Применение бактериофагов в медицине кратко. Применение бактериофагов в медицине и биотехнологии

Отличительные свойства бактериофагов как представителей царства Vira. Вирулентные фаги, стадии взаимодействия с бактериальной клеткой. Практическое применение бактериофагов

Вирулентные фаги вызывают продуктивную инфекцию , при которой происходит репродукция фагов и лизис бактериальной клетки.

Механизм взаимодействия вирулентного фага с микробной клеткой:

1. Адсорбция фага на чувствительной клетке. Происходит при наличии комплементраных рецепторов в клеточной стенке бактерий и на концах нитей фагового отростка. Сперва фаг присоединяется нитями, а затем прочно прикрепляется к клеточной стенке с помощью зубцов банальной пластинки.

2. Проникновение ДНК фага в бактериальную клетку . С помощью лизоцима, находящегося в банальной пластинке, участок клеточной стенки гидролизируется, чехол отростка сокращается и внутренний стержень прокалывать оболочки клетки. Молекула фаговой ДНК по каналу стержня проникает внутрь клетки.

3. Внутриклеточное развитие фага . Фазовая ДНК вносит в бактериальную клетку генетическую информацию. Происходит биосинтез компонентов, необходимых для репродукции. На начальных этапах синтезируются "ранние белки" - ферменты, осуществляющие репликацию фаговой ДНК с целью образования множества ее копий. Затем на клеточных рибосомах формируются структурные "поздние белки"

4. Морфогенез фага . Созревание фага происходит по трем независимым ветвям в различных участках клетки, является разобщенным процессом. Отдельно формируются головки фага - вокруг молекулы ДНК строится капсид. Независимо идет построение отростка. Отдельно синтезируются нити отростка. Затем все составные части фага объединяются, образуя вирионы.

5. Лизис бактериальной клетки и выход фага. Лизис осуществляется под действием лизоцима. Выход путем отпочковывания.

Строгая специфичность бактериофагов позволяет использовать их для фаготипирования и дифференцировки бактериальных культур, а также для индикации их во внешней среде, например в водоемах.

Метод фаготипирования бактерий широко применяется в микробиологической практике. Он позволяет не только определить видовую принадлежность исследуемой культуры, но и ее фаготип (фаговар). Это связано с тем, что у бактерий одного и того же вида имеются рецепторы, адсорбирующие строго определенные фаги, которые затем вызывают их лизис. Использование наборов таких типоспецифических фагов позволяет проводить фаготипирование исследуемых культур с целью эпидемиологического анализа инфекционных заболеваний:(установления источника инфекции и путей ее передачи)

II. Фаги применяют для профилактики и лечения инфекционных заболеваний:

а) фагопрофилактика - метод предупреждения развития некоторых бактериальных инфекций с помощью приема внутрь специфического бактериофага. Применяют для профилактики холеры, дизентерии, брюшного тифа и др.

б) фаготерапия- метод лечения бактериальных инфекций посредством приема внутрь специфического фага. (брюшнотифозного, сальмонеллезных, дизентерийного, протейного, синегнойного, стафилококкового, стрептококкового, коли-фага и комбинированных препаратов. Их используют в терапии инфекционных заболеваний, вызываемых вышеперечисленными микроорганизмами, а также в терапии раневых и анаэробных инфекций.)

Генотипическая изменчивость

Патогенность -

Адгезия

Инвазия

Агрессия .

4.Строение генетического аппарата прокариот. Фенотипическая и генотипическая изменчивость. Генетические основы патогенности бактерий.

Генетический аппарат прокариот - не имеет ядерной оболочки и представлен одной кольцевой молекулой ДНК,которая является хромосомой; располагается в цитоплазме,не содержит белков гистонов. Не способен к митозу

Фенотипическая изменчивость – модификации(изменение не одного или нескольких признаков)– не затрагивает генотип. Изменения Фенотипическая происходят под влиянием факторов внешней среды.Модификации затрагивают большинство особей в популяции. Они не передаются по наследству и с течением времени затухают, т. е. возвращаются к исходному фенотипу.

Генотипическая изменчивость - изменение свойств бактерий,застрагивая их генотип. Передается по наследству, является долговременной. Возникает в следствие мутаций или генетического обмена(трансформации, конъюгации или трансдукции)

Патогенность - видовой признак, передающийся по наследству, закрепленный в геноме микроорганизма т. е. это генотипический признак, отражающий потенциальную возможность микроорганизма проникать в макроорганизм и размножаться в нем (инвазионность), вызывать комплекс патологических процессов, возникающих при заболевании.

К факторам патогенности относят способность микроорганизмов прикрепляться к клеткам (адгезия), размещаться на их поверхности (колонизация), проникать в клетки (инвазия) и противостоять факторам защиты организма (агрессия).

Часть из них кодируется непосредственно генами нуклеоида (например, капсула и ферменты у некоторых видов). Другая часть кодируется внехромосомными факторами наследственности – плазмидами и эписомами. Плазмидные гены обычно определяют взаимодействие возбудителей с эпителием, а хромосомные – существование и размножение бактерий внеклеточно в органах и тканях.

Адгезия Структуры, ответственные за связывание микроорганизма с клеткой называются адгезинами и располагаются они на его поверхности.У грамотрицательных бактерий адгезия происходит за счет пилей I и общего типов. У грамположительных бактерий адгезины представляют собой белки и тейхоевые кислоты клеточной стенки. У других микроорганизмов эту функцию выполняют различные структуры клеточной системы: поверхностные белки, липополисахариды, и др.

Инвазия фермент гиалуронидаза расщепляет гиалуроновую кислоту, входящую в состав межклеточного вещества, и, таким образом, повышает проницаемость слизистых оболочек и соединительной ткани. Нейраминидаза расщепляет нейраминовую кислоту, которая входит в состав поверхностных рецепторов клеток слизистых оболочек, что способствует проникновению возбудителя в ткани.

Агрессия К факторам агрессии относятся: протеазы - ферменты, разрушающие иммуноглобулины; коагулаза - фермент, свертывающий плазму крови; фибринолизин - растворяющий сгусток фибрина; лецитиназа - фермент, действующий на фосфолипиды мембран мышечных волокон, эритроцитов и других клеток.

Набирает все больше поклонников среди врачей, отодвигая антибиотики на второй план. Когда-то появление антибиотиков полностью изменило представление врачей о лечении. Ранее безнадежные пациенты стали поправляться, предельно упростились алгоритмы лечения, резко упала смертность… Чудеса! Волшебные лекарства! Но восторженное отношение продержалось недолго. Слишком много проблем стало возникать.

Враг моего врага – мой друг

Сейчас «скользкие» вопросы антибиотикотерапии известны всем. Действие антибиотиков сопровождается:

Уничтожением необходимой, «полезной», микрофлоры кишечника и слизистых;

Активным ростом новых штаммов бактерий, устойчивых к ним;

Возникновением побочных эффектов за счет системного действия препаратов.

В связи с этим актуальным стал поиск принципиально иных лекарств для лечения бактериальных инфекций. И тут на первый план вышли бактериофаги.

Бактериофаги – это вирусы, избирательно поражающие бактериальные клетки. Вирус закрепляется на клеточной стенке бактерии и вводит внутрь клетки свой генетический материал. В результате начинается синтез новых вирусов, а затем происходят лизис бактериальной клетки и высвобождение 200-1000 новых фагов, которые инфицируют другие бактерии. Когда все бактерии патогенного штамма уничтожены, бактериофаги бесследно выводятся из организма. Многие бактериофаги узкоспецифичны, и каждый штамм вируса поражает только определенный вид бактерий, никак не влияя на прочие микроорганизмы и клетки организма. Это обеспечивает значительное уменьшение числа побочных эффектов.

Таким образом, к несомненным плюсам использования бактериофагов можно отнести:

Высокий профиль безопасности, позволяющий использовать их у пациентов любого возраста, начиная с новорожденных и заканчивая глубокими стариками;

Уменьшение риска возникновения устойчивых штаммов бактерий;

Возможность их сочетания с любыми другими препаратами, в том числе и антибиотиками.

Пожалуй, единственное, что ограничивает использование бактериофагов, – это их избирательность, из-за которой перед лечением необходимо уточнить природу возбудителя и его чувствительность к различным видам бактериофагов. Подобный анализ проводится отнюдь не везде и занимает определенное время, но усовершенствование диагностических систем позволяет надеяться, что эта проблема в скором времени может быть разрешена.

От теории – к практике

Существуют разные виды бактериофагов: монофаги, направленные на уничтожение только одного вида бактерий, и полифаги, действующие сразу на несколько видов патогенных бактерий. Поскольку бактериофаги чрезвычайно востребованы практически во всех областях медицины, от хирургии и гинекологии до неонатологии и ЛОР-практики, то предусмотрен выпуск бактериофагов в различных формах. Их используют для приема внутрь рег оs, в виде клизм, аппликаций, орошений, для введения в полости ран, влагалища, матки, носа, пазух носа, а также для введения в дренированные полости – брюшную, плевральную, мочевого пузыря, почечной лоханки. Продолжительность курса зависит от клинических показаний и может составить 7-20 дней. Безопасные, эффективные и надежные бактериофаги – это именно то оружие, которое так необходимо в борьбе с патогенными бактериями.

Не только лекарство

Прогресс в молекулярной биологии и биотехнологиях позволил использовать бактериофаги не только для лечения, но и для других целей. В США, например, бактериофаги применяют в качестве безопасного консерванта для пищевых продуктов. Добавленные к продуктам, бактериофаги препятствуют размножению нежелательных бактерий.

Интересные факты

Открытие бактериофагов произошло в 1894 году, когда британский бактериолог Эрнест Ханкин заметил, что индийских рек Ганг и Джамна обладает значительной антибактериальной активностью, которая полностью исчезает после кипячения. Он предположил, что в воде присутствует некая субстанция, убивающая бактерии. Название «бактериофаг» («поедатель бактерий») эти вирусы получили в 1917 году от французского ученого Феликса Д’ Эрелля, открывшего «невидимого микроба, поражающего дизентерийную палочку». Уточнение природы этого «невидимки» стало возможным только после появления электронной микроскопии.

Бактериофа ги или фа ги (от др. греч. φᾰγω «пожираю») - вирусы, избирательно поражающие бактериальные клетки. Чаще всего бактериофаги размножаются внутри бактерий и вызывают их лизис. Как правило, бактериофаг состоит из белковой оболочки и генетического материала одноцепочечной или двуцепочечной нуклеиновой кислоты(ДНК или, реже, РНК). Общая численность бактериофагов в природе примерно равна общей численности бактерий (1030 – 1032 частиц). Бактериофаги активно участвуют в круговороте химических веществ и энергии, оказывают заметное влияние на эволюцию микробов и бактерий Структура типичного миовируса бактериофага.

Строение бактериофагов 1 - головка, 2 - хвост, 3 - нуклеиновая кислота, 4 - капсид, 5 - «воротничок» , 6 - белковый чехол хвоста, 7 - фибрилла хвоста, 8 - шипы, 9 - базальная пластинка

Бактериофаги различаются по химической структуре, типу нуклеиновой кислоты, морфологии и характеру взаимодействия с бактериями. По размеру бактериальные вирусы в сотни и тысячи раз меньше микробных клеток. Типичная фаговая частица (вирион) состоит из головки и хвоста. Длина хвоста обычно в 2- 4 раза больше диаметра головки. В головке содержится генетический материал - одноцепочечная или двуцепочечная РНК или ДНК с ферментом транскриптазой в неактивном состоянии, окружённая белковой или липопротеиновой оболочкой - капсидом, сохраняющим геном вне клетки. Нуклеиновая кислота и капсид вместе составляют нуклеокапсид. Бактериофаги могут иметь икосаэдральный капсид, собранный из множества копий одного или двух специфичных белков. Обычно углы состоят из пентамеров белка, а опора каждой стороны из гексамеров того же или сходного белка. Более того, фаги по форме могут быть сферические, лимоновидные или плеоморфные. Хвост, или отросток, представляет собой белковую трубку - продолжение белковой оболочки головки, в основании хвоста имеется АТФаза, которая регенерирует энергию для инъекции генетического материала. Существуют также бактериофаги с коротким отростком, не имеющие отростка и нитевидные.

Систематика бактериофагов Большое количество выделенных и изученных бактериофагов определяет необходимость их систематизации. Этим занимается Международный комитет по таксономии вирусов (ICTV). В настоящее время, согласно Международной классификации и номенклатуре вирусов, бактериофаги разделяют в зависимости от типа нуклеиновой кислоты и морфологии. На данный момент выделяют девятнадцать семейств. Из них только два РНКсодержащих и только пять семейств имеют оболочку. Из семейств ДНКсодержащих вирусов только два семейства имеют одноцепочечные геномы. У девяти ДНК-содержащих семейств геном представлен кольцевой ДНК, а у других девяти - линейной. Девять семейств специфичны только для бактерий, остальные девять только для архей, а (Tectiviridae) инфицирует как бактерий, так и архей

Взаимодействие бактериофага с бактериальными клетками По характеру взаимодействия бактериофага с бактериальной клеткой различают вирулентные и умеренные фаги. Вирулентные фаги могут только увеличиваться в количестве посредством литического цикла. Процесс взаимодействия вирулентного бактериофага с клеткой складывается из нескольких стадий: адсорбции бактериофага на клетке, проникновения в клетку, биосинтеза компонентов фага и их сборки, выхода бактериофагов из клетки. Первоначально бактериофаги прикрепляются к фагоспецифическим рецепторам на поверхности бактериальной клетки. Хвост фага с помощью ферментов, находящихся на его конце (в основном лизоцима), локально растворяет оболочку клетки, сокращается и содержащаяся в головке ДНК инъецируется в клетку, при этом белковая оболочка бактериофага остаётся снаружи. Инъецированная ДНК вызывает полную перестройку метаболизма клетки: прекращается синтез бактериальной ДНК, РНК и белков. ДНК бактериофага начинает транскрибироваться с помощью собственного фермента транскриптазы, который после попадания в бактериальную клетку активируется. Синтезируются сначала ранние, а затем поздние и. РНК, которые поступают на рибосомы клетки-хозяина, где синтезируются ранние (ДНК-полимеразы, нуклеазы) и поздние (белки капсида и хвостового отростка, ферменты лизоцим, АТФаза и транскриптаза) белки бактериофага. Репликация ДНК бактериофага происходит по полуконсервативному механизму и осуществляется с участием собственных ДНК-полимераз. После синтеза поздних белков и завершения репликации ДНК наступает заключительный процесс - созревание фаговых частиц или соединение фаговой ДНК с белком оболочки и образование зрелых инфекционных фаговых частиц

Жизненный цикл Умеренные и вирулентные бактериофаги на начальных этапах взаимодействия с бактериальной клеткой имеют одинаковый цикл. Адсорбция бактериофага на фагоспецифических рецепторах клетки. Инъекция фаговой нуклеиновой кислоты в клетку хозяина. Совместная репликация фаговой и бактериальной нуклеиновой кислоты. Деление клетки. Далее бактериофаг может развиваться по двум моделям: лизогенный либо литический путь. Умеренные бактериофаги после деления находятся в состоянии профаза (лизогенный путь) Вирулентные бактериофаги развиваются по литической модели: Нуклеиновая кислота фага направляет синтез ферментов фага, используя для этого белоксинтезирующий аппарат бактерии. Фаг тем или иным способом инактивирует ДНК и РНК хозяина, а ферменты фага совсем расщепляют её; РНК фага «подчиняет» себе клеточный аппарат синтеза белка. Нуклеиновая кислота фага реплицируется и направляет синтез новых белков оболочки. Образуются новые частицы фага в результате спонтанной самосборки белковой оболочки (капсид) вокруг фаговой нуклеиновой кислоты; под контролем РНК фага синтезируется лизоцим. Лизис клетки: клетка лопается под воздействием лизоцима; высвобождается около 200- 1000 новых фагов; фаги инфицируют другие бактерии.

Применение В медицине Одной из областей использования бактериофагов является антибактериальная терапия, альтернативная приёму антибиотиков. Например, применяются бактериофаги: стрептококковый, стафилококковый, клебсиеллёзный, дизентерийныйиполив алентный, пиобактериофаг, коли, протейный и колипротейный и другие. В России зарегистрировано и применяется 13 медицинских препаратов на основе фагов. В настоящее время их применяют для лечения бактериальных инфекций, которые не чувствительны к традиционному лечению антибиотиками, особенно в республике Грузия. Обычно, применение бактериофагов сопровождается большим, чем антибиотики, успехом там, где присутствуют биологические мембраны, покрытые полисахаридами, через которые антибиотики обычно не проникают. В настоящее время терапевтическое применение бактериофагов не получило одобрения на Западе, хотя и применяются фаги для уничтожения бактерий, вызывающих пищевые отравления, таких, как листерии. В многолетнем опыте в объёме крупного города и сельской местности доказана необычайно высокая лечебная и профилактическая эффективность дизентерийного бактериофага (П. М. Лернер, 2010). В России терапевтические фаговые препараты делают давно, фагами лечили ещё до антибиотиков. В последние годы фаги широко использовали после наводнений в Крымске и Хабаровске, чтобы предотвратить дизентерию.

В биологии Бактериофаги применяются в генной инженерии в качестве векторов, переносящих участки ДНК, возможна также естественная передача генов между бактериями посредством некоторых фагов (трансдукция). Фаговые векторы обычно создают на базе умеренного бактериофага λ, содержащего двухцепочечную линейную молекулу ДНК. Левое и правое плечи фага имеют все гены, необходимые для литического цикла (репликации, размножения). Средняя часть генома бактериофага λ (содержит гены, контролирующие лизогению, то есть его интеграцию в ДНК бактериальной клетки) не существенна для его размножения и составляет примерно 25 тысяч пар нуклеотидов. Данная часть может быть заменена на чужеродный фрагмент ДНК. Такие модифицированные фаги проходят литический цикл, но лизогения не происходит. Векторы на основе бактериофага λ используют для клонирования фрагментов ДНК эукариот (то есть более крупных генов) размером до 23 тысяч пар нуклеотидов (т. п. н.). Причём, фаги без вставок - менее 38 т. п. н. или, напротив, со слишком большими вставками - более 52 т. п. н. не развиваются и не поражают бактерии. Поскольку размножение бактериофага возможно только в живых клетках, бактериофаги могут быть использованы для определения жизнеспособности бактерий. Данное направление имеет большие перспективы, поскольку, одним из основных вопросов при разных биотехнологических процессах является определение жизнеспособности используемых культур. С помощью метода электрооптического анализа клеточных суспензий была показана возможность изучения этапов взаимодействия фаг-микробная клетка

А также в ветеринарии для: профилактики и лечения бактериальных заболеваний птиц и животных; лечения гнойно-воспалительных заболеваний слизистых глаз, полости рта; профилактики гнойно-воспалительных осложнений при ожогах, ранениях, операционных вмешательствах; в генной инженерии: для трансдукции - естественной передачи генов между бактериями; как векторы, переносящие участки ДНК; с помощью фагов можно конструировать направленные изменения в геноме хозяйской ДНК; в пищевой промышленности: в массовом порядке фагосодержащими средствами уже обрабатывают готовые к употреблению продукты из мяса и домашней птицы; бактериофаги применяют в производстве продуктов питания из мяса, мяса птицы, сыров, растительной продукции, и пр. ;

в сельском хозяйстве: распыление фагопрепаратов для защиты растений и урожая от гниения и бактериальных заболеваний; для защиты скота и птицы от инфекций и бактериальных заболеваний; для экологической безопасности: антибактериальная обработка семян и растений; очистка помещений пищеперерабатывающих предприятий; санитарная обработка рабочего пространства и оборудования; профилактика помещений больниц; проведение экологических мероприятий

Таким образом, на сегодняшний день бактериофаги пользуются большой популярностью в жизни человека и животных. На предприятиях намечен целый ряд приоритетных направлений разработки и производства лечебнопрофилактических бактериофагов, которые коррелируют с вновь зарождающимися общемировыми тенденциями. Создаются и внедряются новые препараты, для лечения многих заболеваний . Изучением и применением бактериофагов занимаются бактериологи, вирусологи, биохимики, генетики, биофизики, молекулярные биологи, экспериментальные онкологи, специалисты по генной инженерии и биотехнологии

Препараты фагов применяют для лечения и профилактики инфекционных болезней, а также в диагностике - для определения фагочувствительности и фаготипироваиия при идентификации микроорганизмов. Действие фагов основано на их строгой специфичности. Лечебно-профилактическое действие фагов обусловливается литической активностью самого фага, а также иммунизирующим свойством находящихся в фаголизатах компонентов (антигенов) разрушенных микробных клеток, особенно в случае неоднократного применения. При получении препаратов фагов используют проверенные производственные штаммы фагов и соответственно типичные культуры микроорганизмов. Бактериальную культуру в жидкой питательной среде, находящуюся в логарифмической фазе размножения, заражают маточной взвесью фага.

Лизированную фагом культуру (обычно на следующий день) фильтруют через бактериальные фильтры и к фильтрату, содержащему фаг, в качестве консерванта добавляют раствор хинозола.
Готовый препарат фага представляет собой прозрачную жидкость желтоватого цвета. Для более длительного хранения некоторые фаги выпускаются в сухом виде (в таблетках). При лечении и профилактике кишечных инфекций фаги применяют одновременно с раствором гидрокарбоната натрия, так как кислое содержимое желудка разрушает фаг. Сохраняется фаг в организме недолго (5-7 дней), поэтому рекомендуется применять повторно.

В Советском Союзе выпускались следующие препараты, используемые для лечения и профилактики заболеваний: брюшнотифозный, сальмопеллезный, дизентерийиныи, колифаг, стафилококковый фаг и стрептококковый. В настоящее время фаги применяют для лечения и профилактики в сочетании с антибиотиками. Такое применение оказывает более эффективное действие на антибиотикоустойчивые формы бактерий.

Диагностические бактериофаги широко применяются для идентификации бактерий, выделенных от больного или из инфицированных объектов внешней среды. С помощью бактериофагов вследствие их высокой специфичности можно определить виды бактерий и с большей точностью отдельные типы выделенных бактерий. В настоящее время разработаны фагодиагностика и фаготипирование бактерий рода Salmonella, Vibrio и стафилококков. Фаготипирование помогает устанавливать источник инфекции, изучать эпидемиологические связи, отличать спорадические случаи заболеваний от эпидемических.
В основе фагодиагностики и фаготипирования лежит принцип совместного культивирования выделенного микроорганизма с соответствующими видовыми или типовыми фагами. Положительным результатом считается наличие хорошо выраженного лизиса исследуемой культуры с видовым, а затем с одним из типовых фагов.

Впервые, предположение, что бактериофаги являются вирусами сделал. Д.Эррель. В дальнейшем открыты вирусы грибков и тд, называть стали фаги.

Морфология фага.

Размеры - 20 - 200нм. Большинство фагов имеют форму головастиков. Наиболее сложно устроенные фаги состоят из многогранной головки, в которой располагается нуклеиновая кислота, шейка и отростки. На конце отростка располагается базальная пластинка, с отходящими от нее нитями и зубцами. Эти нити и зубцы служат для прикрепления фага к оболочке бактерии. У наиболее сложноорганизованных фагов в дистальной части отростка, содержится фермент - лизоцим . Этот фермент способствует растворению оболочки бактерий при проникновении фаговой НК в цитоплазму. У многих фагов отросток окружен чехлом, который у некоторых фагов может сокращаться.

Различают 5 морфологических групп

1. Бактериофаги с длинным отростком и сокращающимся чехлом
2. Фаги с длинным отростком, но не сокращающимся чехлом
3. Фаги с коротким отростком
4. Фаги с аналогом отростка
5. Нитевидные фаги

Химический состав.

Фаги состоят из нуклеиновой кислоты и белков. Большинство из них содержит 2хнитевую ДНК, замкнутую в кольцо. Некоторые фаги содержат одну нить ДНК или РНК.

Оболочка фагов - капсид , состоит из упорядоченных белковых субъединиц - капсомеров.

У наиболее сложноорганизованных фагов в дистальной части отростка, содержится фермент - лизоцим . Этот фермент способствует растворению оболочки бактерий при проникновении фаговой НК в цитоплазму.

Фаги хорошо переносят замораживание, нагревание до 70, высушивание. Чувствительны к кислотам, УФ и кипячению. Фаги инфицируют строго определенные бактерии, взаимодействую со специфическими рецепторами клеток.

По специфичности взаимодействия -

Полифаги - взаимодействующие с несколькими родственными видами бактерий

Монофаги - видовые фаги - взаимодействуют с одним видом бактерий

Типовые фаги - взаимодействуют с отдельными вариантами бактерий внутри вида.

По действию типовых фагов вид можно разделить на фаговый ряд . Взаимодействие фагов с бактериями может протекать по продуктивному, апродуктивному и интегративному типу.

Продуктивный тип - образуется фаговое потомство, а клетка лизируется

При апродуктивном - клетка продолжает существовать, процесс взаимодействия обрывается на начальной стадии

Интегративный тип - геном фага интегрирует в хромосому бактерий и сосуществует с ним.

В зависимости от типов взаимодействия различают вирулентные и умеренные фаги.

Вирулентные взаимодействуют с бактериями по продуктивному типу. В начале происходит абсорбция фага на оболочке бактерий, за счет взаимодействия специфических рецепторов. Имеет место проникновение или пенетрация вирусной нуклеиновой кислоты в цитоплазму бактерий. Под действием Лизоцима в оболочке бактерии образуется небольшое отверстие, чехол у фага сокращается и НК впрыскивается. Оболочка фага за пределами бактерии. Далее осуществляется синтез ранних белков. Они обеспечивают синтез фаговых структурных белков, репликацию фаговой нуклеиновой кислоты и репрессию деятельности бактериальной хромосом.

После этого происходит синтез структурных компонентов фагов и репликация нуклеиновой кислоты. Из этих элементов происходит сборка нового поколения фаговых частиц. Сборка носит название морфогенез, новых частиц, которых в одной бактерии может образовываться 10-100. Далее лизис бактерии и выход нового поколения фагов во внешнюю среду.

Умеренные бактериофаги взаимодействуют либо по продуктивному, либо по интегративному типу. Продуктивный цикл идет аналогично. При интегративном взаимодействии - ДНК умеренного фага после попадания в цитоплазму встраивается в хромосому в определенном участке, причем при делении клетки реплицируется синхронно с бактериальной ДНК и вот эти структуры передаются дочерним клеткам. Такая встроенная ДНК фага - профаг , а бактерия, содержащая профаг, называется лизогенной, а явление - лизогения.

Спонтанно, или под влиянием ряда внешних факторов профаг может вырезаться из хромосомы, т.е. переходить в свободное состояние, проявлять свойства вирулентного фага, что будет приводить к образованию нового поколения бактериальных тел - индукция профага .

Лизогенезация бактерий лежит в основе фаговой(лизогенной) конверсии. Под этим понимают изменение признаков или свойств у лизогенных бактерий, по сравнению с нелизогенными того же вида. Изменяться могут разные свойства - морфологические, антигенные и тд.

Умеренные фаги могут быть дефектными - не способными образовывать фаговое потомство не в естественных условиях и в индукции.

Вирион - полноценная вирусная частица, состоящая из НК и белковой оболочки

Практическое применение фагов -

1. Применение в диагностике. В отношение ряда вида бактерий монофаги, используются в реакция фаголизабельности, как один из критериев идентификации культуры бактерии, типовые фаги применяют для фаготипирования, для внутривидовой дифференциации бактерий. Проводятся с эпидимиологоическими целями, для установления источника инфекции и путей устранения
2. Для лечения и профилактики ряда бактериальных инфекций - брюшной тип, стафилококковы и стрептококковые инфекции(таблетки с кислотоустойчивым покрытием)
3. Умеренные бактериофаги применяют в генной инженерии в качестве вектора, способных вносить генетический материал в живую клетку.

Генетика бактерий

Бактериальный геном состоит из генетических элементов, способных к самовоспроизведению - репликонов. Репликонами является бактериальные хромосомы и плазмиды. Бактериальная хромосома формирует нуклеоид, замкнутым кольцом не связанным с белками и несет гаплоидный набор генов.

Плазмиды представляет собой также замкнутое кольцо молекулы ДНК, но гораздо меньших размеров чем хромосома. Наличии плазмид в цитоплазме бактерий не обязательно, но они придают преимущество в окружающей среде. Крупные плазмиды редуцируются с хромосомой и количество их в клетке небольшое. А число мелких плазмид может достигать нескольких десятков. Некоторые плазмиды способны обратимо встраиваться в бактериальную хромосому в определенном ее участке и функционировать в виде единого репликона. Такие плазмиды называются интегративными. Некоторые плазмиды способны передаваться от одной бактерии к другой при непосредственном контакте - коньюгативные плазмиды. Они содержат гены, ответственные за образование F-пилей, формирующих коньюгативный мостик, для передачи генетического материалы.

Основные типы плазмидов-

F - интегративная коньгативная плазмида. Половой фактор, определяет способность бактерий быть донорами при коньюгации

R - плазмиды. Резистентная. Содержит гены, детерминирующие синтез факторов, разрушающих антибактериальные препараты. Бактерии, обладающие такими плазмидами не чувствительны ко многим препаратам. Поэтому формируются устойчивые к препаратам фактор.

Токс плазмиды - детерминирующие факторы патогенности -

Ent - плазмиды - содержит ген за выработку энтеротоксинов.

Hly - разрушают эритроцит.

Подвижные генетические элементы. К ним относятся вставочные - инсерционные элементы . Общепринятое обозначение - Is. Это участки ДНК, способные перемещаться как внутри репликона, так и между ними. Они содержат только гены, необходимые для их собственного перемещения.

Транспозоны - более крупные структуры, обладающие темиже свойствами, что и Is, го помимо они содержат структурные гены, определяющие синтез биологических веществ, например токсинов. Подвижные генетические элементы могут вызывать инактивацию гена, повреждение генетического материала, слияние репликонов и распространение генов в популяции бактерий.

Изменчивость у бактерий.

Все виды изменчивости подразделяют на 2 группы - ненаследственная(фенотипическая, модификационная) и наследственная(генотипическая).

Модификации - фенотипчиеские не наследуемые изменения признаков или свойств. Модификации не затрагивают генотипа, а поэтому не передаются по наследству. Они являются адаптивными реакциями, на изменение каких то конкретных условий внешней среды. Как правило утрачиваются в первом поколении, после прекращения действия фактора.

Генотипическая изменчивость затрагивает генотип организма, а поэтому способна передаваться потомкам. Генотипическая изменчивость подразделяется на мутации и рекомбинации.

Мутации - стойкие, наследуемые изменения признаков или свойств организма. Основа мутаций - качественное или количественное изменение последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК. Мутации могут изменять практически любые свойства.

По происхождению мутации - спонтанные и индуцируемые.

Спонтанные мутации происходит в естественных условиях существования организма, а индцированные возникают в результате направленного действия мутагенного фактора. ПО характеру изменений в первичной структуре ДНК у бактерий различают генные или точковые мутации и хромосомные аберрации.

Генные мутации происходят внутри одного гена и минимально захватывают один нуклеотид. Этот тип мутаций может быть следствием замены одно нуклеотида на другой, выпадения нуклеотида или вставления лишнего.

Хромосомные - могут затрагивать несколько хромосом.

Может быть делеция - потеря участка хромосомы, дупликация - удвоения участка хромосомы. Поворот участка хромосомы на 180 градусов - инверсия.

Любая мутация возникает под действием определенного мутагенного фактора. По своей природе мутагены - физические, химические и биологические. Ионизирующая радиация, рентгеновские лучи, УФ лучи. К химическим мутагенам - аналоги азотистых оснований, саму азотистую кислоту, и даже некоторые лекарственные средства, цитостатики. К биологическим - некоторые вирусы и трансфазоны

Рекомбинация - обмен участками хромосом

Трансдукция - перенос генетического материала с помощью бактериофага

Репарация генетического материала - восстановление возникших в результате мутаций повреждений.

Существует несколько видов репарации

1. Фотореактивация - этот процесс обеспечивается специальным ферментом, который активируется в присутствии видимого света. Этот фермент перемещается по цепочке ДНК и восстанавливает повреждения. Объединяет тимеры, которые образуются при действии УФ. Более значимы результаты темновой репарации. Она не зависит от света и обеспечивается несколькими ферментами - вначале нуклеазы вырезают поврежденный участок цепи ДНК, затем ДНК полимераза, на матрице сохранившейся комплементарно цепи синтезирует заплату, а лигазы вшивают заплатку на поврежденное место.

Репарации подвергаются генные мутации, а хромосомные как правило нет

1. Генетические рекомбинации у бактерий. Характеризуются проникновением генетического материала от бактерии донора в бактерию реципиента с формированием дочернего генома, содержащим генов обеих исходных особей.

Включение фрагмента ДНК донора в рецепиента происходит кроссинговером

Три типа передачи -

1. Трансформация - процесс, при котором происходит передача фрагмента изолированной ДНК донора. Зависит от компетентности рецепиента и состояния донорской ДНК. Компетентность - способность поглощать ДНК. Она зависит от присутствия в клеточной мембране реципиента особых белков и формируется в определенные периоды роста бактерии. Донорская ДНК обязательно должна быть двухцепочечной и не очень большой по размеру. Донорская ДНК проникает через оболочку бактерий, причем одна из цепочек разрушается, другая встраивается в ДНК реципиента.
2. Трансдукция - осуществляется с помощью бактериофагов. Общая трансдукция и специфическая трансдукция.

Общая - происходит при участии вирулентных факторов. В процессе сборки фагов частиц в головку фага по ошибке может включаться не фаговая ДНК, а кусочек хромосомы бактерий. Такие фаги - дефектные фаги.

Специфическая - она осуществляется умеренными фагами. При вырезании, вырезание его строго осуществляется по границе.Встраиваются между определёнными генами и переносят их.

1. Коньюгация - передача генетического материала от бактерии донора рецепиенту, при их непосредственном контакте. Необходимым условием - наличие в клетке донора коньгативного плазмида. При коньюгации за счет пилей образуется коньюгационный мостик, по которому генетический материал передается от донора к пациенту.

Генодиагностика

Комплекс методов, позволяющих выявить геном микроорганизма или его фрагмента в исследуемом материале. Первым был предложен метод гибридизации НК. Основан на использовании принципа комплиментарности. Этот метод позволяет выявить в генетическом материале наличие маркерных фрагментов ДНК возбудителя с помощью молекулярных зондов. Молекулярные зонды представляют собой короткие цепочки ДНК, комплементарные маркерному участку. В состав зонда вводится метка - флюорозром, радиоактивный изотоп, фермент. Исследуемый материал подвергается специальнйо обработке, позволяющей разрушить микрооргнаизмы, высвободить ДНК и разделить ее на одноцепочечные фрагменты. После этого материал фиксируется. Затем выявляется активность метки. Этот метод не отличается высокой чувствительностью. Можно выявить возбудителя лишь при достаточно большом его количестве. 10 в 4 микроорганизмов. Он достаточно сложен технически и требует большого количества зондов. Широкого распространения в практике он не нашел. Был разработан новый метод - полимеразная цепная реакция - ПЦР.

Этот метод основан на способности ДНК и вирусных РНК к репликации, т.е. к саморепродукции. Суть у пациента - является многократное копирование - амплификация in vitro фрагмента ДНК, являющего маркерного для данного микроорганищма. Так как процесс проходит при достаточно высоких температурах 70-90, то метод стал возможен после выделения из термофильных бактерий термостабильной ДНК-полимеразы. Механизм амплификации таков, что копирование цепочек ДНК начинается не в любой точке, а только в определенных стартовых блоках для создания которых используют так называемые праймеры. Праймеры представляют собой полинуклеотидные последовательности, комплиментарные концевым последовательностям копируемого фрагмента искомой ДНК, причем праймеры не только инициируют амплификацию, но и ограничивают. Сейчас существует несколько вариантов ПЦР характерны 3 этапа -

1. Денатурация ДНК(разделение на 1 цепочечные фрагменты)
2. Присоединение праймера.
3. Комплиментарное достраивание цепей ДНК до 2хцепочечных

Этот цикл длится 1,5-2 минуты. В результате количество молекул ДНК удваивает 20-40 раз. В результате 10 в 8 степени копий. После амплификации производят электрофорез и выделяются в виде полосок. Она проводится в специальном приборе, который называется амплификатор.

Достоинства ПЦР

1. Дает прямые указания на присутствие возбудителя в исследуемом материале, без выделения чистой культуры.
2. Очень высокая чувствительность. Теоретически можно обнаружить 1го.
3. Материал для исследования может быть сразу дизенфицировать после забора.
4. 100% специфичность
5. Быстрота получения результатов. Полный анализ - 4-5 часов. Экспресс метод.

Достаточно широко используется для диагностики инфекционных заболеваний, возбудителями которых являются не культивируемые или трудно культивируемые организмы. Хламидии, микоплазмы, многие вирусы - гепатита, герпеса. Разработаны тест системы для определения сибирской язвы, туберкулеза.

Рестрикционный анализ - с помощью ферментов молекула ДНК разделяется по определенным последовательностям нуклеоидов и фрагменты анализируются поп составу. Таким образом можно найти уникальные участки.

Биотехнология и генная инженерия

Биотехнология это наука, которая на основе изучения процессов жизнедеятельности живых организмов использует эти биопроцессы, а также сами биологические объекты для промышленно производства продуктов необходимых для человека, для воспроизведения биоэффектов, не проявляющихся в неестественных условиях. В качестве биологических объектов чаще всего используются одноклеточные микроорганизмы, а также клетки, животных и растений. Клетки очень быстро воспроизводятся, что позволяет за короткое время нарастить биомассу продуцента. В настоящее время биосинтез сложных веществ, таких как белки, антибиотики, экономичнее и технологически доступнее чем другие виды сырья.

Биотехнология использует сами клетки как источник целевого продукта а также крупные молекулы, синтезируемые клеткой, ферменты токсины, антитела и первичные и вторичные метаболиты - аминокислоты, витамины,гормоны. Технология получения продуктов микробного и клеточного синтеза сводится к нескольким типовым стадиям - выбор или создание продуктивного штаба. Подбор оптимальной питательной среды, культивирование. Выделение целевого продукта, его очистка, стандартизация, придание лекарственной формы. Генетическая инженерия сводится к созданию необходимый для человека целевой продукции. Полученный целевой ген сшивают с вектором, а вектором может быть плазмиды и встраивают его в клетку реципиента. Реципиент - бактерия - кишечная палочка, дрожжи. Синтезируемые рекомбинантами целевые продукты, выделяют очищают и используют в практике.

Первыми, были созданы инсулин и человеческий интерферон. Эритропоэтин, гормон роста, монокланальные антитела. Вакцина против гепатита Б.