Анализ скл смешанная культура лимфоцитов. Смешанная культура лимфоцитов

Каждый веб-разработчик должен знать SQL, чтобы писать запросы к базам данных. И, хотя, phpMyAdmin никто не отменял, зачастую необходимо испачкать руки, чтобы написать низкоуровневый SQL.

Именно поэтому мы подготовили краткий экскурс по основам SQL. Начнем же!

1. Создание таблицы

Для создания таблиц предназначена инструкция CREATE TABLE . В качестве аргументов должно быть задано название столбцов, а также их типы данных.

Создадим простую таблицу по имени month . Она состоит из 3 колонок:

• id – Номер месяца в календарном году (целое число).
• name – Название месяца (строка, максимум 10 символов).
• days – Количество дней в этом месяце (целое число).

Вот как будет выглядеть соответствующий SQL запрос:

CREATE TABLE months (id int, name varchar(10), days int);

Также при создании таблиц целесообразно добавить первичный ключ для одной из колонок. Это позволит держать записи уникальными и ускорит запросы на выборку. Пусть в нашем случае уникальным будет название месяца (столбец name )

CREATE TABLE months (id int, name varchar(10), days int, PRIMARY KEY (name));

Дата и время

Тип данных	Описание
DATE	Значения даты
DATETIME	Значения даты и времени с точностью до минты
TIME	Значения времени

2. Вставка строк

Теперь давайте заполнять нашу таблицу months полезной информацией. Добавление записей в таблицу производится через инструкцию INSERT . Есть два способа записи этой инструкции.

Первый способ не указать имена столбцов, куда будут вставлены данные, а указать только значения.

Этот способ записи прост, но небезопасен, поскольку нет гарантии, что по мере расширения проекта и редактировании таблицы, столбцы будут располагаться в том же порядке, что и ранее. Безопасный (и в тоже время более громоздкий) способ записи инструкции INSERT требует указания как значений, так и порядка следования столбцов:

Здесь первое значение в списке VALUES соответствует первому указанному имени столбца и т.д.

3. Извлечение данных из таблиц

Инструкция SELECT - наш лучший друг, когда мы хотим получить данные из базы данных. Она используется очень часто, так что отнеситесь к этому разделу очень внимательно.

Самый простое использование инструкции SELECT - запрос, который возвращает все столбцы и строки из таблицы (например, таблицы по имени characters ):

SELECT * FROM "characters"

Символ звездочка (*) означает, что мы хотим получить данные из всех столбцов. Так базы данных SQL обычно состоят из более чем одной таблицы, то требуется обязательно указывать ключевое слово FROM , следом за которым через пробел должно следовать название таблицы.

Иногда мы не хотим получить данные не из всех столбцов в таблице. Для этого, вместо звездочки (*) мы должны через запятую записать имена желаемых столбцов.

SELECT id, name FROM month

Кроме того, во многих случаях мы хотим, чтобы полученные результаты были отсортированы в определенном порядке. В SQL мы делаем это с помощью ORDER BY . Он может принимать опциональный модификатор – ASC (по-умолчанию) сортирующий по возрастанию или DESC , сортирующий по убыванию:

SELECT id, name FROM month ORDER BY name DESC

При использовании ORDER BY убедитесь, что оно будет последним в инструкции SELECT . В противном случае будет выдано сообщение об ошибке.

4. Фильтрация данных

Вы узнали, как выбрать из базы данных с помощью SQL запроса строго определенные столбцы, но что если нам нужно получить еще и определенные строки? На помощь здесь приходит условие WHERE , позволяющее нам фильтровать данные в зависимости от условия.

В этом запросе мы выбираем только те месяцы из таблицы month , в которых больше 30 дней с помощью оператора больше (>).

SELECT id, name FROM month WHERE days > 30

5. Расширенная фильтрация данных. Операторы AND и OR

Ранее мы использовали фильтрацию данных с использованием одного критерия. Для более сложной фильтрации данных можно использовать операторы AND и OR и операторов сравнения (=,<,>,<=,>=,<>).

Здесь мы имеем таблицу, содержащую четыре самых продаваемых альбомов всех времен. Давайте выберем те из них, которые классифицируются как рок и у которых менее 50 миллионов проданных копий. Это можно легко сделать путем размещения оператора AND между этими двумя условиями.

SELECT * FROM albums WHERE genre = "рок" AND sales_in_millions <= 50 ORDER BY released

6. In/Between/Like

WHERE также поддерживает несколько специальных команд, позволяя быстро проверять наиболее часто используемые запросы. Вот они:

• IN – служит для указания диапазона условий, любое из которых может быть выполнено
• BETWEEN – проверяет, находится ли значение в указанном диапазоне
• LIKE – ищет по определенным паттернам

Например, если мы хотим выбрать альбомы с поп и соул музыкой, мы можем использовать IN("value1","value2") .

SELECT * FROM albums WHERE genre IN ("pop","soul");

Если мы хотим получить все альбомы, изданные между 1975 и 1985годами, мы должны записать:

SELECT * FROM albums WHERE released BETWEEN 1975 AND 1985;

7. Функции

SQL напичкан с функциями, которые делают разные полезные вещи. Вот некоторые из наиболее часто используемых:

• COUNT() – возвращает количество строк
• SUM() – возвращает общую сумму числового столбца
• AVG() – возвращает среднее значение из множества значений
• MIN() / MAX() – получает минимальное / максимальное значение из столбца

Чтобы получить самый последний год в нашей таблице мы должны записать такой SQL запрос:

SELECT MAX(released) FROM albums;

8. Подзапросы

В предыдущем пункте мы научились делать простые расчеты с данными. Если мы хотим использовать результат от этих расчетов, нам не обойтись без вложенных запросов. Допустим, мы хотим вывести artist , album и release year для старейшего альбома в таблице.

Мы знаем, как получить эти конкретные столбцы:

SELECT artist, album, released FROM albums;

Мы также знаем, как получить самый ранний год:

SELECT MIN(released) FROM album;

Все, что нужно сейчас, - это объединить два запроса с помощью WHERE:

SELECT artist,album,released FROM albums WHERE released = (SELECT MIN(released) FROM albums);

9. Объединение таблиц

В более сложных базах данных существует несколько таблиц, связанных друг с другом. Например, ниже представлены две таблицы о видеоиграх (video_games ) и разработчиков видеоигр (game_developers ).

В таблице video_games есть колонка разработчик (developer_id ), но в ней содержится целое число, а не имя разработчика. Это число представляет собой идентификатор (id ) соответствующего разработчика из таблицы разработчиков игр (game_developers ), связывая логически два списка, что позволяет нам использовать информацию, хранящуюся в них обоих одновременно.

Если мы хотим создать запрос, который возвращает все, что нужно знать об играх, мы можем использовать INNER JOIN для связи колонок из обеих таблиц.

SELECT video_games.name, video_games.genre, game_developers.name, game_developers.country FROM video_games INNER JOIN game_developers ON video_games.developer_id = game_developers.id;

Это самый простой и наиболее распространенный тип JOIN . Есть несколько других вариантов, но они применимы к менее частым случаям.

10. Алиасы

Если вы посмотрите на предыдущий пример, то вы заметите, что существуют две колонки называемые name . Это сбивает с толку, так что давайте установим псевдоним одного из повторяющихся столбцов, например, name из таблицы game_developers будет называться developer .

Мы также можем сократить запрос задав псевдонимы имен таблиц: video_games назовем games , game_developers - devs :

SELECT games.name, games.genre, devs.name AS developer, devs.country FROM video_games AS games INNER JOIN game_developers AS devs ON games.developer_id = devs.id;

11. Обновление данных

Часто мы должны изменить данные в некоторых строках. В SQL это делается с помощью инструкции UPDATE . Инструкция UPDATE состоит из:

• Таблицы, в которой находится значение для замены;
• Имен столбцов и их новых значений;
• Выбранные с помощью WHERE строки, которые мы хотим обновить. Если этого не сделать, то изменятся все строки в таблице.

Ниже приведена таблица tv_series с сериалами с их рейтингом. Однако, в таблицу закралась маленькая ошибка: хотя сериал Игра престолов и описывается как комедия, он на самом деле ей не является. Давайте исправим это!

Данные таблицы tv_series UPDATE tv_series SET genre = "драма" WHERE id = 2;

12. Удаление данных

Удаление строки таблицы с помощью SQL - это очень простой процесс. Все, что вам нужно, - это выбрать таблицу и строку, которую нужно удалить. Давайте удалим из предыдущего примера последнюю строку в таблице tv_series . Делается это с помощью инструкции >DELETE

DELETE FROM tv_series WHERE id = 4

Будьте осторожными при написании инструкции DELETE и убедитесь, что условие WHERE присутствует, иначе все строки таблицы будут удалены!

13. Удаление таблицы

Если мы хотим, чтобы удалить все строки, но оставить саму таблицу, то воспользуйтесь командой TRUNCATE:

TRUNCATE TABLE table_name;

В случае, когда мы на самом деле хотим, чтобы удалить и данные, и саму таблицу, то нам пригодится команда DROP:

DROP TABLE table_name;

Будьте очень осторожны с этими командами. Их нельзя отменить!/p>

На этом мы завершаем наш учебник по SQL! Мы многое о чем не рассказали, но то, что вы уже знаете, должно быть достаточно, чтобы дать вам несколько практических навыков в вашей веб-карьере.

Совместное культивирование лимфоцитов, имеющих молекулы МНС-II разного гаплотипа, вызывает их бласттрансформацию и пролиферацию. Реагирующие клетки относятся к Т-лимфоцитам и стимулируются чужеродными MHC-II детерминантами, расположенными на В-лимфоцитах, макрофагах. Сила реакции зависит от степени различия между антигенами гистосовместимости. Для оценки реактивности индивидуума в отношении аллельного варианта МНС готовят однонаправленную культуру лимфоцитов. Для этого клетки-стимуляторы предварительно обрабатывают митомицином или облучают, при этом стимулирующие клетки теряют способность к делению, но сохраняют жизнеспособность.

Реактивность в смешанной культуре лимфоцитов является од-ним из критериев в оценке клеточного иммунитета. СКЛ позволяет провести типирование HLA, подобрать пару донор-реципиент при трансплантациях тканей и органов, провести корреляцию между HLA-антигенами и определенными заболеваниями.

Для постановки реакции используют взвесь лимфоцитов, выделенных из крови пациентов (донора и реципиента). Отмытые отвечающие клетки суспендируют в небольшом количестве среды 199 (0,5 мл) и после подсчета количества клеток доводят до 0,6 * 10 6 клеток/мл. Суспензию стимулирующих клеток приготовят аналогично с добавлением раствор митомицина С (500 мкг митомицина С в 1 мл забуференного физраствора) из расчета 0,1 мл на 1 мл суспензии. Клеточную смесь инкубируют 40 минут при 37 °С на водяной бане, помешивая, затем к суспензии добавляют холодную среду 199 и трижды отмывают клетки при центрифунировании. Осадок суспендируют в питательной среде культивирования, доводя количество клеток до 0,6 * 10 6 клеток/мл.

В лунки стерильного круглодонного иммунологического планшета внесят по 0,1 мл клеточной суспензии в растворе Хенкса и добавляют 0,1 мл клеточной суспензии, несущей аллельные варианты МНС. В контроль добавляют такое же количество раствора Хенкса.

Учет результатов проводят после инкубировать клеток при 37 °С 3-5 суток в зависимости от постановки реакции с использованием морфологического или изотопного метода (см. РБТЛ).

При трансплантации костного мозга выбор гистосовместимого донора проводится по результатам HLA-типирования донора и реципиента, а также при определении совместимости отобранных HLA-идентичных пар донор-реципиент в СКЛ, которая является финальным этапом оценки совместимости. Для этого используется постановка двунаправленной реакции СКЛ с использованием культурального микрометода в 96-луночной планшете с оценкой величины пролиферации по включению радиоактивного Н 3 -тимидина в ДНК пролиферирующих лимфоцитов.

Большое внимание в настоящее время уделяется исследованию роли иммунных механизмов в репродуктивном процессе, поскольку их нарушение приводит к развитию бесплодия и раннему прерыванию беременности. Исследования иммунологических параметров и их взаимосвязи с репродуктивными процессами позволили сделать вывод о необходимости перестройки иммунной системы при подготовке организма матери к беременности, начиная с овуляторного периода, в момент имплантации эмбриона и в ранний период беременности.

Одной из наиболее сложных и трудно диагностируемых причин бесплодия и повторяющихся спонтанных выкидышей являются иммунные дисфункции.

С целью своевременного выявления иммунологическог о бесплодия в лаборатории иммунологии репродукции проводится обследование супружеских пар с использованием следующих методов диагностики:

• исследование уровня пролиферативного ответа лимфоцитов женщины на антигены партнера(в смешанной культуре лимфоцитов)
• определение активности блокирующих факторов в сыворотке крови женщины.
• оценка количественного содержания субпопуляций естественных цитотоксических клеток в периферической крови женщины.
• расширенная иммунограмма
• исследование содержания регуляторных клеток с супрессорной активностью в периферической крови.
• при выявлении клинических и лабораторных признаков иммунологическог о бесплодия пациентам рекомендовано проведение лечебной процедуры – аллоиммунизации лимфоцитами мужа, которая проводится в соответствии с индивидуальным графиком.

Консультация необходима:

• если при отсутствии гинекологических и эндокринных заболеваний при регулярной половой жизни в течении года нет беременностей.
• в случае повторяющихся(более 1раза) спонтанных прерываний беременности (выкидыше).
• при неудачных ЭКО в анамнезе.
• при угрозе прерывания настоящей беременности.

При выявлении нарушений с целью иммунокоррекции нарушений назначается процедура аллоиммунизации лимфоцитами партнера (АИЛ) . Данный метод лечения разрешен к применению Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения (лицензия ФС№2009/179 от 02.07.2009)

Процедура проводится только при наличии у партнера отрицательных результатов анализа на ВИЧ-инфекции, сифилис и вирусные гепатиты (В, С). Осложнения при АИЛ не выявлено. Метод АИЛ обладает выраженным иммунокорригирующим эффектом, повышает эффективность лечения бесплодия, как в естественном цикле, так и при экстракорпоральном оплодотворении (ЭКО). Также назначается при неудачных попытках экстракорпорального оплодотворения.

АИЛ проводится 1 раз в 28-30 дней (в соответствии с менструальным циклом женщины) в 1-ую фазу цикла. Первый курс включает 3 процедуры АИЛ. После 2-ой процедуры пара повторно сдает контрольный анализ. При наличии позитивной динамики третья процедура АИЛ является последней. При отсутствии динамики — доза клеток для иммунизации увеличивается и проводится 2-ой курс, включающий 2 процедуры. После контрольного анализа в некоторых случаях необходимо назначение 3 курса иммунизации с увеличением дозы клеток. После достижения нормативных значений позитивный эффект держится в пределах 6-8 месяцев.

За период с 2003 по 2013гг. в лаборатории клеточной иммунотерапии было проведено около 3000 процедур аллоиммунизации лимфоцитами партнеров. Для данной процедуры из крови партнера выделяются только лимфоциты, которые всегда присутствуют в спермальной жидкости. В других странах* на протяжении 20 лет также проводится процедура аллоиммунизации, которая помогает женщине выносить и родить здорового ребенка.

Вид услуги	Цена, руб.
Тест трансформации лимфоцита (Выявление сесибилизации на 1в-во)	1650
Тест трансформации лимфоцита (Выявление сесибилизации на 2в-ва)	2 900
Тест трансформации лимфоцита (Выявление сесибилизации на 3в-ва)	3 900
Тест трансформации лимфоцита (иммунологическое обследование при бесплодии)	3 200
Иммунограмма расширенная с активационными маркерами	4 625
Комплексное исследование иммунного статуса	4 125
Вакцинация (аллоиммунизация лимфоцитами партнера 1 доза)	1 900
Вакцинация (аллоиммунизация лимфоцитами партнера 2 доза)	2 750
Вакцинация (аллоиммунизация лимфоцитами партнера 3 доза)	3 400
ИсследованиеCD16+/CD56+ лимфоцитов(иммунологическое обследование при бесплодии только НК-клетки)	1 250
Исследование макрофагальной активности (кондиционные среды макрофагов)	9 400
Исследование макрофагальной активности (кондиционные среды)	1 500
Криоконсервирование мононуклеаров для аллоиммунизации	650

2.2. Методы клеточных взаимодействий

В основе почти всех методов клеточных взаимодействий, используемых клинической иммуногенетикой, лежит феномен бластооб- разования в смешанной культуре лимфоцитов, открытый канадской исследовательницей Барбарой Бейн . Реакция смешанной культуры лимфоцитов (mixed lymphocyte culture - MLC) позволила осуществить тонкое дифференцированное изучение комплекса HLA и, в частности, одной из его субъединиц - локуса HLA-D. Ряд других методов клеточных взаимодействий - клеточно-опосредованный лимфолизис (Cell-mediated Lympholysis - CML), тест примирования лимфоцитов (Primed Lymphocyte Typing) - основывается на методе MLC или содержит его как составную часть.

2.2.1. Смешанная культура лимфоцитов (MCL)

Принцип метода изображен на рис. 10, из которого видно, что две популяции различающихся генетически лимфоцитов взаимодействуют между собой в культуре in vitro. Одна из популяций обрабатывается митомицином С или облучается, в результате чего теряет способность к бластообразованию и включению тимидина (3 НТ), однако, не теряя антигенных свойств, сохраняет способность к стимуляции (стимуляторы; S-популяция).

Клетки, отвечающие на стимуляцию (респондеры, R-популяция), через несколько дней трансформируются в бласты и включают тимидин, добавляемый в культуру. Интенсивность реакции измеряется с помощью радиационной метки по включению 3 Н-тимидина.

Известны несколько вариантов реакции смешанной культуры лимфоцитов, из которых здесь предлагаются два: традиционный и микровариант, реализуемый в планшетах Cook (рис. 11).

Рис. 11. Оборудование для микровариантов MLC и CML. 1 - планшет круглодонный е 96 лунками; 2-автоматическая пипетка ("Pipetman") с программой для разных объемов; 3 - автоматическая пипетка ("Sigma") для определенного объема; 4 - наконечник для пипетки одноразового использования; 5 - ламинарный бокс

Традиционный вариант MLC (модификация Ф. С. Барановой):

Лимфоциты выделяют на фиколл-урографиновом градиенте, как описано выше. Первую отмывку производят в PBS (NaCl - 8,0 г, Na 2 HP0 4 - 1,15 г, KH 2 PO 4 - 0,2 г, KC1 - 0,2 г на 1л H 2 O); две последующие производят в среде 199 с 5%-АВ-сыворотки (пул от 15 доноров);

Отвечающие клетки ресуспендируют в среде 199 с 10% сывороткой АВ и доводят концентрацию клеток до 0,6 x 10 6 в 1 мл;

Выделенные таким же образом стимулирующие клетки в концентрации 5 - 10 6 в 1 мл обрабатывают митомицином С (60 γ/мл) фирмы "Serva" и инкубируют 40 мин при 37°С в водяной бане. После инкубации клетки отмывают 3 раза средой 199 с 5% сывороткой АВ, ресуспендируют в среде 199 с 10% сывороткой АВ, доводя концентрацию до 0,6 x 10 6 в 1 мл;

0,5 мл отвечающих клеток и 0,5 мл стимулирующих клеток смешивают в центрифужной пробирке, прибавляют 0,04 мл 10 мл р-ра Hepes ("Serva") и инкубируют 144 ч; опыт ставят в трех параллелях (триплет);

За 24 ч до окончания инкубации в пробирки добавляют 3 Н-тимидин 1μCi (3,7x10 4 БК), на пробу удельной активности 5mСi/мМоль (18,5x10 7 БК/мМоль) и продолжают инкубацию;

По окончании инкубации клетки переносят на миллипоровые фильтры (0,6 - 0,9 микрон), промывают физиологическим раствором (37°С) и охлажденным 5% раствором трихлоруксусной кислоты (4°С). Фильтры сушат и помещают во флаконы с 5 мл сцинтилляционной жидкостью (5 г РРО и 0,5 г РОРОР - на 1 л толуола) * . Активность включения 3 Н-тимидина замеряют на β-счетчике; результат выражают в абсолютных включениях радиоактивной метки в 1 мин или в индексе стимуляции (ИС) по формуле:

* (РРО - 2,5-фенол-оксазол; РОРОР - (1,4-ди-2-15-фенолоксазолитбензол). )

Среднее значение СРМ в трех опытных образцах

ИС = Среднее значение СРМ в трех контрольных образцах/Контрольными образцами служат спонтанные культуры отвечающих клеток.

Микровариант MLC в планшетах Cook . На 8-м Уоркшопе выработаны требования, стандартизирующие микровариант MLC, в соответствии с которыми он излагается ниже :

Лимфоциты выделяют в градиенте изопак-фиколла и ресуспендируют в среде RPMJ-1640 * , доводя концентрацию до 5х10 5 в 1 мл;

* (Можно использовать среду 199, смешанную с человеческой сывороткой группы АВ (5% сыворотки, взятой от нескольких индивидов). )

Клетки-стимуляторы обрабатывают митомицином С или обучением;

5x10 4 репондеров и столько же стимуляторов помещают с помощью микропипетки типа Pipetman в каждую лунку круглодонного микропланшета Cook;

Планшеты инкубируют в термостате с автоматической подачей 5% CO 2 в течение 120 ч; затем в каждую лунку вносят lμmCi 3 Н-тимидина при специфической активности тимидина 6 Ci/мМоль; все манипуляции проводят пипеткой Pipetman;

Через 16 ч после внесения тимидина культуры из каждой лунки автоматической пипеткой переносят на миллипоровые фильтры и промывают физиологическим раствором, а затем 5% трихлоруксусной кислотой; удобно использовать специальные "харвестеры" для переноса культуры на миллипоровые фильтры;

Активность включения тимидина определяют, как описано выше.

2.2.2. Клеточно-опосредованный лимфолизис (CML)

CML используется в иммуногенетических исследованиях сравнительно недавно (с 1972 г.), однако в последнее время становится все более популярной техникой, позволяя детально изучить роль эфферентного звена трансплантационного иммунитета и завоевывая признание как информативный метод иммунологического мониторинга. Принцип метода изображен на рис. 12. В основе метода лежит техника, предложенная J. Lightbody (1971), которая вкратце сводится к следующему.

1. CML начинается с обычного HLC-теста, в котором происходит распознавание отвечающими клетками "стимуляторов", сенсибилизация отвечающих клеток и формирование сенсибилизированных киллеров.

2. Вторая фаза, в которой сенсибилизированные киллеры смешиваются с меченными 51 Сr клетками-мишенями, состоит в деструкции последних эффекторными клетками-киллерами; клетки- мишени могут иметь генотип такой же, как "стимуляторы" в первой фазе MLC, а могут быть клетками "третьего" партнера", наделенными общими со "стимуляторами" антигенными детерминантами или без них.

3. Количество радиоактивного хрома, высвобождающегося из разрушенных клеток-мишеней и выходящего в культуральную среду, служит мерой интенсивности киллер-эффекта.

Рис. 12. Принцип клеточно-опосредованного лимфолизиса (CML). I ряд - сенсибилизация отвечающих клеток, образование киллеров; II ряд - взаимодействие киллеров с мишенью; III ряд - разрушение клетки-мишени; выход 51 Cr культуральную среду

Здесь описано три варианта CML: традиционный вариант в модификации Л. П. Алексеева (1979), микровариант в планшетах Cook, прямая CML (Direct-CML -D-CML.

Традиционный вариант [Алексеев Л. П., 1979].

Метод разделен на несколько этапов.

Получение киллеров :

Периферические лимфоциты обеих популяций (R-клетки и S-клетки) выделяют обычным путем, в градиенте плотности отмывают трижды в среде 199 с 5% АВ-сывороткой (10 мин, 150 g);

1x10 6 R-клеток (0,8 мл) смешивают в центрифужных пробирках с 2x10 6 S-клеток (0,2 мл), обработанных митомицином С, и инкубируют 144 ч при 37°С;

Клетки центрифугируют при 150 g в течение 10 мин, а осадок ресуспендируют в среде 199 с добавлением 20% телячьей сыворотки (среда 199 + т. е.), доведя концентрацию до 1x10 6 в 1 мл;

Одну из проб оставляют для исследования уровня MLC, остальные используют как готовые киллеры.

Получение мишеней :

Выделенные обычным путем лимфоциты ресуспендируют в среде 199 с 20% АВ-сывороткой и инкубируют с фитогемагглютинином (0,003 мг/мл Wellcome) в течение 72 ч при 37°С; концентрация клеток 1x10 6 в 1 мл;

Клетки центрифугируют 10 мин при 150 g, осадок ресуспендируют в среде 199 с 5% АВ-сывороткой и доводят концентрацию клеток до 2x10 4 в 1 мл;

К взвеси добавляют 51 Cr 100 μCi/мл (3,7x10 6 БК/мл) и инкубируют 40 мин при 37°С;

Клетки трижды отмывают в среде 199 с добавкой 5% АВ-сыворотки (150 g, 10 мин) и осадок ресуспендируют в среде 199 с 5% АВ-сывороткой,. доведя концентрацию до 2x10 4 в 1 мл.

Постановка реакций :

5x10 5 киллеров (0,5 мл) смешивают с 1x10 4 мишеней (0,5 мл), инкубируют 4 ч (37°С) и центрифугируют при 150 g 10 мин;

Суспернатант отсасывают и на?-счетчике подсчитывают импульсацию, вызываемую 51 Cr; подсчет ведут в 0,5 мл супернатанта;

Уровень цитолиза подсчитывают по следующей формуле:

экепер. выход 51 Cr - спонтанный выход 51 Cr/максим, выход 51 Cr - спонтанный выход 41 Cr × 100.

Спонтанный выход хрома измеряется на мишенях, инкубированных 4 ч (37°С) без клеток-киллеров; максимальный выход хрома - на мишенях, полностью разрушенных замораживанием-оттаиванием; все пробы осуществляются в триплетах.

Микровариант CML в планшетах [по Mawas С., 1976]:

Фаза получения киллеров осуществляется как MLC в круглодонных планшетах, но смешивают в равных количествах R- и S-клетки по 2x10 5 па каждую лунку и инкубируют при 37°С;

Через 5 сут клетки собирают пастеровской пипеткой в пробирку, подсчитывают с трипаном голубым число живых и доводят концентрацию до 10x10 6 в 1 мл;

Клетки-мишени в течение 3 дней культивируют с ФГА;

В день постановки реакции клетки-мишени отмывают (300 g) и ресуспендируют в культуральной среде, распределяя по 1 мл в пробирки и доводя до 1x10 6 в 1 мл;

Добавляют в каждую пробирку с клетками-мишенями по 200 μCi 51 Cr(7,4x10 6 БК) и инкубируют 1 ч при 37°С; отмывают клетки 3 раза; осадок ресуспендируют и доводят до концентрации 1x10 в 1 мл (живых);

Тест реализуется в круглодонных микропланшетах; для этого распределяют в каждую лунку 0,7 - 1x10 6 клеток-киллеров (0,1 мл) и 1x10 4 клеток-мишеней (0,1 мл); общий объем суспензии в каждой лунке 0,2 мл, добавляют в каждую лунку по 0,05 мл среды и инкубируют (37°С) 4 ч;

Планшеты центрифугируют при 800 g на центрифуге Beckman в течение 10 мин; супернатант из каждой лунки переносят в пробирки и подсчитывают на γ-счетчике;

Фазу получения киллеров (MLC) проводят на среде RPMJ-1640 с добавлением 20% человеческой плазмы; для фазы киллинга употребляют среду MEM с добавлением 20% человеческой плазмы, предварительно прогретой.

Прямая CML (D-CML). Прямая CML является техникой, созданной специально для клинических целей, нашедшей использование при иммунологическом мониторинге. Схема этой реакции изображена на рис. 13.

Основное отличие от традиционной CML состоит в том, что стадия образования киллеров (фаза сенсибилизации) протекает не in vitro, a in vivo, т. е. в организме человека, сенсибилизированного пересадкой аллогенного органа или ткани. Вследствие воздействия аллогенной ткани лимфоциты реципиента сенсибилизированы к тканевым антигенам донора и не нуждаются в специальной обработке in vitro, продолжительность теста значительно сокращается во времени, так как предварительно следует подготовить только мишени.

В качестве мишеней используют лимфоциты, полученные из периферической крови или, чаще, из селезенки донора (см. 2.1.2) и замороженные любым из описанных выше способов (см. 2.1.3).

2.2.3. Антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (Antibody-dependent-cell mediated Cytotoxicity - ADCC)

Этот тип клеточных реакций сходен по механизмам действия с описанной выше CML. Принцип реакции изображен на рис. 14. Компонентами реакции являются клетки-мишени (донорские клетки или аллогенные лимфоциты), сыворотка (аллогенная или реципиента), предположительно содержащая антитела, направленные к детерминантам клеток-мишеней, и клетки-эффекторы (лимфоциты реципиента или аллогенные лимфоциты).

Клетками-эффекторами в данном типе взаимодействия служат так называемые К-клетки, находящиеся в периферической крови. В отличие от клеток-киллеров в CML они осуществляют цитотоксический эффект без предварительной сенсибилизации, однако проявление цитотоксического действия К-клеток возможно только через посредство антител, направленных к детерминантам клеток-мишеней . Специфический лизис измеряется по высвобождению 51 Cr, если исследуемая сыворотка содержит антитела к детерминантам мишеней.

Детерминантами-мишенями в ADCC могут быть практически специфичности всех HLA-локусов, включая HLA-D, HLA-DR, а также детерминанты, лежащие вне HLA-системы .

Наибольшее распространение эта сложная реакция получила в иммунологическом мониторинге для выявления В-клеточных антител. В связи с этим было предложено несколько модификаций, предусматривающих обогащение суспензии клеток-мишеней В-лимфоцитами, адсорбцию сывороток на тромбоцитах и т. д.

Помимо всего, учитывается ряд других особенностей реагирования в данной системе. Исследуемая сыворотка должна быть декомплементирована, так как в противном случае реакция может пойти по типу антитело-опосредованной комплементзависимой цитотоксичности. Предполагается также, что клетки-эффекторы могут вызвать определенную деструкцию мишеней по типу CML.

В конечном итоге весь набор проб в тесте антителозависимок клеточно-опосредованной лимфоцитотоксичности следующий:

Мишени + эффекторы + испытуемая сыворотка (опытная проба);

Мишени (контрольная проба, т. е. спонтанное высвобождение 51 Cr);

Мишени + эффекторы (контрольная проба на активность эффекторов);

Мишени + испытуемая сыворотка (сывороточный контроль).

Лимфоциты выделяют обычным образом и ресуспендируют в RPMI-1640 + 10% эмбриональной телячьей сыворотки; обрабатывают суспензию карбонильным железом для удаления моноцитов; добавляют аммония хлорид или H 2 O для лизиса оставшихся эритроцитов;

В суспензию клеток-мишеней добавляют 51 Cr в форме р-ра Na 2 CrO 4 100 - 200µCi мл (3,7x10 6 - 7,4x106 БК/мл) и инкубируют 40 - 60 мин;

Клетки трижды отмывают в RPMI +0,1% HSA, ресуспендируют в той же среде и доводят до 2x10 8 в 1 мл; 50 µl суспензии меченых клеток помещают в пробирку и в дальнейшем подсчитывают изотопную активность на γ-счетчике для выявления полного изотопного "усвоения"; остальное раскапывают в лунки планшета по 50 µl суспензии (1x10 5 клеток на лунку);

Суспензия клеток-эффекторов доводится до 2x10 7 кл в 1 мл и в. каждую лунку помещают 50 µl суспензии (или 100 µl), соотношение эффекторов и мишеней 10:1 (или 20:1);

Инкубация продолжается 4 ч во влажной атмосфере термостата с 5% CO 2 (длительность инкубации может быть продолжена до 8 ч);

Приготовляют в пробирках несколько разведений испытуемой сыворотки (1:25; 1:100) и добавляют в лунки до 50 µl каждого разведения: и неразведенную сыворотку; окончательная постановка теста выглядит, как показано в табл. 23.

Таблица 23

Постановка ADCC. Все варианты проб, µl

* (Вместо испытуемой сыворотки закапывают пул АВ-сывороток. )

** (Вместо испытуемой сыворотки закапывают моноспецифическую HLA-сыворотку, направленную против мишеней (не эффекторов). )

Инкубация панелей продолжается 4 ч во влажной атмосфере с 4% CO 2 ; длительность инкубации может быть продолжена до 8 ч;

После инкубации половину объема из каждой лунки (100 μl) осторожно отсасывают автоматической пипеткой и помещают в пробирки для подсчета импульсации 51 Cr; активность подсчитывают на γ-счетчике;

Вычисления следующие:

% высвобождения 51 Cr = 2 × А оп - фоновая активность/В - фоновая активность × 100;

% цитотоксичности = А оп - А сп /100 - А сп × 100, где А оп - % высвобождения 51 Cr в опытных пробах; А сп - % спонтанного высвобождения; В - полное усвоение изотопа.

Как положительный результат рассматривается 5% и выше цитотоксичность после 4 ч инкубации.