Mechanizm reakcji wytrącania różni się od reakcji. Reakcja wytrącania (metoda immunologiczna)
Polega na oddziaływaniu rozpuszczalnego antygenu z przeciwciałem, po czym następuje utworzenie drobnoziarnistego osadu (precypitatu).
Reakcja strącania umożliwia stwierdzenie obecności nieznanego antygenu w materiale testowym poprzez dodanie znanego przeciwciała lub wykorzystanie znanego antygenu do oznaczenia nieznanego przeciwciała. Opad atmosferyczny Pogarsza się w przypadku braku soli. Optymalne opady występują w zakresie pH=7,0-7,4.
Mechanizm wytrącania jest zbliżony do mechanizmu aglutynacji. Pod wpływem układu odpornościowego, który zareagował z antygenem, stopień jego rozproszenia maleje. Konieczne jest, aby surowica i antygen były całkowicie przezroczyste. Podczas wytrącania można dodawać różne rozcieńczenia antygenu do jednego rozcieńczenia surowicy lub odwrotnie.
Wytrącanie jest rejestrowane lepiej, jeśli antygen zostanie ułożony w probówce na wierzchu przeciwciała. W tym przypadku obserwuje się pojawienie się osadu w postaci pierścienia - wytrącanie pierścieniowe. Wytrącanie pierścieniowe odbywa się w specjalnych rurkach o średnicy 2,5-3,5 mm. Aby określić liczbę antygenów w materiale badanym lub różnych przeciwciał w surowicy, stosuje się reakcję strącania agaru: 1% klarowany agar wylewa się na lub na szkiełka szklane. Roztwory antygenu i przeciwciał wlewa się do różnych dołków wykonanych w agarze, które dyfundują ku sobie, tworząc linie strącania. Reakcja strącania jest szeroko stosowana w diagnostyce (patrz reakcja Ascoli).
Wytrącanie w agarze umożliwia określenie toksyczności kultur błonicy.
W badania kryminalistyczne wytrącanie służy do ustalenia gatunku krwi, narządów i tkanek przy użyciu specyficznych surowic wytrącających.
Wytrącanie jest reakcją wytrącania kompleksu antygenu (precypitynogenu) i przeciwciała (precypityny). Opady są jednym ze zjawisk immunologicznych, które umożliwiają oznaczenie zawartości przeciwciał (patrz) w surowicy krwi osób chorych lub zaszczepionych, a także we krwi uodpornionych zwierząt. W przypadku stosowania standardowych surowic reakcję strącania można zastosować do miareczkowania rozpuszczalnych antygenów różnego pochodzenia (patrz).
W najprostszej formie reakcji strącania surowicę testową dodaje się poprzez nakładanie warstw do szeregu probówek ze stałą ilością antygenu w serii wielokrotnych rozcieńczeń. Po 30-60 min. inkubacja w temperaturze pokojowej na styku dwóch cieczy tworzy się pierścień zmętnienia - wytrącanie pierścienia. Jako miano surowicy odpornościowej przyjmuje się minimalną ilość surowicy powodującą reakcję wytrącania. Przeprowadzając reakcję odwrotną ze standardową surowicą odpornościową, można oszacować względne stężenie antygenu w różnych płynach biologicznych.
Wyniki miareczkowania przeciwciał i antygenów w oparciu o powyższą metodę nie mają bezwzględnego wyrazu ilościowego. W celu ilościowego określenia zawartości przeciwciał Heidelberger, Kabat (M. Heidelberger, E. Kabat) i inni opracowali Metoda ilościowa reakcja wytrącania, która opiera się na detekcji tzw. strefy równoważności. Podczas mieszania specyficznych dla wieku ilości antygenu ze stałą objętością surowicy odpornościowej, ilość utworzonego osadu początkowo wzrasta, a następnie ponownie maleje ze względu na zwiększoną rozpuszczalność kompleksu antygen-przeciwciało w nadmiarze antygenu. Jeśli we wszystkich probówkach oznaczymy zawartość przeciwciał w supernatancie, okaże się, że w środkowych probówkach rzędu lub nawet w jedynej probówce w supernatancie nie ma przeciwciał; jednocześnie tworzy się tutaj największy osad. Ponieważ w strefie równoważności w osadzie bierze udział także cały antygen wprowadzony do mieszaniny reagujących substancji, po odjęciu białka antygenu od ilości białka osadu otrzymuje się dokładną wartość zawartości przeciwciał w danej objętości surowicy testowej . Zawartość białka w osadzie po dokładnym przemyciu schłodzonym roztworem soli oznacza się azotem lub metodą kolorymetryczną.
Oceniając wartość reakcji strącania jako metoda diagnostyczna należy wziąć pod uwagę, że surowice odpornościowe mogą zawierać przeciwciała, które nie mają właściwości precypityn i dlatego nie tworzą osadu podczas interakcji z antygenem. Należą do nich przede wszystkim przeciwciała niekompletne, a także niektóre inne przeciwciała należące do grupy gamma A-globulin.
Zdolność surowicy odpornościowej do wytrącania antygenu można osłabić przez ogrzewanie do 65-70°, działanie rozpuszczalnikami organicznymi, redukcję w kwaśnym środowisku [Izliker (N. Isliker), A.Ya. Kullberga]. Zjawisko wytrącania się antysurowicą, o której wiadomo, że zawiera precypityny, jest możliwe tylko w określonej temperaturze, stężeniu soli i jonów wodorowych. Reakcja wytrącania zachodzi najszybciej w temperaturze 25-37°. Niezbędnym warunkiem powstania osadu jest obecność chlorku sodu (0,85% roztwór NaCl) w stężeniach izotonicznych. Gdy stężenie NaCl wzrośnie do 15%, osady utworzone przez antygen polisacharydowy częściowo się rozpuszczą, co można wykorzystać do ekstrakcji czystych przeciwciał. Reakcja strącania z antygenami białkowymi zachodzi z tą samą szybkością i kompletnością zarówno w 0,85%, jak i 15% roztwory NaCl. Optymalne stężenie jonów wodorowych do utworzenia osadu odpowiada wartościom pH od 5,0 do 9,0.
W praktyce laboratoryjnej stosuje się różne modyfikacje reakcji strącania. W szczególności reakcję termoprecypitacji wykorzystuje się do wykrywania antygenów bakteryjnych wąglik, zatrucie jadem kiełbasianym itp., niepodlegające denaturacji termicznej (koktoantygeny). Reakcja ta różni się od reakcji wytrącania pierścienia jedynie tym, że jako antygen stosuje się przesącz gotowanego materiału testowego (patrz: Na czym polega reakcja).
Analizując złożoną mieszaninę antygenów za pomocą reakcji strącania, nie da się scharakteryzować właściwości poszczególnych składników mieszaniny. Aby rozwiązać ten problem, uciekają się do metod wytrącania w agarze i immunoelektroforezy. Metoda wytrącania agaru w najpowszechniejszej modyfikacji O. Ouchterlony polega na tym, że antygen i surowica odpornościowa, dyfundując ku sobie w cienkiej warstwie agaru, w momencie spotkania tworzą linie precypitacji. Po liczbie takich linii można ocenić liczbę składników zawartych w danej mieszaninie antygenów. Metoda Ouhgerlonu pozwala porównać różne mieszaniny antygenowe i określić stopień pokrewieństwa występujących w nich składników. Analizując złożoną mieszaninę antygenową zawierającą substancje o tych samych szybkościach dyfuzji w agarze, świetna pomoc może przynieść metodę immunoelektroforezy. Mieszaninę antygenów wstępnie rozdziela się w polu elektrycznym na płytce agarowej, po czym ją wywołuje Poszczególne komponenty surowica odpornościowa. Surowicę odpornościową dodaje się do rowka wykonanego w agarze, równoległego do linii, wzdłuż której przemieszczały się antygeny podczas elektroforezy. Każdy antygen wytwarza indywidualny łuk wytrącania z surowicą odpornościową. Do analizy szeroko stosuje się immunoelektroforezę patologiczne nieprawidłowości w białkach surowicy, a także w analizie immunologicznej antygenów tkankowych i bakteryjnych.
Opady kryminalistyczne. Opady atmosferyczne wykorzystuje się w medycynie sądowej do ustalania gatunku krwi, części narządów i tkanek. W wielu sprawach dochodzeniowych konieczne jest ustalenie rodzaju krwi znalezionej na narzędziach przestępstwa, na ubraniu przestępcy lub ofiary itp. Do reakcji wytrącania stosuje się surowice wytrącające się, uzyskane w wyniku immunizacji królików, koguty, kozy z białkami różnych zwierząt. Zazwyczaj przygotowuje się surowice, które wytrącają człowieka, konia, kota, kurczaka, świnię, psa, bydło. Muszą mieć miano co najmniej 1:10 000 i być dość specyficzne. Z badanej plamy lub skorupy krwi przygotowuje się ekstrakty. roztwór soli, które następnie bada się za pomocą wytrącającej się surowicy. Rodzaj białka uważa się za ustalony, jeśli jedna z wytrącających się surowic tworzy osad z ekstraktem z krwi testowej z odpowiednią reakcją kontrolną. Reakcja wytrącania może również determinować rodzaj białka w tkankach i narządach ludzkich lub zwierzęcych. Zazwyczaj reakcję wytrącania prowadzi się w probówkach ze stożkowym zakończeniem. W przypadku otrzymania mętnych ekstraktów reakcję strącania przeprowadza się na agarze Ouchterlohna.
Reakcja wytrącania (RP) to wytrącanie rozpuszczalnego antygenu pod działaniem przeciwciał w obecności elektrolitu. Widoczny efekt reakcji (zjawisko opadów) – zachmurzenie (tworzenie się mętnego pierścienia lub osadu - Osad).
RP służy do wykrywania nieznanego antygenu w wielu chorobach zakaźnych: na wąglika, tularemię, zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych, ospę. W medycynie sądowej służy do określenia gatunku krwi i nasienia; w badaniach sanitarno-higienicznych - w celu ustalenia fałszerstwa produkty żywieniowe. RP jest bardzo różne wysoka czułość i pozwala na wykrycie antygenu w rozcieńczeniach 1:1 000 000 i 1:10 000 000.
Składniki reakcji strącania.
1. Antygen (precypitynogen) - to jest antygen charakter molekularny, który jest w stanie drobno rozproszonym (rozpuszczalnym). Precypitinogeny to różne lizaty lub ekstrakty tkanek itp. Precypitinogen różni się od aglutynogenu wielkością cząstek antygenu. Aglutynogen To ma rozmiary komórek(nie są to niszczone całe komórki), ale wymiary strącający współmierne rozmiary molekularne(są to białka i ich kompleksy z węglowodanami lub lipidami). Roztwór strącający przezroczysty.
2. Przeciwciała (precypityny) można je znaleźć w ludzkiej surowicy krwi lub w surowicy precypitującej do diagnostyki immunologicznej, która zawiera znane przeciwciała.
3. Elektrolit– izotoniczny roztwór chlorku sodu.
Otrzymywanie strącania.
Otrzymywany przez zmielenie materiału i ekstrakcję z niego antygenów białkowych poprzez gotowanie lub innymi metodami.
Przykłady środków strącających: lizaty lub ekstrakty różne narządy i tkanek, obca surowica krwi (surowica jest rozwiązanie przede wszystkim różnorodne białka), filtraty bulionowych kultur drobnoustrojów, ekstrakty solne drobnoustrojów, autolizaty itp.
Przygotowanie surowic strącających.
Otrzymywany przez hiperimmunizację królików odpowiednimi czynnikami strącającymi. Takie surowice zawierają przeciwciała przeciwko czynnikom strącającym, którymi immunizowano króliki.
Przykłady wytrącających się surowic: wytrącanie się serum wąglika (zawiera przeciwciała przeciwko antygenom wąglika), wytrącającą się surowicę przeciwmeningokokową(zawiera przeciwciała przeciwko antygenom czynnika wywołującego zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych) itp.
Miano surowica wytrącająca - jest to najwyższe rozcieńczenie czynnika wytrącającego, przy którym surowica nadal daje reakcję wytrącania.
Metody konfigurowania RP.
1. Reakcja wytrącania pierścienia – przeprowadzane w specjalnych rurach opadów (średnica - 0,4-0,5 cm, wysokość - 7-8 cm). Do probówki dodaje się 0,2 - 0,3 ml surowicy wytrącającej i taką samą ilość czynnika wytrącającego ostrożnie rozprowadza się wzdłuż ścianek długą końcówką pipety Pasteura. Następnie ostrożnie umieść probówki pionowo z pozycji poziomej.
Uwzględnianie wyników reakcji przeprowadza się poprzez pojawienie się białego pierścienia na styku antygen-przeciwciało. Jeśli reakcja będzie pozytywna obserwuje się powstawanie takiego pierścienia. W tym przypadku antygen dopasowuje się do przeciwciała i one się wiążą.
Jeśli jako czynnik strącający stosuje się gotowane i filtrowane wodne ekstrakty narządów i tkanek, reakcję nazywa się reakcją opady termoringowe (na przykład podczas diagnozowania wąglika).
2. Reakcja wytrącania w żelu – przeprowadza się na szalkach Petriego lub na szkiełkach, na których umieszcza się warstwę żelu agarowego. Gdy żel twardnieje, wycina się dołki, w których umieszcza się antygeny lub przeciwciała, albo jedno i drugie. Wyróżnić 2 metody RP w żelu:
metoda prosta (promieniowa) immunodyfuzja: w dołku umieszcza się jeden ze składników reakcji immunologicznej (antygen lub przeciwciało), a drugi składnik miesza się z agarem; Na wynik pozytywny (antygen odpowiada przeciwciału) a pierścień osadowy ;
b) metoda podwójna immunodyfuzja: zarówno przeciwciało, jak i antygen umieszcza się w oddzielnych dołkach, dyfundują ku sobie w żelu agarowym; jeśli wynik będzie pozytywny gdzie powstają przeciwciała i antygeny linie opadów .
Przykład RP w żelu jest reakcją podwójnej immunodyfuzji Ouchterlony’ego przy diagnozowaniu błonicy
Immunoelektroforeza – Jest to metoda łącząca metodę elektroforezy i reakcję wytrącania. Mieszaninę antygenów (na przykład białek surowicy) rozdziela się w żelu za pomocą elektroforezy. Następnie, aby znaleźć i zidentyfikować interesujące białko (nieznany antygen), stosuje się diagnostyczną surowicę precypitującą zawierającą przeciwciała przeciwko temu białku (znane przeciwciało). W tym celu do rowka równolegle do białek wprowadza się surowicę diagnostyczną. Jeśli wśród białek znajdzie się takie, które odpowiada przeciwciału występującemu w surowicy, to linie opadów.
Reakcja wytrącania-RP (odłac. praecipito– osad) – jest to powstawanie i wytrącanie kompleksu rozpuszczalnego antygenu molekularnego z przeciwciałami w postaci zmętnienia, tzw. Osad. Powstaje przez zmieszanie antygenów i przeciwciał w równoważnych ilościach; nadmiar jednego z nich obniża poziom wykształcenia kompleks immunologiczny. W przeciwieństwie do reakcji aglutynacji, antygenem reakcji wytrącania są związki rozpuszczalne, których wielkość cząstek zbliża się do wielkości cząsteczek. Mogą to być białka, kompleksy białek z węglowodanami i lipidami, ekstrakty bakteryjne, różne disaty lub filtraty bulionowych kultur drobnoustrojów. Przeciwciała biorące udział w reakcji strącania nazywane są precypitynami. Powstały drobno zdyspergowany kompleks antygen-przeciwciało wykrywa się przy użyciu pewnych metod stopniowania reakcji wytrącania.
Reakcję wytrącania pierścienia po raz pierwszy zaproponował Ascoli. Stosowany jest w diagnostyce wąglika, dżumy, tularemii i zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych. Metoda jest prosta i dostępna.
Specyficzną surowicę immunoprecypitującą wlewa się do wąskich probówek do precypitacji i bardzo ostrożnie nakłada na nią antygen. Na przykład podczas diagnozowania wąglika kawałki skóry, wełna, skóra martwego zwierzęcia itp. Są brane pod uwagę jako antygen. Są gotowane, płyn jest filtrowany i stosowany jako antygen. Pojawienie się pierścienia – osadu – na granicy dwóch cieczy wskazuje na obecność odpowiedniego antygenu.
Reakcja wytrącania w żelu agarowym, czyli metoda wytrącania dyfuzyjnego, umożliwia szczegółowe badanie składu złożonych, rozpuszczalnych w wodzie mieszanin antygenowych. Aby rozpocząć reakcję, użyj żelu (półpłynnego lub gęstszego agaru). Każdy składnik tworzący antygen dyfunduje w kierunku odpowiedniego przeciwciała z różną szybkością. Dlatego w organizmie znajdują się kompleksy różnych antygenów i odpowiadających im przeciwciał różne obszaryżel, w którym tworzą się linie opadów. Każda linia odpowiada tylko jednemu kompleksowi antygen-przeciwciało. Reakcję strącania zwykle prowadzi się w temperaturze pokojowej.
Uzyskano metodę immunoelektroforezy szerokie zastosowanie V ostatnie lata podczas badania struktury antygenowej drobnoustrojów. Kompleks antygenu umieszcza się w studzience, która znajduje się w środku żelu agarowego wylanego na płytkę. Następnie przez żel agarowy przepuszcza się prąd elektryczny, powodując, że różne antygeny zawarte w kompleksie przemieszczają się w pole prąd elektryczny w zależności od ich ruchliwości elektroforetycznej. Po zakończeniu elektroforezy do rowka znajdującego się wzdłuż krawędzi płytki dodaje się swoistą surowicę odpornościową i umieszcza w wilgotnej komorze. W miejscach tworzenia kompleksu antygen-przeciwciało pojawiają się linie strącania.
Reakcje opadów umieścić w probówkach (reakcja wytrącania pierścienia), w żelach, pożywkach itp. Szerokie otrzymał dystrybucję rodzaje reakcji strącania w półpłynnym agarze lub żelu agarozowym: podwójną immunodyfuzję według Ouchterlony’ego. Immunodyfuzja promieniowa, immunoelektroforeza itd
Reakcja promienistej immunodyfuzji. Na szkło równomiernie wylewa się surowicę odpornościową z roztopionym żelem agarowym. Po zestaleniu w żelu wykonuje się dołki, w których umieszcza się antygen w różnych rozcieńczeniach. Antygen dyfundując do żelu tworzy pierścieniowe strefy strącania wokół dołków z przeciwciałami (ryc. 13.7). Średnica pierścienia strącającego jest proporcjonalna do stężenia antygenu. Reakcja służy do określenia zawartości immunoglobulin różnych klas, składników układu dopełniacza itp. we krwi.
Immunoelektroforeza- połączenie elektroforezy i immunoprecypitacji: do dołków żelu wprowadza się mieszaninę antygenów i rozdziela w żelu za pomocą elektroforezy. Następnie do rowka równolegle do stref elektroforezy wprowadza się surowicę odpornościową, której przeciwciała dyfundując do żelu tworzą linię precypitacji w miejscu kontaktu z antygenem.
Immunologiczna mikroskopia elektronowa- mikroskopia elektronowa drobnoustrojów, najczęściej wirusów, traktowanych odpowiednimi przeciwciałami. Wirusy poddane działaniu surowicy odpornościowej tworzą agregaty odpornościowe (mikroprecypitaty). Wokół wirionów tworzy się „korona” przeciwciał, kontrastująca z kwasem fosforowolframowym lub innymi preparatami gęstymi elektronowo-optycznie.
123. Reakcja wytrącania w żelu w celu określenia toksyczności mikroorganizmów, mechanizm, metody formułowania.
Reakcja wytrącania (RP)- jest to powstawanie i wytrącanie kompleksu rozpuszczalnego antygenu molekularnego z przeciwciałami w postaci zmętnienia, zwanego osadem. Powstaje przez zmieszanie antygenów i przeciwciał w równoważnych ilościach; nadmiar jednego z nich zmniejsza poziom tworzenia kompleksów immunologicznych.
W 1946 roku J. Oudin zaproponował prostą metodę dyfuzyjną, w której jeden ze składników reakcji wytrącania, zwykle surowica, znajduje się w żelu, a drugi – antygen – nakłada się na pierwszy w postaci roztworu .
Antygen dyfundując do żelu tworzy w nim białe linie precypitacyjne z przeciwciałami, wyraźnie widoczne w bocznym oświetleniu. W 1948 roku J. Ouchterlonyu opracował jeszcze prostszą i wygodniejszą metodę dwuwymiarowej kontrdyfuzji, umożliwiającą bezpośrednie porównanie różnych antygenów i surowic. Metoda ta jest również bardzo cenna w badaniu reakcji krzyżowych.
Do przygotowania reakcji Ouchterlona stosuje się 1% agar przygotowany w roztworze fizjologicznym, który wylewa się na płytki Petriego warstwą 0,5 cm. Po stwardnieniu w płytce agarowej wycina się otwory o średnicy 5-6 mm – jeden na środku naczynia, 4-5 - na obwodzie w odległości 1-2 cm od środkowej. Do dołka centralnego wlewa się diagnostyczną surowicę precypitującą, a do dołków peryferyjnych wlewa się roztwór homologicznych i porównywalnych antygenów. Wyniki rejestruje się po 24, 48 i 72 godzinach inkubacji w temperaturze pokojowej.
Przeciwciała i antygeny dyfundują ku sobie, a w obszarach, w których powstają ich równoważne stężenia, tworzą się łukowate pasma wytrącania. Jeśli pasma opadów pochodzące z dwóch sąsiednich dołków złączą się, oznacza to obecność kilku składników antygenowych w płynie testowym. Reakcję przeciwdyfuzji Ouchterlohna często stosuje się do określenia toksyczności bakterii, takich jak błonica.
Dalszym rozwinięciem metody wytrącania żelu jest immunoelektroforeza. Termin ten odnosi się do metody łączącej elektroforetyczny rozdział mieszaniny antygenów i przeciwdyfuzję Ouchterlona na tej samej płytce z żelem agarowym. Wytrącającą się surowicę wlewa się do rowka wyciętego w żelu równolegle do kierunku rozdziału elektroforetycznego.
Powstałe w wyniku reakcji linie strącania mają postać łuków wydłużonych w kierunku ruchu elektroforetycznego frakcji antygenu. Immunoelektroforeza umożliwia określenie składu złożonych mieszanin rozpuszczalnych antygenów zawierających do 30 składników, dlatego jest cenną metodą diagnostyczną.
Reakcja wytrącania(RP) nazywa się wytrącaniem z roztworu Ag (precypitynogenu) pod wpływem surowicy odpornościowej (precypityny) i elektrolitu.
Za pomocą RP można wykryć antygen w rozcieńczeniach 1:100 000, a nawet 1:1 000 000, czyli w tak małych ilościach, że nie są wykrywalne chemicznie.
Precypitynogeny to ultramikroskopijne cząstki o charakterze białkowo-PS: ekstrakty z mikroorganizmów, narządów i tkanek, materiał patologiczny; produkty rozpadu komórek bakteryjnych, ich lizaty, filtraty. Precypitogeny są żaroodporne, dlatego w celu ich uzyskania materiał gotuje się.
RP używa płynnego, przezroczystego Ag.
Surowice wytrącające się uzyskuje się zazwyczaj poprzez hiperimmunizację królików w cyklach kilkumiesięcznych, wstrzykując im zawiesiny bakteryjne, filtraty hodowli bulionowych, autolizaty, ekstrakty solne mikroorganizmów i białka serwatkowe.
Produkcja: RP Ascoli. W wąskiej probówce zawierającej niewielką ilość nierozcieńczonej surowicy wytrącającej, trzymając ją w pozycji pochylonej, za pomocą pipety powoli rozprowadza się tę samą objętość Ag wzdłuż ścianek.
Aby uniknąć zmieszania obu cieczy, probówkę ostrożnie ustawia się pionowo. Jeżeli reakcja w probówce jest pozytywna, po 5–10 minutach na granicy surowicy i badanego ekstraktu pojawia się szarobiały pierścień. Reakcji koniecznie towarzyszy kontrola surowicy i antygenu.
Reakcja Ascoli służy do wykrywania wąglika, tularemii i dżumy Ag.
Znalazła także zastosowanie w medycynie sądowej do oznaczania rodzaju białek, w szczególności plam krwi, w praktyce sanitarnej przy rozpoznawaniu zafałszowań mięsa, ryb, produkty mączne, zanieczyszczenia w mleku. Wadą tego RP jest niestabilność osadu (pierścienia), który znika nawet przy delikatnym wstrząsaniu. Co więcej, nie można na jego podstawie określić skład ilościowy Ags biorące udział w tworzeniu osadu.
Reakcja strącania Ouchterlony'ego. Reakcję przeprowadza się na szalkach Petriego w dołkach żelu agarowego.
Dobrze umyty przezroczysty agar stosuje się jako żel. Do żelu agarowego dodaje się Ag i surowicę, tak aby zawierające je studzienki znajdowały się w pewnej odległości. Dyfundując ku sobie i łącząc się ze sobą, przeciwciało i antygen tworzą po 24–48 godzinach kompleks immunologiczny w postaci białego paska.
W obecności złożonego czynnika strącającego pojawia się kilka pasm. W tym przypadku prążki antygenów pokrewnych serologicznie łączą się ze sobą, a prążki antygenów odmiennych przecinają się, co pozwala na określenie szczegółów struktury antygenowej badanych substancji.
Szeroko stosowany do diagnozowania chorób wywoływanych przez wirusy i bakterie wytwarzające egzotoksyny.
3.Pośrednia reakcja hemaglutynacji (IRHA). Służy do wykrywania polisacharydów, białek, ekstraktów bakterii, mykoplazm, riketsj i wirusów, których kompleksów immunologicznych z aglutyninami nie widać w konwencjonalnym klasycznym RZS, lub do wykrywania przeciwciał w surowicy pacjentów przeciwko tym silnie rozproszonym substancjom i drobnym mikroorganizmom.
RNGA do serodiagnostyki chorób zakaźnych. Wykorzystując RNGA do wykrywania przeciwciał w surowicy pacjentów, przygotowuje się DIAGNOSTYKĘ ANTYGENU ERTROCYTÓW.
Reakcja wytrącania.
W tym celu czerwone krwinki poddaje się przez 15 minut działaniu roztworu garbników w rozcieńczeniu 1:20 000–1:200 000, co zapewnia im stabilność i zwiększa zdolność adsorpcji. Następnie miesza się je ze znanym antygenem i inkubuje przez 2 godziny w temperaturze 37°C. Uwrażliwione na antygen krwinki czerwone przemywa się 2-3 razy izotonicznym roztworem chlorku sodu i dodaje do surowicy, rozcieńcza i wlewa do dołków. paneli.
Kontrolą jest zawiesina nienaruszonych i obciążonych antygenem erytrocytów, które dodaje się do surowic, które w sposób oczywisty dają reakcje dodatnie i ujemne.
Wyniki reakcji uwzględnia się po 2 godzinach od inkubacji w termostacie i ocenia z plusami: „++++” – czerwone krwinki pokrywają studzienkę w formie parasola z poszarpane krawędzie; „–” – nagromadzenie czerwonych krwinek w formie „przycisku”
Powiązana informacja:
Szukaj na stronie:
Reakcja wytrącania pierścienia
Reakcja sprzęgania pierścienia jest jedną z najprostszych metody serologiczne. Odbywa się to w wąskich rurach strącających. Najpierw do wszystkich probówek wlewa się po równo klarowny roztwór antygenu pobrany w kilku rozcieńczeniach (1:2; 1:4; 1:8; 1:16).
Połączenie antygenów i przeciwciał następuje na granicy kontaktu odczynników. W wyniku tej interakcji, w przypadkach dodatnich (gdy antygen pasuje do przeciwciała), po pewnym czasie tworzy się osad w postaci opalizującego pierścienia.
Znaleziono reakcję szerokie zastosowanie V praktyka lekarska do wykrywania antygenu wąglika w wełnie, skórach i mięsie zwierząt (reakcja Ascoli); do wykrywania innych patogenów chorób zakaźnych w materiale patologicznym uzyskanym od pacjentów lub w przedmiotach otoczenie zewnętrzne, a także w kryminalistyczne badanie lekarskie w celu określenia rodzaju białka, w szczególności białka krwi lub innych płynów biologicznych.
Immunodyfuzja Ouchterlony’ego
Reakcję strącania można przeprowadzić w żelu agarowym.
Metoda polega na tym, że cząstki antygenów i przeciwciał, ze względu na różną wielkość, dyfundują w żelu z różną prędkością i w efekcie przemieszczają się na różne odległości. Umożliwia to wyodrębnienie poszczególnych układów antygenowych w przypadkach, gdy występują one w mieszaninie, a co za tym idzie umożliwia badanie struktury antygenowej bakterii oraz złożonych substancji białkowych, surowic i tkanek zwierzęcych.
Wizualne i skuteczna metoda Ouchterlony zaproponował wytrącanie w żelu.
Na płytkach Petriego z agarem wykonuje się małe dziurki, pocięte w pewnej odległości od siebie. Do jednego z nich wlewa się antygen, do pozostałych surowicę. Składniki reakcji dyfundują w żelu ku sobie i tworzą widoczną linię precypitacji, w której antygeny spotykają się z optymalnymi stężeniami swoistych dla nich przeciwciał. Ponieważ odczynniki dyfundują koncentrycznie ze dołków, można przeprowadzić wiele testów poprzez umieszczenie wielu dołków zawierających różne antygeny (lub różne rozcieńczenia tego samego antygenu) wokół dołka przeciwciała.
Reakcja Ouchterlony'ego pozwala wyciągnąć wniosek o naturze antygenu ze znanej surowicy i odwrotnie, ze znanego antygenu określa się charakter przeciwciał.
Zaletą tej metody jest to, że pozwala na porównanie składników antygenowych złożonych mieszanin i ocenę ich podobieństw lub różnic. Aby porównać wspólność antygenów, przygotuj agar ze dołkami: do jednego wlewa się antysurowicę, a do drugiego porównywane antygeny. Jeżeli antygeny są różne, wówczas prążki precypitacyjne są umiejscowione inaczej.
Immunoelektroforeza
W ostatnich latach do delikatnych badań immunologicznych zaczęto stosować metodę immunoelektroforezy. Metodę tę po raz pierwszy opisał P.
Grabara i K. A. Williamsa w 1953 r. Jest to połączenie elektroforezy w żelu agarowym na płytkach szklanych z immunodyfuzją. Najpierw przeprowadza się elektroforetyczną separację antygenu, który często jest mieszaniną białka lub innych cząsteczek. W tym celu antygen wprowadza się do uprzednio pociętego w agarze dołka, a płytkę agarową umieszcza się na pewien czas w strefie stałego prądu elektrycznego.
Z powodu różne prędkości Ruch cząsteczek powoduje podział antygenu na części składowe. Następnie wytrącającą się surowicę odpornościową wprowadza się do rowka wyciętego w kierunku równoległym do przepływu prądu.
Antygen i surowica odpornościowa dyfundują ku sobie w żelu.
Opad atmosferyczny
Każdy antygen powoduje powstanie strefy wytrącania w kształcie łuku z odpowiadającymi mu przeciwciałami. Liczba, położenie i kształt tych linii dają wyobrażenie o składzie oryginalnej mieszaniny antygenów.
Reakcja flokulacji
Metodę zaproponował Ramon w 1924 r.
Polega na tym, że mieszanina toksyny z surowicą antytoksyczną w określonych warunkach powoduje zmętnienie i wytrącenie osadu. W tym przypadku reakcja zachodzi wcześniej w tych probówkach, w których ilość antytoksyny odpowiada dawce, która całkowicie neutralizuje tę ilość toksyny.
Zatem, jeśli znana jest siła toksyny, można określić ilość antytoksyny w nieznanej surowicy testowej. W tym celu należy przygotować kilka rozcieńczeń surowicy testowej, do każdego rozcieńczenia dodać równe ilości znanej toksyny, a następnie obserwować, w której z probówek nastąpi flokulacja (zmętnienie roztworu) jako pierwsza. Określa się początkową flokulację. Następnie dokonuje się obliczeń.
Konieczne jest np. oznaczenie stężenia przeciwciał przeciw błonicy w badanej surowicy. W reakcji wykorzystuje się toksynę błoniczą zawierającą 50 Lf w 1 ml (Lf to minimalna ilość toksyny, która jest neutralizowana przez 1 jednostkę antytoksyczną (AU) surowicy odpornościowej.
Załóżmy, że w probówce zawierającej 0,2 ml tej surowicy i 2 ml znanej toksyny o aktywności 100 Lf (50 Lf x 2) zaobserwowano początkową flokulację.
Oznacza to, że 0,2 ml surowicy zneutralizowało tę toksynę. Zatem 0,2 ml surowicy zawiera 100 AE, a w 1 ml tej surowicy stężenie przeciwciał odpowiada 500 AE (100 AE x 5).
Podobną metodą reakcję flokulacji można wykorzystać w odwrotnym celu - do określenia właściwości immunizujących toksoidów.
Wymaga to standardowej surowicy antytoksycznej.
Reakcja neutralizacji
Reakcję wykorzystuje się w diagnostyce bakteryjnych zatruć pokarmowych w celu określenia toksyn bakteryjnych w badanym materiale. Ponadto można go wykorzystać podczas badania niektórych obiektów środowiska zewnętrznego pod kątem konserwacji. bakterie chorobotwórcze wytwarzanie toksyn, na przykład podczas badania gleby na obecność patogenów tężca lub zgorzeli gazowej.
Wiadomo, że toksyna po zmieszaniu z homologiczną surowicą antytoksyczną nie wykazuje swoich właściwości efekt toksyczny, ponieważ toksyna jest zneutralizowana. Reakcja interakcji toksyny z antytoksyną jest z reguły ściśle specyficzna, dlatego w celu przeprowadzenia reakcji neutralizacji w celu określenia rodzaju toksyny konieczne jest posiadanie surowic diagnostycznych specyficznych dla każdego rodzaju i rodzaju toksyny. toksyna. Jeśli spodziewana jest obecność kilku toksyn w materiale testowym, można jednocześnie zastosować mieszaninę 2-3 surowic antytoksycznych lub więcej.
Reakcja neutralizacji pozwala określić rodzaj i rodzaj toksyny patogenu.
Badanym materiałem może być filtrat produktów spożywczych, które rzekomo spowodowały zatrucie, wymycia z naczyń, w których znajdowały się te produkty itp.
Podejrzana toksyna jest najpierw neutralizowana. W tym celu do probówki z materiałem testowym (probówka doświadczalna) (zawiera przeciwciała przeciwko pożądanej toksynie) dodaje się antytoksyczną surowicę diagnostyczną; Do drugiej probówki (kontrolnej) dodaje się taką samą objętość roztworu fizjologicznego.
Po krótkotrwałej inkubacji zawartość probówek podaje się dwóm grupom białych myszy (doświadczalnej i kontrolnej).
Wyniki reakcji neutralizacji uwzględnia się natychmiast po śmierci zwierząt kontrolnych. W tym przypadku fakt przeżycia zwierząt, które otrzymały serum antytoksyczne wraz z badanym materiałem wskazuje na obecność w nim toksyny odpowiadającej podanej surowicy.
Zaletą reakcji zobojętniania jest wysoka wiarygodność uzyskanych wyników.
Jednak pod względem czułości i szybkości uzyskania odpowiedzi ustępuje niektórym innym metodom badawczym.
Reakcje lizy
Reakcje lizy nazywane są zwykle rozpuszczaniem antygenów korpuskularnych pod wpływem przeciwciał swoistych dla danego antygenu w obecności dopełniacza.
Z reakcje immunologiczne, bazując na zjawisku lizy bakterii i innych antygenów korpuskularnych, wykorzystuje się głównie reakcje bakteriolizy i hemolizy.
Reakcja bakteriolizy
Reakcja zachodzi zarówno in vitro, jak i in vivo. Ta ostatnia jest znana jako reakcja V.I. Isajew-Pfeiffer.
Naukowcy ci wykazali, że jeśli świnki morskie wstępnie immunizować antygenami cholery, następnie wstrzyknięcie do jamy brzusznej wysoce zjadliwej kultury Vibrio cholerae nie powoduje zakażenia zwierząt, ponieważ Jama brzuszna Patogen ulega rozpuszczeniu pod wpływem specyficznych przeciwciał.
Następnie I.
I. Mechnikov udowodnił, że podobny rozkład Vibrio cholerae pod wpływem surowicy odpornościowej zachodzi w probówce, jeśli do głównych składników doda się świeżą surowicę, będącą źródłem dopełniacza. Rozpuszczenie bakterii pod wpływem specyficznych przeciwciał w obecności dopełniacza nazywa się reakcją bakteriolizy.
Przygotowując reakcję bakteriolizy, najpierw przygotowuje się serię 10-krotnych rozcieńczeń surowicy testowej. Następnie do każdej probówki dodaje się taką samą ilość (1-2 krople) zawiesiny drobnoustrojów. Do mieszaniny dodaje się uzupełnienie. Po inkubacji w temperaturze 37°C mieszaniną zaszczepia się z każdej probówki pożywkę w celu określenia obecności lub braku żywotnych bakterii.
Reakcję można wykorzystać do określenia przeciwciał przy użyciu znanego mikroorganizmu lub do określenia rodzaju drobnoustroju przy użyciu diagnostycznej surowicy odpornościowej.
W praktyczna praca Reakcja ta jest rzadko stosowana przez bakteriologów, głównie w celu odróżnienia cholery od wibracji choleropodobnych.
Reakcja hemolizy
Mechanizm hemolizy jest podobny do mechanizmu bakteriolizy.
Antygenem są czerwone krwinki użyte w reakcji. Źródłem przeciwciał jest surowica antyerytrocytowa (przykładowo, jeśli w reakcji wykorzystuje się erytrocyty owcze, wówczas niezbędną surowicę ze swoistymi przeciwciałami przeciw erytrocytom uzyskuje się od królików immunizowanych erytrocytami owczymi).
Surowica krwi świnki morskiej jest najczęściej stosowana jako uzupełnienie reakcji lizy, ponieważ zawiera znacznie więcej dopełniacza niż surowica innych zwierząt.
W przypadkach, gdy przeciwciała w obecności dopełniacza niszczą czerwone krwinki, wychodzi z nich hemoglobina, a reagująca mieszanina mętnej zawiesiny czerwonych krwinek zamienia się w przezroczystą czerwoną ciecz (lakierowaną krew).
Ta reakcja nazywa się hemolizą. W praktyce laboratoryjnej wykorzystuje się go jako wskaźnik adsorpcji dopełniacza w reakcji wiązania dopełniacza.
Powiązana informacja:
Szukaj na stronie:
Treść wykładu: Przedmiot i krótka historia rozwoju mikrobiologii. Ogólne właściwości mikroorganizmów i ich miejsce w przyrodzie. Reakcja wytrącania
Mikrobiologia weterynaryjna i jej zadania
mir.zavantag.com > Biologia > Wykład
1 … 7 8 9 10 11 12 13 14 15
| ^
RA został po raz pierwszy opracowany przez M. Grubera w 1896 roku. Istotą reakcji jest oddziaływanie przeciwciała z antygenem, w wyniku którego następuje sklejenie (aglutynacja) drobnoustrojów z utworzeniem płatków i grudek widocznych gołym okiem. RA jest szeroko stosowany diagnostyka serologiczna wiele infekcje bakteryjne(bruceloza, nosacizna, salmonelloza, kolibakterioza itp.) oraz do serologicznej identyfikacji gatunków i typów izolowanych mikroorganizmów. Istnieje kilka metod oceny stopnia zaawansowania RZS: probówka (objętość), kroplówka (płytka), kropla krwi, reakcja pierścieniowa z mlekiem, reakcja hemaglutynacji i jej warianty (RZGA, RNGA), test antyglobulinowy Coombsa itp. ^ – zamiast surowicy pobiera się krew. Przeprowadza się reakcję płytkową. Rozpoznaje się pullorozę kurcząt i indyków, mykoplazmozę kurcząt. Reakcja Coombsa�� pozwala na identyfikację niekompletnych przeciwciał. Te ostatnie są jednowartościowe i dlatego hamują tworzenie się aglutynatu. Metoda polega na wykorzystaniu surowicy antyglobulinowej, która pełni rolę pośrednika w łączeniu niekompletnych przeciwciał utrwalonych na antygenach korpuskularnych (erytrocyty, bakterie). ^ – nie dotyczy reakcji serologicznych i diagnostycznie dokładnych, ale pozwala na wykrycie antygenu – hemaglutyniny i ustalenie właściwości hemaglutynujących (zdolności do aglutynacji czerwonych krwinek) u niektórych bakterii i mykoplazm. RNGA– w ostatnich latach zajmuje jedno z czołowych miejsc w serodynamice. Jego istota polega na tym, że cząsteczki białka antygenu odpowiedniego patogenu lub przeciwciała są wstępnie adsorbowane na traktowanych garbnikami erytrocytach owcy lub innego zwierzęcia. Następnie przeprowadza się reakcję poprzez zmieszanie uczulonych erytrocytów z surowicą krwi chorych zwierząt lub w drugim przypadku z badanym antygenem. Jeśli w serum jest coś specjalnego. Przeciwciała przeciwko temu antygenowi (lub odwrotnie) powodują aglutynację czerwonych krwinek – reakcja pozytywna. Zaproponowany przez R. Krausa w 1897 r. Wytrącanie jest zjawiskiem obserwowanym podczas oddziaływania przeciwciał precypitynowych z antygenem precypitynogenu. Istotą reakcji jest zmiana dyspersji koloidów antygenowych i ich wytrącanie pod wpływem swoistych przeciwciał występujących w surowicy odpornościowej. RP można dostarczać w probówkach w środowisku płynnym (reakcja pierścieniowa) lub w żelu agarowym (płytka RP). Reakcję wytrącania pierścienia po raz pierwszy zaproponował Ascoli (1910). Jest ona najczęściej stosowana w diagnostyce wąglika. Podczas dyrygowania badanie weterynaryjne RP to metoda wykrywania fałszerstwa mięsa, mąki i innych produktów. Specjalne znaczenie Reakcja ta występuje w badaniu kryminalistycznym podczas określania rodzaju krwi. Zastosowanie reakcji strącania w ośrodku ciekłym nie pozwala jednak na scharakteryzowanie heterogeniczności antygenów, tj. ilość i stężenie antygenów w preparacie. Informacje te można uzyskać umieszczając RP w żelu (zwykle agarze). Ze względu na prędkość ruchu różne antygeny leku dyfundują nierównomiernie, tworząc osady o grubości przezroczystego żelu w miejscu spotkania z przeciwciałem homologicznym. Lokalizacja i stężenie linii precypitynowych będzie charakterystyczne dla każdego składnika preparatu antygenowego, co stanowi kryterium jego jakości. Rozcieńczając lek, można scharakteryzować względną zawartość antygenów w nim. Opracowano kilka metod klasyfikacji RDP: metodę bezpośredniej dyfuzji jednowymiarowej według Houdina (1946), metodę prostej promieniowej immunodyfuzji według Manciniego (1963), metodę podwójnej dyfuzji do żelu agarowego według Ouchterlony’ego (1963). 1948) itp. ^
(RN) na modelu toksyny tężca i antytoksyny. Istota RN polega na zdolności homologicznych przeciwciał surowicy odpornościowej do tłumienia (neutralizowania) właściwości zakaźnych patogenu lub jego produktów metabolicznych. Aby ustalić wynik reakcji, zwierzęta laboratoryjne, CC i EC zakaża się mieszaniną antygen-przeciwciało. Wskaźnikiem jest dodatnie PH – brak śmierci biologicznych systemów testowych. W praktyka bakteryjna RN stosuje się w diagnostyce enterotoksemii beztlenowej, zatrucia jadem kiełbasianym itp. RN przeprowadza się w celu wykrycia i oznaczenia toksyn, toksoidów lub antytoksyn. Służy do wykrywania przeciwciał w surowicy krwi oraz do wykrywania antygenu w materiale testowym (w przypadku brucelozy, nosacizny, riketsjozy, gruźlicy itp.). Reakcja ta jest pośrednią reakcją dwóch układów. Obejmuje 5 elementów:
Komponenty 3,4,5 tworzą system wskaźników. Jeśli antygen i przeciwciało w surowicy testowej odpowiadają sobie nawzajem przyjacielu, powstaje kompleks immunologiczny antygen-przeciwciało, który wiąże i ekstrahuje dopełniacz ze środowiska, w którym zachodzi reakcja. Jeżeli w surowicy testowej nie ma przeciwciał odpowiadających antygenowi, określony kompleks nie powstaje – dopełniacz pozostaje wolny. Ponieważ są to procesy niewidoczne, aby rozwiązać pytanie, co stało się z dopełniaczem, do probówki jako wskaźnik wprowadza się składniki układu hemolitycznego - surowicę hemolityczną + czerwone krwinki. Jeśli dopełniacz zostanie związany w układzie bakteriologicznym, nie nastąpi hemoliza krwinek czerwonych, wynik jest dodatni – surowica zawiera przeciwciała. Obecność hemolizy jest wskaźnikiem obecności wolnego dopełniacza w układzie bakteriologicznym, co jest możliwe tylko w przypadku braku przeciwciał w badanej surowicy – wynik jest ujemny. RSC występuje w trybie ścisłym relacje ilościowe składniki. Osiąga się to poprzez ich wstępne miareczkowanie (dopełniacz i surowicę hemolityczną miareczkuje się w dniu wystąpienia reakcji, antygen drobnoustrojowy – raz na 2-3 miesiące). Miareczkowanie polega na określeniu najmniejszej ilości danego składnika w reakcji, aby przeprowadzić reakcję w nadmiarze lub niedoborze, co powoduje zniekształcenie wyników; RDSC jest odmianą RSK, ale różni się tym, że pierwsza faza reakcji przebiega przez 16-18 godzin w chłodzie (40°C), co zwiększa czułość ze względu na dłuższą adsorpcję dopełniacza przez kompleks antygen-przeciwciało. |
7 8 9 10 11 12 13 14 15
Podobny:
| Definicja pojęcia „mikrobiologia ekologiczna” Mikrobiologia ogólna, zajmująca się badaniem związków mikroorganizmów między sobą, obiektami środowiska i makroorganizmami |
Najbardziej ogólne i podstawowe pojęcia odzwierciedlające zasadnicze... Filozofia jest nauką, która uczy najwięcej Postanowienia ogólne o człowieku, naturze i wiedzy |
||
| Plan Przedmiot i metoda dyscypliny „Międzynarodowe stosunki gospodarcze”... Przedmiot i metoda dyscypliny „Międzynarodowe stosunki gospodarcze” oraz historia rozwoju międzynarodowych stosunków gospodarczych |
Pytania do egzaminu z kursu „Psychologia prawna” Dla studentów… Pojęcie psychologii prawnej. Przedmiot, cele i historia rozwoju psychologii prawa |
||
| 1. Przedmiot i metoda historii doktryn politycznych i prawnych > Przedmiot… Wynika to z faktu, że w ramach tej dyscypliny prawnej badany i omawiany jest konkretny przedmiot – historia pochodzenia... |
1.
Historia filozofii jako nauki. Jej przedmiot i metoda |
||
| Ministerstwo Edukacji i Nauki Republiki Kazachstanu Stowarzyszenie Studentów... Niniejszy regulamin konkursu republikańskiego „Student Roku 2011” (zwanego dalej konkursem) określa jego cele i zadania, uczestników... |
Definicja terminów „mikrobiologia” i „mikroorganizm” … |
||
| Pytania przygotowujące do egzaminu z dyscypliny „konfliktologia” Konfliktologia jako nauka: przedmiot, cele, zadania, aktualne problemy, znaczenie w nowoczesna scena rozwój społeczeństwa |
O regionalnym konkursie wideoklipów „K-role-k!” Postanowienia ogólne Niniejszy Regulamin określa cele, zadania, zasady Konkursu, tryb jego organizacji i przebiegu, tryb uczestnictwa i rozstrzygania... |
Dodaj przycisk do swojej witryny:
Materiały szkolne
mir.zavantag.com
Reakcja wytrącania
Wytrącanie i aglutynacja to dość podobne reakcje, które różnią się głównie na podstawie właściwości fizyczne AG.
W pierwszym przypadku występuje w postaci rozpuszczalnej, w drugim – w postaci korpuskularnej. Podstawą RP jest tworzenie się osadu podczas reakcji AG-AT. RP jest wysoce swoiste i czułe.
Składniki reakcji:
1. rozpuszczalny AG lub hapten (precypitogen);
2. AT - precypityny (surowica immunoprecypitująca; otrzymywana w wyniku immunizacji królików odpowiednimi roztworami antygenów);
Reakcja wytrącania
izotoniczny roztwór chlorku sodu lub żel agarowy.
Metody ustawiania RP:
1) RP w rozwiązaniach – s. 25
wytrącanie pierścieniowe;
2) RP w żelu.
Reakcję wytrącania pierścieniowego przeprowadza się w wąskich rurkach wytrącających, do których wlewa się wytrącające surowice.
Następnie wlewa się roztwór środka strącającego. Jeśli reakcja jest dodatnia, na styku składników pojawia się mętny pierścień wytrącający. Przykładem tej metody klasyfikacji RP jest reakcja termoprecypitacji Ascoli, stosowana do wykrywania termostabilnego haptenu patogenu wąglika, ekstrahowanego z narządów zwierzęcych, skóry, skóry. i wełna poprzez ekstrakcję przez gotowanie. Jedna z odmian RP w żelu (reakcja Ouchterlony'ego) pozwala określić toksyczność Bacillus błonicy stosując serum antytoksyczne.
Na szalce Petriego z pożywka Umieść pasek bibuły filtracyjnej nasączonej antytoksyczną surowicą błoniczą i zaszczepij go kulturami testowymi w postaci pasków prostopadłych do paska bibuły. Inkubować przy 37 PS przez 24 godziny. W obecności kultury toksynotwórczej w miejscu oddziaływania toksyny z antytoksyną tworzą się linie strącania. Reakcja wytrącania w żelu nazywa się immunodyfuzją.
Często foreza w żelu - immunoelektroforeza. Zasada metody: badany antygen frakcjonuje się elektroforetycznie. powstałe frakcje analizuje się metodą podwójnej dyfuzji przy użyciu surowicy odpornościowej.
Test Ascoli wykonuje się w celu diagnostyki wąglika w celu wykrycia antygenu prątków wąglika. Do przeprowadzenia reakcji wytrącania niezbędne jest posiadanie: strącającego – haptenu B.
Antrachis (ekstrakt tkankowy), precypityna (wytrącająca surowica wąglika) i sól fizjologiczna.
Przygotowanie termoprecypitynogenu.
1. Kolbę o pojemności 8, zawierającą 1 g rozdrobnionej skóry lub 1 ml kultury B. antilgas, napełnić 10 ml roztworu fizjologicznego.
2. Umieścić kolbę we wrzącej łaźni na 30-45 minut.
3. Przefiltruj materiał azbestowy. Filtrat powinien być całkowicie przezroczysty. W przypadku reakcji strącania przesącz rozcieńcza się 100 razy lub więcej.
Ustawianie reakcji wytrącania pierścienia.
1) 0,3 ml wytrącającej się surowicy, całej lub rozcieńczonej w stosunku 1:5, 1:10, wlewa się do probówki do wytrącania.
2) Precypitynogen ostrożnie rozprowadza się wzdłuż ścianek probówki. Reakcję uznaje się za pozytywną, jeśli nie później niż po 5-15 minutach na granicy obu cieczy utworzy się mętny pierścień wytrącającego się białka.
Podczas ustawiania reakcji wytrącania stosuje się następujące elementy sterujące:
a) antygen i roztwór soli;
b) surowica swoista i fizyczna.
c) antygen i surowica nieswoista.
We wszystkich probówkach kontrolnych nie powinno być zmętnienia. Do reakcji wytrącania stosuje się specjalne rurki wytrącające o wysokości 40-60 mm i średnicy 4-5 mm. Opady w wąskich rurkach zachodzą znacznie szybciej i są wyraźniejsze niż w zwykłe tuby, są one dokładnie myte i suszone, dzięki czemu ich szkło jest całkowicie przezroczyste i suche.
W reakcji strącania wytrąca się specyficzny kompleks immunologiczny, składający się z rozpuszczalnego antygenu (lizat, ekstrakt, hapten) i swoistego przeciwciała w obecności elektrolitów.
Mętny pierścień lub osad powstały w wyniku tej reakcji nazywa się Osad. Reakcja ta różni się od reakcji aglutynacji głównie wielkością cząstek antygenu.
Reakcję strącania stosuje się zwykle do oznaczania antygenu w diagnostyce szeregu infekcji (wąglik, zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych itp.); w medycynie sądowej – w celu określenia gatunku krwi, nasienia itp.; w badaniach sanitarno-higienicznych – przy stwierdzeniu fałszerstwa produktów; za jego pomocą określa się pokrewieństwo filogenetyczne zwierząt i roślin. Do reakcji potrzebujesz:
1. Przeciwciała (precypityny) – surowica odpornościowa o wysokim mianie przeciwciał (nie niższym niż 1:100 000). Miano wytrącającej się surowicy określa się na podstawie największego rozcieńczenia antygenu, z którym reaguje. Surowicę zazwyczaj stosuje się w postaci nierozcieńczonej lub rozcieńczonej 1:5 -1:10.
2. Antygen - rozpuszczone substancje o charakterze polisacharydów białkowych lub lipidowych (pełne antygeny i hapteny).
3. Roztwór izotoniczny.
Głównymi metodami prowadzenia reakcji wytrącania są: reakcja wytrącania pierścieniowego i reakcja wytrącania na agarze (żelu).
Uwaga! Wszystkie składniki biorące udział w reakcji wytrącania muszą być całkowicie przezroczyste.
Reakcja wytrącania pierścienia. Za pomocą pipety Pasteura dodać 0,2 - 0,3 ml (5-6 kropli) surowicy do probówki do strącania (surowica nie powinna dostać się na ścianki probówki). Antygen w tej samej objętości ostrożnie nakłada się warstwami na surowicę, wylewając ją cienką pipetą Pasteura wzdłuż ścianki probówki. Probówkę trzyma się w pozycji pochylonej. Po prawidłowym nałożeniu warstw powinna istnieć wyraźna granica między surowicą a antygenem. Ostrożnie, aby nie wymieszać płynu, probówkę należy umieścić w stojaku. Jeżeli reakcja jest pozytywna, na styku antygenu i przeciwciała tworzy się mętny „pierścień” – osad.
Reakcja wytrącania na agarze(żel). Osobliwością tej reakcji jest to, że interakcja antygenu i przeciwciała zachodzi w gęstym środowisku, tj. żel. Powstały osad daje mętną smugę na grubości podłoża. Brak pasma wskazuje na rozbieżność pomiędzy składnikami reakcji. Reakcja ta jest szeroko stosowana w badaniach biomedycznych, w szczególności w badaniu powstawania toksyn w czynniku wywołującym błonicę.
Reakcja lizy (cytoliza immunologiczna)
Liza immunologiczna- jest to rozpuszczanie komórek pod wpływem przeciwciał z obowiązkowym udziałem dopełniacza. Do reakcji potrzebujesz:
1. Antygen- drobnoustroje, czerwone krwinki i inne komórki.
2. Przeciwciało(lizyna) - surowica immunologiczna, rzadziej surowica pacjenta. Surowica bakteriolityczna zawiera przeciwciała biorące udział w lizie bakterii; hemolityczny - hemolizyny, które promują lizę czerwonych krwinek; do lizy krętków potrzebne są spirochetolizyny, tolizyny komórkowe itp.
3. Komplement. Najwięcej dopełniacza zawiera surowica świnek morskich. To serum (mieszanka kilku zwierząt) jest zwykle stosowane jako uzupełnienie.
4. Roztwór izotoniczny.
Reakcja wytrącania.
| Nazwa parametru | Oznaczający |
| Temat artykułu: | Reakcja wytrącania. |
| Rubryka (kategoria tematyczna) | Edukacja |
Reakcja wytrącania (RP) - wytrącanie rozpuszczalnego antygenu pod działaniem przeciwciał w obecności elektrolitu. Widoczny efekt reakcji (zjawisko opadów) – zachmurzenie (tworzenie się mętnego pierścienia lub osadu - Osad).
W wielu przypadkach RP służy do wykrywania nieznanego antygenu choroba zakaźna: na wąglika, tularemię, zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych, ospę. W medycynie sądowej służy do określenia gatunku krwi i nasienia; w badaniach sanitarno-higienicznych – w celu stwierdzenia fałszerstwa produktów spożywczych. RP jest bardzo czuły i może wykryć antygen w rozcieńczeniach 1:1 000 000 i 1:10 000 000.
Składniki reakcji strącania.
1. Antygen (precypitynogen) - Jest to antygen o charakterze molekularnym, występujący w stanie drobno rozproszonym (rozpuszczalnym). Substancje strącające - różne lizaty lub ekstrakty tkankowe itp.
Opublikowano na ref.rf
Precypitinogen różni się od aglutynogenu wielkością cząstek antygenu. Aglutynogen To ma rozmiary komórek(nie są to niszczone całe komórki), ale wymiary strącający współmierne rozmiary molekularne(są to białka i ich kompleksy z węglowodanami lub lipidami). Roztwór strącający przezroczysty.
2. Przeciwciała (precypityny) można je znaleźć w ludzkiej surowicy krwi lub w surowicy precypitującej do diagnostyki immunologicznej, która zawiera znane przeciwciała.
3. Elektrolit– izotoniczny roztwór chlorku sodu.
Otrzymywanie strącania.
Otrzymywany przez zmielenie materiału i ekstrakcję z niego antygenów białkowych poprzez gotowanie lub innymi metodami.
Przykłady środków strącających: lizaty lub ekstrakty różnych narządów i tkanek, obca surowica krwi (surowica jest rozwiązanie przede wszystkim różnorodne białka), filtraty bulionowych kultur drobnoustrojów, ekstrakty solne drobnoustrojów, autolizaty itp.
Przygotowanie surowic strącających.
Otrzymywany przez hiperimmunizację królików odpowiednimi czynnikami strącającymi. Takie surowice zawierają przeciwciała przeciwko czynnikom strącającym, którymi immunizowano króliki.
Przykłady wytrącających się surowic: wytrącającą się surowicę wąglika(zawiera przeciwciała przeciwko antygenom wąglika), wytrącającą się surowicę przeciwmeningokokową(zawiera przeciwciała przeciwko antygenom czynnika wywołującego zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych) itp.
Miano surowica wytrącająca - najwyższe rozcieńczenie czynnika wytrącającego, przy którym surowica nadal daje reakcję wytrącania.
Metody konfigurowania RP.
1. Reakcja wytrącania pierścienia – przeprowadzane w specjalnych rurach opadów (średnica - 0,4-0,5 cm, wysokość - 7-8 cm). Do probówki dodaje się 0,2 - 0,3 ml surowicy wytrącającej i taką samą ilość czynnika wytrącającego ostrożnie rozprowadza się wzdłuż ścianek długą końcówką pipety Pasteura. Następnie ostrożnie od pozycja pozioma Probówki ustawia się pionowo.
Uwzględnianie wyników reakcji przeprowadza się poprzez pojawienie się białego pierścienia na styku antygen-przeciwciało. Jeśli reakcja będzie pozytywna obserwuje się powstawanie takiego pierścienia. W tym przypadku antygen dopasowuje się do przeciwciała i one się wiążą.
Jeśli gotowane i filtrowane ekstrakty wodne narządach i tkankach, wówczas reakcję nazywa się zwykle reakcją opady termoringowe (na przykład podczas diagnozowania wąglika).
2. Reakcja wytrącania żelu – przeprowadza się na szalkach Petriego lub na szkiełkach, na których umieszcza się warstwę żelu agarowego. Gdy żel twardnieje, wycina się dołki, w których umieszcza się antygeny lub przeciwciała, albo jedno i drugie. Wyróżnić 2 metody RP w żelu:
metoda prosta (promieniowa) immunodyfuzja: w dołku umieszcza się jeden ze składników reakcji immunologicznej (antygen lub przeciwciało), a drugi składnik miesza się z agarem; jeśli wynik będzie pozytywny (antygen odpowiada przeciwciału) a pierścień osadowy ;
b) metoda podwójna immunodyfuzja: zarówno przeciwciało, jak i antygen umieszcza się w oddzielnych dołkach, dyfundują ku sobie w żelu agarowym; jeśli wynik będzie pozytywny gdzie powstają przeciwciała i antygeny linie opadów.
Przykład RP w żelu jest reakcją podwójnej immunodyfuzji Ouchterlony’ego przy diagnozowaniu błonicy
Immunoelektroforeza – Jest to metoda łącząca metodę elektroforezy i reakcję wytrącania. Mieszaninę antygenów (na przykład białek surowicy) rozdziela się w żelu za pomocą elektroforezy. Następnie, aby znaleźć i zidentyfikować interesujące białko (nieznany antygen), stosuje się diagnostyczną surowicę precypitującą zawierającą przeciwciała przeciwko temu białku (znane przeciwciało). W tym celu do rowka równolegle do białek wprowadza się surowicę diagnostyczną. Jeśli wśród białek znajdzie się takie, które odpowiada przeciwciału występującemu w surowicy, to linie opadów.
Reakcja wytrącania. - koncepcja i rodzaje. Klasyfikacja i cechy kategorii „Reakcja opadów”. 2017, 2018.
