Il meccanismo di reazione di precipitazione della reazione differisce dalla reazione. Reazione di precipitazione (metodo immunologico)
Consiste nell'interazione di un antigene solubile con un anticorpo, seguita dalla precipitazione di un precipitato a grana fine (precipitato).
La reazione di precipitazione consente di determinare la presenza di un antigene sconosciuto nel materiale di prova aggiungendo un anticorpo noto o utilizzando un antigene noto, un anticorpo sconosciuto. precipitazione andando peggio in assenza di sali. L'optimum di precipitazione è nell'intervallo di pH=7.0-7.4.
Il meccanismo della precipitazione è simile a quello dell'agglutinazione. Sotto l'influenza del sistema immunitario che ha reagito con l'antigene, il grado della sua dispersione diminuisce. Il siero e l'antigene devono essere completamente trasparenti. Quando si imposta la precipitazione, è possibile aggiungere diverse diluizioni dell'antigene a una diluizione del siero o viceversa.
La precipitazione si registra meglio se l'antigene è sovrapposto all'anticorpo nella provetta. In questo caso si osserva l'aspetto di un precipitato sotto forma di anello: precipitazione ad anello. La precipitazione dell'anello viene effettuata in provette speciali con un diametro di 2,5-3,5 mm. Per determinare il numero di antigeni nel materiale di prova o diversi anticorpi nel siero, viene utilizzata la reazione di precipitazione dell'agar: l'1% di agar chiarificato viene versato dentro o sopra i vetrini. Le soluzioni di antigeni e anticorpi vengono versate in diversi pozzetti realizzati in agar, che diffondono l'una verso l'altra formando linee di precipitazione. La reazione di precipitazione è ampiamente utilizzata nella diagnosi (vedi reazione di Ascoli).
La precipitazione in agar permette di determinare la tossigenicità delle colture di difterite.
IN ricerca forense la precipitazione serve a stabilire l'appartenenza di specie di sangue, organi e tessuti con l'ausilio di specifici sieri precipitanti.
Precipitazione - la reazione di precipitazione di un complesso di antigene (precipitinogeno) e anticorpi (precipitina). La precipitazione è uno dei fenomeni immunologici che consente di determinare il contenuto di anticorpi (vedi) nel siero del sangue di persone malate o vaccinate, nonché nel sangue di animali immunizzati. Quando si utilizzano sieri standard, la reazione di precipitazione può essere utilizzata per titolare antigeni solubili di varia origine (vedi).
Nella forma più semplice di impostazione della reazione di precipitazione, il siero in esame in una serie di diluizioni multiple viene aggiunto mediante stratificazione a una serie di provette con una quantità costante di antigene. Dopo 30-60 min. l'incubazione a temperatura ambiente al confine dei due liquidi formava un anello di torbidità - precipitazione ad anello. La quantità minima di siero che dà una reazione di precipitazione viene presa come titolo dell'antisiero. Quando la reazione viene invertita con un antisiero standard, è possibile stimare la concentrazione relativa dell'antigene in vari fluidi biologici.
I risultati della titolazione di anticorpi e antigeni basati sul metodo di cui sopra non hanno un'espressione quantitativa assoluta. Per quantificare il contenuto di anticorpi, Heidelberger, Kabat (M. Heidelberger, E. Kabat) e altri hanno sviluppato metodo quantitativo reazione di precipitazione, che si basa sul rilevamento della cosiddetta zona di equivalenza. Quando quantità adeguate all'età di antigene vengono miscelate con volumi costanti di antisiero, la quantità di precipitato formato inizialmente aumenta e poi diminuisce nuovamente a causa di un aumento della solubilità del complesso antigene-anticorpo nell'antigene in eccesso. Se determiniamo il contenuto di anticorpi nel surnatante in tutte le provette, si scopre che nelle provette centrali di una fila o anche in una singola provetta non ci sono anticorpi nel surnatante; allo stesso tempo, qui si forma il precipitato più grande. Poiché nella zona di equivalenza è coinvolto nel precipitato anche l'intero antigene introdotto nella miscela di reagenti, sottraendo il precipitato proteico dell'antigene dalla quantità di proteine, si ottiene il valore esatto del contenuto di anticorpi in un dato volume di siero in esame. Il contenuto proteico del precipitato dopo lavaggio accurato con soluzione fisiologica raffreddata viene determinato mediante azoto o mediante qualche metodo colorimetrico.
Quando si valuta il valore della reazione di precipitazione come metodo diagnostico si deve tener conto che nei sieri immuni possono essere presenti anticorpi che non hanno le proprietà delle precipitine e, quindi, non formano un precipitato quando interagiscono con un antigene. Questi includono principalmente anticorpi incompleti, così come alcuni altri anticorpi appartenenti al gruppo delle globuline gamma-A.
La capacità dell'antisiero di precipitare l'antigene può essere ridotta riscaldando a 65-70 °, trattamento con solventi organici, riduzione in un mezzo acido [Isliker (N. Isliker), A.Ya. Kulberg]. Il fenomeno della precipitazione con antisiero, consapevolmente contenente precipitine, è possibile solo a una certa temperatura, concentrazione di sali e ioni idrogeno. La reazione di precipitazione procede più rapidamente a 25-37°. Condizione indispensabile per la formazione di un precipitato è la presenza di cloruro di sodio in concentrazioni isotoniche (soluzione di NaCl allo 0,85%). Quando la concentrazione di NaCl viene aumentata al 15%, i precipitati formati dall'antigene di natura polisaccaridica si dissolvono parzialmente, che possono essere utilizzati per estrarre anticorpi puri. La reazione di precipitazione con antigeni di natura proteica procede alla stessa velocità e completezza sia nello 0,85% che nel 15% Soluzioni di NaCl. La concentrazione ottimale di ioni idrogeno per la formazione di un precipitato corrisponde a valori di pH da 5,0 a 9,0.
Nella pratica di laboratorio vengono utilizzate varie modifiche della reazione di precipitazione. In particolare, la reazione di termoprecipitazione viene utilizzata per rilevare antigeni batterici. antrace, botulismo, ecc., non soggetti a denaturazione termica (coctoantigeni). Questa reazione differisce dalla reazione di precipitazione dell'anello solo per il fatto che il filtrato del materiale di prova bollito viene usato come antigene (vedi Reazione A).
Quando si analizza una miscela complessa di antigeni utilizzando la reazione di precipitazione, è impossibile caratterizzare le proprietà dei singoli componenti della miscela. Per risolvere questo problema, ricorrere a metodi di precipitazione in agar e immunoelettroforesi. Il metodo di precipitazione in agar nella modifica più comune di Ouchterlony (O. Ouchterlony) si basa sul fatto che l'antigene e l'antisiero, diffondendosi l'uno verso l'altro in un sottile strato di agar, formano una linea di precipitazione quando si incontrano. Dal numero di tali linee, si può giudicare il numero di componenti contenuti in una data miscela di antigeni. Il metodo Ouhgerlonu consente di confrontare diverse miscele antigeniche e determinare il grado di parentela dei componenti in esse presenti. Quando si analizza una miscela antigenica complessa contenente sostanze con le stesse velocità di diffusione in agar, grande aiuto può portare il metodo di immunoelettroforesi. La miscela di antigeni viene preliminarmente separata in un campo elettrico in una piastra di agar, dopo di che viene sviluppata singoli componenti antisiero. L'antisiero viene introdotto in una fossa praticata in agar parallelamente alla linea lungo la quale si sono mossi gli antigeni durante l'elettroforesi. Ciascuno degli antigeni fornisce un singolo arco di precipitazione con antisiero. L'immunoelettroforesi è ampiamente utilizzata per l'analisi anomalie patologiche nelle proteine del siero, così come nell'analisi immunologica degli antigeni tissutali e batterici.
Precipitazioni forensi. La precipitazione è utilizzata in medicina legale per determinare le specie di sangue, parti di organi e tessuti. In un certo numero di casi investigativi, è necessario stabilire il tipo di sangue trovato sugli strumenti del crimine, sugli abiti dell'autore del reato o della vittima, ecc. Per la reazione di precipitazione, sieri precipitanti ottenuti immunizzando conigli, galli e capre con proteine di vari animali. Di solito vengono preparati sieri che precipitano umani, cavalli, gatti, polli, maiali, cani, bestiame. Devono avere un titolo di almeno 1:10.000 ed essere sufficientemente specifici. Gli estratti sono preparati dal punto studiato o dalla crosta di sangue per salino fisiologico, che vengono poi testati con sieri precipitanti. Il tipo di proteina è considerato stabilito se uno dei sieri precipitanti forma un precipitato con un estratto del sangue in esame con una reazione di controllo appropriata. La reazione di precipitazione può anche determinare il tipo di proteina nei tessuti e negli organi umani o animali. Tipicamente, la reazione di precipitazione viene effettuata in provette con un'estremità a forma di cono. Al ricevimento di estratti torbidi, la reazione di precipitazione viene effettuata in agar secondo Ouchterlon.
La reazione di precipitazione (RP) è la precipitazione di un antigene solubile sotto l'azione di anticorpi in presenza di un elettrolita. Effetto di reazione visibile (fenomeno di precipitazione) - torbidità (formazione di anello torbido o sedimento - precipitato).
RP viene utilizzato per rilevare un antigene sconosciuto in una serie di malattie infettive: con antrace, tularemia, meningite, vaiolo. In medicina legale, viene utilizzato per determinare la specie del sangue, dello sperma; nella ricerca sanitaria e igienica - per stabilire la falsificazione prodotti alimentari. RP è molto diverso. alta sensibilità e consente di rilevare l'antigene in una diluizione di 1: 1.000.000 e 1: 10.000.000.
Componenti della reazione di precipitazione.
1. Antigene (precipitinogeno) -è un antigene natura molecolare, che è in uno stato finemente disperso (solubile). I precipitinogeni sono vari lisati o estratti di tessuto, ecc. Il precipitinogeno differisce dall'agglutinogeno per le dimensioni delle particelle di antigene. Agglutinogeno Esso ha dimensioni delle celle(queste non sono celle intere distrutte), ma le dimensioni precipitinogeno commisurato a dimensione molecolare(queste sono proteine e i loro complessi con carboidrati o lipidi). Soluzione di precipitatinogeno trasparente.
2. Anticorpi (precipitine) si trovano nel siero umano o nei sieri immuno-diagnostici che contengono anticorpi noti.
3. Elettrolita- soluzione isotonica di cloruro di sodio.
Ottenere precipitinogeno.
Si ottiene macinando il materiale ed estraendo da esso gli antigeni proteici mediante bollitura o con altri metodi.
Esempi di precipitinogeni: lisati o estratti vari corpi e tessuti, siero di sangue estraneo (siero is soluzione, prima di tutto, vari proteine), filtrati di colture in brodo di microbi, estratti salini di microbi, autolisati, ecc.
Ottenere sieri precipitanti.
Ottenuto mediante iperimmunizzazione di conigli con precipitinogeni appropriati. Tali sieri contengono anticorpi contro quei precipitinogeni con cui sono stati immunizzati i conigli.
Esempi di sieri precipitanti: precipitante siero di antrace (contiene anticorpi contro gli antigeni dell'antrace), siero antimeningococcico precipitante(contiene anticorpi contro gli antigeni dell'agente eziologico della meningite), ecc.
Titolo il siero precipitante è la più alta diluizione di precipitinogeno alla quale il siero dà ancora una reazione di precipitazione.
Modi di impostare RP.
1. Reazione di precipitazione dell'anello - effettuato in speciali tubi precipitanti (diametro - 0,4-0,5 cm, altezza - 7-8 cm). 0,2 - 0,3 ml di siero precipitante vengono aggiunti alla provetta e la stessa quantità di precipitinogeno viene accuratamente stratificata lungo la parete con il naso lungo di una pipetta Pasteur. Quindi, con attenzione da una posizione orizzontale, i tubi vengono posizionati verticalmente.
Contabilizzazione dei risultati della reazione effettuato dalla comparsa di un anello bianco al confine dell'antigene-anticorpo. Con una reazione positiva si osserva un tale anello. In questo caso, l'antigene corrisponde all'anticorpo e si verifica il loro legame.
Se come precipitinogeno vengono utilizzati estratti acquosi bolliti e filtrati di organi e tessuti, la reazione viene chiamata reazione precipitazione termica (ad esempio, quando si diagnostica l'antrace).
2. Reazione di precipitazione in gel - effettuato in piastre Petri o su vetrini, dove viene posto uno strato di gel di agar. Quando il gel si solidifica, vengono ritagliati dei pozzetti in cui vengono inseriti antigeni o anticorpi, o entrambi. Distinguere 2 metodi PR in gel:
un metodo immunodiffusione semplice (radiale).: uno dei componenti della reazione immunitaria (antigene o anticorpo) viene posto nel pozzetto e l'altro componente viene miscelato con agar; A un risultato positivo (l'antigene corrisponde a un anticorpo) attorno al pozzetto si forma anello precipitato ;
b) metodo doppia immunodiffusione: sia l'anticorpo che l'antigene sono posti in pozzetti separati, diffondono nel gel di agar l'uno verso l'altro; con esito positivo dove si incontrano anticorpi e antigeni linee di precipitazione .
Un esempio di RP in un gelè la doppia reazione di immunodiffusione di Ouchterlony nella diagnosi di difterite
Immunoelettroforesi -è un metodo che combina il metodo dell'elettroforesi e la reazione di precipitazione. Una miscela di antigeni (ad esempio proteine del siero) viene separata nel gel mediante elettroforesi. Quindi, per trovare e determinare la proteina desiderata (antigene sconosciuto), viene utilizzato un siero precipitante diagnostico, che contiene anticorpi contro questa proteina (anticorpo noto). Per fare ciò, il siero diagnostico viene introdotto nel solco parallelo alle proteine. Se tra le proteine \u200b\u200bce n'è una che corrisponde all'anticorpo nel siero, attorno ad essa si formano linee di precipitazione.
reazione di precipitazione-RP (da lat. praeci-pito- precipitato,) è la formazione e la precipitazione di un complesso di un antigene molecolare solubile con anticorpi sotto forma di torbidità, chiamato precipitato. Si forma mescolando antigeni e anticorpi in quantità equivalenti; un eccesso di uno di essi riduce il livello di istruzione complesso immunitario. Contrariamente alla reazione di agglutinazione, l'antigene per la reazione di precipitazione è costituito da composti solubili, la cui dimensione delle particelle si avvicina alla dimensione delle molecole. Questi possono essere proteine, complessi di proteine con carboidrati e lipidi, estratti batterici, vari disati o filtrati di colture microbiche in brodo. Gli anticorpi coinvolti nella reazione di precipitazione sono chiamati precipitine. Il complesso fine antigene-anticorpo risultante viene rilevato mediante determinati metodi di messa in scena della reazione di precipitazione.
La reazione di precipitazione dell'anello è stata proposta per la prima volta da Ascoli. È usato nella diagnosi di antrace, peste, tularemia, meningite. Il metodo è semplice e accessibile.
Uno specifico siero immunoprecipitante viene versato in strette provette di precipitazione e l'antigene viene stratificato con molta attenzione su di esso. Come antigene, ad esempio, quando si diagnostica l'antrace, vengono prelevati pezzi di pelle, lana, pelli di un animale caduto, ecc .. Vengono bolliti, il liquido viene filtrato e utilizzato come antigene. La comparsa di un anello - un precipitato al confine di due liquidi - indica la presenza dell'antigene corrispondente.
La reazione di precipitazione su gel di agar, o metodo di precipitazione per diffusione, consente di studiare in dettaglio la composizione di complesse miscele antigeniche idrosolubili. Per impostare la reazione, viene utilizzato un gel (agar semiliquido o più denso). Ogni componente che compone l'antigene diffonde verso l'anticorpo corrispondente a una velocità diversa. Pertanto, si trovano complessi di vari antigeni e corrispondenti anticorpi diverse aree gel, dove si formano le linee di precipitazione. Ciascuna delle linee corrisponde a un solo complesso antigene-anticorpo. La reazione di precipitazione è solitamente impostata a temperatura ambiente.
Il metodo di immunoelettroforesi ricevuto largo uso v l'anno scorso nello studio della struttura antigenica dei microbi. Il complesso di antigeni viene posto nel pozzetto, che si trova al centro del gel di agar, versato sulla piastra. Quindi, una corrente elettrica viene fatta passare attraverso il gel di agar, a seguito della quale i vari antigeni inclusi nel complesso si spostano nel campo. corrente elettrica a seconda della loro mobilità elettroforetica. Dopo che l'elettroforesi è stata completata, un siero immunitario specifico viene introdotto nella trincea situata lungo il bordo della piastra e posto in una camera umida. Nei punti in cui si forma il complesso antigene-anticorpo compaiono linee di precipitazione.
Reazioni di precipitazione Mettere nelle provette (reazione di precipitazione dell'anello), in gel, mezzi nutritivi, ecc. Ampio distribuzione ricevuta varietà di reazione di precipitazione in un gel semiliquido di agar o agarosio: doppia immunodiffusione secondo Ouchterlony. immunodiffusione radiale, immunoelettroforesi e così via
Reazione di immunodiffusione radiale. Il siero immunitario con gel di agar fuso viene versato uniformemente sul bicchiere. Dopo la solidificazione nel gel, vengono realizzati dei pozzetti nei quali viene posto l'antigene in varie diluizioni. L'antigene, diffondendosi nel gel, forma con gli anticorpi zone di precipitazione ad anello intorno ai pozzetti (Fig. 13.7). Il diametro dell'anello di precipitazione è proporzionale alla concentrazione dell'antigene. La reazione viene utilizzata per determinare i livelli ematici di immunoglobuline di varie classi, componenti del sistema del complemento, ecc.
Immunoelettroforesi- una combinazione del metodo dell'elettroforesi e dell'immunoprecipitazione: una miscela di antigeni viene introdotta nei pozzetti del gel e separata nel gel mediante elettroforesi. Quindi, parallelamente alle zone di elettroforesi, viene introdotto nel solco un siero immunitario i cui anticorpi, diffondendosi nel gel, si formano nel punto di incontro con l'antigene della linea di precipitazione.
Microscopia elettronica immunitaria- microscopia elettronica di microbi, più spesso virus, trattati con opportuni anticorpi. I virus trattati con siero immunitario formano aggregati immunitari (microprecipitati). Attorno ai virioni si forma una "corolla" di anticorpi contrastati con acido fosfotungstico o altri preparati elettronotticamente densi.
123. Reazione di precipitazione in gel per determinare la tossigenicità dei microrganismi, meccanismo, modalità di presa.
Reazione di precipitazione (RP)- questa è la formazione e la precipitazione di un complesso di un antigene molecolare solubile con anticorpi sotto forma di torbidità, chiamato precipitato. Si forma mescolando antigeni e anticorpi in quantità equivalenti; un eccesso di uno di essi riduce il livello di formazione del complesso immunitario.
Nel 1946, J. Oudin propose il metodo della diffusione semplice, secondo il quale uno dei componenti della reazione di precipitazione, solitamente siero, è nel gel, e l'altro - l'antigene - è stratificato sul primo sotto forma di soluzione.
L'antigene, diffondendosi nel gel, forma al suo interno linee di precipitazione bianche con anticorpi, che sono chiaramente visibili sotto l'illuminazione laterale. Nel 1948, J. Ouchterlonu sviluppò un metodo ancora più semplice e conveniente di controdiffusione bidimensionale, che consente il confronto diretto di vari antigeni e sieri. Questo metodo è anche molto prezioso nello studio delle reazioni incrociate.
Per allestire la reazione secondo Ouchterlon si utilizza agar all'1% preparato in soluzione fisiologica, che viene versato in piastre Petri con uno strato di 0,5 cm attorno alla circonferenza ad una distanza di 1-2 cm dal centro. Il siero precipitante diagnostico viene versato nel pozzetto centrale e una soluzione di omologhi e antigeni confrontati con esso viene versata nei pozzetti periferici. I risultati vengono registrati dopo 24, 48 e 72 ore di incubazione a temperatura ambiente.
Anticorpi e antigeni si diffondono l'uno verso l'altro e nelle aree in cui si creano le loro concentrazioni equivalenti si formano bande di precipitazione arcuate. Se le bande di precipitazione provenienti da due pozzetti adiacenti si fondono, ciò indica la presenza di più componenti antigenici nel fluido in esame. La reazione di controdiffusione secondo Ouchterlohn viene spesso utilizzata per determinare la tossigenicità di batteri, come la difterite.
Un ulteriore sviluppo del metodo di precipitazione su gel è l'immunoelettroforesi. Questo termine si riferisce a un metodo che combina la separazione elettroforetica di una miscela di antigeni e la controdiffusione di Ouchterlohn sulla stessa piastra di gel di agar. Il siero precipitante viene quindi versato in una scanalatura tagliata nel gel parallelamente alla direzione della separazione elettroforetica.
Le linee di precipitazione formatesi a seguito della reazione hanno la forma di archi allungati nella direzione del movimento elettroforetico delle frazioni antigeniche. L'immunoelettroforesi consente di determinare la composizione di miscele complesse di antigeni solubili contenenti fino a 30 componenti ed è quindi un prezioso metodo diagnostico.
Reazione di precipitazione(RP) è chiamata precipitazione da una soluzione di Ag (precipitinogeno) quando è esposta al siero immunitario (precipitina) e all'elettrolita.
Mediante RP, un antigene può essere rilevato in diluizioni di 1:100.000 e anche 1:1.000.000, cioè in quantità così piccole che non possono essere rilevate chimicamente.
I precipitatinogeni sono particelle ultramicroscopiche di proteine-PS naturali: estratti da micron, organi e TC, materiale pat; prodotti di decadimento di una cellula batterica, i loro lisati, filtrati. I precipitatinogeni sono termicamente stabili, pertanto, per ottenerli, il materiale viene sottoposto a ebollizione.
In RP vengono utilizzati Ag liquidi trasparenti.
I sieri precipitanti sono solitamente ottenuti mediante iperimmunizzazione dei conigli in cicli di diversi mesi, introducendoli con sospensioni batteriche, filtrati di brodocoltura, autolisati, estratti salini di microrganismi e sieroproteine.
A cura di RP Ascoli. In una provetta stretta con una piccola quantità di siero precipitante non diluito, tenendola in posizione inclinata, lo stesso volume di Ag viene lentamente stratificato lungo la parete con una pipetta.
Per non mescolare i due liquidi, la provetta viene accuratamente posizionata verticalmente. Con una reazione positiva in una provetta, dopo 5-10 minuti appare un anello bianco-grigiastro al confine tra il siero e l'estratto studiato. La reazione è necessariamente accompagnata da controlli del siero e dell'antigene.
La reazione di Ascoli viene utilizzata per identificare antrace, tularemia, peste Ag.
Ha anche trovato applicazione in medicina legale per determinare la specie di una proteina, in particolare macchie di sangue, nella pratica sanitaria per rilevare la falsificazione di carne, pesce, prodotti di farina, impurità nel latte. Lo svantaggio di questo RP è l'instabilità del precipitato (anello), che scompare anche con un leggero scuotimento. Inoltre, non può essere utilizzato per determinare composizione quantitativa Ag coinvolti nella formazione del precipitato.
Reazione di precipitazione di Ouchterlony. La reazione viene posta su piastre Petri nei pozzetti di gel di agar.
L'agar trasparente ben lavato viene utilizzato come gel. Ag e siero vengono introdotti nel gel di agar in modo che i pozzetti che li contengono siano ad una certa distanza. Diffondendosi l'uno verso l'altro e connettendosi tra loro, l'anticorpo e l'antigene formano un complesso immunitario sotto forma di una banda bianca in 24-48 ore.
In presenza di un complesso precipitinogeno compaiono diverse bande. Allo stesso tempo, le bande di antigeni sierologicamente correlati si uniscono e le bande di quelli eterogenei si intersecano, il che consente di determinare i dettagli della struttura antigenica delle sostanze in esame.
È ampiamente utilizzato per diagnosticare malattie causate da virus e batteri che producono esotossine.
3.La reazione di emoagglutinazione indiretta (RNGA). Viene utilizzato per rilevare polisaccaridi, proteine, estratti di batteri, micoplasmi, rickettsia e virus, i cui immunocomplessi con agglutinine non possono essere visti nell'AR classica convenzionale, o per rilevare anticorpi nel siero dei pazienti contro queste sostanze altamente disperse e i microrganismi più piccoli .
RNGA per sierodiagnosi di malattie infettive. Utilizzando l'RNHA per rilevare gli anticorpi nei sieri dei pazienti, viene preparata la diagnostica dell'antigene eritrocitario.
reazione di precipitazione.
Per fare ciò, gli eritrociti vengono trattati per 15 minuti con una soluzione di tannino a una diluizione di 1:20.000–1:200.000, che conferisce loro stabilità e aumenta la loro capacità di adsorbimento. Quindi vengono miscelati con un antigene noto e incubati per 2 ore a una temperatura di 37 ° C. Gli eritrociti sensibilizzati all'antigene vengono lavati 2-3 volte con una soluzione isotonica di cloruro di sodio e aggiunti al siero, diluiti e versati nei pozzetti del pannelli.
Sospensioni di eritrociti intatti e carichi di antigeni, che vengono aggiunti ai sieri, danno ovviamente reazioni positive e negative, servono come controllo.
I risultati della reazione vengono presi in considerazione 2 ore dopo l'incubazione in un termostato e valutati con vantaggi: "++++" - gli eritrociti coprono il pozzetto sotto forma di un ombrello con bordi frastagliati; "-" - accumulo di eritrociti sotto forma di "pulsante"
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Reazione di precipitazione dell'anello
La reazione di adesione dell'anello è una delle più semplici metodi sierologici. Viene eseguito in tubi di precipitazione stretti. In primo luogo, una soluzione limpida dell'antigene presa in diverse diluizioni (1:2; 1:4; 1:8; 1:16) viene versata ugualmente in tutte le provette.
La connessione di antigeni e anticorpi avviene al confine di contatto dei reagenti. Come risultato di questa interazione, nei casi positivi (quando l'antigene corrisponde all'anticorpo), dopo un po' si forma un precipitato sotto forma di un anello opalescente.
Reazione trovata ampia applicazione v pratica medica per rilevare l'antigene dell'antrace in lana, pelli, carne di animali (reazione di Ascoli); rilevare altri agenti patogeni di malattie infettive in materiale patologico ottenuto da pazienti o in oggetti ambiente esterno, così come dentro visita medica forense per determinare la specie di una proteina, in particolare, una proteina del sangue o altri fluidi biologici.
Immunodiffusione di Ouchterlony
La reazione di precipitazione può essere eseguita su un gel di agar.
Il metodo si basa sul fatto che le particelle di antigeni e anticorpi, a causa delle loro diverse dimensioni, si diffondono nel gel a velocità diverse e, di conseguenza, si spostano a distanze diverse. Ciò consente di separare i singoli sistemi di antigeni quando si trovano in una miscela e, quindi, consente di studiare la struttura antigenica di batteri e proteine complesse, sieri e tessuti animali.
Visivo e metodo efficace la precipitazione su gel è stata suggerita da Ouchterlony.
Piccoli pozzetti sono realizzati su piastre Petri con agar, ritagliati a una certa distanza l'uno dall'altro. L'antigene viene versato in uno di essi, il siero negli altri. I componenti della reazione diffondono nel gel l'uno verso l'altro e formano una linea visibile di precipitazione dove gli antigeni incontrano concentrazioni ottimali di anticorpi specifici per esso. Poiché i reagenti diffondono concentricamente fuori dai pozzetti, è possibile eseguire analisi multiple posizionando più pozzetti con antigeni diversi (o diverse diluizioni dello stesso antigene) attorno a un pozzetto di anticorpo.
La reazione di Ouchterlony consente di trarre una conclusione sulla natura dell'antigene da un siero noto e, al contrario, da un antigene noto, viene determinata la natura degli anticorpi.
Il vantaggio del metodo è che consente di confrontare i componenti antigenici di miscele complesse e giudicare la loro comunanza o differenze. Per confrontare la comunanza degli antigeni, viene preparato un agar con pozzetti: l'antisiero viene versato in uno e gli antigeni da confrontare vengono versati negli altri. Se gli antigeni sono diversi, le bande di precipitazione si trovano in modo disuguale.
Immunoelettroforesi
Negli ultimi anni, il metodo dell'immunoelettroforesi è stato utilizzato per fini studi immunologici. Il metodo è stato descritto per la prima volta da P.
Grabar e K. A. Williams nel 1953. Si tratta di una combinazione di elettroforesi su gel di agar su lastre di vetro con immunodiffusione. All'inizio viene eseguita una separazione elettroforetica dell'antigene, che spesso è una miscela di proteine o altre molecole. Per fare ciò, l'antigene viene introdotto in un pozzo tagliato in anticipo nell'agar e la piastra di agar viene posta per qualche tempo in una zona di corrente elettrica continua.
Per colpa di velocità diversa il movimento delle molecole è la separazione dell'antigene nelle sue parti componenti. Successivamente, il siero immunitario precipitante viene introdotto nella scanalatura tagliata nella direzione parallela al flusso di corrente.
L'antigene e l'antisiero si diffondono nel gel l'uno verso l'altro.
precipitazione
Ogni antigene dà una zona di precipitazione sotto forma di arco con anticorpi corrispondenti. Il numero, la posizione e la forma di queste linee danno un'idea della composizione della miscela antigenica originale.
reazione di flocculazione
Il metodo è stato proposto da Ramon nel 1924.
Si basa sul fatto che una miscela di tossina con siero antitossico in determinate condizioni dà torbidità e precipitazione. In questo caso, la reazione avviene prima in quelle provette in cui la quantità di antitossina corrisponde alla dose che neutralizza completamente questa quantità di tossina.
Pertanto, se la forza della tossina è nota, è possibile determinare la quantità di antitossina nel siero di prova sconosciuto. Per fare ciò, vengono preparate diverse diluizioni del siero in esame, ad ogni diluizione vengono aggiunte le stesse quantità di una tossina nota, dopodiché si osserva quale delle provette flocculerà per prima (torbidità della soluzione). Determinare la flocculazione iniziale. Quindi viene effettuato il calcolo.
Ad esempio, è necessario determinare la concentrazione di anticorpi anti-difterite nel siero del test. La reazione utilizza tossina difterica contenente 50 Lf per 1 ml (Lf è la quantità minima di tossina neutralizzata da 1 unità antitossica (AU) di antisiero.
Si supponga di notare la flocculazione iniziale in una provetta contenente 0,2 ml di questo siero e 2 ml di una tossina nota con un'attività di 100 Lf (50 Lf x 2).
Quindi 0,2 ml di siero hanno neutralizzato questa tossina. Pertanto, 0,2 ml di siero contengono 100 AU e in 1 ml di questo siero la concentrazione di anticorpi corrisponde a 500 AU (100 AU x 5).
Con un metodo simile, la reazione di flocculazione può essere utilizzata per lo scopo opposto: determinare le proprietà immunizzanti dei tossoidi.
Ciò richiede un siero antitossico standard.
Reazione di neutralizzazione
La reazione viene utilizzata nella diagnosi di intossicazione batterica alimentare per determinare le tossine batteriche nel materiale di prova. Inoltre, può essere inserito nello studio di alcuni oggetti dell'ambiente esterno per il contenuto batteri patogeni producendo tossine, ad esempio, quando si esamina il terreno per la presenza di agenti patogeni del tetano o della cancrena gassosa.
È noto che la tossina mescolata con siero antitossico omologo non mostra la sua azione tossica mentre la tossina viene neutralizzata. La reazione dell'interazione di una tossina con un'antitossina, di regola, è strettamente specifica, quindi, per impostare una reazione di neutralizzazione per determinare il tipo di tossina, è necessario disporre di sieri diagnostici specifici per ciascun tipo e il tipo di tossina. Una miscela di 2-3 sieri antitossici e più può essere utilizzata contemporaneamente se si prevede la presenza di più tossine nel materiale di prova.
La reazione di neutralizzazione consente di determinare il tipo e il tipo di tossina patogena.
Il materiale di prova può essere un filtrato di prodotti alimentari che presumibilmente hanno causato avvelenamento, lavaggi dai piatti in cui si trovavano questi prodotti, ecc.
Viene eseguita la neutralizzazione preliminare della presunta tossina. Per fare questo, un siero diagnostico antitossico (contiene anticorpi contro la tossina desiderata) viene aggiunto alla provetta con il materiale di prova (provetta sperimentale); un volume uguale di soluzione fisiologica viene aggiunto ad un'altra provetta (controllo).
Dopo una breve incubazione, il contenuto delle provette viene introdotto in due gruppi di topi bianchi (sperimentali e di controllo).
I risultati della reazione di neutralizzazione vengono presi in considerazione immediatamente dopo la morte degli animali di controllo. In questo caso, il fatto della sopravvivenza degli animali ricevuti siero antitossico insieme al materiale di prova, indica la presenza di una tossina in esso, corrispondente al siero iniettato.
Il vantaggio della reazione di neutralizzazione è l'elevata affidabilità dei risultati ottenuti.
Tuttavia, nella sua sensibilità e velocità nell'ottenere una risposta, è inferiore ad altri metodi di ricerca.
Reazioni di lisi
Le reazioni di lisi sono solitamente chiamate dissoluzione di antigeni corpuscolari sotto l'azione di anticorpi specifici per questo antigene in presenza di complemento.
Da reazioni immunitarie sulla base del fenomeno della lisi dei batteri e di altri antigeni corpuscolari, vengono utilizzate principalmente reazioni di batteriolisi ed emolisi.
reazione di batteriolisi
La reazione avviene sia in vitro che in vivo. Quest'ultima è nota come reazione di V.I. Isaev - Pfeiffer.
Questi scienziati hanno dimostrato che se porcellini d'India pre-immunizzato con antigeni del colera, quindi la sua successiva introduzione nella cavità addominale di una coltura altamente virulenta di vibrio cholerae non provoca infezione di animali, poiché in cavità addominale l'agente patogeno viene dissolto sotto l'influenza di anticorpi specifici.
Più tardi, io.
I. Mechnikov ha dimostrato che una simile dissoluzione del colera vibrio sotto l'influenza del siero immunitario si verifica in una provetta, se ai componenti principali viene aggiunto siero fresco, una fonte di complemento. La dissoluzione dei batteri sotto l'azione di anticorpi specifici in presenza di complemento è chiamata reazione di batteriolisi.
Quando si imposta la reazione di batteriolisi, viene prima preparata una serie di diluizioni 10 volte del siero in esame. Quindi, la stessa quantità (1-2 gocce) di sospensione microbica viene aggiunta a ciascuna provetta. Il complemento viene aggiunto alla miscela. Dopo l'incubazione a 37 °C, la miscela viene inoculata da ciascuna provetta su un terreno nutritivo per determinare la presenza o l'assenza di batteri vitali.
La reazione può essere utilizzata per rilevare gli anticorpi utilizzando un microrganismo noto o per determinare il tipo di microbi utilizzando un siero immunitario diagnostico.
IN lavoro pratico i batteriologi usano raramente questa reazione, principalmente per la differenziazione del colera e dei vibrioni simili al colera.
Reazione di emolisi
Il meccanismo dell'emolisi è simile a quello della batteriolisi.
Gli eritrociti utilizzati nella reazione sono l'antigene. La fonte di anticorpi è il siero anti-eritrocita (ad esempio, se nella reazione vengono utilizzati eritrociti di pecora, il siero necessario con anticorpi anti-eritrociti specifici viene ottenuto da conigli immunizzati con eritrociti di pecora).
Il siero di sangue di cavia viene spesso utilizzato come complemento nelle reazioni di lisi, poiché contiene molto più complemento rispetto ai sieri di altri animali.
In quei casi in cui gli anticorpi in presenza del complemento distruggono gli eritrociti, l'emoglobina viene rilasciata da essi e la miscela di reazione da una sospensione torbida di eritrociti si trasforma in un liquido rosso trasparente (sangue laccato).
Questa reazione è chiamata emolisi. Nella pratica di laboratorio, viene utilizzato come indicatore dell'adsorbimento del complemento nella reazione di fissazione del complemento.
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RA è stato sviluppato per la prima volta da M. Gruber nel 1896. L'essenza della reazione è l'interazione dell'anticorpo con l'antigene, con conseguente incollaggio (agglutinazione) di microbi con la formazione di scaglie, grumi visibili ad occhio nudo. RA è ampiamente utilizzato per diagnosi sierologica molti infezioni batteriche(brucellosi, morva, salmonellosi, colibacillosi, ecc.) e per l'identificazione sierologica di specie e tipi di microrganismi isolati. Esistono diversi metodi per impostare l'AR: provetta (volumetrica), gocciolamento (piatto), goccia di sangue, reazione ad anello con il latte, reazione di emoagglutinazione e sue varianti (RHGA, RNHA), test dell'antiglobulina di Coombs, ecc. ^ – invece del siero, viene prelevato il sangue. Impostare la reazione della piastra. Diagnosticare pullorosi di polli e tacchini, micoplasmosi di polli. Reazione di Coombs consente il rilevamento di anticorpi incompleti. Questi ultimi sono monovalenti e quindi inibiscono la formazione di agglutinati. Il metodo si basa sull'uso del siero antiglobulinico, che funge da intermediario per la connessione di anticorpi incompleti fissati su antigeni corpuscolari (eritrociti, batteri). ^ - non si applica alle reazioni sierologiche e diagnosticamente accurate, tuttavia consente di rilevare l'antigene - emoagglutinina e stabilire proprietà emoagglutinanti (la capacità di agglutinare i globuli rossi) in alcuni batteri e micoplasmi. RNG- negli ultimi anni ha preso uno dei posti di primo piano nella sierodinamica. La sua essenza sta nel fatto che le molecole proteiche dell'antigene del corrispondente patogeno o anticorpo sono pre-adsorbite sugli eritrociti di una pecora o di un altro animale trattato con tannino. Poi mettere la reazione mescolando eritrociti sensibilizzati con sieri di sangue di animali malati o nel secondo caso con l'antigene in studio. In presenza di siero spec. Si verifica l'agglutinazione degli anticorpi contro questo antigene (o viceversa) - la reazione è positiva. Proposto da R. Kraus nel 1897. La precipitazione è un fenomeno osservato durante l'interazione di anticorpi-precipitine e antigene-precipitinogeno. L'essenza della reazione è modificare la dispersione dei colloidi dell'antigene e la loro precipitazione sotto l'influenza di anticorpi specifici nel siero immunitario. RP può essere posto in provette in un mezzo liquido (reazione di precipitazione dell'anello) o in gel di agar (RDP lamellare). La reazione di precipitazione ad anello fu proposta per la prima volta da Ascoli (1910), è la più utilizzata per la diagnosi di antrace. Durante la conduzione competenza veterinaria RP è un metodo per determinare la falsificazione di carne, farina e altri prodotti. Significato speciale questa reazione ha una visita medica forense per determinare il tipo di sangue. L'uso della reazione di precipitazione in un mezzo liquido, tuttavia, non consente di caratterizzare l'eterogeneità degli antigeni, cioè il numero e la concentrazione di antigeni nella preparazione. Questa informazione può essere ottenuta mettendo RP in un gel (solitamente agar). Avendo una velocità di movimento, diversi antigeni del farmaco si diffondono in modo diverso, formando precipitati nello spessore del gel trasparente nel punto in cui si incontrano con l'anticorpo omologo. La localizzazione e la concentrazione delle linee di precipitina saranno caratteristiche per ciascun componente della preparazione antigenica, che funge da criterio per la sua qualità. Diluendo la preparazione, è possibile caratterizzare il relativo contenuto di antigeni in essa contenuti. Sono stati sviluppati diversi metodi per impostare RDP: il metodo della diffusione unidimensionale diretta secondo Uden (1946), il metodo della semplice immunodiffusione radiale secondo Mancini (1963), il metodo della doppia diffusione in gel di agar secondo Ouchterlony (1948 ), eccetera. ^
(PH) sul modello tossine del tetano e antitossine. L'essenza della RN risiede nella capacità degli anticorpi omologhi del siero immunitario di sopprimere (neutralizzare) le proprietà infettive dell'agente eziologico della malattia o dei suoi prodotti metabolici. Stabilire il risultato della reazione con una miscela di antigene-anticorpo infettare animali da laboratorio, CC, EC. Un indicatore di pH positivo è l'assenza di morte dei sistemi di test biologici. IN pratica batterica RN è utilizzato nella diagnosi di enterotossiemia anaerobica, botulismo, ecc. RN viene eseguito per rilevare e titolare tossine, toxoidi o antitossine. Utilizzato per rilevare gli anticorpi nel siero del sangue e per rilevare l'antigene nel materiale di prova (per brucellosi, morva, rickettsiosi, tubercolosi, ecc.). Questa reazione appartiene alla reazione indiretta a due sistemi. Ha 5 componenti:
I componenti 3,4,5 costituiscono il sistema indicatore. Se l'antigene e l'anticorpo del siero del test corrispondono tra loro un altro, si forma un complesso immunitario antigene-anticorpo, che lega ed estrae il complemento dall'ambiente in cui avviene la reazione. In assenza di anticorpi corrispondenti all'antigene nel siero del test, il complesso specificato non si forma: il complemento rimane libero. Poiché si tratta di processi invisibili, per risolvere la questione di cosa sia successo al complemento, i componenti del sistema emolitico vengono introdotti nella provetta come indicatore: siero emolitico + eritrociti. Se il complemento è legato al sistema batteriologico, non si verificherà l'emolisi degli eritrociti, il risultato è positivo: il siero contiene anticorpi. La presenza di emolisi funge da indicatore della presenza di complemento libero nel sistema batteriologico, che è possibile solo in assenza di anticorpi nel siero del test - il risultato è negativo. RSC procede in condizioni rigorose rapporti quantitativi componenti. Ciò si ottiene mediante la loro titolazione preliminare (il complemento e il siero emolitico vengono titolati il giorno della reazione; antigene microbico - una volta entro 2-3 mesi). La titolazione è la determinazione della quantità minima di uno o dell'altro componente nella reazione per eseguire la reazione, un eccesso o una carenza è una distorsione dei risultati. RDSC è una variante di CSC, ma differisce in quanto la prima fase della reazione procede per 16-18 ore al freddo (40°C), il che aumenta la sensibilità a causa del più lungo adsorbimento del complemento da parte del complesso antigene-anticorpo. |
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reazione di precipitazione
La precipitazione e l'agglutinazione sono reazioni abbastanza simili che differiscono principalmente sulla base di Proprietà fisiche AG.
Nel primo caso si presenta in forma solubile, nel secondo in forma corpuscolare. RP si basa sulla formazione di un precipitato durante la reazione AG-AT. RP è altamente specifico e sensibile.
Ingredienti di reazione:
1. antigene o aptene solubile (precipititogeno);
2. AT - precipitine (siero immunoprecipitante; ottenuto mediante immunizzazione di conigli con opportune soluzioni di antigeni);
reazione di precipitazione
soluzione isotonica di cloruro di sodio o gel di agar.
Metodi di impostazione RP:
1) RP nelle soluzioni - r.
precipitazione ad anello;
2) RP in gel.
La reazione di precipitazione dell'anello viene posta in tubi di precipitazione stretti in cui vengono versati i sieri di precipitazione.
Quindi versare la soluzione di precipitinogeno. Con una reazione positiva, un anello di precipitazione torbida appare all'interfaccia degli ingredienti.Un esempio di questo metodo di creazione di RP è la reazione di termoprecipitazione di Ascoli, che viene utilizzata per rilevare un aptene termostabile del patogeno dell'antrace, estratto da organi animali, pelle e lana per estrazione durante l'ebollizione Una delle varietà di RP nel gel (reazione di Ouchterlony) consente di determinare la tossigenicità bacillo difterico con siero antitossico.
In una capsula di Petri con mezzo nutritivo posizionare una striscia di carta da filtro impregnata di siero difterico antitossico e inoculare con le colture studiate sotto forma di tratti perpendicolari alla striscia di carta. Incubato a 37 PS durante il giorno. In presenza di una coltura tossigenica, si formano linee di precipitazione nel sito di interazione della tossina con l'antitossina.La reazione di precipitazione nel gel è chiamata immunodiffusione.
Spesso mediante foresi in gel - immunoelettroforesi. Principio del metodo: l'antigene studiato viene frazionato elettroforeticamente. le frazioni ottenute vengono analizzate con il metodo della doppia diffusione mediante antisiero.
La reazione di Ascoli viene utilizzata per diagnosticare l'antrace al fine di rilevare l'antigene dei bacilli dell'antrace. Per avviare una reazione di precipitazione, devi avere: precipitinogeno - aptene B.
Antrachis (estratto di tessuto), precipitina (siero che precipita l'antrace) e soluzione salina.
Preparazione del termoprecipitinogeno.
1. Versare 10 ml di soluzione fisiologica in un pallone contenente 1 g di pelle frantumata o 1 ml di coltura di B. anthracis.
2. Mettere il pallone in un bagno bollente per 30-45 minuti.
3. Filtrare attraverso l'amianto. Il filtrato deve essere completamente limpido. Per la reazione di precipitazione, il filtrato viene diluito 100 volte o più.
Impostazione della reazione di precipitazione dell'anello.
1) Nel tubo di precipitazione si versano 0,3 ml di siero precipitante intero o diluito 1:5, 1:10.
2) Un precipitinogeno viene accuratamente stratificato lungo la parete del tubo.La reazione è considerata positiva se si forma un anello torbido di proteine precipitate al bordo di due liquidi entro e non oltre 5-15 minuti.
Quando si imposta la reazione di precipitazione, vengono utilizzati i seguenti controlli:
a) antigene e soluzione fisiologica;
b) siero specifico e fisico.
c) antigene e siero non specifico.
Non dovrebbe esserci torbidità in tutte le provette di controllo Per la reazione di precipitazione vengono utilizzate speciali provette di precipitazione alte 40-60 mm e con un diametro di 4-5 mm, la precipitazione in provette strette avviene molto più velocemente e si manifesta più chiaramente rispetto alle normali provette , vengono accuratamente lavati e asciugati, in modo che il loro vetro sia completamente trasparente e asciutto.
Nella reazione di precipitazione viene precipitato uno specifico immunocomplesso, costituito da un antigene solubile (lisato, estratto, aptene) e da un anticorpo specifico in presenza di elettroliti.
Viene chiamato l'anello torbido o il precipitato formatosi a seguito di questa reazione precipitato. Questa reazione differisce dalla reazione di agglutinazione principalmente per la dimensione delle particelle di antigene.
La reazione di precipitazione viene solitamente utilizzata per determinare l'antigene nella diagnosi di numerose infezioni (antrace, meningite, ecc.); in medicina legale - per determinare le specie di sangue, sperma, ecc.; negli studi sanitari e igienici - quando si stabilisce la falsificazione dei prodotti; con il suo aiuto determinare la relazione filogenetica di animali e piante. Per la reazione hai bisogno di:
1. Anticorpi (precipitine) - siero immunitario con un alto titolo di anticorpi (non inferiore a 1:100.000). Il titolo del siero precipitante è determinato dalla massima diluizione dell'antigene con cui reagisce. Il siero viene solitamente utilizzato non diluito o diluito 1:5 -1:10.
2. Antigene - sostanze disciolte di natura proteica o polisaccaridica lipoide (antigeni completi e apteni).
3. Soluzione isotonica.
I metodi principali per eseguire la reazione di precipitazione sono: reazione di precipitazione ad anello e reazione di precipitazione in agar (gel).
Attenzione! Tutti i componenti coinvolti nella reazione di precipitazione devono essere completamente trasparenti.
Reazione di precipitazione dell'anello. 0,2 - 0,3 ml (5-6 gocce) di siero vengono aggiunti alla provetta di precipitazione utilizzando una pipetta Pasteur (il siero non deve cadere sulle pareti della provetta). L'antigene viene accuratamente stratificato sul siero nello stesso volume, versandolo con una sottile pipetta Pasteur lungo la parete della provetta. La provetta viene mantenuta in posizione inclinata. Con una corretta stratificazione, dovrebbe essere ottenuto un chiaro confine tra il siero e l'antigene. Con attenzione, per non mescolare il liquido, posizionare la provetta su un treppiede. Con un risultato positivo della reazione, si forma un "anello" torbido al confine tra antigene e anticorpo - un precipitato.
Reazione di precipitazione in agar(gel). La particolarità della reazione è che l'interazione dell'antigene e dell'anticorpo avviene in un mezzo denso, cioè in gel. Il precipitato risultante dà una fascia torbida nello spessore del mezzo. L'assenza di una banda indica una discrepanza tra i componenti della reazione. Questa reazione è ampiamente utilizzata nella ricerca biomedica, in particolare nello studio della formazione di tossine nell'agente eziologico della difterite.
Reazione di lisi (citolisi immunitaria)
lisi immunitaria- questa è la dissoluzione delle cellule sotto l'influenza di anticorpi con la partecipazione obbligatoria del complemento. Per la reazione hai bisogno di:
1. Antigene microbi, eritrociti o altre cellule.
2. Anticorpo(lisina) - siero immunitario, raramente il siero del paziente. Il siero batteriolitico contiene anticorpi coinvolti nella lisi dei batteri; emolitico - emolisine che contribuiscono alla lisi dei globuli rossi; per la lisi di spirochete, sono necessarie spirochetolizine, cellule - itolizine, ecc.
3. Complemento. La maggior parte del complemento nel siero delle cavie. Questo siero (miscela di diversi animali) viene solitamente utilizzato come complemento.
4. Soluzione isotonica.
reazione di precipitazione.
| Nome del parametro | Senso |
| Oggetto dell'articolo: | reazione di precipitazione. |
| Rubrica (categoria tematica) | Formazione scolastica |
Reazione di precipitazione (RP) - ϶ᴛᴏ precipitazione di un antigene solubile sotto l'azione di anticorpi in presenza di un elettrolita. Effetto di reazione visibile (fenomeno di precipitazione) - torbidità (formazione di anello torbido o sedimento - precipitato).
RP viene utilizzato per rilevare un antigene sconosciuto in un numero di malattie infettive: con antrace, tularemia, meningite, vaiolo. In medicina legale, viene utilizzato per determinare il tipo di sangue, lo sperma; nella ricerca sanitaria e igienica - per stabilire la falsificazione dei prodotti alimentari. RP è molto sensibile e può rilevare l'antigene in diluizioni di 1:1.000.000 e 1:10.000.000.
Componenti della reazione di precipitazione.
1. Antigene (precipitinogeno) -è un antigene di natura molecolare, che si trova in uno stato finemente disperso (solubile). Precipitinogeni - ϶ᴛᴏ vari lisati o estratti di tessuto, ecc.
Ospitato su ref.rf
Un precipitinogeno differisce da un agglutinogeno nella dimensione delle particelle di antigene. Agglutinogeno Esso ha dimensioni delle celle(queste non sono celle intere distrutte), ma le dimensioni precipitinogeno commisurato a dimensione molecolare(queste sono proteine e i loro complessi con carboidrati o lipidi). Soluzione di precipitatinogeno trasparente.
2. Anticorpi (precipitine) si trovano nel siero umano o nei sieri immuno-diagnostici che contengono anticorpi noti.
3. Elettrolita- soluzione isotonica di cloruro di sodio.
Ottenere precipitinogeno.
Si ottiene macinando il materiale ed estraendo da esso gli antigeni proteici mediante bollitura o con altri metodi.
Esempi di precipitinogeni: lisati o estratti di vari organi e tessuti, siero di sangue estraneo (siero is soluzione, prima di tutto, vari proteine), filtrati di colture in brodo di microbi, estratti salini di microbi, autolisati, ecc.
Ottenere sieri precipitanti.
Ottenuto mediante iperimmunizzazione di conigli con precipitinogeni appropriati. Tali sieri contengono anticorpi contro quei precipitinogeni con cui sono stati immunizzati i conigli.
Esempi di sieri precipitanti: precipitazione del siero di antrace(contiene anticorpi contro gli antigeni dell'antrace), siero antimeningococcico precipitante(contiene anticorpi contro gli antigeni dell'agente eziologico della meningite), ecc.
Titolo siero precipitante - ϶ᴛᴏ la più alta diluizione del precipitinogeno, alla quale il siero dà ancora una reazione di precipitazione.
Modi di impostare RP.
1. Reazione di precipitazione dell'anello - effettuato in speciali tubi precipitanti (diametro - 0,4-0,5 cm, altezza - 7-8 cm). 0,2 - 0,3 ml di siero precipitante vengono aggiunti alla provetta e la stessa quantità di precipitinogeno viene accuratamente stratificata lungo la parete con il naso lungo di una pipetta Pasteur. Avanti, con attenzione posizione orizzontale i tubi sono posizionati verticalmente.
Contabilizzazione dei risultati della reazione effettuato dalla comparsa di un anello bianco al confine dell'antigene-anticorpo. Con una reazione positiva si osserva un tale anello. In questo caso, l'antigene corrisponde all'anticorpo e si verifica il loro legame.
Se bollito e filtrato estratti acquosi organi e tessuti, quindi la reazione è solitamente chiamata reazione precipitazione termica (ad esempio, nella diagnosi di antrace).
2. Reazione di precipitazione su gel - effettuato in piastre Petri o su vetrini, dove viene posto uno strato di gel di agar. Quando il gel si solidifica, vengono ritagliati dei pozzetti in cui vengono inseriti antigeni o anticorpi, o entrambi. Distinguere 2 metodi PR in gel:
un metodo immunodiffusione semplice (radiale).: uno dei componenti della reazione immunitaria (antigene o anticorpo) viene posto nel pozzetto e l'altro componente viene miscelato con agar; con esito positivo (l'antigene corrisponde a un anticorpo) attorno al pozzetto si forma anello precipitato ;
b) metodo doppia immunodiffusione: sia l'anticorpo che l'antigene sono posti in pozzetti separati, diffondono nel gel di agar l'uno verso l'altro; con esito positivo dove si incontrano anticorpi e antigeni linee di precipitazione.
Un esempio di RP in gelè la doppia reazione di immunodiffusione di Ouchterlony nella diagnosi di difterite
Immunoelettroforesi -è un metodo che combina il metodo dell'elettroforesi e la reazione di precipitazione. Una miscela di antigeni (ad esempio, proteine del siero del sangue) viene separata in un gel mediante elettroforesi. Quindi, per trovare e determinare la proteina desiderata (antigene sconosciuto), viene utilizzato un siero precipitante diagnostico, che contiene anticorpi contro questa proteina (anticorpo noto). Per fare ciò, il siero diagnostico viene introdotto nel solco parallelo alle proteine. Se tra le proteine \u200b\u200bce n'è una che corrisponde all'anticorpo nel siero, attorno ad essa si formano linee di precipitazione.
reazione di precipitazione. - concetto e tipi. Classificazione e caratteristiche della categoria "Reazione di precipitazione". 2017, 2018.
