Lenfositlerin skl karışık kültürünün analizi. Karışık lenfosit kültürü

Her web geliştiricisinin veritabanı sorguları yazabilmesi için SQL bilmesi gerekir. Ve her ne kadar phpMyAdmin iptal edilmemiş olsa da, düşük seviyeli SQL yazmak için çoğu zaman ellerinizi kirletmeniz gerekir.

Bu nedenle SQL'in temelleri hakkında kısa bir tur hazırladık. Başlayalım!

1. Bir tablo oluşturun

CREATE TABLE ifadesi tablo oluşturmak için kullanılır. Bağımsız değişkenler sütunların adı ve veri türleri olmalıdır.

adında basit bir tablo oluşturalım. ay. 3 sütundan oluşur:

• İD– Takvim yılındaki ayın numarası (tamsayı).
• isim– Ayın adı (dize, maksimum 10 karakter).
• günler– Bu aydaki gün sayısı (tamsayı).

İlgili SQL sorgusu şöyle görünecektir:

CREATE TABLE aylar (id int, name varchar(10), günler int);

Ayrıca tablo oluştururken sütunlardan biri için birincil anahtar eklemeniz önerilir. Bu, kayıtları benzersiz tutacak ve seçme sorgularını hızlandıracaktır. Bizim durumumuzda ayın adı benzersiz olsun (sütun isim)

CREATE TABLE aylar (id int, name varchar(10), günler int, PRIMARY KEY (name));

tarih ve saat

Veri tipi	Tanım
TARİH	Tarih değerleri
DATETIME	Dakika hassasiyetinde tarih ve saat değerleri
ZAMAN	Zaman değerleri

2. Satır ekleyin

Şimdi tablomuzu dolduralım aylar kullanışlı bilgi. Bir tabloya kayıt eklemek INSERT deyimi aracılığıyla yapılır. Bu talimatı yazmanın iki yolu vardır.

Birinci yol, verilerin ekleneceği sütunların adlarını belirtmek değil, yalnızca değerleri belirtmektir.

Bu gösterim basittir ancak güvensizdir çünkü proje genişledikçe ve tablo düzenlendikçe sütunların öncekiyle aynı sırada olacağının garantisi yoktur. INSERT deyimi yazmanın daha güvenli (ve aynı zamanda daha hantal) bir yolu, sütunların hem değerlerinin hem de sırasının belirtilmesini gerektirir:

İşte listedeki ilk değer DEĞERLER belirtilen ilk sütun adıyla eşleşir vb.

3. Tablolardan veri çıkarma

SELECT ifadesi bizim en iyi arkadaş Veritabanından veri almak istediğimizde. Çok sık kullanıldığı için lütfen bu bölümü çok dikkatli okuyun.

SELECT ifadesinin en basit kullanımı, bir tablodaki (örneğin, adlı bir tablo) tüm sütunları ve satırları döndüren bir sorgudur. karakterler):

"Karakterler"DEN * SEÇİN

Yıldız karakteri (*), tüm sütunlardan veri almak istediğimiz anlamına gelir. SQL veritabanları genellikle birden fazla tablodan oluştuğu için belirtmek gerekir. anahtar kelime FROM , ardından bir boşluk ve ardından tablonun adı gelir.

Bazen bir tablodaki tüm sütunlardan veri almak istemeyiz. Bunun için yıldız işareti (*) yerine istenilen sütunların adlarını virgülle ayırarak yazmalıyız.

Aydan itibaren kimlik ve adı SEÇİN

Ayrıca çoğu durumda sonuçların belirli bir sıraya göre sıralanmasını isteriz. SQL'de bunu ORDER BY ile yaparız. İsteğe bağlı bir değiştirici gerekebilir - artan düzende sıralamak için ASC (varsayılan), azalan düzende sıralamak için DESC:

Kimliği, adı SEÇİN aydan İTİBAREN ADINA GÖRE SIRALAMA

ORDER BY kullanırken, SELECT deyiminde en sonda geldiğinden emin olun. Aksi halde bir hata mesajı verilecektir.

4. Veri filtreleme

SQL sorgusu kullanarak bir veritabanından belirli sütunları nasıl seçeceğinizi öğrendiniz, peki ya belirli satırları da almak istersek? WHERE deyimi burada imdadımıza yetişiyor ve verileri bir koşula göre filtrelememizi sağlıyor.

Bu sorguda tablodan sadece o ayları seçiyoruz ay(>) operatörü kullanılarak 30 günden daha büyük olan veriler.

Kimlik SEÇİN, ad NEREDEN aydan itibaren gün > 30

5. Gelişmiş veri filtreleme. VE ve VEYA operatörleri

Daha önce verileri tek bir kritere göre filtreliyorduk. Daha karmaşık veri filtreleme için AND ve OR operatörlerini ve karşılaştırma operatörlerini (=,<,>,<=,>=,<>).

Burada tüm zamanların en çok satan dört albümünü içeren bir tablomuz var. Rock olarak sınıflandırılan ve 50 milyondan az kopyası satılanları seçelim. Bu, bu iki koşulun arasına bir AND operatörü yerleştirilerek kolayca yapılabilir.

SEÇİN * FROM albümler WHERE türü = "rock" VE sales_in_millions<= 50 ORDER BY released

6. İçinde/Arasında/Beğen

WHERE ayrıca birçok özel komutu da destekleyerek en sık kullanılan sorguları hızlı bir şekilde kontrol etmenize olanak tanır. İşte buradalar:

• IN - herhangi birinin karşılanabileceği bir dizi koşulu belirtmek için kullanılır
• BETWEEN - Değerin belirtilen aralıkta olup olmadığını kontrol eder
• LIKE - belirli kalıpları arar

Örneğin, albümleri seçmek istiyorsak pop Ve ruh müzik için IN("value1","value2") kullanabiliriz.

SELECT * FROM albümler WHERE tür IN ("pop", "soul");

1975 ile 1985 yılları arasında çıkan tüm albümleri almak istiyorsak şunu yazarız:

SELECT * 1975 VE 1985 ARASINDA NEREDE yayımlanan albümlerden;

7. İşlevler

SQL, her türlü yararlı şeyi yapan işlevlerle doludur. İşte en sık kullanılanlardan bazıları:

• COUNT() - satır sayısını döndürür
• SUM() - sayısal bir sütunun toplam toplamını döndürür
• AVG() - bir dizi değerden ortalama değeri döndürür
• MIN() / MAX() - Bir sütundan minimum / maksimum değeri alır

Tablomuzdaki en son yılı almak için aşağıdaki SQL sorgusunu yazmalıyız:

SELECT MAX(yayınlandı) FROM albümlerden;

8. Alt Sorgular

Önceki paragrafta verilerle basit hesaplamaların nasıl yapıldığını öğrendik. Bu hesaplamaların sonucunu kullanmak istersek iç içe sorgular olmadan yapamayız. Diyelim ki çıktı almak istiyoruz sanatçı, albüm Ve çıkış tarihi tablodaki en eski albüm için.

Bu belirli sütunları nasıl elde edeceğimizi biliyoruz:

SELECT sanatçı, albüm, yayımlanan FROM albümler;

Ayrıca en erken yılın nasıl alınacağını da biliyoruz:

SELECT MIN(yayınlandı) FROM albümden;

Şimdi tek yapmanız gereken iki sorguyu bir WHERE ile birleştirmektir:

SELECT sanatçı,albüm,çıkışlanan albümler NEREDE yayınlandı = (SELECT MIN(yayınlanan) FROM albümler);

9. Tabloları birleştirme

Daha karmaşık veritabanlarında birbiriyle ilişkili birden fazla tablo bulunur. Örneğin aşağıda video oyunlarıyla ilgili iki tablo bulunmaktadır ( video oyunları) ve video oyunu geliştiricileri ( game_developers).

Masa video oyunları bir geliştirici sütunu var ( geliştirici_id), ancak geliştiricinin adını değil, bir tam sayı içeriyor. Bu numara bir tanımlayıcıdır ( İD) oyun geliştiricileri tablosundan ilgili geliştiricinin ( game_developers) iki listeyi mantıksal olarak birbirine bağlayarak her ikisinde de saklanan bilgileri aynı anda kullanmamıza olanak tanır.

Oyunlar hakkında bilmemiz gereken her şeyi döndüren bir sorgu oluşturmak istiyorsak, her iki tablodaki sütunları birbirine bağlamak için INNER JOIN'i kullanabiliriz.

video_games.name, video_games.genre, game_developers.name, game_developers.country'yi video_games'DEN SEÇİN INNER JOIN game_developers ON video_games.developer_id = game_developers.id;

Bu en basit ve en yaygın JOIN türüdür. Başka seçenekler de var, ancak bunlar daha az sıklıkta görülen durumlar için geçerlidir.

10. Takma Adlar

Önceki örneğe bakarsanız, adında iki sütun olduğunu fark edeceksiniz. isim. Bu kafa karıştırıcı olduğundan tekrarlanan sütunlardan birine bir takma ad ayarlayalım, örneğin: isim masadan game_developers Aranacak geliştirici.

Ayrıca tablo adlarına takma ad vererek sorguyu kısaltabiliriz: video oyunları Hadi arayalım oyunlar, game_developers - geliştiriciler:

games.name, games.genre, devs.name AS geliştiricisini, devs.country'yi video_games AS oyunlarından SEÇİN game_developers AS devs ON games.developer_id = devs.id;

11. Veri güncelleme

Çoğu zaman bazı satırlardaki verileri değiştirmemiz gerekir. SQL'de bu UPDATE deyimiyle yapılır. UPDATE deyimi aşağıdakilerden oluşur:

• Değiştirme değerini içeren tablo;
• Sütun adları ve yeni değerleri;
• Güncellemek istediğimiz WHERE ile seçilen satırlar. Bu yapılmazsa tablodaki tüm satırlar değişecektir.

Aşağıda tablo var TV dizisi reytingleriyle birlikte dizilerle. Ancak tabloya küçük bir hata girdi: Her ne kadar seri Game of Thrones ve bir komedi olarak tanımlanıyor, aslında değil. Hadi bunu düzeltelim!

tv_series tablo verileri UPDATE tv_series SET tür = "drama" WHERE id = 2;

12. Verilerin silinmesi

SQL ile bir tablo satırını silmek çok basit bir işlemdir. Tek yapmanız gereken silmek istediğiniz tabloyu ve satırı seçmek. Tablodaki son satırı önceki örnekten kaldıralım TV dizisi. Bu >DELETE deyimi kullanılarak yapılır.

tv_series'DEN SİL WHERE id = 4

DELETE deyimini yazarken dikkatli olun ve WHERE deyiminin mevcut olduğundan emin olun, aksi takdirde tüm tablo satırları silinecektir!

13. Tabloyu silmek

Tüm satırları kaldırmak ancak tablonun kendisini bırakmak istiyorsak TRUNCATE komutunu kullanın:

TRUNCATE TABLE tablo_adı;

Hem verileri hem de tablonun kendisini gerçekten silmek istediğimizde, DROP komutu kullanışlı olacaktır:

DROP TABLE tablo_adı;

Bu komutlara çok dikkat edin. Geri alınamazlar!/p>

Bu, SQL eğitimimizi tamamlıyor! Çok fazla değinmedik, ancak zaten bildikleriniz, web kariyerinizde size bazı pratik beceriler kazandırmak için yeterli olmalıdır.

Lenfositlerin farklı haplotipteki MHC-II molekülleri ile birlikte yetiştirilmesi, bunların patlama dönüşümüne ve çoğalmasına neden olur. Reaksiyona giren hücreler T lenfositlerine aittir ve B lenfositleri, makrofajlar üzerinde bulunan yabancı MHC-II determinantları tarafından uyarılır. Reaksiyonun gücü doku uyumluluk antijenleri arasındaki farkın derecesine bağlıdır. Bir bireyin MHC alelik varyantına ilişkin reaktivitesini değerlendirmek için tek yönlü bir lenfosit kültürü hazırlanır. Bunu yapmak için, uyarıcı hücreler mitomisin ile ön işleme tabi tutulur veya ışınlanırken, uyarıcı hücreler bölünme yeteneklerini kaybeder ancak canlı kalır.

Karışık bir lenfosit kültüründe reaktivite, değerlendirmedeki kriterlerden biridir hücresel bağışıklık. SKL gerçekleştirilmesine izin verir HLA yazarak HLA antijenleri ile bazı hastalıklar arasında korelasyon kurmak için doku ve organ nakli için donör-alıcı çiftini seçmek.

Reaksiyonu oluşturmak için hastaların (donör ve alıcı) kanından izole edilen bir lenfosit süspansiyonu kullanılır. Yıkanan yanıt veren hücreler, az miktarda ortam 199 (0,5 mi) içinde süspanse edilir ve hücrelerin sayısı sayıldıktan sonra 0,6 x 106 hücre/ml'ye ayarlanır. Uyarıcı hücre süspansiyonu, 1 ml süspansiyon başına 0,1 ml oranında bir mitomisin C çözeltisinin (1 ml tamponlu salinde 500 μg mitomisin C) eklenmesiyle benzer şekilde hazırlanır. Hücre karışımı, karıştırılarak bir su banyosunda 37°C'de 40 dakika süreyle inkübe edilir, daha sonra süspansiyona soğuk ortam 199 eklenir ve hücreler, santrifüjleme yoluyla üç kez yıkanır. Çökelti askıya alınır kültür ortamı yetiştirme, hücre sayısını 0,6 x 106 hücre/ml'ye getirme.

Hank solüsyonundaki 0,1 ml hücre süspansiyonu, steril yuvarlak tabanlı bir immünolojik plakanın oyuklarına eklenir ve MHC alelik varyantlarını taşıyan 0,1 ml hücre süspansiyonu ilave edilir. Kontrole aynı miktarda Hank solüsyonu eklendi.

Sonuçlar, morfolojik veya izotop yöntemi kullanılarak reaksiyonun formülasyonuna bağlı olarak hücreler 37 °C'de 3-5 gün inkübe edildikten sonra kaydedilir (bkz. RBTL).

Nakil yaparken kemik iliği Doku uyumlu bir donörün seçimi, donör ve alıcının HLA tiplemesinin sonuçlarına ve ayrıca uyumluluk değerlendirmesinin son aşaması olan SCL'de seçilen HLA-özdeş donör-alıcı çiftlerinin uyumluluğunun belirlenmesine dayanır. Bunun için, radyoaktif H3-timidin'in çoğalan lenfositlerin DNA'sına dahil edilmesiyle çoğalmanın büyüklüğünün bir değerlendirmesiyle 96 oyuklu bir plakada mikrokültürel bir yöntem kullanılarak çift yönlü bir SCL reaksiyonu kullanılır.

Şu anda rolün incelenmesine çok dikkat ediliyor. bağışıklık mekanizmalarıüreme sürecinde, ihlalleri kısırlığın gelişmesine ve hamileliğin erken sonlandırılmasına yol açtığından. İmmünolojik parametreler ve bunların birbirleriyle olan ilişkileri üzerine çalışmalar üreme süreçleri yeniden yapılanmanın gerekli olduğu sonucuna varılmıştır. bağışıklık sistemi Annenin vücudunu hamileliğe hazırlamak için öncelikle Yumurtlama dönemi Embriyo implantasyonu sırasında ve erken periyot gebelik.

Kısırlığın ve tekrarlayan spontan düşüklerin en karmaşık ve teşhis edilmesi zor nedenlerinden biri bağışıklık fonksiyon bozukluğudur.

Amacıyla zamanında tespitÜreme immünolojisi laboratuvarında immünolojik kısırlık inceleniyor çiftler kullanarak aşağıdaki yöntemler teşhis:

• Bir kadının lenfositlerinin partner antijenlerine proliferatif tepki düzeyinin incelenmesi (karışık bir lenfosit kültüründe)
• Bir kadının kan serumundaki bloke edici faktörlerin aktivitesinin belirlenmesi.
• doğal sitotoksik hücrelerin alt popülasyonlarının kantitatif içeriğinin değerlendirilmesi Periferik kan kadınlar.
• genişletilmiş immünogram
• Periferik kanda baskılayıcı aktiviteye sahip düzenleyici hücrelerin içeriğinin incelenmesi.
• Klinik tanımlarken ve laboratuvar işaretleriİmmünolojik infertilite nedeniyle hastaların muayene edilmesi önerilir. tıbbi prosedür- bireysel bir programa uygun olarak gerçekleştirilen kocanın lenfositleriyle alloimmünizasyon.

Konsültasyon gerekli:

• jinekolojik yokluğunda ve endokrin hastalıkları yıl boyunca düzenli cinsel yaşamla gebelik olmaz.
• tekrarlanan (1 defadan fazla) kendiliğinden düşük (düşük) durumunda.
• en başarısız IVF tarihte.
• gerçek bir hamileliğin sonlandırılması tehdidiyle.

İhlaller tespit edilirse, ihlallerin immüno-düzeltilmesi amacıyla bir prosedür belirlenir. partner lenfositlerle alloimmünizasyon (AIL). Bu method tedaviler onaylandı Federal Hizmet Sağlık alanında denetime ilişkin (02.07.2009 tarih ve FS No. 2009/179 lisansı)

Prosedür yalnızca partnerin sahip olması durumunda gerçekleştirilir. olumsuz sonuçlar HIV enfeksiyonu, frengi testi ve viral hepatit(M.Ö). AIL'de komplikasyon tespit edilmedi. AIL yöntemi belirgin bir immüno-düzeltici etkiye sahiptir, kısırlık tedavisinin etkinliğini arttırır. doğal döngü, birlikte tüp bebek(EKO). Ayrıca in vitro fertilizasyondaki başarısız girişimler için de reçete edilir.

AIL 28-30 günde 1 kez gerçekleştirilir (uygun olarak adet döngüsü Kadınlar) döngünün 1. aşamasında. İlk kurs 3 AIL prosedürünü içerir. 2. işlemden sonra çift kontrol analizini tekrar alır. Olumlu dinamiklerin varlığında üçüncü AIL işlemi sonuncusudur. Dinamiklerin yokluğunda immünizasyon için hücre dozu arttırılır ve 2 prosedür içeren 2. kurs gerçekleştirilir. Kontrol analizinden sonra, bazı durumlarda, hücre dozunun arttırılmasıyla 3. bir aşılama kürünün reçete edilmesi gerekir. Standart değerlere ulaşıldıktan sonra olumlu etki 6-8 ay içerisinde devam eder.

2003'ten 2013'e kadar olan dönem için. hücresel immünoterapi laboratuvarında partnerlerin lenfositleriyle yaklaşık 3000 alloimmünizasyon prosedürü gerçekleştirildi. Bu işlem için partnerin kanından sadece lenfositler izole edilir ve bunlar her zaman menide bulunur. Diğer ülkelerde*, bir kadının sağlıklı bir çocuk doğurmasına ve doğurmasına yardımcı olan alloimmünizasyon prosedürü de 20 yıldır uygulanmaktadır.

Servis tipi	fiyat, ovmak.
Lenfosit dönüşüm testi	1650
Lenfosit transformasyon testi (2v-va'da duyarlılığın tespiti)	2 900
Lenfosit transformasyon testi (3v-va'da duyarlılığın tespiti)	3 900
Lenfosit transformasyon testi (kısırlık için immünolojik inceleme)	3 200
Aktivasyon belirteçleri içeren genişletilmiş immünogram	4 625
Bağışıklık durumunun kapsamlı çalışması	4 125
Aşılama (eşin lenfositleriyle alloimmünizasyon 1 doz)	1 900
Aşılama (eşin lenfositleriyle alloimmünizasyon 2 doz)	2 750
Aşılama (eşin lenfositleriyle alloimmünizasyon 3 doz)	3 400
CD16+/CD56+ lenfositlerin araştırılması (kısırlığa yönelik immünolojik inceleme sadece NK hücreleri)	1 250
Makrofaj aktivitesinin incelenmesi (makrofajların şartlandırılmış ortamları)	9 400
Makrofaj aktivitesinin incelenmesi (koşullu ortam)	1 500
Alloimmünizasyon için mononükleer hücrelerin dondurularak saklanması	650

2.2. Hücre etkileşimi yöntemleri

Klinik immünogenetikte kullanılan hemen hemen tüm hücre etkileşimi yöntemleri, Kanadalı araştırmacı Barbara Bain tarafından keşfedilen karışık lenfosit kültüründe patlama oluşumu olgusuna dayanmaktadır. Karışık lenfosit kültürü (MLC) reaksiyonu, HLA kompleksinin ve özellikle onun alt birimlerinden biri olan HLA-D lokusunun çok iyi farklılaştırılmış bir çalışmasına olanak sağladı. Hücre etkileşimlerinin bir dizi başka yöntemi - hücre aracılı lenfoliz (Hücre aracılı Lenfoliz - CML), prime edici lenfositlerin testi (Primed Lenfosit Tiplemesi) - MLC yöntemini temel alır veya onu ayrılmaz bir parça olarak içerir.

2.2.1. Karışık lenfosit kültürü (MCL)

Yöntemin prensibi Şek. Şekil 10, genetik olarak farklı lenfositlerden oluşan iki popülasyonun in vitro kültürde birbirleriyle etkileşime girdiğini göstermektedir. Popülasyonlardan biri mitomisin C ile tedavi edilir veya ışınlanır, bunun sonucunda patlama oluşumu ve timidin katılımı (3 HT) yeteneğini kaybeder, ancak antijenik özelliklerini kaybetmeden uyarma yeteneğini (uyarıcılar; S-) korur. nüfus).

Stimülasyona yanıt veren hücreler (yanıt verenler, R popülasyonu) birkaç gün sonra patlamalara dönüşür ve kültüre eklenen timidin içerir. Reaksiyonun yoğunluğu,3H-timidin ilavesiyle bir radyasyon etiketi kullanılarak ölçülür.

Karışık bir lenfosit kültürünün reaksiyonunun çeşitli varyantları bilinmektedir; bunlardan ikisi burada önerilmektedir: geleneksel bir varyant ve Cook plakalarında uygulanan bir mikro varyant (Şekil 11).

Pirinç. 11. MLC ve CML mikro değişkenleri için ekipman. 1 - yuvarlak tabanlı tablet ve 96 delik; Farklı hacimler için programlı 2-otomatik pipet ("Pipetman"); 3 - belirli bir hacim için otomatik pipet ("Sigma"); 4 - tek kullanımlık pipet ucu; 5 - laminer kutu

MLC'nin geleneksel versiyonu (F. S. Baranova tarafından değiştirilmiştir):

Lenfositler yukarıda açıklandığı gibi bir fikol-ürografin gradyanı üzerinde izole edilir. İlk yıkama PBS'de gerçekleştirilir (NaCl - 8,0 g, Na2HP0 4 - 1,15 g, KH2P04 - 0,2 g, KC1 - 1 litre H20 başına 0,2 g); sonraki ikisi %5 AB serumu (15 donörden oluşan havuz) içeren ortam 199'da üretilir;

Yanıt veren hücreler, %10 AB serumu içeren 199 ortamında yeniden süspanse edilir ve hücre konsantrasyonu, 1 ml'de 0.6 x 106'ya ayarlanır;

Aynı şekilde 1 ml başına 5 - 106 konsantrasyonda izole edilen uyarıcı hücreler, Serva'dan alınan mitomisin C (60 y/ml) ile işleme tabi tutulur ve bir su banyosunda 37°C'de 40 dakika süreyle inkübe edilir. İnkübasyondan sonra hücreler 3 kez %5 serum AB'li ortam 199 ile yıkanır, %10 serum AB'li ortam 199'da yeniden süspanse edilir, konsantrasyon 1 ml'de 0.6 x 106'ya getirilir;

0,5 ml tepki veren hücre ve 0,5 ml uyarıcı hücre bir santrifüj tüpünde karıştırılır, 0,04 ml 10 ml Hepes çözeltisi (Serva) eklenir ve 144 saat süreyle inkübe edilir; deneyim üç paralele (üçlü) yerleştirilmiştir;

İnkübasyonun bitiminden 24 saat önce tüplere numune başına 3 H-timidin 1μCi (3,7x10 4 BC) eklenir. spesifik aktivite 5mSi/mmol (18.5x107 Bq/mmol) ve inkübasyona devam edin;

İnkübasyonun sonunda hücreler milipor filtrelere (0,6 - 0,9 mikron) aktarılır, yıkanır. tuzlu su(37°C) ve soğutulmuş %5 trikloroasetik asit çözeltisi (4°C). Filtreler kurutulur ve 5 ml sintilasyon sıvısı (1 litre tolüen başına 5 g PPO ve 0,5 g POPOP)* içeren şişelere yerleştirilir. 3H-timidin katılma aktivitesi bir p-sayacı üzerinde ölçülür; sonuç, aşağıdaki formüle göre radyoaktif etiketin 1 dakikadaki mutlak kapanımları veya stimülasyon indeksi (SI) cinsinden ifade edilir:

* (PPO - 2,5-fenol-oksazol; POPOP - (1,4-di-2-15-fenol oksazolitbenzen).)

Üç prototipteki ortalama BGBM değeri

SI = Üç kontrolün/Kontrollerin ortalama BGBM'si, yanıt veren hücrelerin spontan kültürleridir.

Cook tabletlerindeki MLC mikro çeşidi. 8. Çalıştayda, MLC mikro değişkenini standartlaştıran gereksinimler geliştirildi ve buna göre aşağıda sunuldu:

Lenfositler bir izopac-ficoll gradyanında izole edilir ve RPMJ-1640* ortamında yeniden süspanse edilir, konsantrasyon 1 ml'de 5x105'e getirilir;

* (AB grubu insan serumu (birkaç kişiden alınan %5 serum) ile karıştırılmış Ortam 199 kullanılabilir.)

Stimülatör hücreler mitomisin C veya eğitim ile tedavi edilir;

5x104 yanıtlayıcı ve aynı sayıda uyarıcı, Pipetman tipi bir mikropipet kullanılarak bir Cook yuvarlak tabanlı mikroplakanın her bir oyuğuna yerleştirilir;

Plakalar, 120 saat boyunca otomatik %5 CO2 beslemeli bir termostatta inkübe edilir; daha sonra her bir oyuğa 6 Ci/mmol timidin spesifik aktivitesinde 1μmCi3H-timidin eklenir; tüm manipülasyonlar bir Pipetman pipeti ile gerçekleştirilir;

Timidin ilave edildikten 16 saat sonra, her bir kuyucuktan alınan kültürler, otomatik bir pipetle mili gözenekli filtrelere aktarılır ve salinle ve ardından %5 trikloroasetik asitle yıkanır; kültürü millipor filtrelere aktarmak için özel "biçerdöverlerin" kullanılması uygundur;

Timidin katılma aktivitesi yukarıda anlatıldığı gibi belirlenir.

2.2.2. Hücre aracılı lenfoliz (KML)

KML immünogenetik çalışmalarda nispeten yakın zamanda (1972'den beri) kullanılmıştır, ancak Son zamanlarda gittikçe daha fazla oluyor popüler teknik Transplant bağışıklığının efferent bağlantısının rolünü ayrıntılı olarak incelemenize ve şu şekilde tanınmanıza olanak tanır: bilgilendirici yöntem immünolojik izleme. Yöntemin prensibi Şek. 12. Yöntem, J. Lightbody (1971) tarafından önerilen ve aşağıda özetlenen tekniğe dayanmaktadır.

1. CML, yanıt veren hücrelerin "uyarıcıları" tanıdığı, yanıt veren hücreleri duyarlı hale getirdiği ve duyarlı öldürücüler oluşturduğu geleneksel bir HLC testiyle başlar.

2. Duyarlılaştırılmış katillerin 51 Cr etiketli hedef hücrelerle karıştırıldığı ikinci aşama, ikincisinin efektör öldürücü hücreler tarafından yok edilmesini içerir; hedef hücreler, MLC'nin birinci fazındaki "uyarıcılar" ile aynı genotipe sahip olabilir veya bunlar, "uyarıcılarla" ortak veya bunlar olmadan antijenik belirleyicilerle donatılmış "üçüncü" partnerin hücreleri olabilir.

3. Yok edilen hedef hücrelerden salınan ve kültür ortamına salınan radyoaktif krom miktarı, öldürücü etkinin yoğunluğunun bir ölçüsü olarak hizmet eder.

Pirinç. 12. Hücre aracılı lenfolizin (CML) prensibi. Ben kürek çekiyorum - tepki veren hücrelerin hassaslaşması, katillerin oluşumu; II satır - katillerin hedefle etkileşimi; III satır - hedef hücrenin imhası; çıkış 51 Cr kültür ortamı

Burada CML'nin üç çeşidi açıklanmaktadır: L.P. Alekseev (1979) tarafından değiştirilen geleneksel versiyon, Cook plakalarındaki mikro varyant, doğrudan CML (Direct-CML -D-CML.

Geleneksel seçenek[Alekseev L.P., 1979].

Yöntem birkaç aşamaya ayrılmıştır.

Kiralık katil almak:

Her iki popülasyonun (R hücreleri ve S hücreleri) periferik lenfositleri olağan şekilde izole edilir, %5 AB serumu (10 dakika, 150 g) içeren ortam 199'da yoğunluk gradyanında üç kez yıkanır;

1x106 R hücreleri (0,8 mi), mitomisin C ile işlenen ve 37°C'de 144 saat boyunca inkübe edilen 2x106 S hücreleri (0,2 mi) ile santrifüj tüplerinde karıştırılır;

Hücreler 150 g'de 10 dakika süreyle santrifüjlenir ve pelet, %20 buzağı serumu (ortam 199 + yani) ilavesiyle ortam 199'da yeniden süspanse edilir ve konsantrasyon 1 ml'de 1x106'ya getirilir;

Örneklerden biri MLC seviyesini incelemek için bırakılır, geri kalanı hazır katil olarak kullanılır.

Hedefler alınıyor:

Geleneksel olarak izole edilen lenfositler, %20 AB serumu içeren 199 ortamında yeniden süspanse edilir ve fitohemaglutinin (0.003 mg/ml Wellcome) ile 37°C'de 72 saat süreyle inkübe edilir; 1 ml'de hücre konsantrasyonu 1x106;

Hücreler 10 dakika süreyle 150 g'de santrifüje tabi tutulur, topak, %5 AB serumu içeren ortam 199'da yeniden süspanse edilir ve hücre konsantrasyonu, 1 ml'de 2x104'e ayarlanır;

Süspansiyona 51 Cr 100 uCi/ml (3.7x106 Bq/ml) eklenir ve 37°C'de 40 dakika süreyle inkübe edilir;

Hücreler, %5 AB serumu ile desteklenmiş 199 ortamında (150 g, 10 dakika) üç kez yıkanır ve pelet, %5 AB serumu ile desteklenmiş 199 ortamında yeniden süspanse edilir. konsantrasyonun 1 ml'de 2x10 4'e getirilmesi.

Tepki beyanı:

5x105 katil (0,5 mi), 1x104 hedef (0,5 mi) ile karıştırılır, 4 saat süreyle (37°C) inkübe edilir ve 150 g'de 10 dakika süreyle santrifüjlenir;

Süpernatan emilir ve 51Cr'nin neden olduğu darbe bir a-sayacında sayılır; sayma 0,5 ml süpernatan içinde gerçekleştirilir;

Sitoliz düzeyi aşağıdaki formülle hesaplanır:

eker. çıkış 51 Cr - anlık çıkış 51 Cr/maks, çıkış 51 Cr - anlık çıkış 41 Cr × 100.

Kendiliğinden krom salınımı, öldürücü hücreler olmadan 4 saat (37°C) inkübe edilen hedefler üzerinde ölçülür; maksimum krom verimi - donma-çözülme nedeniyle tamamen yok edilen hedeflerde; Tüm testler üçlü olarak gerçekleştirilir.

Tabletlerdeki CML'nin mikro değişkeni [Mawas S., 1976'ya göre]:

Öldürücü üretim aşaması, yuvarlak dipli plakalarda MLC olarak gerçekleştirilir, ancak R- ve S-hücreleri, her bir kuyucukta 2x105 PA'da eşit miktarlarda karıştırılır ve 37°C'de inkübe edilir;

5 gün sonra hücreler bir Pasteur pipeti ile bir test tüpünde toplanır, tripan mavisi ile canlı hücre sayısı sayılır ve konsantrasyon 1 ml'de 10x106'ya ayarlanır;

Hedef hücreler 3 gün boyunca PHA ile kültürlenir;

Reaksiyon gününde hedef hücreler yıkanır (300 g) ve kültür ortamında yeniden süspanse edilir, tüplere 1 ml dağıtılır ve 1 ml'de 1x106'ya getirilir;

Hedef hücrelerin bulunduğu her tüpe 200 μCi51 Cr (7,4x106 BK) eklenir ve 37°C'de 1 saat süreyle inkübe edilir; hücreleri 3 kez yıkayın; çökelti yeniden süspanse edilir ve 1 ml'de (canlı) 1x10 konsantrasyonuna ayarlanır;

Test yuvarlak tabanlı mikroplakalarda uygulanır; bunun için her kuyucuğa 0,7 - 1x106 öldürücü hücre (0,1 mi) ve 1x104 hedef hücre (0,1 mi) dağıtılır; her bir kuyucuktaki süspansiyonun toplam hacmi 0,2 ml'dir, her bir kuyucuğa 0,05 ml ortam eklenir ve 4 saat boyunca inkübe edilir (37°C);

Plakalar, bir Beckman santrifüjünde 10 dakika boyunca 800 g'de santrifüjlendi; her kuyucuktan gelen süpernatan test tüplerine aktarılır ve bir γ sayacında sayılır;

Öldürücü üretim aşaması (MLC), %20 insan plazması ile desteklenmiş RPMJ-1640 ortamında gerçekleştirilir; Öldürme aşaması için, önceden ısıtılmış %20 insan plazmasının eklenmesiyle MEM ortamı kullanılır.

Doğrudan CML (D-CML). Doğrudan CML, immünolojik izlemede kullanım alanı bulmuş, klinik amaçlar için özel olarak geliştirilmiş bir tekniktir. Bu reaksiyonun şeması Şek. 13.

Geleneksel KML'den temel fark, öldürücü oluşum aşamasının (duyarlılaşma aşaması) in vitro değil, in vivo, yani allojenik bir organ veya dokunun transplantasyonuyla duyarlı hale getirilmiş insan vücudunda meydana gelmesidir. Allojeneik dokunun etkisi nedeniyle alıcının lenfositleri, donörün doku antijenlerine karşı duyarlı hale gelir ve özel in vitro tedaviye ihtiyaç duymaz, önce yalnızca hedeflerin hazırlanması gerektiğinden test süresi zaman içinde önemli ölçüde kısalır.

Hedefler, periferik kandan veya daha yaygın olarak bir donörün dalağından (bkz. 2.1.2) elde edilen ve yukarıda açıklanan yöntemlerden herhangi biri (bkz. 2.1.3) kullanılarak dondurulmuş lenfositlerdir.

2.2.3. Antikora bağımlı hücre aracılı Sitotoksisite (ADCC)

Bu tip hücresel yanıt, etki mekanizması açısından yukarıda açıklanan CML'ye benzer. Reaksiyonun prensibi şekil 2'de gösterilmektedir. 14. Reaksiyonun bileşenleri, hedef hücreler (verici hücreler veya allojenik lenfositler), muhtemelen hedef hücre belirleyicilerine yönelik antikorlar içeren serum (alojeneik veya alıcı) ve efektör hücrelerdir (alıcı lenfositler veya allojenik lenfositler).

Bu tür etkileşimdeki efektör hücreler, periferik kanda bulunan K hücreleri olarak adlandırılan hücrelerdir. KML'deki öldürücü hücrelerin aksine, önceden duyarlılaşma olmadan sitotoksik etki gösterirler, ancak K hücrelerinin sitotoksik etkisinin ortaya çıkması yalnızca hedef hücrelerin belirleyicilerine yönelik antikorlar yoluyla mümkündür. Spesifik lizis, test serumunun hedef belirleyicilere karşı antikorlar içermesi durumunda51Cr salınımıyla ölçülür.

ADCC'deki hedef belirleyiciler, HLA-D, HLA-DR dahil hemen hemen tüm HLA lokuslarının spesifikasyonları olabileceği gibi HLA sistemi dışındaki belirleyiciler de olabilir.

En yaygın bu karmaşık reaksiyon, B hücresi antikorlarını tespit etmek için immünolojik izleme sırasında elde edildi. Bu bağlamda, hedef hücre süspansiyonunun B-lenfositlerle zenginleştirilmesini, serumların trombositlere adsorpsiyonunu vb. içeren çeşitli modifikasyonlar önerilmiştir.

Ek olarak, bu sistemdeki yanıtın bir dizi başka özelliği de dikkate alınır. Test serumu dekomplemante edilmelidir, aksi takdirde reaksiyon antikor aracılı kompleman bağımlı sitotoksisite olarak ilerleyebilir. Ayrıca efektör hücrelerin, CML tipine göre hedeflerin belirli bir şekilde yok edilmesine neden olabileceği varsayılmaktadır.

Sonuçta antikora bağımlı hücre aracılı lenfositotoksisite testindeki numunelerin tamamı aşağıdaki gibidir:

Hedefler + efektörler + test edilmiş serum (deneysel numune);

Hedefler (kontrol numunesi, yani 51Cr'nin spontan salınımı);

Hedefler + efektörler (efektör aktivitesi için kontrol testi);

Hedefler + test serumu (serum kontrolü).

Lenfositler olağan şekilde izole edilir ve RPMI-1640 + %10 fetal sığır serumu içerisinde yeniden süspanse edilir; monositlerin uzaklaştırılması için süspansiyonun karbonil demir ile işlenmesi; kalan eritrositleri lize etmek için amonyum klorür veya H20 ekleyin;

Hedef hücre süspansiyonuna, Na2CrO4 çözeltisi 100 - 200μCi ml (3,7x106 - 7,4x106 BK / ml) formunda 51 Cr eklenir ve 40 - 60 dakika inkübe edilir;

Hücreler RPMI + %0.1 HSA'da üç kez yıkanır, aynı ortamda yeniden süspanse edilir ve 1 ml'de 2x108'e ayarlanır; Etiketli hücre süspansiyonunun 50 ul'si bir test tüpüne yerleştirilir ve daha sonra izotopik aktivite, tam izotopik "alımı" saptamak için bir y-sayacı üzerinde sayılır; geri kalanı 50 ul süspansiyonla (oyuk başına 1x105 hücre) tabletin gözeneklerine damlatılır;

Hücre-efektörlerin süspansiyonu 1 ml ve içinde 2x10 7 hücreye getirilir. efektör-hedef oranı 10:1 (veya 20:1) olacak şekilde her bir kuyucuğa 50 ul süspansiyon (veya 100 ul) koyun;

Kuluçka, %5 CO2 içeren nemli atmosferli bir kuluçka makinesinde 4 saat sürer (kuluçka süresi 8 saate kadar uzatılabilir);

Test tüplerinde test serumunun birkaç seyreltimini (1:25; 1:100) hazırlayın ve kuyucuklara her seyreltmeden 50 µl'ye kadar ekleyin: ve seyreltilmemiş serum; Testin son ayarı Tabloda gösterildiği gibi görünür. 23.

Tablo 23

ADCC'nin ayarlanması. Tüm numune seçenekleri, µl

* (Test serumu yerine bir AV serumu havuzu damlatılır.)

** (Test serumu yerine hedeflere (efektörlere değil) yönelik monospesifik bir HLA serumu aşılanır.)

Paneller %4 C02 içeren nemli bir atmosferde 4 saat süreyle inkübe edilir; kuluçka süresi 8 saate kadar uzatılabilir;

İnkübasyondan sonra, her bir kuyucuğun hacminin yarısı (100 ul) otomatik bir pipetle dikkatlice aspire edilir ve 51 Cr darbesinin sayılması için tüplere yerleştirilir; aktivite bir γ sayacında sayılır;

Hesaplamalar aşağıdaki gibidir:

51 Cr salınımı yüzdesi = 2 × A op - arka plan etkinliği/B - arka plan etkinliği × 100;

% sitotoksisite = A op - A sp /100 - A sp × 100, burada A op - deney numunelerinde 51 Cr'nin % salımı; Ve cn -% kendiliğinden salınım; B - izotopun tam asimilasyonu.

Nasıl olumlu sonuç 4 saatlik inkübasyondan sonra %5 veya daha yüksek sitotoksisite kabul edilir.