Viroloji - hangi enfeksiyonlar araştırılıyor. Virolojik araştırma yöntemleri
Virolojik araştırma yöntemleri- virüslerin biyolojisini ve bunların tanımlanmasını inceleme yöntemleri. Virolojide, viral partiküllerin moleküler yapısını, hücreye nüfuz etme yöntemlerini ve viral üreme özelliklerini, viral nükleik asitlerin ve proteinlerin birincil yapısını oluşturmanın mümkün olduğu moleküler biyoloji yöntemleri yaygın olarak kullanılmaktadır. Viral nükleik asitlerin ve protein amino asitlerinin kurucu elemanlarının dizisini belirlemek için yöntemler geliştirilmektedir. Nükleik asitlerin ve kodladıkları proteinlerin fonksiyonlarını nükleotid dizisine bağlamak ve viral enfeksiyonun patogenezinde önemli rol oynayan hücre içi süreçlerin nedenlerini belirlemek mümkün hale gelir.
Virolojik araştırma yöntemleri aynı zamanda immünolojik süreçlere (antijenin antikorlarla etkileşimi), virüsün biyolojik özelliklerine (hemaglutinasyon yeteneği, hemoliz, enzimatik aktivite), virüsün konakçı hücre ile etkileşiminin özelliklerine (sitopatik etkinin doğası) dayanmaktadır. , hücre içi kapanımların oluşumu, vb.) .
Viral enfeksiyonların tanısında, virüslerin yetiştirilmesinde, izolasyonunda ve tanımlanmasında, ayrıca aşı preparatlarının üretiminde doku ve hücre kültürü yöntemi yaygın olarak kullanılmaktadır. Birincil, ikincil, stabil sürekli ve diploid hücre kültürleri kullanılır. Birincil kültürler, dokuyu proteolitik enzimler (tripsin, kollajenaz) ile dağıtarak elde edilir. Hücrelerin kaynağı insan ve hayvan embriyolarının doku ve organları (genellikle böbrekler) olabilir. Besin ortamındaki hücrelerin bir süspansiyonu şiltelere, şişelere veya Petri kaplarına yerleştirilir; burada hücreler kabın yüzeyine bağlandıktan sonra çoğalmaya başlar. Virüs enfeksiyonu için genellikle bir hücre tek katmanı kullanılır. Besin sıvısı boşaltılır, belirli seyreltmelerde viral süspansiyon eklenir ve hücrelerle temas ettirildikten sonra genellikle serumsuz taze besin ortamı eklenir.
Birincil kültürlerin çoğunun hücreleri alt kültürlenebilir; böyle bir kültüre ikincil kültür denir. Hücrelerin daha fazla geçişiyle, hızlı çoğalma yeteneğine sahip, çoğu orijinal kromozom setini koruyan fibroblast benzeri hücre popülasyonu oluşur. Bunlar sözde diploid hücrelerdir. Hücrelerin seri olarak kültürlenmesiyle stabil sürekli hücre kültürleri elde edilir. Geçişler sırasında, heteroploid kromozom setine sahip, hızla bölünen homojen hücreler ortaya çıkar. Kararlı hücre çizgileri tek katmanlı veya süspansiyonlu olabilir. Tek katmanlı kültürler cam yüzey üzerinde sürekli bir katman şeklinde büyürken, süspansiyon kültürleri ise karıştırma cihazları kullanılarak çeşitli kaplarda süspansiyonlar şeklinde büyür. 40 farklı hayvan türünden (primatlar, kuşlar, sürüngenler, amfibiler, balıklar, böcekler dahil) ve insanlardan elde edilen 400'den fazla hücre dizisi vardır.
Bireysel organ ve doku parçaları (organ kültürleri) yapay besin ortamlarında kültürlenebilir. Bu tür kültürler, özellikle farklılaşmamış doku kültürlerinde çoğalmayan virüslerin (örneğin, koronavirüsler) izolasyonu ve geçişi için önemli olan doku yapısını korur.
Enfekte hücre kültürlerinde virüsler, hücre morfolojisindeki değişikliklerle, spesifik olabilen sitopatik etkilerle, inklüzyonların ortaya çıkmasıyla, hücrede ve kültür sıvısında viral antijenlerin belirlenmesiyle tespit edilebilir; kültür sıvısındaki viral nesillerin biyolojik özelliklerinin belirlenmesi ve doku kültüründe, tavuk embriyolarında veya hassas hayvanlarda virüslerin titre edilmesi; Hücrelerdeki bireysel viral nükleik asitlerin moleküler hibridizasyon yoluyla veya nükleik asit birikimlerinin floresan mikroskopi kullanılarak sitokimyasal yöntemle tanımlanması yoluyla.
Virüsleri izole etmek emek yoğun ve zaman alıcı bir süreçtir. Popülasyon arasında dolaşan virüsün tipini veya varyantını belirlemek için gerçekleştirilir (örneğin, grip virüsünün bir serovaryantını, çocuk felci virüsünün yabani veya aşı suşunu vb. tanımlamak için); acil epidemiyolojik önlemlerin alınmasının gerekli olduğu durumlarda; yeni virüs türleri veya çeşitleri ortaya çıktığında; gerekirse ön tanıyı onaylayın; çevresel nesnelerdeki virüslerin tespiti için. Virüsleri izole ederken, insan vücudunda kalma olasılıklarının yanı sıra iki veya daha fazla virüsün neden olduğu karışık bir enfeksiyonun meydana gelme olasılığı dikkate alınır. Bir viriondan elde edilen virüsün genetik olarak homojen popülasyonuna viral klon denir ve bunu elde etme sürecine klonlama denir.
Virüsleri izole etmek için duyarlı laboratuvar hayvanlarının enfeksiyonu ve tavuk embriyoları kullanılır, ancak çoğunlukla doku kültürü kullanılır. Bir virüsün varlığı genellikle spesifik hücre dejenerasyonu (sitopatik etki), semplast ve sinsit oluşumu, hücre içi kapanımların tespiti ve ayrıca immünofloresan, hemadsorpsiyon, hemaglutinasyon (hemaglutinasyon virüsleri için) vb. kullanılarak tespit edilen spesifik bir antijen ile belirlenir. . Bu belirtiler ancak virüsün 2-3 geçişinden sonra tespit edilebiliyor.
Tavuk embriyoları, grip virüsleri gibi bir dizi virüsü izole etmek için kullanılır ve yeni doğmuş fareler, bazı Coxsackie virüslerini ve bir dizi arbovirüsü izole etmek için kullanılır. İzole edilmiş virüslerin tanımlanması serolojik reaksiyonlar ve diğer yöntemler kullanılarak gerçekleştirilir.
Virüslerle çalışırken titreleri belirlenir. Virüslerin titrasyonu genellikle doku kültüründe gerçekleştirilir; doku dejenerasyonunun meydana geldiği virüs içeren sıvının en yüksek seyreltmesi belirlenir, kalıntılar ve virüse özgü antijenler oluşturulur. Plak yöntemi birçok virüsün titre edilmesinde kullanılabilir. Plaklar veya negatif virüs kolonileri, agar kaplaması altında tek katmanlı bir doku kültüründe virüs tarafından yok edilen hücrelerin odaklarıdır. Koloni sayımı, bir bulaşıcı virüs parçacığının bir plak oluşturması temelinde virüslerin bulaşıcı aktivitesinin niceliksel bir analizine olanak tanır. Plaklar, kültürün genellikle nötr kırmızı olan intravital boyalarla boyanmasıyla tespit edilir; plaklar boyayı adsorbe etmez ve bu nedenle lekeli canlı hücrelerin arka planında hafif noktalar olarak görülebilir. Virüs titresi, 1 beher başına plak oluşturan ünite sayısı olarak ifade edilir. ml.
Virüslerin saflaştırılması ve konsantrasyonu genellikle diferansiyel ultrasantrifüjleme ve ardından konsantrasyon veya yoğunluk gradyanlı santrifüjleme ile gerçekleştirilir. Virüsleri saflaştırmak için immünolojik yöntemler, iyon değişim kromatografisi, immünosorbentler vb. kullanılır.
Viral enfeksiyonların laboratuvar tanısı, klinik materyalde patojenin veya bileşenlerinin tespitini içerir; virüsün bu materyalden izole edilmesi; serolojik tanı. Her bir vakada laboratuvar teşhis yönteminin seçimi, hastalığın doğasına, hastalığın süresine ve laboratuvarın yeteneklerine bağlıdır. Viral enfeksiyonların modern teşhisi, hastalıktan sonraki erken aşamalarda klinik materyal alındıktan birkaç saat sonra cevap almayı mümkün kılan ekspres yöntemlere dayanmaktadır.Bunlar arasında elektron ve immün elektron mikroskobu ve ayrıca moleküler hibridizasyon yöntemi olan immünofloresan bulunur. , IgM sınıfının antikorlarının tespiti vb.
Negatif boyalı virüslerin elektron mikroskobu, virüsleri ayırt etmeyi ve konsantrasyonlarını belirlemeyi mümkün kılar. Viral enfeksiyonların tanısında elektron mikroskobunun kullanımı, klinik materyaldeki viral partikül konsantrasyonunun oldukça yüksek olduğu durumlarla sınırlıdır (10 5'te 1). ml Ve daha yüksek). Yöntemin dezavantajı aynı taksonomik gruba ait virüslerin ayırt edilememesidir. Bu eksiklik immün elektron mikroskobu kullanılarak giderilir. Yöntem, viral partiküllere spesifik serum eklenirken aynı anda viral partiküllerin yoğunlaştırılarak tanımlanmasına olanak tanıyarak bağışıklık komplekslerinin oluşturulmasına dayanıyor. Yöntem aynı zamanda antikorları tespit etmek için de kullanılır. Açık teşhis amacıyla, doku ekstraktlarının, dışkıların, keseciklerden gelen sıvının ve nazofarenks salgılarının elektron mikroskobik incelemesi gerçekleştirilir. Elektron mikroskobu, virüsün morfogenezini incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır; etiketli antikorların kullanımıyla yetenekleri genişletilmektedir.
Virüse özgü nükleik asitlerin tespitine dayanan moleküler hibridizasyon yöntemi, genlerin tek kopyalarının tespit edilmesini mümkün kılar ve hassasiyet açısından eşi benzeri yoktur. Reaksiyon, tamamlayıcı DNA veya RNA iplikçiklerinin (problar) hibridizasyonuna ve çift iplikli yapıların oluşumuna dayanır. En ucuz prob klonlanmış rekombinant DNA'dır. Prob, radyoaktif öncüllerle (genellikle radyoaktif fosfor) etiketlenmiştir. Kolorimetrik reaksiyonların kullanımı umut vericidir. Moleküler hibridizasyon için çeşitli seçenekler vardır: spot hibridizasyon, leke hibridizasyon, sandviç hibridizasyon, yerinde hibridizasyon vb.
IgM sınıfına ait antikorlar, G sınıfına ait antikorlardan daha erken ortaya çıkar (hastalığın 3.-5. gününde) ve birkaç hafta sonra kaybolur, dolayısıyla bunların tespiti yeni bir enfeksiyona işaret eder. IgM sınıfına ait antikorlar, immünofloresan veya anti-m antiserumları (IgM ağır zincirlerine karşı serum) kullanılarak enzime bağlı immünosorbent tahlili ile tespit edilir.
Virolojideki serolojik yöntemler klasik immünolojik reaksiyonlara dayanmaktadır (bkz. İmmünolojik araştırma yöntemleri ): kompleman fiksasyon reaksiyonları, hemaglütinasyon inhibisyonu, biyolojik nötralizasyon, immünodifüzyon, dolaylı hemaglutinasyon, radyal hemoliz, immünfloresan, enzim immünolojik testi, radyoimmünoanaliz. Pek çok reaksiyon için mikro yöntemler geliştirilmiş ve teknikleri sürekli olarak geliştirilmektedir. Bu yöntemler, bilinen bir dizi serum kullanarak virüsleri tanımlamak ve ikinci serumdaki antikorlardaki birinciye kıyasla artışı belirlemek için serodiagnoz için kullanılır (ilk serum hastalıktan sonraki ilk günlerde alınır, ikincisi - 2-2'den sonra). 3 hafta). Tanısal değer, ikinci serumdaki antikorlarda dört kattan az bir artış değildir. IgM sınıfına ait antikorların tespiti yeni bir enfeksiyonu gösteriyorsa, IgC sınıfına ait antikorlar birkaç yıl, bazen de ömür boyu devam eder.
Proteinlerin ön saflaştırılması olmadan karmaşık karışımlarda virüslerin ayrı ayrı antijenlerini ve bunlara karşı antikorları tanımlamak için immünoblotlama kullanılır. Yöntem, poliakrilamid jel elektroforezi kullanılarak protein fraksiyonasyonunu ve ardından enzim immünoanaliz yöntemini kullanarak proteinlerin immüno-endikasyonunu birleştirir. Protein ayrımı, antijenin kimyasal saflığına ilişkin gereksinimleri azaltır ve bireysel antijen-antikor çiftlerinin tanımlanmasını mümkün kılar. Bu görev, örneğin, yanlış pozitif enzime bağlı immünosorbent tahlil reaksiyonlarının, viral proteinlerin yetersiz saflaştırılmasının bir sonucu olarak mevcut olan hücresel antijenlere karşı antikorların varlığından kaynaklandığı HIV enfeksiyonunun serodiagnozu ile ilgilidir. Hasta serumlarında iç ve dış viral antijenlere karşı antikorların tanımlanması, hastalığın evresini ve popülasyonları analiz ederken viral proteinlerin değişkenliğini belirlemeyi mümkün kılar. HIV enfeksiyonu için immünoblotlama, bireysel viral antijenleri ve bunlara karşı antikorları tanımlamak için doğrulayıcı bir test olarak kullanılır. Popülasyonları analiz ederken, yöntem viral proteinlerin değişkenliğini belirlemek için kullanılır. Yöntemin büyük değeri, rekombinant DNA teknolojisi kullanılarak sentezlenen antijenlerin analiz edilmesi, boyutlarının ve antijenik belirleyicilerin varlığının belirlenmesi olasılığında yatmaktadır.
Viral nitelikteki hastalıkların tanısına yönelik araştırma. Bu, virüsü tanımlamak, biyolojisini ve hayvan ve insan hücrelerini etkileme yeteneğini incelemek için gereklidir. Böylece viral hastalıkların patogenezini anlamak ve buna göre doğru tedavi yöntemini seçmek mümkün hale gelir.
Teşhis nedir?
Canlı hücrelerde. Bunu incelemek için deneysel bir organizma düzeyinde yetiştirmek gerekir veya Bunun için tıbbi uygulamada ve genel olarak mikrobiyolojide aşağıdaki ana yaklaşımlara sahip virolojik araştırma yöntemleri yürütülür:
- dümdüz;
- dolaylı;
- serolojik.
Materyal, nükleik asitlerin, viral antijenin varlığı açısından doğrudan incelenebilir veya örneğin virüs, klinik materyalden izole edilebilir ve tanımlanabilir.
Hastalığın etiyolojisini belirleme ve terapötik etkiyi izleme yeteneğinin yanı sıra virolojik araştırma yöntemleri, anti-salgın önlemlerde önemli bir rol oynamaktadır. İzolasyon için tavuk embriyoları, laboratuvar hayvanları veya hücre kültürleri kullanılır.
Nasıl araştırılıyor?
En hızlısı doğrudan yöntemdir. Klinik materyalin kendisinde bir virüs, antijen veya NA (nükleik asit) tespit etmenizi sağlar. İki saatten bir güne kadar sürer.
- EM - elektron mikroskobu. Virüsü doğrudan algılar.
- IEM - bağışıklık elektron mikroskobu. Virüslere karşı spesifik antikorlar kullanır.
- RIF - immünofloresan reaksiyonu. Bir boyaya bağlı antikorları kullanır. Bu tür virolojik araştırma yöntemleri, üst solunum yolunun mukoza zarından parmak izi lekeleri alındığında ARVI'nin (akut solunum yolu viral enfeksiyonları) etiyolojisini hızlı bir şekilde deşifre etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır.
- ELISA - enzime bağlı immünosorbent tahlili - RIF'ye benzer, ancak antikorların enzimlerle etiketlenmesine dayanan viral antijenlerin belirlenmesi.
- RIA - radyoimmünoanaliz. Viral antijenin tespitinde yüksek hassasiyet sağlamak için antikorların radyoetiketlemesini kullanır.
- PCR (polimeraz zincir reaksiyonu) kullanılarak virüs genomlarının moleküler - NK hibridizasyonu veya izolasyonu.
- Sitoloji nadiren kullanılır, ancak bazı enfeksiyonlar için bu virolojik araştırma yöntemleri çok etkilidir. Boyama ve mikroskop altında analiz için işlenen biyopsi materyalleri, otopsiler ve smearlar incelenir.
Araştırmanın amacı nedir?
Virüslerin başarılı bir şekilde izole edilebilmesi için klinik materyal patogenezine uygun olarak ve mümkün olan en kısa sürede alınır. Genellikle bu süreç, belirli virolojik araştırma yöntemlerini uygulamadan önce birkaç pasaj gerektirir.
Mikrobiyoloji mikroskobik canlıları inceleyen bilim dalıdır. Ve onun alanı sadece tıp değil. Tarım, veterinerlik, uzay ve teknik endüstriler ve jeoloji için temel bir bilimdir.
Ama elbette her şey bu güzel gezegende insan ve onun gelişimi için yaratıldı. Bu nedenle tehlikeyi zamanında tespit edip etkisiz hale getirmek çok önemlidir. Virüsler bakterilerden farklıdır. Bunlar vücuda giren ve yeni neslin oluşmasına neden olan yapılardır. Kristallere benzerler ve üreme sürecini kontrol etmeyi amaçlarlar, ancak kendileri beslenmezler, büyümezler ve metabolik ürünler salgılamazlar.
Virüs girdiği her canlı organizmada ciddi hastalıklara neden olma kapasitesine sahiptir. Üstelik gelişebilir. Bu nedenle mikrobiyolojide virolojik araştırma yöntemlerinin geliştirilmesi ve iyileştirilmesi gerekmektedir, çünkü insan uygarlığı bir bütün olarak tehdit altında olabilir.
Malzemeler
Tıpta virüsleri tespit etmek ve tanımlamak için kural olarak aşağıdakiler alınır:
- nazofaringeal lavaj (solunum yolu enfeksiyonları);
- kızarma ve dışkı (enteroviral enfeksiyonlar);
- kazıntılar, kabarcıkların içeriği (cilt lezyonları, uçuk, su çiçeği gibi mukoza zarları);
- ateş basması (kızamık, kızamıkçık gibi ekzantemal enfeksiyonlar);
- kan, beyin omurilik sıvısı (arbovirüs enfeksiyonları).
Aşamalar
Virolojik araştırma yönteminin tüm aşamaları şunları içerir:
- malzemenin toplanması;
- seçimi, bir test sisteminin elde edilmesi, uygulanabilirliğinin belirlenmesi;
- test sisteminin enfeksiyonu;
- virüs göstergesi;
- virüs tipinin belirlenmesi.
Temel olarak patojenik virüsler doku ve tip spesifikliğine göre farklılık gösterir. Örneğin yalnızca primatlarda (hücrelerinde) üreyen çocuk felci virüsünü ele alalım. Buna göre spesifik bir virüsü izole etmek için spesifik bir doku kültürü kullanılır. Bilinmeyen bir patojenden bahsediyorsak, o zaman üç veya daha iyisi dört hücre kültürünün aynı anda enfekte edilmesi tavsiye edilir.
Bu nedenle belki içlerinden biri hassas olacaktır. Enfekte kültürlerde bir virüsün varlığını belirlemek için spesifik hücre dejenerasyonunun gelişimine, hücre içi kapanımlara, spesifik bir antijenin tanımlanmasına, pozitif hemaglutinasyona ve hemadsorpsiyon reaksiyonlarına bakarlar.
Tüm virolojik araştırma yöntemleri (doğrudan ve dolaylı, serolojik), şüpheli enfeksiyon vakasına en uygun olanı seçilmelidir.
Dolaylı yöntemler virüsün izolasyonu ve tanımlanmasına dayanmaktadır. Bunlar emek yoğun, zaman alıcı ama doğrudur.
Serodiyagnoz
Bu tanı, antijen-antikor reaksiyonuna dayanan bir yöntemi ifade eder. Çoğu zaman, birkaç hafta aralıklarla alınan eşleştirilmiş kan serumları kullanılır. Antikor titresi 4 kat veya daha fazla artarsa reaksiyon pozitif kabul edilir. Virüsün tip spesifikliğini belirlemek için bir virüs nötralizasyon reaksiyonu kullanılır. Grup özgüllüğünü belirlemek için tamamlayıcı fiksasyon reaksiyonunun elde edilmesi gereklidir.
Enzim immünoanalizinin çeşitli çeşitleri, hemaglutinasyon inhibisyon reaksiyonu, pasif hemaglutinasyon, ters pasif hemaglütinasyon ve RIF yaygın olarak kullanılmaktadır. Genetik mühendisliğinde bile monoklonal antikorlar üretmeye yönelik bir yöntem geliştirildi. Monoklonların dar özgüllüğü, farklı viral belirleyicilere karşı çeşitli monoklonal antikorlar kullanılarak aşılabilir. Böylece antijen tespit testinin özgüllüğü ve duyarlılığı arttırıldı.
Bazı özellikler
Günümüzde bir virüsün canlı organizmaya girmesi sonucu ortaya çıkan enfeksiyonların immünolojik tanısı için birçok farklı test sistemi oluşturulmuştur.
Dolayısıyla virolojik araştırma yöntemleri, virüsleri izole etmeye, özelliklerini incelemeye ve belirli hastalıklarla etiyolojik bağlantılarını kurmaya yönelik yöntemlerdir.
Bulaşıcı hastalıklar kliniğindeki virolojik çalışmalar giderek daha önemli hale geliyor; bu, öncelikle klinik tablosu her zaman tipik olmayan viral nitelikteki enfeksiyonların artan oranından kaynaklanmaktadır. Aynı zamanda tüm bulaşıcı hastalıklar için hızlı ve güvenilir virolojik tanı yöntemleri geliştirilememiştir; birçoğu emek yoğun olup özel koşullar, deney hayvanları, kültür ortamları ve eğitimli personel gerektirmektedir. Şu anda viral enfeksiyonları teşhis etmek için 3 ana araştırma türü kullanılmaktadır.
1. Dokulardaki viral antijeni veya patognomonik değişiklikleri tanımlamak için bulaşıcı materyalin mikroskobik incelenmesi. Teşhis amacıyla, sınırlı sayıda viral enfeksiyon (kuduz, su çiçeği, sarı humma, herpes vb.) için hastalardan alınan bulaşıcı materyalin doğrudan mikroskobik incelemesi kullanılır. Floresan antikorlar kullanılarak viral antijenin tespitine dayanan bir yöntem daha yaygın olarak kullanılmaya başlandı. İmmünofloresan yöntemi ancak tüm teknik gerekliliklerin sıkı bir şekilde karşılanması durumunda güvenilir olabilir.
2. Virolojik yöntemler.
3. Hastalığın seyri boyunca antikor titresindeki artışı belirlemek için serolojik çalışmalar. Serolojik araştırma yöntemlerine laboratuvar koşullarında daha erişilebilir.
Bu çalışmalar için hastalığın akut döneminde ve iyileşme döneminde kan serumu (eşleştirilmiş serum) alınması gerekir. Serolojik çalışmalar için kan numuneleri antikoagülanlar veya koruyucular olmadan steril olarak alınır.
Virolojik araştırmanın ana aşamaları virüslerin izolasyonu, tanımlanması ve temel biyolojik özelliklerin karakterizasyonudur. Şu anda farklı virüs gruplarını izole etmek için birleşik bir yöntem yoktur. Bu öncelikle özelliklerinin çeşitliliğinden ve konakçı organizma dışındaki ekimin özelliklerinden kaynaklanmaktadır. Araştırma için, özel işleme tabi tutulan ve ardından materyalin geçirilmesiyle biyosubstratlar kullanılır (mukoza zarlarından yıkamalar, kan ve bileşenleri, beyin omurilik sıvısı, idrar ve dışkı, otopsi sırasında alınan organ ve doku biyopsileri veya bunların parçaları). Araştırma için alınan materyal -20 °C ila -70 °C arasındaki sıcaklıkta saklanmalıdır. Ön tanıya bağlı olarak, malzemenin işlenmesinin kendine has özellikleri vardır, ancak her durumda, mukus safsızlıklarından, organ ve doku hücrelerinden veya bunların parçalarından ve bakterilerden maksimum düzeyde saflaştırılmış bir substrat elde edildiği varsayılır. Bu, incelenen malzemenin özel bir aparatta homojenleştirilmesiyle veya soğukta kuvars camla (organ ve doku parçaları) steril soğutulmuş (+4 C) 0,9 ilavesiyle porselen havanda öğütülmesiyle elde edilir. %
%10-30'luk bir süspansiyon elde edilene kadar sodyum klorür çözeltisinde bekletilir ve ardından 1500-3000 rpm'de 10-15 dakika santrifüj edilir. Bu şekilde elde edilen süpernatan sıvı daha ileri araştırmalar için kullanılır.
Doku ve hücre kültürü yönteminin yoğun olarak geliştirilmesinden ve yaygın olarak uygulanmasından önce, deney hayvanlarının veya tavuk embriyolarının enfeksiyonu kullanıldı. Bu yöntemler günümüzde de kullanılmaktadır. Virüslerin hayvanlar kullanılarak tespiti, bir deneyde bulaşıcı bir hastalığın tipik bir resmini veya bireysel belirtilerini yeniden üretmenin mümkün olduğu durumlarda en uygunudur. Böylece, arbovirüsler ve Coxsackie grubunun patojenleri, emziren farelerin beynindeki enfeksiyonla, grip, tavuk embriyolarının enfeksiyonuyla veya test materyalinin farelere intranazal uygulanmasıyla tespit edilebilir. Son yıllarda viroloji laboratuvarları, adenovirüsleri, herpes virüslerini, solunum sinsityal virüsünü, mikssovirüsleri ve diğerlerini izole etmeyi ve ilk etapta hastalığın etiyolojik tanısını gerçekleştirmeyi mümkün kılan hücre ve doku kültürü yöntemini en yaygın şekilde kullanmıştır. çalışmanın aşamaları. Bunun temeli, çoğu virüs ve hücrenin etkileşiminin iyi çalışılmış sitolojik özellikleridir. Bu nedenle, HeLa, Hep-2 hücrelerinin, adenovirüs tip 2 içeren materyalle 3. günde enfeksiyonu, hücre tek katmanının büyüme modelinde bir değişikliğe ve üzüm salkımları vb. şeklinde tipik hücrelerin ortaya çıkmasına yol açar. , düşük büyütmede olağan ışık mikroskobunda iyi tanımlanmıştır.
Bulaşıcı bir hastalığın etiyolojik tanısı için olağanüstü önem taşıyan, test materyalinden virüs izolasyonunun standardizasyonudur; bu, işin bu aşamasında fenotipik (öncelikle yaş) özelliklerini dikkate alarak genetik olarak saf doğrusal hayvanların kullanımını içerir. Bunun temel nedeni, farklı genetik soy ve yaşlardaki deney hayvanlarının virüslere değişen derecelerde duyarlı olmasıdır. Bu nedenle, farelerin influenza virüsünün nörotropik suşu WSN ile intraserebral enfeksiyonu sırasında, BALB/c, A, CBA ve soy dışı soyların hayvanlarının duyarlılığı en yüksek düzeydeydi; testin intranazal uygulanması durumunda da aynı model oluşturuldu. malzeme. Virüs izolasyonunun nihai sonuçları için esas olan, hayvanların, tavuk embriyolarının, hücre ve doku kültürlerinin latent virüs taşıyıcılığı açısından ön incelemesidir. Laboratuar uygulamalarında çok yaygın olarak kullanılan tavuk embriyoları, kuş lösemisi, kuş ensefalomiyeliti, enfeksiyöz sinüzit, psittakoz, Newcastle hastalığı, bazı bakteriyel enfeksiyonların etken maddeleri (paratifo ateşi vb.) virüslerinin yanı sıra mikoplazma virüsleriyle enfekte olabilir. . Daha da fazla sayıda bakteriyel ve özellikle viral ajan, hücre ve doku kültürlerini kendiliğinden enfekte etme ve bunlarda hayatta kalma kapasitesine sahiptir. Onların varlığı, incelenen materyalin değerlendirmesini önemli ölçüde etkiler. Hücre kültüründeki bazı mikoplazma türleri
hemaglutinasyona ve hemadsorpsiyona neden olabilir ve hatta agar kaplaması altında virüslerin oluşturduğu plaklara benzer plaklar oluşturabilir. Bir tür hücre kültürlerinin başkaları tarafından kontaminasyonu da küçük bir öneme sahip değildir, çoğu zaman bu HeLa hücreleriyle ilişkilidir ve aynı odada farklı kültür türleri ile çalışırken, laboratuvar cam malzemeleri kötü işlendiğinde vb. Hücre kültürlerinin kontaminasyonu veya hayvanların bakteriyel ajanlarla enfeksiyonu, Kural olarak, oldukça açık bir şekilde kendini gösterir (hücrelerin tek katmanının büyüme modelindeki değişiklikler, kültür ortamının özellikleri, tavuk embriyolarının veya hayvanların ölümü belirli semptomlarla vb.) ve sonuçların değerlendirilmesinde herhangi bir özel zorluk yaratmaz. Serolojik ve diğer yöntemlerin kullanılmasının gerekli olduğu gizli enfeksiyon formlarında durum daha karmaşıktır. Bir virologun çalışmasında, özellikle hastalığın belirsiz vakalarının etiyolojik teşhisini yaparken bu talimatlar dikkate alınmalıdır.
Viral enfeksiyonların laboratuvar tanısı
Viral hastalıkların etiyolojik tanısı yapılır virolojik, virüsoskopik, serolojik ve moleküler genetik yöntemler. Son üç yöntem hızlı teşhis yöntemleri olarak kullanılabilir.
Virolojik tanı yöntemi.
Yöntemin nihai amacı virüsleri türlere veya serolojik varyantlara göre tanımlamaktır. Virolojik yöntem birkaç aşamayı içerir: 1) araştırma için materyal seçimi; 2) virüs içeren materyalin işlenmesi; 3) hassas yaşam sistemlerinin materyalle kirlenmesi; 4) canlı sistemlerdeki virüslerin göstergesi; 5) izole edilmiş virüslerin titrasyonu; 6) bağışıklık reaksiyonlarında virüslerin tanımlanması.
1. Araştırma için materyal seçimi. Malzemenin yabancı mikroflora ile kirlenmesini ve tıbbi personelin enfeksiyonunu önleyen kurallara tabi olarak hastalığın erken aşamalarında gerçekleştirilir. Taşıma sırasında virüslerin inaktivasyonunu önlemek için malzeme, dengeli bir tuz çözeltisi, antibiyotikler ve serum albüminden oluşan bir viral taşıma ortamına (VTS) yerleştirilir. Malzeme, ısı yalıtımlı özel bir kap ve buz içeren kapalı plastik torbalar içerisinde taşınır. Gerektiğinde malzeme -20˚C'de saklanır. Araştırmaya yönelik her materyal örneği, hastanın adını, materyalin türünü, toplanma tarihini, ayrıntılı klinik tanıyı ve diğer bilgileri içerecek şekilde işaretlenmeli ve etiketlenmelidir.
Hastalığın doğasına bağlı olarak araştırma materyali şunlar olabilir: 1) farenksin burun kısmından yıkama ve farenksten smear; 2) beyin omurilik sıvısı; 3) dışkı ve rektal sürüntüler; 4) kan; 5) idrar; 6) seröz boşluklardan gelen sıvı; 7) konjonktivadan smear; 8) keseciklerin içerikleri; 8) kesit malzemesi.
Almak için orofarinksten lavaj 15-20 ml BTS kullanın. Hasta VTS'yi 1 dakika boyunca dikkatlice gargara yapar ve durulamayı steril bir şişede toplar.
Boğazın arkasından sürüntü dilin köküne bir spatula ile bastırarak steril bir pamuklu çubukla alın. Tampon 2-3 ml VTS'ye konulur, durulanır ve sıkılır.
Beyin omurilik sıvısı omurga ponksiyonuyla elde edilir. 1-2 ml beyin omurilik sıvısı steril bir kaba konularak laboratuvara ulaştırılır.
Dışkı örnekleri 2-3 gün içerisinde steril flakonlarda toplanır. Elde edilen malzemeden Hanks çözeltisi kullanılarak %10'luk bir süspansiyon hazırlanır. Süspansiyon 3000 rpm'de santrifüjlenir, süpernatan toplanır, antibiyotikler eklenir ve steril bir kaba yerleştirilir.
Damar yolu ile elde edilen 5-10 ml hacimdeki kan, heparin eklenerek defibrine edilir. Tam kan dondurulmaz ve antibiyotik eklenmez. Serum elde etmek için kan örnekleri 37˚C sıcaklıktaki termostatta 60 dakika bekletilir.
Seröz boşluklardan 1-2 ml miktarında delinerek sıvı elde edilir. Sıvı hemen kullanılır veya dondurularak saklanır.
Steril bir çubukla konjonktivadan bir smear alınır ve bir VTS'ye yerleştirilir, ardından toplanan materyal santrifüjlenir ve dondurulur.
Vezikül içeriğiİnce iğneli bir şırınga ile aspire edilerek VTS'ye yerleştirildi. Materyal, cam slaytlar üzerinde kurutulmuş smearlar halinde veya kapalı steril kılcal damarlar veya ampuller içerisinde laboratuvara gönderilir.
Seksiyonel malzeme asepsi kurallarına uyularak mümkün olduğu kadar erken seçilir. Her numuneyi toplamak için ayrı steril alet setleri kullanılır. Alınan doku miktarı 1-3 gr olup steril flakonlara konulur. Öncelikle ekstrakaviter organlardan (beyin, lenf düğümleri vb.) örnekler alınır. Karın boşluğu açılmadan önce göğüs boşluğundan doku toplanır. Elde edilen doku örnekleri, steril kum ve steril sodyum klorür çözeltisi ilavesiyle bir havanda öğütülür ve ardından malzeme santrifüjlenir. Süpernatan şişelerde toplanır ve antibiyotikler eklenir. Virolojik araştırma materyali hemen kullanılır veya -20˚C'de saklanır.
2. Virüs içeren materyalin işlenmesi. Malzemeyi eşlik eden bakteriyel mikrofloradan kurtarmak amacıyla gerçekleştirilir. Bu amaçla fiziksel ve kimyasal yöntemler kullanılmaktadır. Fiziksel yöntemler: 1) çeşitli bakteri filtrelerinden filtreleme; 2) santrifüjleme. Kimyasal yöntemler: 1) süperkapsid içermeyen virüslerin izolasyonu durumunda malzemenin eter ile işlenmesi; 2) malzemeye bir heptan ve freon karışımının eklenmesi; 3) antibiyotiklerin uygulanması (penisilin - 200-300 U/ml; streptomisin - 200-500 mcg/ml; nistatin - 100-1000 U/ml).
Laboratuvar hayvanları. Beyaz fareler, kobaylar, hamsterlar, tavşanlar vb. Kullanılır.Beyaz fareler, çok sayıda virüs türüne karşı en duyarlı olanlardır. Hayvanları enfekte etme yöntemi, virüsün dokulara olan tropizmi tarafından belirlenir. Beyindeki enfeksiyon, nörotropik virüslerin (kuduz virüsleri, çocuk felci virüsleri vb.) izole edilmesinde kullanılır. Burun içi enfeksiyon, solunum yolu enfeksiyonlarının patojenleri izole edildiğinde gerçekleştirilir. Kas içi, damar içi, periton içi, deri altı ve diğer enfeksiyon yöntemleri yaygın olarak kullanılmaktadır. Hasta hayvanlara eterle ötenazi yapılıyor, açılıyor, organ ve dokulardan materyal toplanıyor.
Tavuk embriyoları. Yaygın olarak bulunur ve kullanımı kolaydır. 5 ila 14 günlük tavuk embriyoları kullanılır. Enfeksiyondan önce, tavuk embriyoları ovoskopiktir: canlılıkları belirlenir, hava kesesinin sınırı ve embriyonun yeri kabuk üzerinde işaretlenir (embriyonun "karanlık gözü"). Tavuk embriyolarıyla çalışma, steril aletlerle (cımbız, şırınga, makas, mızrak vb.) Steril bir kutuda gerçekleştirilir. İşin bir kısmını tamamladıktan sonra aletler% 70 etil alkole batırılır ve bir sonraki manipülasyondan önce yakılır. Enfeksiyondan önce, tavuk embriyosunun kabuğu, yanan alkollü bir bez ve bir alkol iyot çözeltisiyle silinir. Embriyoya enjekte edilen test materyalinin hacmi 0,1-0,2 ml'dir. Virüsleri bir materyalden izole etmek için en az 4 tavuk embriyosu kullanılır.
Bir tavuk embriyosunu enfekte etmenin birkaç yolu vardır: amniyon ve allantois boşluğunda, koryon-allantoik membranda, yumurta sarısı kesesinde (Şekil 1).
Allantois boşluğunda enfeksiyon. Tavuk yumurtası, hava kesesi yukarı bakacak şekilde dikey olarak yerleştirilir. Yumurtanın künt direğinin ortasında, hava kesesinin üzerinde kabuk delinir, hava kesesi sınırının 2-3 mm altına kas içi enjeksiyon için bir iğne yerleştirilir ve test materyali bir tüberkülin şırıngası ile enjekte edilir. Kabuktaki delik, eritilmiş parafin veya yapışkan sıva ile kaplanır.
Amniyon boşluğunda enfeksiyon. Dikey olarak yerleştirilmiş bir yumurtanın hava kesesinin üzerinden 1x1 cm ölçülerinde bir pencere kesilir ve embriyo gövdesinin üzerindeki koryon-allantoik membranın bir kısmı dikkatlice çıkarılır. Test materyali, bir tüberkülin şırıngası kullanılarak cımbızla içine enjekte edilir. Cımbızın serbest bırakılmasıyla amniyon orijinal konumuna getirilir. Kabuktaki delik yapışkan bir sıva ile kaplanmıştır.
Koryon-allantoik membran enfeksiyonu. Dikey olarak konumlandırılmış bir yumurtanın hava odasının üzerinde bir kabuk parçası kesilerek bir pencere oluşturulur. Daha sonra kabuğun altındaki zar soyuluyor ve koryon-allantoik zarın üzerine test malzemesinin uygulandığı bir kısmı açığa çıkıyor. Kabuktaki delik yapışkan bantla kapatılmıştır.
Yumurta sarısı kesesinde enfeksiyon. Yumurta, embriyonun gövdesi altta ve yumurta sarısı onun üstünde olacak şekilde yatay olarak yerleştirilir. Hava kesesi bölgesindeki kabuğun delinmesi yoluyla, kas içi enjeksiyon için bir iğne, yumurtanın merkezi ekseni boyunca iğne uzunluğunun 2/3'ü derinliğe kadar sokulur ve test materyali enjekte edilir. bir şırınga. Kabuktaki delik yapışkan bantla kapatılmıştır.
Enfeksiyondan sonra embriyolar küt ucu yukarı bakacak şekilde bir termostatta inkübe edilir. Kuluçka sıcaklığı ve süresi izole edilen virüsün biyolojik özelliklerine bağlıdır. Kuluçka sonunda embriyolar +4˚C'de 16-18 saat soğutulur.Daha sonra tavuk embriyosu, işaretli sınırın üzerindeki hava kesesinin üzerindeki kabukta bir delik açılarak steril olarak açılır. Bir Pasteur pipeti veya şırıngası kullanılarak allantoik ve ardından amniyotik sıvı emilir, koryon-allantoik membran çalışma için kesilir ve yumurtanın geri kalan içeriği bir Petri kabına alınır. Allantoik ve amniyotik sıvılar virüsleri belirtmek için kullanılır.
Organ kültürleri. Bunlar, in vitro yapılarını ve işlevlerini birkaç gün, bazen de haftalarca koruyan, uygun şekilde hazırlanmış organ bölümleridir. Organ kültürleri, bir "sal" veya "platform" kullanılarak sıvı bir kültür ortamının yüzeyinde büyütülür. Bir organ kültürünün enfeksiyonu, bir organ veya doku parçalarının test materyali ile birlikte bir test tüpüne yerleştirilmesiyle gerçekleştirilir. Virüs adsorpsiyonu oda sıcaklığında 1-2 saat süreyle gerçekleştirilir. Daha sonra incelenen materyal boşaltılır, organ veya doku parçaları Hanks solüsyonunda yıkanır, ekim için bir kaba yerleştirilir, besin ortamı eklenir ve bir termostatta tutulur. Doku kültüründe virüsün tespiti için materyalin toplanması ekimin 2. gününde başlar.
Hücre kültürleri. Hücre kültürü, bir hayvan veya insan vücudunda yapay koşullar altında yetiştirilen ve virüslerin yetiştirilmesi amaçlanan aynı tip hücrelerin popülasyonudur. Yaşam sürelerine bağlı olarak hücre kültürleri şu şekilde ayrılır: 1) birincil; 2) yarım yapraklı; 3) nakledilebilir.
Birincil hücre kültürleri hayvan ve insan dokularından enzimatik parçalanma yoluyla elde edilir. Doku parçaları, 37˚C sıcaklıkta %0,25'lik bir trypsin çözeltisine yerleştirilir ve periyodik olarak karıştırılır. Bunun sonucunda doku hücreleri birbirinden ayrılır. Hücrelerin bazı kısımları ayrılırken toplanır, santrifüj edilir, trypsin boşaltılır, büyüme ortamı eklenir ve hücreler bunun içinde süspanse edilir. Primer hücre kültürleri in vitro olarak 10'a kadar bölünmeye uğrayabilir, birçok virüse karşı oldukça duyarlıdır, büyük miktarlarda elde edilebilir ve onkogenik açıdan güvenlidir. Birincil kültürlerin dezavantajı, önemli emek yoğunluğu ve üretim süresinin yanı sıra gizli virüslerle olası kirlenmedir. Birincil hücre kültürleri, insan embriyonik böbrek hücrelerini, al yanaklı makakları, domuz embriyolarını ve tavuk embriyo fibroblastlarını içerir.
Yarı sürekli hücre kültürleri orijinal diploid kromozom setini korurken, in vitro 100'e kadar bölünmeye maruz kalabilen aynı tipteki diploid hücrelerdir. Yarı sürekli hücre kültürleri insan embriyonik fibroblastlarını içerir (Şekil 2). Bu hücreler yetiştirme koşulları açısından son derece zorludur ve bu nedenle viroloji laboratuvarlarında kullanımı sınırlıdır.
Sürekli hücre kültürleri- bunlar, in vitro koşullarda sınırsız büyüme kapasitesine sahip, değiştirilmiş karyotipe sahip aynı tip tümör veya insan ve hayvanların normal hücreleridir. Sürekli hücre kültürlerinin yetiştirilmesi kolaydır ve bu nedenle insanlarda viral hastalıkların laboratuvar tanısında yaygın olarak kullanılır. Nakledilebilir hücre kültürleri arasında HeLa (insan rahim ağzı karsinomu hücreleri), KV (insan ağız karsinomu hücreleri), Vero (yeşil maymun böbrek hücreleri), SPEV (domuz embriyonik böbrek hücreleri) vb. hatları yer alır.
Büyüyen hücre kültürleri, türüne bakılmaksızın, besin ortamının eklendiği özel düz cam kaplarda - şiltelerde steril koşullar altında gerçekleştirilir. Yatağın alt kısmındaki hücreler çoğaldıklarında tek tabaka oluştururlar.
Hücre kültürlerinin yetiştirilmesi için fizyolojik miktarlarda amino asitler, karbonhidratlar, mineral tuzlar içeren ve pH'ı 7.2-7.4 olan özel besin ortamları kullanılır. Ortam, besin maddelerinin yanı sıra, pH optimal değerden uzaklaştıkça ortamın rengini değiştiren bir gösterge içerir. Hücre kültürleriyle çalışırken en yaygın kullanılanlar şunlardır: ortam 199, Eagle ortamı. Medium 199, 60 bileşen içerir ve sürekli ve birincil trypsinize hücrelerin yetiştirilmesi için kullanılır. Eagle'ın ortamı minimum miktarda amino asit (13) ve vitamin (8) içerir. Diploid ve sürekli hücre kültürlerinin yetiştirilmesinde kullanılır.
Hücre ekimi aseptik koşullar altında yapılmalıdır ve bu nedenle kültür ortamına antibiyotikler (örneğin penisilin ve streptomisin) eklenir.
4. Canlı sistemlerde virüslerin gösterilmesi. Virüslerin tespiti, test materyalinde virüslerin aileye, cinse, türe veya serovaryana ait oldukları belirlenmeden tespit edilmesidir.
Laboratuvar hayvanlarında virüs belirtileri. Vücutta virüslerin varlığı öncelikle hastalık semptomlarının gelişmesi veya hayvanın ölümü ile gösterilir. Etkilenen organ ve doku örnekleri, ölü veya önceden ötanazi uygulanmış bir hayvandan eterle alınır, porselen bir havana yerleştirilir, tuzlu su çözeltisi eklenir ve kumla öğütülür. Ortaya çıkan süspansiyon, doku artıklarını çökeltmek üzere santrifüjlenir. Süpernatan sıvısında virüsler hemaglutinasyon, kompleman sabitleme veya diğer antijenlerle tanımlanır.
Tavuk embriyolarında virüs belirtileri. Virüsler amniyotik ve allantoik sıvıda hemaglutinasyon reaksiyonu (HRA) kullanılarak tespit edilir. Bir civciv embriyosu enfekte olduğunda, virüse özgü lezyonlar olan plaklar veya kabarcıklar genellikle koryon-allantoik membran üzerinde bulunur. Koryon-allantoik membrandaki virüslerin endikasyonu hemaglutinasyon veya kompleman fiksasyonu (CFF) reaksiyonlarında gerçekleştirilir. Bunu yapmak için, kabuk bir havanda öğütülür, doku döküntüsünü çökeltmek için santrifüjlenen bir süspansiyon hazırlanır ve süpernatan RGA veya RSC'de incelenir.
Organ ve hücre kültürlerinde virüslerin gösterilmesi aşağıdakilere göre gerçekleştirilir: 1) virüslerin sitopatik etkisi (CPE); 2) hücre içi kapanımların oluşumu; 3) hemaglutinasyon reaksiyonunda; 4) plak oluşumuyla; 5) renk testi ile; 6) hemadsorpsiyon reaksiyonu ile.
CPD– bunlar, virüslerin hücrelerde çoğalması sırasında ortaya çıkan organ ve hücre kültüründeki morfolojik değişikliklerdir. CPD'ye neden olan virüslere sitopatojenik denir. CPE'nin doğası virüslerin biyolojik özelliklerine, virüsün dozuna, hücrelerin özelliklerine ve yetiştirme koşullarına bağlıdır. Virüslerin CPD'si kendisini nekroz, küme oluşumu, semplasto ve sinsityum oluşumu, yuvarlak hücre dejenerasyonu, hücre proliferasyonu ve fokal yıkım olarak gösterebilir.
Çocuk felci, Coxsackie, ECHO virüslerinin nekrotik CPD'si ile hücrelerin çoğu tamamen yok edilir, geri kalan hücreler kırışır (çekirdek ve sitoplazmik membranın piknozu, vakuolizasyon), mikroskop altında çift kırılma - güçlü parlaklık ile karakterize edilirler.
Küme oluşumunun türüne göre CPD, hücrelerin yuvarlandığı, genişlediği ve kısmen küme şeklinde kümeler oluşturmak üzere birbirleriyle birleştiği adenovirüslerin karakteristiğidir (Şekil 3).
| |
Bir sinsityum, sitoplazmik köprülerle birbirine bağlanan hücrelerden oluşurken, bir semplast, tekrarlanan tamamlanmamış mitozların bir sonucu olarak oluşan büyük, çok çekirdekli bir hücredir.
Yuvarlak hücre dejenerasyonunun türüne göre virüslerin CPD'si, hücrelerin yuvarlanması ve hücreler arası bağlantıların kaybı ile karakterize edilir. Piknoz, buruşma ve hücre tahribatı da gözlenebilmektedir (Şekil 5).
Onkogenik virüslerde CPD, yoğun hücre proliferasyonu ve çok katmanlı hücresel yapıların oluşumunun eşlik ettiği hücrelerin malign hücrelere dönüşümü olarak kendini gösterebilir. Bazı grip, aşı ve çiçek hastalığı virüslerinin CPD'si, hücre kültürünün odaksal olarak yok edilmesiyle kendini gösterir - genel olarak korunmuş bir tek tabakanın arka planında hücre hasarı odakları (mikroplaklar) belirir.
CPE'nin yokluğunda veya zayıf şekilde eksprese edilmesi durumunda, yeni hücre kültürleri, kültür sıvısı ile enfekte edilir.
Hücre içi kapanımlar kuduz, çiçek hastalığı, grip, herpes, adenovirüsler vb. virüslerin çoğalması sırasında hücrelerin sitoplazmasında veya çekirdeğinde oluşur Hücre içi kapanımlar, viryonların kristalin birikimleridir. İnklüzyonlar, camların Romanovsky-Giemsa tek katmanıyla boyanmasından sonra ışık daldırma mikroskobuyla veya akridin portakalı ile muameleden sonra floresan mikroskobuyla tespit edilir. Romanovsky-Giemsa'ya göre boyandığında viral kapanımlar pembe veya pembe-leylak rengi alır. Akridin turuncusu ile boyandığında DNA yapıları yeşil bir parlaklık verirken, RNA yapıları kırmızımsı-turuncu bir parlaklık verir. Şu anda, kuduz (Babes-Negri cisimcikleri) tanısı sırasında hücre içi kapanımların tespiti yapılmaktadır (Şekil 6). Daha önce çiçek hastalığında Guarneri cisimleri tespit edilmişti.
Plak oluşumu. Plaklar, bir agar kaplaması altında bulunan, yok edilmiş birincil virüsle enfekte tek katmanlı hücrelerin odaklarıdır. Plaklar, kültürün agar kaplamasına dahil edilen veya sonuçların kaydedilmesinden hemen önce eklenen nötr kırmızı ile boyanmasıyla tespit edilir. Plaklar, boyayı algılamayan ölü hücrelerden oluştuğu için, canlı hücrelerin pembe-kırmızı tek katmanının arka planında açık noktalar olarak görülebilirler. Hücrelerin bulaşıcı aktivitesinin kantitatif analizi için plak oluşumu kaydedilir.
Renk testi. Hücre kültürlerinin yetiştirildiği Media 199 ve Igla, koyu kırmızı bir renge sahiptir, pH = 7,2-7,4 ve pH değiştiğinde ortamın rengini değiştiren bir gösterge içerir. Virüsle enfekte olmayan hücre kültürleri bu ortamlarda ekildiğinde, hücrelerin asidik metabolik ürünler salması nedeniyle ortamın rengi turuncuya döner. Virüsle enfekte olmuş hücreler, viral üreme yoluyla metabolizmanın baskılanmasının yanı sıra virüslerin CPE'sinin bir sonucu olarak yok edilir, hücrelerin alkali sitoplazması, rengini değiştirmeden ortama girer (ortam kırmızı kalır) .
Hemaglutinasyon reaksiyonu (HRA) dış kabuğunda aglütinin içeren bazı virüslerin belirli hayvan türlerinin kırmızı kan hücrelerini birbirine yapıştırma (aglutinasyon) yeteneğine dayanmaktadır. RGA gerçekleştirmek için hücre içermeyen virüs içeren materyal (allantoik veya amniyotik sıvı, doku kültürü süpernatantı) kullanılır. Virüs içeren sıvı, 0,5 ml izotonik sodyum klorür çözeltisi ve 0,5 ml %1'lik yıkanmış kırmızı kan hücresi süspansiyonu ile karıştırılır ve ardından 37˚, 20˚ veya 4˚C'de 30-60 dakika inkübe edilir. Negatif kontrolde, deneyde aglütinasyonun gelişmesi, test sıvısında bir virüsün varlığını gösterir. Kontrol, 0,5 ml kırmızı kan hücresi ile eşit hacimde virüs içermeyen izotonik sodyum klorür çözeltisinin karışımıdır.
Hemadsorpsiyon reaksiyonu (RGad'ler) CPE gelişmeden önce hücre kültürlerinde hemaglutinin içeren virüslerin tespit edilmesini mümkün kılar (Şekil 7). Hemadsorpsiyon, yalnızca virüsün hemaglutinininin kültür hücrelerinin sitoplazmik zarında mevcut olması durumunda gözlenir. Rgads, hücre kültürüne 0,2 ml %0,5'lik kırmızı kan hücresi süspansiyonu eklenerek gerçekleştirilir, ardından hücreler 15-20 dakika boyunca 37˚, 20˚ veya 4˚C'de (çoğunluğun özelliklerine bağlı olarak) tutulur. virüs). Daha sonra tüpler, adsorbe edilmemiş eritrositleri uzaklaştırmak için çalkalanır ve bunların tek tek hücreler üzerindeki veya tüm tek tabaka üzerindeki birikimleri, düşük mikroskop büyütmesi altında dikkate alınır. Virüslerle enfekte olmayan hücrelerde eritrositlerin adsorpsiyonu gözlenmez.
5. İzole edilmiş virüslerin titrasyonu - Bu, virolojik teşhis yönteminin zorunlu bir aşamasıdır; bunun amacı, incelenen materyalin birim hacmi başına viral partiküllerin içeriğini kantitatif olarak belirlemektir.
Laboratuar hayvanlarında izole edilen virüslerin titre edilmesi için yöntemler Patojenin enfekte hayvanların %50'sinin ölümüne veya hastalığın karakteristik semptomlarına neden olduğu dozun (titrasyon) belirlenmesini sağlar. Virüslerin titresi LD50 - öldürücü doz veya ID 50 - bulaşıcı doz olarak ifade edilir.
Tavuk embriyolarından izole edilen virüslerin titrasyonu ve hemaglutinasyon aktivitesine sahip olanlar bir hemaglutinasyon reaksiyonunda gerçekleştirilir. X-ışını analizi test tüplerinde veya özel tabletlerde gerçekleştirilir. Virüs içeren materyalden 0,5 ml izotonik sodyum klorür çözeltisi içerisinde çift seyreltiler hazırlanır. Tüm test tüplerine 0,5 ml kırmızı kan hücresi süspansiyonu ekleyin. Kontrol, 0,5 ml kırmızı kan hücresi ile aynı hacimde virüs içermeyen izotonik sodyum klorür çözeltisinin karışımıdır. İncelenen virüsün özelliklerine bağlı olarak karışım, 37˚, 20˚ ve 4˚C'de bir termostatta inkübe edilir. Reaksiyonun sonuçları, kontroldeki eritrositlerin tamamen sedimantasyonundan 30-60 dakika sonra dikkate alınır: (++++) - eritrositlerin yoğun ve hızlı aglütinasyonu, tortu, fistolu kenarlara sahip yıldız şeklinde bir şekle sahiptir (“şemsiye) ”); (+++) – eritrosit çökeltisinde boşluklar var; (++) – daha az belirgin tortu; (+) - aglütine eritrosit yığınları bölgesi ile çevrelenmiş topaklaşmış eritrosit çökeltisi ve (-) - kontroldekiyle aynı şekilde keskin bir şekilde tanımlanmış eritrosit çökeltisi ("bozuk para sütunu"). RGA sırasında virüsün titresi, kırmızı kan hücrelerinin aglütinasyonunun hala gözlemlendiği en yüksek seyreltmedir. Bu seyreltmenin bir hemaglutinasyon ünitesi virüs (1 HAU) içerdiği kabul edilir. 1 GAE'den önceki seyreltmeler, onları takip eden seyreltmeyle karşılaştırıldığında 2 kat daha fazla GAE içerecektir. Örneğin, 1 GAE 1:64'lük bir seyreltmeye karşılık geliyorsa, 1:32'lik bir seyreltme 2 GAE'ye karşılık gelecektir ve 1:16 ve 1:8'lik seyreltmeler sırasıyla 4 ve 8 GAE'ye karşılık gelecektir. Virüsleri tanımlamak için genellikle 4 GAU'luk bir virüs titresi kullanılır.
Hücre kültürlerinde virüslerin titrasyonu CPP, plak oluşumu ve renk testi ile gerçekleştirilir.
Hücre kültürlerinde CPE ile belirlendiğinde virüs titresi, virüsün enfekte hücre kültürlerinin %50'sinde CPE'ye neden olabileceği virüs içeren materyalin en yüksek seyreltimidir. Bu değere %50 doku sitopatik dozu (TCD 50) adı verilir. Virüsün CPD ile titrasyonu aşağıdaki aşamaları içerir: 1) oluşturulmuş tek tabakalı hücrelerin test tüpü kültürlerinin ekilmesi, büyütülmesi ve seçilmesi; 2) virüs içeren materyalin 10 kat seyreltilmesinin elde edilmesi; 3) hücre kültürlerinin virüsün farklı seyreltileriyle enfeksiyonu; 4) hücre kültürlerinin 37˚ sıcaklıktaki bir termostatta tutulması; 5) sonuçların plus sistemine (++++) göre 5-7. günlerde kaydedilmesi ve sonuçların istatistiksel olarak işlenmesi. İstatistiksel olarak güvenilir sonuçlar elde etmek için bir dizi kurala uymak gerekir: a) 1 virüs seyreltimi ile enfeksiyon için en az 4 test tüpü hücre kültürünün kullanılması; b) virüsün 2 dilüsyonunun titre serisine dahil edilmesi - CPE 50'nin altında ve üstünde.
Virüslerin hücre kültürlerinde plak oluşumuna dayalı titrasyonu, virüslerin kantitatif tayini için en hassas ve doğru yöntemlerden biridir. Ancak yöntem teknik olarak karmaşıktır ve çoğunlukla bilimsel araştırmalarda kullanılır.
Renk testi yöntemi kullanılarak hücre kültürlerindeki virüslerin titrasyonu, 1 ml'de 200 bin hücre konsantrasyonunda hücre süspansiyonu içeren ortamda renk değişikliğinin meydana geldiği virüs içeren materyalin en yüksek seyreltisini belirlemeyi amaçlamaktadır. Virüs titresi belirlendikten sonra virüsleri tanımlamak için kullanılan 100 TCD 50 çalışma dozu hazırlanır.
6. İmmün reaksiyonlarda virüslerin tanımlanması. Virüslerin tanımlanması veya titrasyonu, bunların varyantının, türünün, cinsinin ve aile ilişkisinin belirlenmesidir. Virüs tanımlaması şu prensibe göre gerçekleştirilir: bilinmeyenin bilinenden tanımlanması. Virüslerin tanımlanmasında iyi bilinen bir bileşen, nötralizasyonun serolojik reaksiyonlarında (RN), hemadsorpsiyonun inhibisyonunda (RTGad'ler), hemaglutinasyonun inhibisyonunda kullanılan spesifik antiviral serumlardır (anti-influenza, kızamık önleyici vb.). HTI), RPHA, RSK'nin yanı sıra ELISA ve RIA'da. Bu serumlar spesifik antiviral antikorlar içerir ve tanısal olarak adlandırılır.
Nötralizasyon reaksiyonu (RN) hücre kültürü, tavuk embriyoları ve hayvanlar üzerinde yapılabilir. Nötralizasyon karışımları, eşit hacimlerde virüs içeren materyal (1.0 ml'de genellikle 100 TCD50 virüs) ve teşhis serumundan (1.0 ml) oluşan test tüplerinde hazırlanır. Hazırlanan karışımlar iyice çalkalandıktan sonra 37˚C'de 3 saat reaksiyona sokulur. Daha sonra nötralizasyon karışımları hassas hücre kültürüne eklenir ve 37˚C'de 5-7 gün inkübe edilir, ardından CPP ve renk testi sonuçları dikkate alınır (Tablo 1).
Ders çalışması
"Klinik viroloji yöntemleri"
giriiş
Viral enfeksiyonların laboratuvar tanısı esas olarak elektron mikroskobu, hassas hücre kültürleri ve immünolojik yöntemler kullanılarak gerçekleştirilir. Kural olarak, viral enfeksiyonun evresine bağlı olarak tanı koymak için bir yöntem seçilir. Örneğin, her üç yaklaşım da su çiçeği teşhisinde faydalı olabilir, ancak mikroskopi ve hücre kültürü tekniklerinin başarılı kullanımı, hastalığın nispeten erken döneminde tatmin edici örneklerin toplanması yeteneğine bağlıdır.
Viral teşhisin başarısı büyük ölçüde elde edilen örneklerin kalitesine bağlıdır. Bu nedenle laboratuvar personelinin gerekli numunelerin toplanması sürecine doğrudan katılması gerekmektedir. Numunelerin özellikleri ve laboratuvara teslim yöntemleri Lennett, Schmidt, Christ ve diğerleri tarafından açıklanmaktadır.
Laboratuvar teşhislerinde kullanılan çoğu reaktif ve cihaz çeşitli şirketlerden satın alınabilir. Çoğu durumda, aynı reaktif birden fazla şirket tarafından aynı anda üretilir. Bu nedenle reaktif tek bir şirket tarafından sağlanmadığı sürece tek tek şirketleri belirtmedik. Diğer tüm durumlarda, tabloda belirtilen genel tedarikçi listesine başvurmalısınız. 1.
İnsandaki viral enfeksiyonların teşhisine yönelik mevcut tüm yöntemlerin kapsamlı bir tanımını yapmayı amaçlamadık. Öncelikle ana yöntemleri tanımladık. Bağımsız çalışma deneyimi kazandıkça bu temel teknikler daha karmaşık sorunları çözmek için kullanılabilir.
1. Elektron mikroskobu
Viral enfeksiyonların elektron mikroskobik tanısı için etkilenen dokunun ince kesitleri kullanılabilir. Elektron mikroskobu için kullanılan en yaygın malzeme dışkı veya sıvıdır.
Tablo 1. Reaktif ve ekipman tedarik eden şirketlerin listesi
| Flow Laboratuvarları: Gibco Avrupa: Doku Kültürü Hizmetleri: Hoş Geldiniz Diagnostik: Northumbria Biyolojikler: Oxoid: Dynatech Laboratories Ltd.: Sterilin Ltd.: Abbott Laboratories Ltd.: | Woodcock Hill, Harefield Road, Rickmansworth, Hertfordshire WD3 1PQ, UK Unit 4, Cowley Mill Trading Estate, Longbridge Way, Uxbridge, Middlesex UB8 2YG, UK 10 Henry Road, Slough, Berkshire SL1 2QL, UK Temple Hill, DartfordT Kent DAI 5BR, Birleşik Krallık Güney Nelson Sanayi Bölgesi, Cramlington, Northumberland NE23 9HL, Birleşik Krallık Wade Road, Basingstoke, Hampshire RG24 OPW, Birleşik Krallık Daux Road, Ballingshurst, Sussex RH14 9SJ, Birleşik Krallık 43/45 Broad Street, Teddington, Middlesex TW11 8QZ, Birleşik Krallık Brighton Hill Geçit Töreni, Basingstoke, Hampshire RG22 4EH, Birleşik Krallık |
su çiçeği gibi bazı hastalıkları karakterize eden kesecikler. Bu tür materyali analiz ederken, negatif boyama kullanılarak virüsler tespit edilebilir, bu da viryonun bileşenlerini tanımlayan elektron yoğun materyalle sonuçlanır. Yöntem, dışkı veya kesecik sıvısı gibi test numunelerinde virüs konsantrasyonu yüksek olduğunda etkilidir. Numunelerdeki viral partikül içeriğinin düşük olduğu durumlarda, virüsün ultrasantrifüjleme yoluyla konsantre edilmesi veya spesifik antikorlarla agregasyonu yoluyla virüsün tespit edilme olasılığı artırılabilir. İkinci yöntem aynı zamanda virüslerin tanımlanması için de uygundur. Burada rotavirüs enfeksiyonunun teşhisi için elektron mikroskobik yöntemini ve parvovirüslere karşı spesifik antikorların saptanması örneğini kullanarak immünelektron mikroskobu yöntemini açıklayacağız. Elektron mikroskobu yöntemleri Field tarafından daha ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.
2.1 Dışkıların doğrudan elektron mikroskobik incelemesi
1. Pasteur pipetinin ucunu dışkıya batırın ve 1 cm'lik bir yayma elde etmeye yetecek kadar malzeme çekin.
2. Yarı saydam bir süspansiyon elde edilene kadar dışkı yaymasını elektron mikroskobik negatif kontrast boyasında yeniden süspanse edin. Negatif kontrast boya, damıtılmış su içinde% 2'lik bir fosfotungstik asit çözeltisidir.
3. Elektron mikroskobik bir numune elde etmek için, karbon-formvar film ile kaplanmış bir elektron mikroskobu ızgarasının üzerine bir damla süspansiyon yerleştirilir. Bu işlem sırasında ağ bir çift ince cımbızla tutulur.
4. İlaç 30 saniye boyunca havada bırakılır.
5. Camın kenarına filtre kağıdıyla dokunularak fazla sıvı alınır.
6. İlaç havada kurutulur.
7. Gerekirse ızgaranın her iki tarafı da 440.000 μW-s/cm2 şiddetindeki ultraviyole ışıkla ışınlanarak canlı virüs etkisiz hale getirilir. Bu durumda filtreli kısa dalga ultraviyole lamba kullanılır. Lamba ızgaradan 15 cm uzakta olmalıdır; Her iki taraf için ışınlama süresi 5 dakikadır.
8. Rotavirüs viryonları, 30.000 ila 50.000 büyütmeli bir transmisyon elektron mikroskobu altında karakterize edilebilir.
2.2 İmmünoelektron mikroskobu
Aşağıda açıklanan immünelektron mikroskobu yöntemi, birçok benzer immünolojik yöntemden yalnızca biridir. Virüse özgü antikorları incelemek için ek olarak, protein A'nın mikroskobik ağına bağlanmayı içeren bir yöntem kullanılır. Antiviral antikorların çalışma konsantrasyonu, 1/10 ila 1/1000 aralığında deneme yanılma yoluyla belirlenir. Belirttiğimiz konsantrasyon genellikle rutin çalışmalarda kullanılır. Antikorların virüsle etkileşiminde en iyi sonuçları elde etmek için parvovirüs içeren serum da aynı şekilde titre edilir.
1. 10 µl insan parvovirüs antiserumu PBS ile 100 kez seyreltilir. Çözelti bir su banyosunda 56°C'ye ısıtılır.
2. 10 ml %2 agarozu PBS içinde her zamanki gibi eritin ve bir su banyosunda 56 °C'ye soğutun.
3. 56 °C'de 1 ml seyreltilmiş antiserumu 1 ml %2 agaroz ile karıştırın.
4. Elde edilen karışımın 200 ul'sini 96 kuyucuklu bir mikrotitre plakasının iki kuyucuğuna aktarın.
5. Agarozun oda sıcaklığında sertleşmesine izin verilir. Tablet, yapışkan bantla kapatıldığı takdirde 4°C'de birkaç hafta saklanabilir.
6. Agaroz ve antiserum karışımı içeren bir kuyucuğa parvovirüs içeren 10 µl serum ekleyin.
7. Önceden hazırlanmış karbon-formvar kaplamalı bir elektron mikroskobu ızgarası, bir damla serumun daha az parlak tarafına yerleştirilir.
8. Ağ nemli bir odada 37°C'de 2 saat süreyle tutulur.
9. İnce cımbız kullanarak ağı çıkarın ve serumla temas eden ağ yüzeyine %2'lik bir fosfotungstik asit damlası uygulayın.
10. 30 saniye sonra fazla boya yıkanır, preparat kurutulur ve virüs etkisiz hale getirilir.
Toplanan viral parçacıklar, 30.000 ila 50.000 büyütmede bir transmisyon elektron mikroskobu altında incelenir.
3. Viral antijenlerin tanımlanması
Dokularda veya doku sıvılarında bulunan virüsler, antijen-antikor reaksiyonu kullanılarak virüse özgü proteinler kullanılarak tanımlanabilir. Antijen-antikor reaksiyonunun ürünü, doğrudan antiviral antikorlara veya virüse özgü antikorlara karşı yönlendirilen antikorlara yerleştirilen bir etikete karşı test edilir. Antikorlar floresan, radyoaktif iyot veya substratı parçalayarak renk değişikliğine neden olan bir enzim ile etiketlenebilir. Ayrıca virüsü tanımlamak için hemaglütinasyon reaksiyonundan yararlanılır. Günlük uygulamada, açıklanan yöntemler esas olarak kandaki hepatit B virüsü antijenlerini tespit etmek ve çeşitli solunum yolu hastalıklarına neden olan çeşitli virüslerin antijenlerini aramak için kullanılır.
Şu anda birçok şirket, hepatit B virüsünü tespit etmek için olanlar da dahil olmak üzere eritrosit, radyoaktif ve enzimatik teşhisler üretmektedir.Bu teşhislerle çalışma yöntemlerinin ana hatlarını çizmenin uygun olduğunu düşünmüyoruz: ekteki talimatları takip etmek yeterlidir. Aşağıda nazofaringeal sekresyonlarda solunum sinsityal virüsünü tanımlamak için immünofloresan yöntemine odaklanacağız.
3.1 Nazofaringeal sekresyonlarda solunum sinsityal virüsünün immünfloresan ile tanımlanması
Nazofaringeal salgıların preparatlarının elde edilmesine yönelik yöntem Gardner ve McQuillin tarafından açıklanmaktadır. Laboratuvar koşullarında bu işlem iki aşamada gerçekleştirilir. İlk olarak, bir cam slayt üzerinde nazofaringeal mukus lekesi hazırlanır. Ortaya çıkan smear'lar aylarca -20°C'de sabit olarak saklanabilir. İkinci aşamada, solunum sinsityal virüs antijenini tespit etmek için yaymalar boyanır. Bu amaçla dolaylı immünfloresan yöntemi kullanılır.
3.1.1 Nazofaringeal sekresyon preparatlarının hazırlanması
1. Özel forsepslerden gelen mukus 1-2 ml PBS ile yıkanır ve bir santrifüj tüpüne aktarılır.
2. Masa üstü santrifüjde 1500 rpm'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.
3. Süpernatan boşaltılır.
4. Hücre topağı, homojen bir süspansiyon elde edilene kadar 2-3 ml PBS içerisinde dikkatlice yeniden süspanse edilir. Bunu yapmak için geniş boyunlu bir Pasteur pipeti kullanın.
5. Ortaya çıkan süspansiyon bir test tüpüne aktarılır.
6. Süspansiyona 2-4 ml daha PBS ekleyin ve pipetleyerek karıştırın. Büyük mukus pıhtıları çıkarılır.
7. Masa üstü santrifüjde 1500 rpm'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.
8. Süpernatan atılır, çökelti öyle bir hacimde PBS içinde yeniden süspanse edilir, böylece elde edilen süspansiyon tüpün duvarlarından kolayca ayrılır.
9. Ortaya çıkan süspansiyon, işaretlenmiş bir cam slayta uygulanır.
10. Cam havada kurutulur.
4°C'de 10 dakika boyunca asetonda sabitleyin.
12. Sabitleme işleminden sonra cam tekrar havada kurutulur.
13. Elde edilen preparasyonlar hemen boyanır veya -20°C'de saklanır.
3.1.2. Boyama tekniği
1. Ticari RSV antiserumunu yazdırın ve PBS'de önerilen çalışma konsantrasyonuna kadar seyreltin.
2. Pasteur pipeti kullanarak hazırlanan preparasyona bir damla antiserum uygulayın.
3. İlaç nemli bir odaya yerleştirilir.
4. İlaç 37 °C'de 30 dakika süreyle inkübe edilir.
5. Numuneler özel bir rezervuarda fazla antikorları uzaklaştırmak için PBS ile dikkatlice yıkanır.
6. Numuneler, her biri 10 dakika olmak üzere üç PBS vardiyasında yıkanır.
7. Numuneleri kurutun, fazla PBS'yi filtre kağıdıyla çıkarın ve havayla kurutun.
