per ossiuri e tenidi, metodi di sedimentazione per trematodi (uova di opistorch, ecc.). Pertanto, per un esame mirato del paziente per l'elmintiasi, il medico nel referto dovrebbe indicare a quali elminti dovrebbe essere prestata l'attenzione principale (diagnosi), che consentirà all'assistente di laboratorio di scegliere la tecnica appropriata per identificare questo tipo di elminti. Feci prelevate da luoghi differenti le feci in una quantità di almeno 50 grammi (cucchiaino) in un piatto di vetro pulito devono essere inviate al laboratorio entro e non oltre un giorno dalla defecazione ed esaminate il giorno del ricovero. Se necessario, conservare le feci fino a quando Il giorno dopo viene posto in un luogo freddo (0-4°C) o riempito con uno dei conservanti. Prima dello studio, le feci vengono mescolate con un bastoncino in modo che le uova di elminto siano distribuite uniformemente massa totale. Se nella preparazione vengono trovate uova di elminti, la visione non viene interrotta, perché. può essere doppia o tripla invasione. Il monitoraggio dell'efficacia del trattamento dell'elmintiasi viene effettuato esaminando le feci per le uova di elminti in 2-3 settimane o 2-3 mesi dopo il trattamento, a seconda dell'elminto rilevato. I metodi macroscopici vengono utilizzati per rilevare interi elminti sessualmente maturi o i loro frammenti nelle feci ad occhio nudo o con una lente d'ingrandimento manuale. Spesso sulla superficie delle feci dopo la defecazione, puoi vedere ossiuri che strisciano attivamente; escreto con le feci nematode; a volte le persone stesse notano lo scarico degli elminti. Nei pazienti con difillobotriasi possono emergere frammenti dello strobilo della tenia (sotto forma di "tagliatelle"), e in quelli infettati da tenidi (tenia suina o bovina), segmenti di elminti (sotto forma di "tagli bianchi" ) spesso lasciano le feci (sotto forma di "tagli bianchi") o strisciano attivamente fuori dall'ano. Il metodo macroscopico è il principale per la diagnosi differenziale di teniadosi e teniarincosi (in combinazione con un sondaggio). Tra gli speciali metodi macroscopici, viene utilizzato il metodo del lavaggio sequenziale delle feci. Le feci vengono mescolate in acqua per ottenere una sospensione uniforme, dopodiché, sotto una buona illuminazione, vengono accuratamente esaminate in piccole porzioni separate in cuvette fotografiche nere o su sfondo scuro in piastre Petri. Con una pinzetta o un ago da dissezione, tutte le particelle bianche sospette, le grandi formazioni sospette di frammenti di elminti vengono rimosse ed esaminate sotto una lente d'ingrandimento tra due vetrini. Piccoli elminti o teste di cestodi vengono esaminati sotto una lente d'ingrandimento in una goccia di glicerina o al microscopio. Quando si utilizza questo metodo per la diagnosi di segmenti di maiale, tenia bovina, tenia larga, i segmenti lavati vengono posti tra due vetri e, guardando la luce sotto una lente d'ingrandimento o un microscopio a basso ingrandimento, determinare la specie dalla struttura di l'utero (in un segmento maturo tenia del maiale Dal tronco centrale partono 8-12 rami laterali, e nella tenia bovina 18-32, più spesso 28-32, in una tenia larga, i segmenti sono più larghi e l'utero è al centro a forma di "rosetta" ). Se l'utero è poco visibile, può essere prima tenuto per un po 'di tempo in una soluzione di glicerina al 50%, dopodiché anche i tronchi uterini abbandonati sono chiaramente visibili. Quando si determinano questi cestodi dalla struttura delle teste staccate, vengono accuratamente posizionati con un collo in una goccia di glicerolo tra i vetrini (o coperti con un coprioggetto) e, senza schiacciarli, vengono esaminati al microscopio a basso ingrandimento.

I metodi microscopici sono divisi in semplici, complessi e speciali.

I metodi semplici includono striscio nativo, striscio nativo con soluzione di Lugol, striscio spesso sotto cellophane secondo Kato, torsione (secondo Shulman) e raschiamento perianale.

I metodi complessi sono più efficienti e si basano sulla concentrazione di uova nelle preparazioni. Includono il pretrattamento delle feci con reagenti liquidi, a seguito del quale le uova di elminti precipitano o galleggiano sulla superficie del liquido.

A metodi complessi metodi di arricchimento includono:

a) flottazione (quando il peso specifico delle uova è inferiore al peso specifico della soluzione salina e le uova galleggiano nella pellicola superficiale);

b) sedimentazione (quando il peso specifico delle uova è maggiore del peso specifico delle soluzioni saline e le uova si depositano nel sedimento).

Metodi speciali per rilevare uova e larve di elminti, cisti e forme vegetative di protozoi sono i metodi di raschiatura, flottazione, sedimentazione, larvoscopia, protozooscopia, lo studio della bile e i metodi di colorazione delle macchie di feci, espettorato, ecc.

Campionamento e conservazione

Per la ricerca, le feci vengono prelevate da luoghi diversi in porzioni da 50 ge inviate al laboratorio in un contenitore di vetro o plastica pulito con un coperchio ermetico. Vengono esaminate le feci fresche (non più vecchie di un giorno) e in alcuni casi (nello studio per la strongiloidiasi) immediatamente dopo la defecazione. Sono stati proposti alcuni conservanti per feci contenenti uova di elminti: soluzione di formalina al 4-10%, che deve essere riscaldata a t° 50-60° per evitare lo sviluppo di uova di anchilostomi; una miscela di soluzione acquosa di nitrato di sodio allo 0,2% (1900 ml), soluzione di Lugol (5 g di iodio, 10 g di ioduro di potassio, 250 ml di acqua), formalina (300 ml) e glicerina (25 ml), in cui uova di elminti sono conservati 6-8 mesi; una miscela di glicerina (5 ml), formalina (5 ml) e acqua (100 ml); soluzioni di detergenti all'1-1,5% "Lotus", "Extra", "Barf", "Tide", ecc. (in un rapporto ponderale tra feci e soluzione detergente 1: 5); una miscela di mertiolato 1:1000 (200 ml), formalina (25 ml), glicerina (5 ml), acqua distillata (250 ml) con l'aggiunta di 0,6 ml di soluzione di Lugol (in base a 1 g di feci per 10 ml di la miscela).

Per la diagnosi delle elmintiasi vengono utilizzati metodi macro e microelmintoscopici per l'esame delle feci.

Studi di macroelmintoscopia

Metodo di liquidazione

La porzione giornaliera di feci viene accuratamente miscelata con 5-10 volte la quantità di acqua, versata in alti cilindri di vetro (barattoli, secchi) e lasciata fino a quando le particelle in sospensione non si sono completamente depositate. Lo strato torbido superiore viene accuratamente drenato e viene aggiunta acqua pulita (ripetere più volte fino a quando l'acqua sopra il sedimento diventa trasparente). Dopo aver drenato lo strato superiore, trasferire il precipitato in una cuvetta o in una capsula di Petri e visualizzarlo (su sfondo scuro) sotto una lente d'ingrandimento oa occhio nudo.

Metodo di selezione

Sul setaccio superiore del dispositivo, costituito da un sistema di setacci con fori di diametro decrescente, vengono poste le feci miste ad acqua, il dispositivo viene collegato alla rete idrica e, aprendo il rubinetto dell'acqua, viene lavato e il liquido che scorre viene scaricato in fogna. I grandi elminti rimangono sul crivello superiore, mentre quelli più piccoli indugiano su quelli inferiori. Si capovolgono i setacci e, dopo aver lavato il contenuto in cuvette scure, si osservano ad occhio nudo o sotto una lente d'ingrandimento.

Studi di microelmintoscopia

Viene eseguito per rilevare le uova (metodi elminto-ovoscopici - colore. Fig. 1) o larve di elminti (metodi elminto-larvoscopici).

Metodi elmintoovoscopici

Metodi qualitativi senza arricchimento

macchia nativa. Una piccola quantità di feci viene triturata su un vetrino in una goccia di soluzione di glicerolo al 50% o acqua bollita. Le particelle di grandi dimensioni vengono accuratamente rimosse, la miscela viene coperta con un coprioggetto ed esaminata al microscopio (vengono visualizzati due strisci). È più conveniente e più facile preparare lunghi strisci tra due vetrini. Lo striscio nativo viene utilizzato solo in aggiunta ai metodi di arricchimento, poiché non è sufficientemente efficace, soprattutto con invasioni deboli.

Striscia spessa con cellophane secondo Kato(K. Kato, 1954) è molto metodo efficace ricerca. Pezzi di cellophane idrofilo (dimensioni 4x2 cm) vengono immersi per 24 ore in una miscela di glicerolo (50 ml), soluzione di fenolo al 6% (500 ml) e soluzione acquosa al 3% (6 ml) di malachite verde (quest'ultima è facoltativa ). OK. 100 mg di feci vengono spalmati su un vetrino e, coperti con un pezzo di cellophane bagnato, premuti con un tappo di gomma n. 5. Il farmaco viene esaminato dopo 30-60 minuti, quando si asciuga leggermente e si schiarisce, come risultato di cui le uova di elminti sono facili da rilevare con un microscopio a basso ingrandimento.

Metodi qualitativi con arricchimento (metodi di flottazione e sedimentazione)

I primi si basano sull'uso di soluzioni sature di vari prodotti chimici. sostanze in cui le uova galleggiano a causa della differenza di peso specifico.

Metodo Kofoid-Barber(Ch.A. Kofoid, M. A. Barber) modificato da Fulleborn (F. Fulleborn, 1920). OK. 5 g di feci in un barattolo alto e stretto (volume 100 ml) vengono mescolati con un bastoncino di legno in 100 ml di una soluzione satura sale da tavola, es. peso to-rogo 1,18 (400 g di sale si sciolgono all'ebollizione in 1 l di acqua). Le particelle di grandi dimensioni che sono salite in superficie vengono rapidamente rimosse con un bastoncino o un pezzo di carta. Dopo aver fatto riposare la miscela per 45-90 min. un'ansa di filo metallico (0,8-1 cm di diametro) rimuove l'intera pellicola superficiale, la trasferisce su un vetrino. Durante il test per le uova di anchilostomi, la miscela viene lasciata riposare per 10-15 minuti. Puoi rimuovere la pellicola direttamente con un vetrino, che copre il barattolo in modo che venga a contatto con il liquido (una soluzione salina satura viene aggiunta ai bordi del barattolo). Dopo la sedimentazione, il vetrino viene rimosso, capovolto rapidamente ed esaminato al microscopio (senza vetrino coprioggetto) un film con uova di elminti aderenti. Questo metodo rivela bene le uova di tutti i nematodi e la tenia pigmea. Uova di trematodi pesanti; la maggior parte dei cestodi e dei nematodi non fecondati galleggiano male, quindi viene esaminato anche il sedimento. Per fare ciò, dopo aver rimosso la pellicola, il liquido dal barattolo viene rapidamente drenato e alcune gocce vengono prelevate dal sedimento con un'ansa o una pipetta, trasferite su un vetrino, viene aggiunta una goccia di glicerina per la chiarificazione ed esaminata sotto un microscopio.

Metodo E.V. Kalantaryan(1938) È una modifica più efficiente del metodo Fülleborn. In esso, la soluzione di cloruro di sodio è sostituita da una soluzione satura di nitrato di sodio, sp. peso to-rogo 1,39 (un volume di nitrato di sodio viene sciolto in un volume uguale di acqua durante l'ebollizione), il film viene rimosso dopo 20-30 minuti.

Vengono applicati anche i metodi di Faust (E. S. Faust, 1939), Brudastov et al. (1970) e altri.

Per la deposizione delle uova di elminti viene utilizzata una sostanza chimica. sostanze che sciolgono grassi e proteine ​​nelle feci.

Metodo di Telemann (W. Telemann, 1908) modificato da Miyagawa (Y. Miyagawa, 1913). OK. 5 g di feci vengono macinate in un mortaio o barattolo, aggiungendo 5 ml di etere etilico e una soluzione di acido cloridrico al 50%; la miscela viene filtrata attraverso un setaccio a filo o per capelli in una provetta e centrifugata. Nella provetta si formano tre strati: in alto - etere con grasso disciolto, in basso - acido cloridrico con sostanze proteiche disciolte, nel sedimento - parti insolubili di feci e uova di elminti. Gli strati superiori vengono drenati e l'acqua viene aggiunta al sedimento e centrifugata. Alcune gocce del precipitato vengono trasferite su un vetrino ed esaminate al microscopio. Questo metodo può rilevare le uova di tutti i tipi di elminti, ma a volte sono deformate.

Metodo Ritchie (LS Kitchie, 1948). Per sciogliere grassi e proteine ​​si usano la formalina e l'etere.

Per la deposizione delle uova di elminti si possono utilizzare vari detergenti. All'estero si è diffuso il metodo di filtrazione in speciali dispositivi Bell, che viene utilizzato per studiare non solo le feci, ma anche l'urina, il sangue, ecc.

Esistono numerosi metodi che combinano i principi della flottazione e della decantazione delle uova. Tra questi ci sono i metodi di Lane (C. A. Lane), Rivas (D. Rivas), Gorkina, Darling (S. T. Darling). Uno di questi metodi di flottazione-sedimentazione, così come il metodo degli scarichi successivi, è stato proposto da N.V. Demidov (1963, 1965) per testare la fascioliasi e la dicroceliosi.

Metodi quantitativi

Metodo Stoll(NR Stoll, 1926). In una provetta o pallone graduato largo (con due tacche: 56 e 60 ml), si versa la soluzione decinormale di idrossido di sodio fino alla prima tacca, si aggiungono le feci fino a quando il livello del liquido raggiunge la seconda tacca, si mescola accuratamente con una bacchetta di vetro e , posizionando 10 perle di vetro o piccoli sassolini, tappare e agitare per 1 min. Rapidamente, affinché la sospensione non si depositi, si raccolgono con una pipetta graduata 0,075 ml della miscela (0,005 g di feci), si trasferiscono su un vetrino con sopra applicata una griglia, si copre con un coprioggetto e si inseriscono le uova di elminto i preparati vengono contati al microscopio; moltiplicando il numero risultante per 200, ottieni il numero di uova in 1 g di feci. Per un risultato più accurato, le uova vengono contate in due o più preparazioni e viene presa una media. Il metodo Stoll è insensibile alle invasioni deboli. Pertanto, si consiglia di contare il numero di uova nelle preparazioni preparate vari metodi flottazione o sedimentazione, previo uso costante di un uguale campione di feci e piatti dello stesso volume. Viene utilizzato anche uno spesso striscio di Kato.

Metodo del castoro(RC Beaver, 1950). Viene preparato uno striscio standard, la cui densità viene determinata utilizzando un elettrofotometro, quindi vengono contate tutte le uova di elminti.

Metodi elmintolarvoscopici

Metodo Bermann(G.Baermann, 1917). 5-10 g di feci appena espulse vengono posti su una rete metallica in un imbuto di vetro, all'estremità stretta del quale viene inserito un tubo di gomma con un morsetto. Per evitare la contaminazione del sedimento con particelle fecali, si consiglia di posizionare (sulla rete) carta o aggiungere carbone animale o farina di mais alle feci. L'imbuto viene riempito con acqua tiepida (t° 45-50°) fino a quando non entra in contatto con le feci. A causa della termotropia, le larve si spostano attivamente acqua calda e si accumulano gradualmente nella parte inferiore dell'imbuto, sopra la pinza. Dopo 3-4 ore, il morsetto viene aperto, il liquido viene abbassato in 1-2 provette, centrifugato per 2-3 minuti, lo strato superiore viene drenato e il precipitato viene esaminato su un vetrino al microscopio.

Metodo per la rilevazione di miracidia schistosomes. Le feci vengono lavate al buio a t° 8-10°, il sedimento viene mantenuto per 45 minuti. in piena luce a t ° 28 °, quindi versare in un pallone scuro con un tubo sul lato. I miracidi sono concentrati in un tubo laterale trasparente da dove possono essere prelevati.

I metodi di Fülleborn e altri sono usati anche per rilevare le larve di anchilostomi.

Metodi per studiare altre secrezioni, nonché tessuti e organi

OK. 100 ml dell'urina del test rimangono per 30 minuti. in un cilindro e, tolto lo strato superiore, versare 10-15 ml di sedimento in una provetta, centrifugare a 1500 rpm per 1-2 minuti; viene esaminato il sedimento. Si consiglia di raccogliere l'intera porzione giornaliera di urina.

La schistosomiasi urogenitale viene diagnosticata identificando i miracidi. Una porzione di urina fresca viene centrifugata per 5 minuti, il sedimento viene versato in un pallone di colore nero, un tubo di vetro trasparente viene saldato alla parte superiore del taglio. L'acqua viene aggiunta in rapporto 1:5, 1:10 e posta per 2 ore in un termostato a t° 25-30°. I miracidi che emergono dalle uova sono visibili attraverso un tubo trasparente ad occhio nudo sotto forma di puntini in rapido movimento. A hron, la forma di uno schistosomoz a pazienti entro la fine di sangue di urination è assegnata, ma le uova in urina trovano di rado perciò è consigliato fare ricorso a una biopsia di una vescica.

Esame dell'espettorato. L'espettorato può contenere uova di paragonimus, schistosomi, tominx, larve di nematodi migratori, frammenti di vescica echinococcica. L'intera porzione di espettorato erogata viene attentamente esaminata ad occhio nudo o sotto una lente d'ingrandimento, vengono selezionati ed esaminati tutti i frammenti visibili di tessuto, i grappoli color ruggine, ecc.; quindi visualizzare l'intera porzione con tratti. Espettorato purulento versare una quantità uguale di soluzione alcalina caustica allo 0,5%, centrifugare ed esaminare il precipitato.

Con alcune elmintiasi nell'espettorato, ci sono cambiamenti caratteristici. Con la paragonimiasi, ad esempio, nell'espettorato si possono trovare ammassi di uova sotto forma di grumi giallastri, oltre a una grande quantità di muco, leucociti, eritrociti, cellule alveolari, spirali di Kurschmann, fibre elastiche, cristalli di Charcot-Leiden. Vengono inoltre rivelati caratteristici cristalli romboidali con estremità appuntite. Disponibilità un largo numero gli eosinofili consentono di differenziare la paragonimiasi dalla tubercolosi.

Esame del contenuto di ascessi e punteggiati. IN secrezioni purulente ascessi, così come nei tumori e nelle cisti rimosse durante l'intervento chirurgico, si possono trovare elminti, loro frammenti, larve e uova (echinococco, alveococco, sparganum, cisticerco, dirofilaria, nematodi, toxocara, paragonimus, ecc.). La tecnica di ricerca è comune; in alcuni casi si preparano sezioni istologiche di tessuti tumorali. I contenuti purulenti possono essere elaborati con il metodo Telemann; il liquido limpido viene esaminato allo stesso modo del contenuto duodenale mediante l'aggiunta di etere solforico. Il liquido echinococcico viene centrifugato e il sedimento viene esaminato per la presenza di scolici e uncini; le preparazioni sono colorate con carbolfuchsina secondo Ziehl-Nelsen.

Studio del sangue. Nel sangue si trovano microfilarie e larve di nematodi migratori. Una goccia di sangue viene prelevata da un dito o da un lobo dell'orecchio ed esaminata fresca o da essa vengono preparati preparati.

Una goccia di sangue viene posta su un vetrino con un quadrato di vaselina applicato e pressata leggermente con un vetrino coprioggetto. Al microscopio, le microfilarie si muovono tra le cellule del sangue. Il sangue può essere posto tra due strati di nastro adesivo di cellulosa; le microfilarie rimangono mobili per 6 ore; in una preparazione completamente essiccata, possono essere distinti al microscopio entro 30 giorni. Le specie di microfilaria possono essere identificate solo in strisci colorati o gocce spesse. I preparati preparati vengono essiccati, emolizzati e colorati secondo Romanovsky - Giemsa, Wright, Ziehl-Nelsen, Leishman, Papanicolaou (vedi metodo di colorazione Wright, metodo Romanovsky-Giemsa, metodo Ziehl-Nelsen). Avendo trovato microfilarie in una goccia di sangue colorato secondo Romanovsky-Giemsa, il preparato viene ulteriormente colorato con ematossilina di Hansen; dopo 15-60 min. lavato 2 min. nell'acqua corrente. La preparazione riverniciata è differenziata in soluzione di acido cloridrico allo 0,2%; il cappuccio delle microfilarie diventa viola pallido e la sostanza nucleare del corpo diventa viola scuro.

Per invasioni deboli, è necessario esaminare 2-10 ghiacci sanguigni con un anticoagulante (ad esempio, con una soluzione al 5% citrato di sodio) utilizzando uno dei seguenti metodi.

Metodo di Knott (J. Knott, 1939), modificato da Markell e Foge (E. K. Markell, M. Voge, 1965). 2 ml di sangue vengono miscelati in una provetta da centrifuga con 10 casi di acido acetico all'1%, centrifugati per 2 minuti. a 1500 giri/min; strato superficiale drenato, il precipitato viene distribuito su più vetrini ed esaminato al microscopio. I preparati possono essere colorati secondo Romanovsky-Giemsa o altri metodi.

Metodo di filtrazione Bell (DR Bell, 1967). In un apparecchio costituito da un imbuto in acciaio inossidabile con foro rettangolare e filtri a membrana della stessa forma, di dimensioni 19 x 42 mm, con una dimensione dei pori da 0,8 a 5 μm, il sangue viene filtrato in provette, emolizzato in una miscela di 1 ml di detergente Tipol e 9 ml di fiziol, soluzione (per velocizzare la filtrazione, l'apparecchio è collegato ad una pompa del vuoto). Il filtro viene fissato in acqua distillata bollente e colorato secondo Romanovsky-Giemsa o ematossilina Ehrlich calda. Il filtro colorato viene essiccato in essiccatore o in alcool isopropilico (successivamente in 3 tazze), chiarificato su vetro con olio da immersione ed esaminato sotto coprioggetto. I preparati dipinti vengono conservati per diverse settimane. Il metodo Bell è il più efficace per il conteggio quantitativo delle microfilarie nel sangue.

Viene utilizzato anche il metodo con il polividone di Goldsmid.

Ricerca sulla pelle. Nella pelle si possono trovare microfilarie dell'onco-chiesa e larve di elminti degli animali, che causano forma della pelle larva migrante(cm.). Sezioni di pelle o materiale ottenuto per scarificazione vengono prelevati a livello della coscia, del polpaccio, dei glutei oa livello del muscolo deltoide. Un pezzo di epidermide a forma di cono viene sollevato con uno spillo entomologico e, tagliato con un rasoio, esaminato su vetro in una goccia di soluzione di fiziolo. A risultato negativo una preparazione fresca viene riesaminata dopo 10 minuti; le larve sono solitamente localizzate lungo i bordi della preparazione. Il materiale ricevuto può esser tenuto in 2 millilitri fiziol, soluzione tra 1-2 ore. ed esaminare il sedimento. Si consiglia di prelevare 5 sezioni cutanee dal paziente.

È possibile preparare preparazioni dal sangue e dal fluido tissutale rilasciati dopo una forte compressione delle sezioni. Le gocce sono macchiate secondo Mayer, Romanovsky-Giemsa o hematoxylin di Delafield.

Metodo standard per quantificare l'invasione. Area biopsiata della pelle dia. 3-5 mm e del peso di almeno 1-4 mg, pesare, tagliare a pezzetti e contare le larve al microscopio in fiziol. soluzione su vetrino; 1-4 larve nel campo visivo sono contrassegnate con un segno +, 5-9 larve - con un segno ++, 10-19 - con un segno +++, 20 o più - con un segno + + + +. La contabilità quantitativa è più conveniente da eseguire su preparazioni macchiate.

Test per trichinosi, cisticercosi e schistosomiasi

Identificazione delle larve di Trichinella

metodo di compressione. Un pezzo di doppia testa o muscolo del polpaccio(vicino al tendine), prelevato chirurgicamente in asepsi, viene diviso con aghi da dissezione in fibre sottili separate, schiacciate tra due vetrini in una goccia di glicerina in modo che la preparazione sia sottile e trasparente. Le larve di Trichinella sono chiaramente visibili al microscopio con un campo visivo oscurato. La ricerca di diversi pezzi di muscoli nei compressori usati in veterinaria è efficace. pratica, specialmente in speciali trichinelloscopi.

Il metodo di digestione Bechman(GW Bachman, 1928). 1 e i muscoli schiacciati vengono versati con 60 ml di succo gastrico artificiale (0,5 g di pepsina; 0,7 ml di acido cloridrico concentrato; 100 ml di acqua) e incubati per 18 ore. in termostato a t° 37°; lo strato superiore del liquido viene drenato, al precipitato viene aggiunta acqua calda (t ° 37-45 °) e versata nell'apparato di Bermann. Un'ora dopo, il liquido viene calato in una provetta, centrifugato e si esamina il sedimento. Se le larve sono racchiuse in capsule calcificate, vengono preliminarmente decalcificate in una soluzione di acido cloridrico, azotato o solforico.

saggio biologico. I pezzi dei muscoli studiati vengono nutriti con topi bianchi o ratti. Dopo 2-3 giorni, Trichinella sessualmente matura può essere trovata nel contenuto duodenale e dopo 2-3 settimane, larve nei muscoli del diaframma e della lingua.

Sezioni istologiche. Pezzi di muscoli sono fissati in Bouin, Zenker o altri fluidi; nel solito modo le sezioni vengono preparate su un microtomo e colorate con ematossilina di Delafield.

Identificazione dei cisticerchi

Si esamina ad occhio nudo un pezzo di muscolo asportato, tessuto connettivo, ecc., si isola accuratamente un cisticerco, una vescicola traslucida biancastra di 1-2 cm, frantumata tra due vetrini in una goccia di glicerina ed esaminata sotto microscopio. Per determinare la vitalità dei cisticerchi isolati dai tessuti, questi vengono conservati in una soluzione al 50% di bile per fiziolo. soluzione in termostato a t° 37°; dopo 10-60 min. la testa di un cisticerco vitale si gira verso l'esterno. I cisticerchi calcificati vengono preventivamente decalcificati con una soluzione al 4% di acido nitrico per un'ora.

Rilevamento di uova schistosome

a hron, forme di schistosomatosi, quando la formazione di granulomi impedisce il rilascio di uova dai tessuti nel lume intestinale o nel tratto urinario, viene utilizzata una biopsia della mucosa rettale, che viene eseguita con un cucchiaio speciale utilizzando un rettoscopio, scegliere un sito con una lesione visibile. Il pezzo di biopsia viene schiacciato tra due vetrini ed esaminato al microscopio. Se il risultato è negativo, i pezzi vengono chiarificati in una soluzione al 4% di alcali caustici e da essi viene preparato il gistol. fette. Una biopsia della mucosa del digiuno viene eseguita per via orale e il materiale risultante viene esaminato con il metodo di compressione o gistol, le sezioni vengono preparate da esso. In alcuni casi di schistosomiasi urogenitale, la diagnosi può essere fatta solo sulla base di una biopsia endovescicale. Con la forma epatolienale della schistosomiasi, viene eseguita una biopsia per puntura del fegato; gistol, le sezioni vengono preparate dal materiale ottenuto ed esaminate al microscopio a fluorescenza. Un microscopio a fluorescenza con un campo scuro di utilizzo e per l'esame del tessuto epatico alla ricerca di uova di schistosoma. Quando gli schistosomi colpiscono il tratto genitale femminile, la secrezione viene raccolta utilizzando uno specchio vaginale o pezzi di mucosa della cervice vengono prelevati con un cucchiaio affilato; il materiale ricevuto è esaminato sotto un microscopio su vetro in una goccia fiziol, soluzione.

Ricerca su enterobiasi e teniidosi

Raschiamento perianale (si consiglia di assumere la sera, 1 - 1,5 ore dopo che il paziente è andato a letto o la mattina prima di andare in bagno). Con un fiammifero tagliato obliquamente e inumidito in una goccia di liquido (fiziol, soluzione, acqua bollita o soluzione al 2% di bicarbonato), applicato su un vetrino, lo faccio con attenzione? raschiando dalla mucosa dell'ano e dalle pieghe attorno ad esso (dal centro verso l'esterno). Il muco raccolto alla fine della partita viene raschiato via con il bordo del vetrino in una goccia di liquido sul vetrino e, coperto con lo stesso vetrino, viene esaminato. Durante gli esami di massa, quando i raschietti vengono prelevati nei bambini o in altre istituzioni, il fiammifero usato viene posto in una goccia di liquido su un vetrino, dopo l'asciugatura, le gocce vengono coperte con un altro vetrino e consegnate al laboratorio, avvolte in carta e fissate con un elastico. Per lo studio del muco rettale viene utilizzato un dispositivo speciale: un tubo Shakhmatov o Ziemann, con il quale viene prelevato il muco dal retto e gli strisci vengono esaminati al microscopio.

Metodo del batuffolo di cotone. Ai pazienti viene data una provetta con un batuffolo di cotone su un bastoncino di vetro o di legno a casa; al mattino il paziente pulisce le pieghe perianali con un tampone inumidito acqua bollita e metterlo in una provetta con una piccola quantità di acqua. In laboratorio, i tamponi vengono risciacquati nella stessa provetta con una nuova porzione di acqua e il sedimento viene esaminato dopo la centrifugazione.

Metodo del cellophane di Hall (M.C. Hall, 1937). Un pezzo quadrato di cellophane è rinforzato con un elastico su una bacchetta di vetro. La raschiatura viene eseguita con cellophane secco e posta in una provetta. In laboratorio si sposta leggermente il cellophane dal bastoncino e, tagliandone la punta con le forbici, lo si raddrizza su un vetrino; inumidito con una soluzione decinormale di idrossido di sodio, coperto con un coprioggetto ed esaminato al microscopio.

Metodo del nastro di cellulosa di Graham (C. F. Graham, 1941). Una striscia di nastro di cellulosa viene premuta con il suo lato adesivo alle pieghe perianali del soggetto, quindi con lo stesso lato al vetrino ed esaminata senza vetrino coprioggetto; puoi aggiungere una goccia di toluene. VV Kaledin (1972) ha proposto di usare con questi scopi dischi di celluloide tagliati da film a raggi lavato e inumiditi con glicerina; i dischi vengono esaminati su un vetrino in una goccia di colla ai silicati. Il metodo del nastro di cellulosa può essere utilizzato anche per esaminare la biancheria intima dei bambini.

Raschiamento subungueale. I bordi dell'unghia, il letto ungueale, gli spazi subungueali vengono inumiditi con una soluzione allo 0,5-1% di alcali caustici e puliti con tamponi di cotone bagnati. I tamponi vengono posti in provette da centrifuga con la stessa soluzione, centrifugati e si esamina il sedimento.

Metodi di ricerca sugli oggetti ambiente su uova e larve di elminti (studi sanitari ed elmintologici)

La ricerca viene effettuata per determinare il grado di contaminazione degli oggetti con uova e larve di elminti ambiente esterno. L'uso di dati ricevuto per una valutazione una dignità. lo stato delle istituzioni e delle imprese e l'efficacia delle misure in corso per combattere l'elmintiasi.

Quando si studia il grado di contaminazione di vari oggetti ambientali con uova e larve di elminti e si valuta il loro ruolo nell'epidemiologia dell'elmintiasi, è importante stabilire non solo il numero di uova trovate, ma anche la loro vitalità e invasività, che sono determinate: a ) per apparenza, al microscopio; b) colorazione con vari coloranti, compresi quelli luminescenti; di norma, le uova e le larve vive non si macchiano; c) coltivazione in condizioni ottimali fino allo stadio invasivo; d) infezione di animali da laboratorio (saggio biologico).

Studi di acqua e fognature. Per uno studio vengono utilizzati 10-25 litri di acqua (fiumi, mari, stagni, piscine, condutture dell'acqua) e 1-2-5 litri di acque reflue.

Metodo 3. G. Vasilkova (1941). L'acqua o le acque reflue vengono filtrate attraverso ultrafiltri a membrana in un apparato Goldman, che consiste in un imbuto di vetro o metallo con filtri collegati da un anello ugello a un pallone Bunsen. Per accelerare il processo di filtrazione, una pompa a vuoto è collegata all'apparecchio. Dopo la filtrazione, i filtri a membrana vengono esaminati al microscopio, dopo essere stati chiarificati con una soluzione di glicerolo al 50%; il sedimento accumulato viene ripulito e visualizzato separatamente sotto forma di macchie. Vengono utilizzati dispositivi di filtrazione e altri design.

Il metodo di G. Sh. Gudzhabidze e G. A. Yudin (1963) per lo studio del fluido di scarico. 1 litro di liquido viene depositato per 2 ore in un cilindro Lisenko; il sedimento risultante (5-9 ml) viene trattato come nello studio del suolo (vedi sotto).

Metodo N. A. Romanenko (1967). A 1 litro di liquido di scarto posto in un cilindro di vetro con una capacità di 1200-1500 ml, aggiungere 0,4-0,6 g di solfato di alluminio o cloruro ferrico (ai fini della coagulazione, che accelera il processo di sedimentazione delle particelle sospese) e dopo 40 minuti. la miscela viene centrifugata per 3 minuti. a 1000 giri/min; lo strato superiore viene drenato e per sciogliere i fiocchi si aggiungono 1-2 ml di una soluzione al 3% di acido cloridrico, quindi 150 ml di una soluzione satura di nitrato di sodio. Il sedimento viene esaminato come il suolo.

Ricerca del suolo

Viene determinata la contaminazione del suolo con uova di elminti al fine di identificare i focolai di elmintiasi e valutare l'efficacia della loro riabilitazione.

Metodo 3. G. Vasilkova e V. A. Gefter (1948). 12,5 g di terreno vengono mescolati in provette (100 ml) di acciaio inossidabile o ottone con 20 ml di soluzione alcalina caustica al 5%, aggiungendo 10 perle di vetro o piccoli sassolini. I tubi vengono chiusi con tappi di gomma e agitati per 20 minuti. in uno shaker o a mano. Tolti i tappi, si centrifugano le provette per 3-5 minuti, si drena il liquido superficiale, si aggiungono al sedimento 60-80 ml di una soluzione satura di nitrato di sodio e, dopo aver accuratamente miscelato, si centrifuga nuovamente per 3-5 minuti. In questa superficie il film con le uova galleggianti viene rimosso toccando la superficie della miscela con un anello complesso (5-6 anelli collegati su un'asta comune) e trasferito in un bicchiere d'acqua; miscelato con la stessa soluzione, centrifugato; l'intera procedura viene ripetuta almeno 3 volte. Il contenuto del bicchiere, dove viene trasferita la pellicola, viene diluito con acqua e filtrato attraverso filtri a membrana, che vengono esaminati al microscopio in una goccia di glicerolo.

Metodo 3. G. Vasilkova e V. A. Gefter modificato da A. A. Namitokov (1961) differisce dal metodo principale in quanto invece di studiare le preparazioni del film, viene utilizzata metà del contenuto del tubo (aggiungendo ogni volta una nuova porzione di una soluzione satura di sodio nitrato), filtrato ed esamina i filtri.

N. A. Romanenko (1968) raccomanda di esaminare campioni di suolo e fanghi di depurazione per le uova di elminti utilizzando l'apparato proposto da G. Sh. Gudzhabidze. 50 g di terreno vengono accuratamente miscelati per 1 min. in 150 ml di acqua in provette da centrifuga (capacità 250 ml) con lame speciali, azionate da un motore elettrico. La miscela viene centrifugata per 3 minuti. a 1000 rpm si scarica l'acqua e, aggiungendo 150 ml di una soluzione satura di nitrato di sodio, si agita e si centrifuga nuovamente per 3 minuti. Le provette con i campioni vengono poste su un supporto, viene aggiunta una soluzione di nitrato di sodio fino a formare un menisco convesso, coperto con vetrini (10 x 6 cm) e messo da parte per 10-15 minuti, quindi gli occhiali vengono rimossi ed esaminati; la procedura viene ripetuta almeno 4 volte.

Ricerca sulle larve di elminti secondo il metodo di Bermann (1917). 200-400 g di terreno vengono posti in un pezzo di garza su una rete metallica (con un diametro del foro di 1-2 mm) posta sulla parte larga di un imbuto di vetro fissato su un treppiede. Un tubo di gomma con un morsetto è teso sull'estremità stretta dell'imbuto. L'imbuto viene riempito con acqua calda (t ° 50 °) in modo che la parte inferiore della maglia con il terreno entri in contatto con l'acqua. A causa della termotropia, le larve strisciano attivamente nell'acqua calda e, depositandosi, si accumulano nella parte inferiore del tubo di gomma sopra il morsetto. Dopo 3-4 ore, 50 ml del contenuto vengono rilasciati dall'imbuto in una provetta, centrifugati e si esamina il sedimento.

Ricerca di ortaggi, frutta e bacche

Indagare principalmente verdure, bacche e frutti, mangiati senza trattamento termico. Metodo 3. G. Vasilkova (1948). 5-10 pezzi di frutta o verdura (circa 0,5 kg) o 100-200 g di verdure (lattuga, cipolle verdi) vengono versati per diverse ore con acqua in barattoli di vetro a bocca larga con tappi macinati e agitati per 10-20 minuti . in uno shaker o a mano. L'acqua viene scaricata, gli oggetti di prova vengono risciacquati acqua pulita e tutta l'acqua di lavaggio viene filtrata nell'apparato Goldman; i filtri vengono esaminati mediante chiarificazione con glicerina. Puoi colorare i filtri con la soluzione di Lugol al 25% in glicerina; mentre le uova di elminti vengono colorate colore marrone e sono facilmente riconoscibili tra i grani di amido tinti in Colore blu. Il sedimento di grandi dimensioni viene trattato come il suolo.

Studio dei tamponi da oggetti domestici e mani. Si passa ripetutamente sull'oggetto o sulle mani in esame uno spazzolino di colla (o un batuffolo di cotone avvolto in un pezzo di tessuto di nylon) imbevuto di una soluzione al 2% di bicarbonato di sodio, dopodiché si risciacqua nella stessa soluzione versata in un provetta. In laboratorio, spazzole e tamponi vengono risciacquati con acqua pulita; tutta l'acqua di lavaggio viene centrifugata e il sedimento viene esaminato.

Metodo VA Gefter (1960). È più efficiente raccogliere la polvere da attrezzature morbide con un aspirapolvere collegato a un imbuto, composto da 2 parti staccabili: un filtro a membrana è posto sulla superficie della parte inferiore coperta da una rete metallica o plastica e rinforzata parte superiore imbuti. L'imbuto assemblato è fissato al tubo dell'aspirapolvere con un tubo di gomma. La polvere viene raccolta dall'oggetto per 3 minuti, dopodiché il filtro viene rimosso e sostituito con uno nuovo. In laboratorio, i filtri vengono osservati al microscopio dopo essere stati chiarificati con glicerina. Se lo strato di polvere sul filtro è grande, viene raschiato via e visto come macchie o trattato come terra.

Metodi diagnostici immunologici

Possibilità di utilizzo immunol. metodi per diagnosticare le elmintiasi è dovuto alla capacità degli elminti di produrre antigeni attivi che influenzano le cellule immunocompetenti dell'ospite e stimolano la produzione di anticorpi. I metodi immunodiagnostici più efficaci per le elmintiasi intestinali, quando i segreti e le escrezioni degli elminti con attività antigenica entrano direttamente nel sangue dell'ospite. Immunol, le reazioni sono utilizzate per diagnosticare ascariasis, trichinosi, filariosi, schistosomatosi, echinococcosi e alveococcosi, cisticercosi, paragonimiasi, il complesso di sintomi larva migrans- (toxocariasi, angiostrongilosi), ecc. Applicare vari sieroli, test (reazioni di precipitazione, agglutinazione, fissazione del complemento , anticorpi fluorescenti ) e test allergologici intradermici. Gli antigeni vengono preparati da larve ed elminti maturi utilizzando estratti salini di omogenati di tessuti appena congelati o liofilizzati, nonché vari fluidi biologicamente attivi (fluido da vescicole echinococciche, fluido cavitario di ascaridi, ecc.). A causa del fatto che gli elminti hanno una struttura antigenica molto complessa e nel loro mosaico antigenico ci sono componenti e determinanti individuali che reagiscono in modo incrociato con altri tipi di elminti, batteri e antigeni dell'ospite, si stanno sviluppando metodi per purificarli da componenti non specifici. Viene eseguito il frazionamento metodi diversi: gel filtrazione in colonne con Sephadex, cromatografia a scambio ionico su DEAE-Sephadex, trattamento con acidi, ecc. Gli antigeni frazionati hanno solitamente una specificità maggiore rispetto agli estratti interi, mentre la loro attività è approssimativamente la stessa. I metodi immunodiagnostici trovano tutto maggiore applicazione. Le reazioni sono utilizzate non solo per la diagnosi più completa e precoce dei pazienti, ma anche per lo studio dei focolai e lo studio dell'epidemiologia delle elmintiasi.

Reazioni sierologiche. La reazione di microprecipitazione su larve vive viene utilizzata per diagnosticare i nematodi: la fase preimmaginale di ascariasis, anchilostomidosi, trichinosi. La reazione diventa positiva 5-10 giorni dopo l'infezione (ascariasis, anchilostomidosi) e persiste per 90-100 giorni. L'antigene è costituito da larve vive di nematodi isolate dai tessuti di animali da laboratorio infettati sperimentalmente. Le larve selezionate vengono accuratamente lavate dalle proteine ​​dell'ospite con fiziolo sterile, soluzione e acqua distillata e 10-15 copie ciascuna. posizionato con una pipetta Pasteur su un vetrino sterile con pozzetto. Applicare 2-3 gocce del siero del test, coprire con un vetrino coprioggetto sterile, collocare in una camera umida (capsula di Petri rivestita con carta da filtro inumidita) e incubare per 24-48 ore. in un termostato a t° 37°. Con una reazione positiva a basso ingrandimento del microscopio, sono visibili intorno alla bocca e buchi anali larve bianco-grigiastre, masse di precipitati leggermente opalescenti di forma sferica oa zig-zag. L'efficienza della reazione raggiunge l'85-95%.

La reazione di precipitazione dell'anello è stata sviluppata da V. P. Pashuk (1957) per la diagnosi della trichinosi. La reazione diventa positiva alla 2-3a settimana di malattia. La sua efficienza raggiunge l'80-90%. L'antigene è un estratto in polvere di larve essiccate a t° 35° isolate dai muscoli di animali infetti. In provette diam. 0,5 cm versare 0,1 ml di ciascuna diluizione dell'antigene e sovrapporre accuratamente su di esso (o abbassarlo sul fondo) una quantità uguale del siero del test in modo che i liquidi non si mescolino. I tubi vengono tenuti per 30 minuti. in termostato a t° 37°, e poi 30-60 min. a temperatura ambiente. Con una reazione positiva, al confine di contatto tra l'antigene e il siero appare un delicato anello biancastro, che si disintegra facilmente se agitato.

La reazione di precipitazione nel gel secondo Ouchterlony (O. Ouchterlony, 1949) nella micromodificazione di A. I. Gusev e V. S. Tsvetkov è stata proposta da I. A. Ginovker, E. A. Zabozlaeva, A. V. Doronin (1970) per la diagnosi delle prime fasi dell'optorchiasi. Secondo i dati preliminari, la sua efficienza è dell'87%. L'antigene è un estratto di un omogenato di opisthorchis sessualmente maturo appena congelato isolato dal fegato dei gatti.

La reazione dell'emoagglutinazione indiretta (vedi) con un diagnosticum - una sospensione di eritrociti di ariete formalizzati e tanizzati sensibilizzati dal fluido echinococcico - sviluppata

LN Stepankovskaya (1972) per la diagnosi di echinococcosi e alveococcosi.

RNHA con un diagnostico di eritrociti di pecora formalizzati sensibilizzati con un estratto di un omogenato di cisticerchi freschi congelati di tenia suina è stato proposto da L. M. Konovalova (1973) per la diagnosi di cisticercosi cerebrale; è efficace nell'85% dei casi.

RNHA con ascaris diagnosticum è proposto per la diagnosi della fase preimmaginale dell'ascariasi.

La reazione di fissazione del complemento (vedi) viene posta secondo il solito metodo e viene utilizzata per diagnosticare la trichinosi e la cisticercosi.

Metodo degli anticorpi luminescenti (metodo indiretto). Questo metodo con omogenato secco sgrassato di cisticerchi di tenia suina come antigene, fissato su un vetrino, è stato sviluppato da JI. M. Konovalova (1973) per la diagnosi di cisticercosi umana. La stessa reazione con gistol, sezioni di larve di Trichinella come antigene è stata sviluppata per la diagnosi di trichinosi.

ES Leykina, VA Gefter.

Quando si trovano uova di elminti su vari oggetti ambientali (suolo, acqua, verdure, ecc.), è sempre necessario determinarne la vitalità in base all'aspetto, alla colorazione con coloranti vitali, alla coltivazione in condizioni ottimali e all'allestimento di un campione biologico, ad es.

Alimentazione degli animali da laboratorio.

Determinazione della vitalità di uova o larve di elminti in apparenza. Le uova di elminto vengono microscopiche prima a basso ingrandimento, poi ad alto ingrandimento. Nelle uova deformate e morte di elminti, il guscio è lacerato o piegato verso l'interno, il plasma è torbido, allentato. Nelle uova segmentate, le sfere di scissione (blastomeri) sono di dimensioni disuguali, di forma irregolare e spesso spostate su un polo. A volte ci sono uova anormali che, avendo deformità esterne, si sviluppano normalmente. Nelle larve viventi di ascaridi, la fine granularità è presente solo nella parte centrale del corpo, mentre muoiono, la granularità si diffonde in tutto il corpo, compaiono grandi vacuoli ialini lucenti - i cosiddetti fili di perle.

Per determinare la vitalità delle uova mature di ascaridi, tricocefali, ossiuri, i movimenti attivi delle larve dovrebbero essere causati riscaldando leggermente la preparazione (a una temperatura non superiore a 37 ° C). È più conveniente osservare la vitalità delle larve di ascaridi e tricocefali dopo che sono state isolate dal guscio dell'uovo premendo sul vetro di copertura della preparazione con un ago da dissezione o una pinzetta.

Nelle larve invasive di ascaridi, si vede spesso un cappello che si è staccato all'estremità della testa, e nelle larve di tricocefali che hanno completato lo sviluppo nell'uovo, in questo punto si trova uno stiletto ad alto ingrandimento. Nelle larve morte di elminti, indipendentemente dalla loro posizione (nell'uovo o al di fuori di esso), si nota il decadimento del corpo. In cui struttura interna la larva diventa grumosa o granulosa e il corpo è torbido e opaco. I vacuoli si trovano nel corpo e le rotture si trovano sulla cuticola.

La vitalità delle oncosfere tenidi (tenia bovina, suina, ecc.) è determinata dal movimento degli embrioni esposti a enzimi digestivi. Le uova vengono poste su un vetro da orologio con succo gastrico di cane o succo duodenale artificiale. La composizione di quest'ultimo: pancreatina 0,5 g, bicarbonato di sodio 0,09 g, acqua distillata 5 ml. Gli occhiali con le uova vengono posti in un termostato a 36-38 ° C per 4 ore, in questo caso gli embrioni viventi vengono liberati dai gusci. I gusci delle oncosfere viventi si dissolvono anche nella pepsina acidificata e in soluzione alcalina tripsina dopo 6-8 ore in termostato a 38 °C.

Se le uova tenidi vengono poste in una soluzione all'1% di solfuro di sodio, o una soluzione al 20% di ipocloruro di sodio, o in una soluzione all'1% di acqua di cloro a 36-38 ° C, gli embrioni maturi e vivi vengono liberati dai gusci e non non cambiare per 1 giorno. Le oncosfere immature e morte si restringono o si gonfiano e aumentano bruscamente, quindi "si dissolvono" entro 10 minuti - 2 ore Anche gli embrioni vivi di tenidi si muovono attivamente in una miscela di soluzione di cloruro di sodio all'1%, soluzione di bicarbonato di sodio allo 0,5% e bile a 36- 38 °C.

La vitalità di skolex echinococci è determinata con un basso riscaldamento. Per fare ciò, gli scolici o le capsule di covata lavate in acqua vengono poste in una goccia d'acqua su un vetrino forato, coperte con un coprioggetto ed esaminate al microscopio con stadio di riscaldamento a una temperatura di 38-39 ° C. Se non è presente un tavolo riscaldante, la preparazione viene riscaldata utilizzando qualsiasi fonte di calore. Allo stesso tempo, gli scolici vitali si muovono attivamente, riducendo o rilassando le ventose, allungando e accorciando la proboscide. Se metti scolice nello 0,5-1% soluzione acquosa filicilene a temperatura ambiente, quindi tutti gli scolici vitali si riveleranno rapidamente e moriranno. skoleks non vitali non si presentano.

La vitalità della fasciolia adolescariae raccolta da piante e altri oggetti di corpi idrici viene verificata esaminandoli su un vetrino in soluzione salina al microscopio con uno stadio di riscaldamento. Quando riscaldate, le larve di trematodi nella cisti iniziano a muoversi.

La vitalità delle uova della tenia nana è determinata dalla posizione dei ganci sull'embrione.

Nelle uova vive della tenia pigmea, i lenti movimenti pendolari del protoplasma e le estensioni e gli spostamenti quasi impercettibili delle estremità appuntite della coppia laterale di uncini si allontanano dalla coppia centrale.

Le contrazioni del protoplasma dell'embrione e degli uncini germinali aiutano l'embrione a liberarsi prima dai gusci dell'oncosfera, e poi dal guscio esterno dell'uovo.

In un uovo vivo, la coppia mediana e le coppie laterali di uncini sono disposte in parallelo; in alcune uova, le lame delle coppie laterali sono accostate e si trovano ad un angolo inferiore a 45° rispetto alla coppia media di uncini.

L'embrione morente si contrae convulsamente e spinge lentamente gli uncini. Nell'embrione morto, il movimento degli uncini si arresta, e sono disposti in modo disordinato, a volte gli uncini laterali alla coppia vicina sono allontanati ad angolo retto, ottuso o acuto.

A volte si osservano le rughe dell'embrione, la formazione di granularità. Un metodo più accurato si basa sulla comparsa di movimenti dell'oncosfera durante un brusco cambiamento di temperatura: da 5-10 a 38-40 °C.

La determinazione della vitalità dei nematodi immaturi dovrebbe essere studiata in una camera umida (piastre di Petri), ponendo le uova di ascaridi in una soluzione di formalina al 3% preparata in una soluzione isotonica di cloruro di sodio a una temperatura di 24-30 ° C, le uova di tricocefali in una soluzione al 3% soluzione di acido cloridrico a una temperatura di 30-35 ° C, uova di ossiuri in una soluzione isotonica di cloruro di sodio a una temperatura di 37 "C. Le piastre Petri devono essere aperte 1-3 volte a settimana per una migliore aerazione e inumidire nuovamente la carta da filtro con acqua pulita.

Le osservazioni sullo sviluppo delle uova di elminti vengono effettuate almeno 2 volte a settimana. L'assenza di segni di sviluppo entro 2-3 mesi indica la loro non fattibilità. I segni dello sviluppo delle uova di elminti sono prima le fasi della frantumazione, la divisione del contenuto dell'uovo in blastomeri separati. Durante il primo giorno si sviluppano fino a 16 blastomeri, che passano al secondo stadio - morula, ecc.

Le uova di anchilostoma vengono coltivate in un cilindro di vetro (50 cm di altezza e 7 cm di diametro) chiuso con un tappo. Una miscela di uguali volumi di sabbia sterile, carbone e feci con uova di anchilostoma, diluite con acqua fino a consistenza semiliquida, versate con cura sul fondo del cilindro mediante un tubo di vetro. Durante 1-2 giorni di deposizione al buio a una temperatura di 25-30 ° C, le larve rabditoidi si schiudono dalle uova e dopo 5-7 giorni diventano già filariformi: le larve strisciano lungo le pareti del cilindro, dove sono visibili anche ad occhio nudo. Le uova di trematodi che si sviluppano naturalmente in acqua, come opisthorchis, diphyllobotriid, fasciol, ecc., Vengono poste su un vetro da orologio, una capsula di Petri o in un altro recipiente, viene versato un piccolo strato di acqua normale. Quando si coltivano le uova di fasciola, va tenuto presente che si sviluppano più velocemente al buio, mentre il miracidium si forma nelle uova vive a una temperatura di 22-24 ° C in 9-12 giorni. Quando si osserva al microscopio lo sviluppo di uova di trematodi, i movimenti del miracidio sono chiaramente visibili. Fasciola miracidium emerge dai gusci delle uova solo alla luce. Durante la coltivazione, l'acqua viene cambiata dopo 2-3 giorni.

Le larve di anchilostomi e gli strongiloidi vengono coltivati ​​su agar in una capsula di Petri con carbone animale. Dopo essere state in un termostato alla temperatura di 26-30°C per 5-6 giorni, le larve si sono diffuse sull'agar, lasciando dietro di sé un percorso di batteri (metodo Fülleborn).

Metodo di Harada e Mori (1955). 7 ml di acqua distillata vengono aggiunti a provette poste in un rack. Prelevare 0,5 g di feci con un bastoncino di legno e fare uno striscio su carta filtro (15X150 mm) a 5 cm dal bordo sinistro (questa operazione va eseguita su un foglio di carta per proteggere la superficie del tavolo del laboratorio). Quindi la striscia con lo striscio viene inserita nella provetta in modo che l'estremità sinistra libera dallo striscio raggiunga il fondo della provetta. L'estremità superiore è ricoperta da un pezzo di cellophane e strettamente avvolta da un elastico. Sulla provetta scrivere il numero e il cognome del soggetto. In questo stato le provette vengono conservate per 8-10 giorni ad una temperatura di 28 °C. Per studiare la cultura, rimuovere e rimuovere il coperchio di cellophane e rimuovere una striscia di carta da filtro con una pinzetta. Occorre prestare attenzione in questo caso, poiché un piccolo numero di larve infettive può spostarsi verso l'estremità superiore della carta da filtro o verso la parete della provetta e penetrare sotto la superficie del cellophane.

Le provette vengono poste in un bagno di acqua calda a 50°C per 15 minuti, dopodiché il contenuto viene agitato e versato rapidamente in una provetta da 15 mL per far precipitare le larve. Dopo la centrifugazione, il surnatante viene rimosso e il precipitato viene trasferito su un vetrino, coperto con un vetrino coprioggetto e analizzato al microscopio a basso ingrandimento.

Per la diagnosi differenziale delle larve filariformi è necessario utilizzare i dati presentati in Tabella. 13.

Metodi per la colorazione di uova e larve di elminti. I tessuti morti nella maggior parte dei casi percepiscono i colori più velocemente di quelli vivi. Queste caratteristiche sono utilizzate in elmintologia per determinare la vitalità di uova e larve di elminti. Tuttavia, in alcuni casi, alcune vernici sono percepite meglio dai tessuti vivi che da quelli morti.

Tabella 13 Diagnosi differenziale larve filamentose di A.duodenale, N.americanus, Strongyloides stercoralis, Trichostrongylus spp.

Per il riconoscimento differenziale di uova e larve vive e morte, vengono utilizzati i seguenti colori e metodi.

Il blu di metilene leucobase viene utilizzato per colorare i tessuti vivi e morti. Una cellula o un tessuto vivente riduce il blu di metilene a una leucobase incolore; il tessuto morto non ha questa capacità e quindi acquisisce un colore.

Per colorare le uova di Ascaris, puoi usare il blu di metilene in una soluzione di acido lattico con alcali caustici (blu di metilene 0,05 g, soda caustica 0,5 g, acido lattico 15 ml). Le uova vive non percepiscono il colore, gli embrioni delle uova morte diventano blu.

Il metodo di colorazione non è applicabile alle uova immature di ascaridi e tricocefali; il guscio pigmentato è macchiato e quindi non è visibile se la cellula germinale all'interno dell'uovo si è macchiata.

Le larve di Ascaris sono colorate con una soluzione basica di vernice blu cresile brillante ad una concentrazione di 1:10 LLC. nel seguente modo: una goccia di liquido con uova di ascaridi e una goccia della soluzione pittorica principale vengono applicate su un vetrino. La preparazione è coperta con un coprioggetto, che viene premuto saldamente sull'oggetto picchiettando leggermente con un ago da dissezione. Al microscopio si osserva il numero di larve schiuse e il grado della loro colorazione, dopodiché la stessa preparazione viene nuovamente esaminata dopo 2-3 ore.Sono considerate vive solo le larve non deformate che non si sono macchiate per 2 ore.Le larve morte si colorano quando il guscio si rompe (parzialmente o completamente).

È indicata la possibilità di colorare i preparati con soluzione di iodio nel determinare la vitalità delle uova di uccelli ascaridi. In questo caso, come colorante viene utilizzata una soluzione alcolica al 5% di iodio. Quando viene applicato al farmaco, gli embrioni delle uova di ascaridi morti diventano arancioni entro 1-3 secondi. Le uova morte di opisthorchis e le oncosfere di tenia bovina vengono colorate con una soluzione di blu di toluidina (1:1000) e le oncosfere morte di tenia bovina vengono colorate con una soluzione di blu cresile brillante (1:10.000). Allo stesso tempo, gli embrioni e i gusci delle uova morte e vive acquisiscono colore. Pertanto, dopo la colorazione, le uova e le oncosfere vengono lavate acqua pulita e inoltre colorato con safranina (a una diluizione di 1:10.000 con una soluzione alcolica al 10%). L'alcol rimuove il colorante dai gusci e la safranina conferisce loro un colore rosso. Di conseguenza, le uova vive sono macchiate di rosso, l'embrione delle uova morte è blu e il guscio rimane rosso. Embrioni morti di oncosfere di tenia bovina rapidamente, entro pochi minuti, si colorano di rosso vivo o rosa con safranina o di blu con diamante-cresyl blue a una diluizione di 1:4000 o con indaco carminio a una diluizione di 1:1000-1: 2000.

Gli embrioni vivi non cambiano sotto l'influenza di questi colori anche dopo 2-7 ore.

Per determinare la vitalità delle uova di tenia pigmeo, si consiglia di utilizzare le seguenti vernici: 1) blu cresile brillante (1: 8000) - dopo 1 ora, l'oncosfera delle uova morte è macchiata in modo particolarmente brillante, che risalta nettamente su un pallido o sfondo incolore del resto dell'uovo; 2) safranina: alla diluizione 1:8000 se esposta per 2 ore e 1:5000 per 3-5 ore; 3) Soluzione al 50% di acido pirogallico a una diluizione di 1:2 - se esposto per 1 ora a una temperatura di 29-30 ° C (più bassa è la temperatura, più lungo è il processo di colorazione).

I plerocercoidi vivi della tenia si colorano molto bene con una soluzione acquosa (1:1000) di bocca neutra per 5-20 minuti. Per ottenere un colore rosa persistente che non scompaia entro 5 giorni e non pregiudichi la mobilità dei plerocercoidi, di solito bastano 10 minuti. Il grado di colorazione viene controllato osservando le larve in soluzione isotonica pura di cloruro di sodio, per la quale i plerocercoidi vengono periodicamente rimossi dalla vernice. Si consiglia di utilizzare il blu di metilene per colorare i plerocercoidi morti.

RE Chobanov e altri (1986) hanno proposto un metodo per determinare la vitalità di uova e larve di elminti utilizzando il pigmento rubrin ottenuto coltivando il fungo Peniciliium rubrum come colorante. Per fare ciò, utilizzare una soluzione colorante acquosa al 3%.

Il processo di colorazione delle uova e delle larve è completato dopo 1,5 ore: le uova non vitali di ossiuri, tenie bovine e nane, anchilostomidi, tricostrongilidi acquisiscono un colore rosa intenso, le larve di anchilostomidi e tricostrongilidi diventano rosse. Un colore meno brillante si osserva nelle uova di ascaridi e tricocefali, poiché, sporgendosi dall'intestino, hanno già un colore marrone scuro: le uova e le larve vitali non si macchiano.

Metodi fisico-chimici per stimolare il rilascio di miracdia dalle uova di trematodi. I metodi sono stati sviluppati da SM German e SA Beer (1984) per determinare la vitalità delle uova di opisthorchia e dicrocelium esponendo le uova al mezzo di reazione. Se sono vivi, esce il miracidium. I metodi si basano sull'attivazione fisico-chimica della ghiandola da cova del miracidio e sulla stimolazione attività motoria larve. La stimolazione si ottiene esponendo le uova di trematode a uno speciale mezzo di reazione in combinazione con metodi successivi: creazione di una differenza di temperatura, essiccazione di una sospensione di uova, esposizione a una debole corrente di liquido nella goccia di prova, che contribuisce al rilascio di massa di miracidi da uova.

Determinazione della vitalità delle uova di opistorch con il metodo di Herman, Beer. Una sospensione di uova in acqua (rubinetto, decantata) viene preraffreddata a 10-12 ° C. Tutte le successive operazioni vengono effettuate a temperatura ambiente (18-22 °C). Una goccia (circa 0,05 ml) di una sospensione contenente 100-400 uova viene aggiunta a una provetta da centrifuga. Le provette vengono poste in un rack per 5-10 minuti per far precipitare le uova. Poi striscia stretta carta da filtro aspirare accuratamente l'acqua in eccesso fino a rimuoverla completamente. 2 gocce del terreno vengono aggiunte alla provetta, agitate, il contenuto viene trasferito con una pipetta su un vetrino e lasciato per 5-10 minuti, agitando leggermente (o posto sotto un asciugacapelli) per creare deboli correnti di liquido nel calo della sospensione in fase di studio. Questa operazione, che imita la peristalsi intestinale di un mollusco, permette di attivare il rilascio di miracidi. Successivamente, alla sospensione vengono aggiunte altre 2 gocce del terreno, quindi la preparazione viene esaminata al microscopio utilizzando un microscopio ottico convenzionale (X200). Durante questo periodo, le uova con miracidi vitali dovrebbero aprire il coperchio, mentre la larva emerge attivamente nell'ambiente. A causa della presenza di etanolo in esso, il miracidium viene immobilizzato in 3-5 minuti e quindi colorato con un colorante nel mezzo. Di conseguenza, i miracidi vengono facilmente rilevati e contati.

Preparazione del mezzo di reazione. Il mezzo viene preparato in tampone Tris-HCi 0,05 M in condizioni di pH ottimali di 8,0-9,5. L'etanolo viene aggiunto al tampone fino al 10-13% e colorante (safranina, blu di metilene e altri che lavorano nell'intervallo di pH) fino a colorazione debole liquido (ad esempio, per la safranina, la sua concentrazione finale sarà 1:50.000). È possibile utilizzare un altro tampone che funzioni nell'intervallo di pH alcalino, ad esempio fosfato 0,05 M (pH 8,5). Pertanto, il terreno contiene il 96% di etanolo - 12 parti; colorante (soluzione madre) - 1-10 parti; 0,05 M tris-HC! tampone (pH 8,5-9,5) - fino a 100 parti. Esempio medio: 12 parti di etanolo al 96%, 1 parte di soluzione safranina safranina, il resto fino a 100 parti - tampone Tris-HCl 0,05 M, pH 9,5.

Determinazione della vitalità delle uova dicrocelium mediante il metodo di Herman, Beer, Stratan. Una goccia di sospensione contenente 100-150 uova di trematodi viene posta in una provetta da centrifuga per 1-2 minuti per depositare le uova. Il liquido viene poi accuratamente asciugato con una striscia di carta da filtro. Aggiungere 1-2 gocce del mezzo di reazione con una pipetta Pasteur e incubare a bagnomaria a 28-30 °C per 2-3 minuti. Composizione del terreno: 6 parti di butanolo, 94 parti di soluzione di cloruro di sodio allo 0,4% o soluzione di cloruro di potassio allo 0,3% in acqua distillata. Le uova nel terreno vengono trasferite con una pipetta su un vetrino e lasciate per 1,5-2 ore a temperatura ambiente (18-22 °C), mentre ogni 25-30 minuti (man mano che si asciuga) si aggiungono 1-2 gocce (0,05 ml) soluzione di butanolo in acqua distillata. Successivamente, la preparazione viene microscopica a un ingrandimento di 100-200 volte. La vitalità è determinata dal numero di uova aperte con miracidi rilasciati. Il butanolo penetra attraverso i pori del guscio d'uovo, raggiunge i miracidi e li attiva. L'incubazione a una temperatura marcata migliora questo processo. Il butanolo ad una concentrazione del 3-7% è dannoso per il miracidium che è emerso dall'uovo. Il trasferimento di una sospensione di uova da una provetta a un vetrino consente, al momento dell'uscita del miracidium (dopo 30-40 minuti), di ridurre la concentrazione di butanolo dovuta alla volatilizzazione a un livello sicuro (1,5-0,5%). La presenza di cloruro di sodio nel mezzo ad una concentrazione di 0,1-0,5% (o cloruro di potassio ad una concentrazione di 0,05-0,4%) determina l'attività del miracidium rilasciato. A differenza delle piccole uova trasparenti di opisthorch, le uova di dicrocelium hanno un guscio di colore scuro; hanno un coperchio ben visibile, che si apre dopo il rilascio del miracidium. Pertanto, la vitalità delle uova di dicrocelium viene valutata più convenientemente contando le uova che si sono aperte, piuttosto che colorando e contando i miracidi.

Metodo luminescente per lo studio di uova e larve di elminti.

Per la prima volta nella pratica elmintologica, i metodi di microscopia a luminescenza furono applicati nel 1955. È stato riferito che la microscopia a luminescenza consente di differenziare oggetti vivi e morti senza danneggiare l'uovo. Per la fluorescenza non sono stati utilizzati i raggi UV, ma la parte blu-viola della luce visibile, con un microscopio convenzionale e vetrini; all'illuminatore "OI-18" è stato applicato insieme speciale filtri colorati.

È stato riscontrato che le uova vive e morte di ascaridi, ossiuri, tenie pigmee, tenie bovine, tenie larghe e altri elminti si illuminano in modo diverso. Questo fenomeno si osserva sia durante la luminescenza primaria senza l'uso di coloranti, sia quando colorato con fluorocromi (arancio di acridina, corifosfina, primulina, aurolina, berlerin solfato, tripaflavina, rivanolo, quinacrina, ecc.).

Le uova di nematodi vive non segmentate non verniciate brillano di un verde brillante con una sfumatura giallastra; nelle uova morte, il guscio si irradia luce verde molto più luminoso del germinale verde scuro; nelle uova di ascaridi con una larva compare solo il guscio, mentre nei morti sia il guscio che la larva sono di un giallo brillante.

Le uova vive non pigmentate e non segmentate di ossiuri e tenie pigmee emettono una luce giallo-verdastra; nelle uova morte, il guscio si illumina intensamente sullo sfondo di una massa embrionale verde scuro. Con la luminescenza secondaria (quando colorato con arancio di acridina a una diluizione di 1:10 OOO e 1:50 OOO da 30 minuti a 2 ore), il guscio di nematodi, trematodi e cestodi vivi e morti si illumina in modo diverso.

Il guscio di Ascaris lumbricoides vivi e morti, Toxocara leonina, Enterobius vermicularis, Hymenolepis nana, H.fraterna, H. diminuta, T.saginatus, D.latum diventa rosso-arancio. Embrioni di Asc viventi. lumbricoides, T.leonina, H.diminuta, D.latum e le oncosfere della tenia bovina si illuminano di un colore verde scuro opaco o verde-grigio. Gli embrioni morti di queste uova di elminti emettono una luce rosso-arancio "ardente". Le larve vive di ossiuri e i toxocar (gusci d'uovo) emettono una luce grigio-verde opaca e, quando muoiono, il colore cambia dall'estremità della testa a un verde chiaro "bruciante", quindi giallo, arancione e infine arancione brillante.

Se macchiato con fluorocromi - coryphosphyllum, primulin - nelle uova morte di ascaridi e tricocefali, si osserva un bagliore dal giallo lilla al rosso rame. Le uova vitali non si illuminano, ma diventano verde scuro. Le uova vive dei trematodi Paragonimus westermani e Clonorchis sinensis non si illuminano dopo la colorazione con arancio di acridina, mentre le uova morte emettono una luce verde giallastra.

Il metodo della luminescenza può essere utilizzato anche per determinare la vitalità delle larve di elminti. Quindi, fluorocromato con una soluzione di arancio di acridina (1:2000) larve di fortelato, bagliore di rabdita: vivo - verde (con una sfumatura), morto - luce arancione brillante. Le larve vive di Trichinella non brillano o danno un bagliore debole se trattate per 10 minuti con soluzioni di isotiocianato di fluoresceina, auramina, ecc. Le larve morte fluorocromizzate (a una concentrazione di 1:5000) danno un bagliore luminoso.

I miracidi viventi che sono emersi dal guscio emettono una fioca luce bluastra con una corolla di ciglia giallo chiaro appena percettibile, ma 10-15 minuti dopo la morte appaiono come una luce verde chiaro "ardente" e poi rosso-arancio.