Lenfositlerin skl karışık kültürünün analizi. Karışık lenfosit kültürü

Her web geliştiricisinin veritabanı sorguları yazabilmesi için SQL bilmesi gerekir. Ve her ne kadar phpMyAdmin iptal edilmemiş olsa da, düşük seviyeli SQL yazmak için çoğu zaman ellerinizi kirletmeniz gerekir.

Bu yüzden SQL'in temellerine ilişkin kısa bir tur hazırladık. Başlayalım!

1. Bir tablo oluşturun

CREATE TABLE ifadesi tablo oluşturmak için kullanılır. Bağımsız değişkenler sütunların adlarının yanı sıra veri türleri olmalıdır.

adında basit bir tablo oluşturalım. ay. 3 sütundan oluşur:

• İD– Takvim yılındaki ay numarası (tamsayı).
• isim– Ay adı (dize, maksimum 10 karakter).
• günler– Bu aydaki gün sayısı (tamsayı).

Karşılık gelen SQL sorgusu şöyle görünecektir:

CREATE TABLE aylar (id int, name varchar(10), günler int);

Ayrıca tablo oluştururken sütunlardan biri için birincil anahtar eklemeniz önerilir. Bu, kayıtları benzersiz tutacak ve getirme isteklerini hızlandıracaktır. Bizim durumumuzda ayın adı benzersiz olsun (sütun isim)

CREATE TABLE aylar (id int, name varchar(10), günler int, PRIMARY KEY (name));

tarih ve saat

Veri tipi	Tanım
TARİH	Tarih değerleri
DATETIME	Tarih ve saat değerleri dakikasına kadar doğru
ZAMAN	Zaman değerleri

2. Satır ekleme

Şimdi tablomuzu dolduralım aylar kullanışlı bilgi. Bir tabloya kayıt eklemek INSERT deyimi kullanılarak yapılır. Bu talimatı yazmanın iki yolu vardır.

Birinci yöntem verilerin ekleneceği sütunların adlarını belirtmek değil, yalnızca değerleri belirtmektir.

Bu kayıt yöntemi basittir ancak güvensizdir çünkü proje genişledikçe ve tablo düzenlendikçe sütunların eskisi gibi aynı sırada olacağının garantisi yoktur. INSERT ifadesini yazmanın güvenli (ve aynı zamanda daha hantal) bir yolu, sütunların hem değerlerinin hem de sırasının belirtilmesini gerektirir:

İşte listedeki ilk değer DEĞERLER belirtilen ilk sütun adıyla vb. eşleşir.

3. Tablolardan veri çıkarma

SELECT ifadesi bizimdir en iyi arkadaş Veritabanından veri almak istediğimizde. Çok sık kullanıldığı için bu bölüme çok dikkat edin.

SELECT ifadesinin en basit kullanımı, bir tablodaki tüm sütunları ve satırları döndüren bir sorgudur (örneğin, ada göre tablolar) karakterler):

"Karakterler"DEN * SEÇİN

Yıldız (*) sembolü tüm sütunlardan veri almak istediğimiz anlamına gelir. SQL veritabanları genellikle birden fazla tablodan oluştuğu için belirtmek gerekir. anahtar kelime FROM ve ardından boşlukla ayrılmış tablo adı gelir.

Bazen bir tablodaki tüm sütunlardan veri almak istemeyiz. Bunu yapmak için yıldız işareti (*) yerine istenen sütunların adlarını virgülle ayırarak yazmalıyız.

Aydan itibaren kimlik ve adı SEÇİN

Ek olarak çoğu durumda ortaya çıkan sonuçların belirli bir sıraya göre sıralanmasını isteriz. SQL'de bunu ORDER BY kullanarak yaparız. İsteğe bağlı bir değiştiriciyi kabul edebilir - ASC (varsayılan) artan düzende sıralama veya DESC, azalan düzende sıralama:

Kimliği, adı SEÇİN aydan İTİBAREN ADINA GÖRE SIRALAMA

ORDER BY kullanırken, SELECT deyiminde en sonda geldiğinden emin olun. Aksi halde bir hata mesajı görüntülenecektir.

4. Veri filtreleme

SQL sorgusu kullanarak veritabanından belirli sütunları nasıl seçeceğinizi öğrendiniz, peki ya belirli satırları da almamız gerekirse? WHERE deyimi burada imdadımıza yetişiyor ve duruma göre verileri filtrelememize olanak tanıyor.

Bu sorguda tablodan sadece o ayları seçiyoruz ay Büyük (>) operatörünün kullanıldığı 30 günden fazla sürenin olduğu.

Kimlik SEÇİN, ad NEREDEN aydan itibaren gün > 30

5. Gelişmiş veri filtreleme. VE ve VEYA operatörleri

Daha önce tek bir kriter kullanarak veri filtrelemeyi kullanıyorduk. Daha karmaşık veri filtreleme için AND ve OR operatörlerini ve karşılaştırma operatörlerini (=,<,>,<=,>=,<>).

Burada tüm zamanların en çok satan dört albümünü içeren bir tablomuz var. Rock olarak sınıflandırılan ve 50 milyondan az kopya satanları seçelim. Bu, bu iki koşulun arasına bir AND operatörü yerleştirilerek kolayca yapılabilir.

SEÇİN * FROM albümler WHERE türü = "rock" VE sales_in_millions<= 50 ORDER BY released

6. İçinde/Arasında/Beğen

WHERE ayrıca birçok özel komutu da destekleyerek en sık kullanılan sorguları hızlı bir şekilde kontrol etmenize olanak tanır. İşte buradalar:

• IN – herhangi birinin karşılanabileceği bir dizi koşulu belirtmeye yarar
• BETWEEN – bir değerin belirtilen aralıkta olup olmadığını kontrol eder
• LIKE – belirli kalıpları arar

Örneğin, albümleri seçmek istiyorsak pop Ve ruh müzik için IN("value1","value2") kullanabiliriz.

SELECT * FROM albümler WHERE tür IN ("pop", "soul");

1975 ile 1985 yılları arasında çıkan tüm albümleri almak istiyorsak şunu yazmalıyız:

SELECT * 1975 VE 1985 ARASINDA NEREDE yayımlanan albümlerden;

7. İşlevler

SQL, her türlü yararlı şeyi yapan işlevlerle doludur. İşte en sık kullanılanlardan bazıları:

• COUNT() – satır sayısını döndürür
• SUM() - sayısal bir sütunun toplam toplamını döndürür
• AVG() - bir değer kümesinin ortalamasını döndürür
• MIN() / MAX() – Bir sütundan minimum/maksimum değeri alır

Tablomuzdaki en son yılı almak için aşağıdaki SQL sorgusunu yazmalıyız:

SELECT MAX(yayınlandı) FROM albümlerden;

8. Alt Sorgular

Önceki paragrafta verilerle basit hesaplamaların nasıl yapıldığını öğrendik. Bu hesaplamaların sonucunu kullanmak istersek iç içe sorgular olmadan yapamayız. Diyelim ki çıktı almak istiyoruz sanatçı, albüm Ve çıkış tarihi tablodaki en eski albüm için.

Bu belirli sütunları nasıl elde edeceğimizi biliyoruz:

SELECT sanatçı, albüm, yayımlanan FROM albümler;

Ayrıca en erken yılın nasıl alınacağını da biliyoruz:

SELECT MIN(yayınlandı) FROM albümden;

Şimdi gereken tek şey iki sorguyu WHERE kullanarak birleştirmektir:

SELECT sanatçı,albüm,çıkışlanan albümler NEREDE yayınlandı = (SELECT MIN(yayınlanan) FROM albümler);

9. Masaları birleştirmek

Daha karmaşık veritabanlarında birbiriyle ilişkili birden fazla tablo bulunur. Örneğin aşağıda video oyunlarıyla ilgili iki tablo bulunmaktadır ( video oyunları) ve video oyunu geliştiricileri ( game_developers).

Masada video oyunları bir geliştirici sütunu var ( geliştirici_id), ancak geliştiricinin adını değil, bir tam sayı içeriyor. Bu sayı tanımlayıcıyı temsil eder ( İD) oyun geliştiricileri tablosundan ilgili geliştiricinin ( game_developers), iki listeyi mantıksal olarak birbirine bağlayarak her ikisinde de saklanan bilgileri aynı anda kullanmamıza olanak tanır.

Oyunlar hakkında bilmemiz gereken her şeyi döndüren bir sorgu oluşturmak istiyorsak, her iki tablodaki sütunları birbirine bağlamak için INNER JOIN'i kullanabiliriz.

video_games.name, video_games.genre, game_developers.name, game_developers.country'yi video_games'DEN SEÇİN INNER JOIN game_developers ON video_games.developer_id = game_developers.id;

Bu en basit ve en yaygın JOIN türüdür. Başka seçenekler de var, ancak bunlar daha az yaygın olan durumlar için geçerlidir.

10. Takma Adlar

Önceki örneğe bakarsanız, adında iki sütun olduğunu fark edeceksiniz. isim. Bu kafa karıştırıcı, o yüzden yinelenen sütunlardan birine şöyle bir takma ad ayarlayalım: isim masadan game_developers Aranacak geliştirici.

Ayrıca tablo adlarına takma ad vererek sorguyu kısaltabiliriz: video oyunları Hadi arayalım oyunlar, game_developers - geliştiriciler:

games.name, games.genre, devs.name AS geliştiricisini, devs.country'yi video_games AS oyunlarından SEÇİN game_developers AS devs ON games.developer_id = devs.id;

11. Veri güncelleme

Çoğu zaman bazı satırlardaki verileri değiştirmemiz gerekir. SQL'de bu UPDATE ifadesi kullanılarak yapılır. UPDATE deyimi aşağıdakilerden oluşur:

• Değiştirme değerinin yer aldığı tablo;
• Sütun adları ve yeni değerleri;
• Güncellemek istediğimiz WHERE kullanılarak seçilen satırlar. Bu yapılmazsa tablodaki tüm satırlar değişecektir.

Aşağıda tablo var TV dizisi TV dizileri ve reytingleri ile. Ancak tabloya küçük bir hata girdi: Her ne kadar seri Game of Thrones ve bir komedi olarak tanımlanıyor, aslında değil. Hadi bunu düzeltelim!

Tablo verileri tv_series UPDATE tv_series SET tür = "drama" WHERE id = 2;

12. Verilerin silinmesi

SQL kullanarak bir tablo satırını silmek çok basit bir işlemdir. Tek yapmanız gereken silmek istediğiniz tabloyu ve satırı seçmek. Önceki örnekteki tablodaki son satırı silelim TV dizisi. Bu >DELETE komutu kullanılarak yapılır.

tv_series'DEN SİL WHERE id = 4

DELETE deyimini yazarken dikkatli olun ve WHERE deyiminin bulunduğundan emin olun, aksi takdirde tablodaki tüm satırlar silinecektir!

13. Bir tabloyu silin

Tüm satırları silmek ancak tablonun kendisini bırakmak istiyorsak TRUNCATE komutunu kullanın:

TRUNCATE TABLE tablo_adı;

Hem verileri hem de tablonun kendisini gerçekten silmek istediğimizde, DROP komutu bizim için yararlı olacaktır:

DROP TABLE tablo_adı;

Bu komutlara çok dikkat edin. İptal edilemezler!/p>

Bu, SQL eğitimimizi tamamlıyor! Ele almadığımız pek çok şey var, ancak zaten bildikleriniz, web kariyeriniz için size bazı pratik beceriler kazandırmaya yeterli olacaktır.

Farklı haplotiplerdeki MHC-II moleküllerine sahip lenfositlerin birlikte yetiştirilmesi, bunların patlama dönüşümüne ve çoğalmasına neden olur. Yanıt veren hücreler T lenfositlerine aittir ve B lenfositleri ve makrofajlar üzerinde bulunan yabancı MHC-II belirleyicileri tarafından uyarılır. Reaksiyonun gücü doku uyumluluk antijenleri arasındaki farkın derecesine bağlıdır. Bir bireyin bir MHC alelik varyantına karşı reaktivitesini değerlendirmek için tek yönlü bir lenfosit kültürü hazırlanır. Bunu yapmak için, uyarıcı hücreler mitomisin ile ön işleme tabi tutulur veya ışınlanırken, uyarıcı hücreler bölünme yeteneğini kaybeder ancak canlı kalır.

Karışık lenfosit kültüründeki reaktivite, değerlendirmedeki kriterlerden biridir hücresel bağışıklık. SCL şunları yapmanızı sağlar HLA yazarak, doku ve organ nakilleri için bir donör-alıcı çifti seçin ve HLA antijenleri ile belirli hastalıklar arasında bir korelasyon kurun.

Reaksiyonun aşamalandırılması için hastaların (donör ve alıcı) kanından izole edilen bir lenfosit süspansiyonu kullanılır. Yıkanan yanıt veren hücreler, az miktarda ortam 199 (0,5 mi) içinde süspanse edilir ve hücrelerin sayısı sayıldıktan sonra 0,6 x 106 hücre/ml'ye ayarlanır. Uyarıcı hücrelerin bir süspansiyonu, 1 ml süspansiyon başına 0,1 ml oranında bir mitomisin C çözeltisinin (1 ml tamponlu salinde 500 μg mitomisin C) eklenmesiyle benzer şekilde hazırlanacaktır. Hücre karışımı, bir su banyosunda 37°C'de 40 dakika boyunca karıştırılarak inkübe edilir, daha sonra süspansiyona soğuk ortam 199 eklenir ve hücreler, santrifüjleme yoluyla üç kez yıkanır. Tortu askıya alınır besin ortamı yetiştirme, hücre sayısını 0,6 x 106 hücre/ml'ye getirme.

Steril yuvarlak tabanlı bir immünolojik plakanın oyuklarına Hanks çözeltisi içindeki 0,1 ml hücre süspansiyonu ilave edilir ve MHC alelik varyantlarını taşıyan 0,1 ml hücre süspansiyonu ilave edilir. Kontrole aynı miktarda Hanks çözeltisi eklenir.

Sonuçlar, morfolojik veya izotop yöntemi kullanılarak reaksiyon kurulumuna bağlı olarak hücrelerin 37 °C'de 3-5 gün inkübe edilmesinden sonra kaydedilir (bkz. RBTL).

Transplantasyon sırasında kemik iliği Doku uyumlu bir donörün seçimi, donör ve alıcının HLA tiplemesinin sonuçlarına ve ayrıca uyumluluk değerlendirmesinin son aşaması olan SCL'de seçilen HLA-özdeş donör-alıcı çiftlerinin uyumluluğunun belirlenmesine göre gerçekleştirilir. Bu amaçla, çoğalan lenfositlerin DNA'sına radyoaktif H3-timidin dahil edilmesiyle çoğalma miktarının değerlendirilmesi ile 96 oyuklu bir plakada kültürel bir mikro yöntem kullanılarak çift yönlü bir SCL reaksiyonu kullanılır.

Şu anda rolün araştırılmasına büyük önem verilmektedir. bağışıklık mekanizmalarıüreme sürecinde, ihlalleri kısırlığın gelişmesine ve hamileliğin erken sonlandırılmasına yol açtığından. İmmünolojik parametreler ve bunların birbirleriyle olan ilişkileri üzerine çalışmalar üreme süreçleri yeniden yapılanmanın gerekli olduğu sonucuna varmamızı sağladı bağışıklık sistemi Annenin vücudunu hamilelik için hazırlarken, Yumurtlama dönemi Embriyo implantasyonu sırasında ve erken periyot gebelik.

Kısırlığın ve tekrarlayan spontan düşüklerin en karmaşık ve teşhis edilmesi zor nedenlerinden biri bağışıklık fonksiyon bozukluğudur.

Amacıyla zamanında tespitİmmünolojik infertilite muayenesi üreme immünolojisi laboratuvarında yapılır. evli çiftler kullanarak aşağıdaki yöntemler teşhis:

• Bir kadının lenfositlerinin partnerin antijenlerine proliferatif tepki düzeyinin incelenmesi (karışık bir lenfosit kültüründe)
• Bir kadının kan serumundaki bloke edici faktörlerin aktivitesinin belirlenmesi.
• doğal sitotoksik hücrelerin alt popülasyonlarının kantitatif içeriğinin değerlendirilmesi Periferik kan kadınlar.
• genişletilmiş immünogram
• Periferik kanda baskılayıcı aktiviteye sahip düzenleyici hücrelerin içeriğinin incelenmesi.
• Klinik tanımlarken ve laboratuvar işaretleri Kısırlık hastalarının immünolojik muayeneden geçmesi önerilir tıbbi prosedür– bireysel bir programa uygun olarak gerçekleştirilen, kocanın lenfositleriyle alloimmünizasyon.

Konsültasyon gerekli:

• jinekolojik yokluğunda ve endokrin hastalıkları Bir yıl boyunca düzenli cinsel aktivite ile hamilelik olmaz.
• Hamileliğin tekrarlanan (birden fazla) kendiliğinden sonlandırılması (düşük) durumunda.
• en başarısız IVF anamnezde.
• gerçek bir hamileliğin sonlandırılması tehdidi olduğunda.

Bozukluklar tespit edilirse, bozuklukların immüno-düzeltilmesi amacıyla bir prosedür reçete edilir partner lenfositlerle alloimmünizasyon (AIL). Bu method kullanım için onaylanmış tedavi Federal hizmet sağlık alanında denetim için (07/02/2009 tarihli FS No. 2009/179 lisansı)

Prosedür yalnızca partnerin sahip olması durumunda gerçekleştirilir. olumsuz sonuçlar HIV enfeksiyonu, frengi analizi ve viral hepatit(M.Ö). AIL'de herhangi bir komplikasyon tespit edilmedi. AIL yöntemi belirgin bir immüno-düzeltici etkiye sahiptir, kısırlık tedavisinin etkinliğini arttırır. doğal döngü, Ve birlikte tüp bebek(EKO). Ayrıca in vitro fertilizasyondaki başarısız girişimler için de reçete edilir.

AIL her 28-30 günde bir gerçekleştirilir (uygun olarak adet döngüsü Kadınlar) döngünün 1. aşamasında. İlk kurs 3 AIL prosedürünü içerir. 2. işlemden sonra çift tekrar kontrol testi yaptırır. Olumlu bir dinamik varsa üçüncü AIL prosedürü sonuncudur. Dinamik yoksa immünizasyon için hücre dozu artırılır ve 2 prosedür içeren 2. kurs gerçekleştirilir. Kontrol analizinden sonra, bazı durumlarda hücre dozunun arttırılmasıyla 3. bir aşılama kürünün reçete edilmesi gerekebilir. Standart değerlere ulaşıldıktan sonra olumlu etki 6-8 ay kadar sürer.

2003'ten 2013'e kadar olan dönem için. Hücresel immünoterapi laboratuvarında partner lenfositlerle yaklaşık 3000 alloimmünizasyon işlemi gerçekleştirildi. Bu işlem için partnerin kanından sadece lenfositler izole edilir ve bunlar her zaman meni sıvısında bulunur. Diğer ülkelerde*, bir kadının sağlıklı bir çocuk taşımasına ve doğurmasına yardımcı olan alloimmünizasyon prosedürü de 20 yıldır uygulanmaktadır.

Servis tipi	fiyat, ovmak.
Lenfosit transformasyon testi (1. Yüzyılda duyarlılığın tespiti)	1650
Lenfosit transformasyon testi (2b-va'da duyarlılığın tespiti)	2 900
Lenfosit transformasyon testi (3b-va'da duyarlılığın tespiti)	3 900
Lenfosit transformasyon testi (kısırlık için immünolojik inceleme)	3 200
Aktivasyon belirteçleriyle genişletilmiş immünogram	4 625
Bağışıklık durumunun kapsamlı çalışması	4 125
Aşılama (eşin lenfositleriyle alloimmünizasyon 1 doz)	1 900
Aşılama (eşin lenfositleriyle alloimmunizasyon, 2. doz)	2 750
Aşılama (eşin lenfositleriyle alloimmunizasyon, 3. doz)	3 400
CD16+/CD56+ lenfositlerin incelenmesi (kısırlığa yönelik immünolojik inceleme yalnızca NK hücreleri)	1 250
Makrofaj aktivitesinin incelenmesi (şartlandırılmış makrofaj ortamı)	9 400
Makrofaj aktivitesinin incelenmesi (şartlandırılmış ortam)	1 500
Alloimmünizasyon için mononükleer hücrelerin dondurularak saklanması	650

2.2. Hücre etkileşimi yöntemleri

Klinik immünogenetikte kullanılan hemen hemen tüm hücre etkileşimi yöntemleri, Kanadalı araştırmacı Barbara Bain tarafından keşfedilen karışık lenfosit kültüründe patlama oluşumu olgusuna dayanmaktadır. Karışık bir lenfosit kültürünün (MLC) reaksiyonu, HLA kompleksi ve özellikle onun alt birimlerinden biri olan HLA-D lokusu hakkında ince farklılaştırılmış bir çalışmanın gerçekleştirilmesini mümkün kıldı. Hücre etkileşimlerinin bir dizi başka yöntemi - hücre aracılı lenfoliz (CML), lenfosit hazırlama testi (Hazırlanmış Lenfosit Tiplemesi) - MLC yöntemini temel alır veya onu ayrılmaz bir parça olarak içerir.

2.2.1. Karışık Lenfosit Kültürü (MCL)

Yöntemin prensibi Şekil 2'de gösterilmektedir. Buradan genetik olarak farklı iki lenfosit popülasyonunun in vitro kültürde birbirleriyle etkileşime girdiği açıktır. Popülasyonlardan biri mitomisin C ile tedavi edilir veya ışınlanır, bunun sonucunda patlama oluşturma ve timidin (3 HT) içerme yeteneğini kaybeder, ancak antijenik özelliklerini kaybetmeden uyarma yeteneğini korur (uyarıcılar; S) -nüfus).

Stimülasyona yanıt veren hücreler (yanıt verenler, R popülasyonu) birkaç gün sonra patlamalara dönüşür ve kültüre eklenen timidin içerir. Reaksiyonun yoğunluğu,3H-timidin eklenmesi için bir radyasyon izleyici kullanılarak ölçülür.

Karışık bir lenfosit kültürünün reaksiyonunun çeşitli varyantları bilinmektedir; bunlardan ikisi burada önerilmektedir: Cook tabletlerinde uygulanan geleneksel ve mikro varyant (Şekil 11).

Pirinç. 11. MLC ve CML mikro varyantları için ekipman. 1 - 96 delikli yuvarlak tabanlı tablet; Farklı hacimler için bir programa sahip 2-otomatik pipet (“Pipetman”); 3 - belirli bir hacim için otomatik pipet ("Sigma"); 4 - tek kullanımlık pipet ucu; 5 - laminer akış kutusu

MLC'nin geleneksel versiyonu (F. S. Baranova tarafından yapılan değişiklik):

Lenfositler yukarıda açıklandığı gibi bir Ficoll-ürografin gradyanı üzerinde izole edilir. İlk yıkama PBS'de gerçekleştirilir (NaCl - 8,0 g, Na2HP0 4 - 1,15 g, KH2P04 - 0,2 g, KC1 - 1 litre H20 başına 0,2 g); sonraki ikisi %5 AB serumu içeren ortam 199'da üretilir (15 donörden alınan havuz);

Yanıt veren hücreler, %10 AB serumu içeren ortam 199'da yeniden süspanse edilir ve hücre konsantrasyonu, ml başına 0.6 x 106'ya ayarlanır;

Aynı şekilde 1 ml başına 5 - 106 konsantrasyonda izole edilen uyarıcı hücreler, Serva'dan alınan mitomisin C (60 y/ml) ile işleme tabi tutulur ve bir su banyosunda 37°C'de 40 dakika süreyle inkübe edilir. İnkübasyondan sonra hücreler, %5 AB serumu içeren ortam 199 ile 3 kez yıkanır, %10 AB serumu içeren ortam 199'da yeniden süspanse edilir, konsantrasyon 1 ml'de 0.6 x 106'ya getirilir;

0,5 ml tepki veren hücre ve 0,5 ml uyarıcı hücre bir santrifüj tüpünde karıştırılır, 0,04 ml 10 ml Hepes çözeltisi (Serva) eklenir ve 144 saat süreyle inkübe edilir; deneyim üç paralele (üçlü) yerleştirilmiştir;

İnkübasyonun bitiminden 24 saat önce, numune başına test tüplerine 3 H-timidin 1μCi (3,7x10 4 BC) ekleyin spesifik aktivite 5mCi/mmol (18.5x107 BC/mmol) ve inkübasyona devam edin;

İnkübasyon sonunda hücreler milipor filtrelere (0,6 - 0,9 mikron) aktarılır ve yıkanır. tuzlu su çözeltisi(37°C) ve soğutulmuş %5 trikloroasetik asit çözeltisi (4°C). Filtreler kurutulur ve 5 ml sintilasyon sıvısı (1 litre tolüen başına 5 g PPO ve 0,5 g POPOP) içeren şişelere yerleştirilir. 3H-timidin katılma etkinliği bir p-sayacında ölçülür; sonuç, aşağıdaki formüle göre 1 dakikadaki radyoaktif etiketin mutlak kapanımları veya stimülasyon indeksi (SI) cinsinden ifade edilir:

* (PPO - 2,5-fenol-oksazol; POPOR-(1,4-di-2-15-fenoloksazolitbenzen).)

Üç prototipte ortalama BGBM değeri

SI = Üç kontrol örneğindeki ortalama CPM değeri/Yanıt veren hücrelerin spontan kültürleri, kontrol örnekleri olarak görev yapar.

Cook tabletlerindeki MLC'nin mikro versiyonu. 8. Çalıştayda, MLC'nin mikro seçeneğini standartlaştıran gereksinimler geliştirildi ve buna göre aşağıda belirtildi:

Lenfositler bir izopak-ficoll gradyanında izole edilir ve RPMJ-1640* ortamında yeniden süspanse edilir, konsantrasyon 1 ml'de 5x105'e getirilir;

* (AB grubu insan serumu (birkaç kişiden alınan %5 serum) ile karıştırılmış Ortam 199 kullanılabilir.)

Stimülatör hücreler mitomisin C veya eğitim ile tedavi edilir;

5x104 yanıtlayıcı ve aynı sayıda uyarıcı, Pipetman tipi bir mikropipet kullanılarak Cook yuvarlak tabanlı mikroplakanın her bir oyuğuna yerleştirilir;

Plakalar, 120 saat boyunca otomatik %5 CO2 beslemeli bir termostatta inkübe edilir; daha sonra her bir oyuğa spesifik bir timidin 6 Ci/mmol aktivitesinde 1μmCi3H-timidin eklenir; tüm manipülasyonlar bir Pipetman pipeti ile gerçekleştirilir;

Timidin ilave edildikten 16 saat sonra, her bir kuyucuktan gelen kültürler, otomatik bir pipet kullanılarak mili gözenekli filtrelere aktarılır ve salinle ve ardından %5 trikloroasetik asitle yıkanır; kültürü millipor filtrelere aktarmak için özel "biçerdöverler" kullanmak uygundur;

Timidin katılma aktivitesi yukarıda anlatıldığı gibi belirlendi.

2.2.2. Hücre aracılı lenfoliz (KML)

KML immünogenetik çalışmalarda nispeten yakın zamanda (1972'den beri) kullanılmıştır, ancak Son zamanlarda giderek daha fazla hale geliyor popüler teknoloji Transplantasyon bağışıklığının eferent bağlantısının rolünün ayrıntılı bir şekilde incelenmesine olanak tanır ve şu şekilde tanınır: bilgilendirici yöntem immünolojik izleme. Yöntemin prensibi Şekil 2'de gösterilmektedir. 12. Yöntem, J. Lightbody (1971) tarafından önerilen ve aşağıda kısaca özetlenen tekniğe dayanmaktadır.

1. CML, yanıt veren hücrelerin "uyarıcıları" tanıdığı, yanıt veren hücreleri duyarlı hale getirdiği ve duyarlı öldürücü hücreler oluşturduğu geleneksel bir HLC testiyle başlar.

2. Duyarlılaştırılmış öldürücü hücrelerin 51 Cr etiketli hedef hücrelerle karıştığı ikinci aşama, ikincisinin efektör öldürücü hücreler tarafından yok edilmesini içerir; Hedef hücreler, MLC'nin ilk aşamasındaki "uyarıcılar" ile aynı genotipe sahip olabilir veya bunlar, "uyarıcılar" için ortak olan veya bunlar olmayan antijenik belirleyicilerle donatılmış "üçüncü" bir partnerin hücreleri olabilir.

3. Yok edilen hedef hücrelerden salınan ve kültür ortamına salınan radyoaktif krom miktarı, öldürücü etkinin yoğunluğunun bir ölçüsü olarak hizmet eder.

Pirinç. 12. Hücre aracılı lenfolizin (CML) prensibi. Sıra I - yanıt veren hücrelerin hassaslaşması, öldürücü hücrelerin oluşumu; Satır II - katillerin hedefle etkileşimi; Satır III - hedef hücrenin imhası; verim 51 Cr kültür ortamı

Burada CML'nin üç çeşidi açıklanmaktadır: L.P. Alekseev (1979) tarafından değiştirilen geleneksel versiyon, Cook tabletlerindeki mikro değişken, doğrudan CML (Direct-CML -D-CML.

Geleneksel seçenek[Alekseev L.P., 1979].

Yöntem birkaç aşamaya ayrılmıştır.

Kiralık katil almak:

Her iki popülasyonun (R hücreleri ve S hücreleri) periferik lenfositleri olağan şekilde izole edilir, %5 AB serumu (10 dakika, 150 g) ile ortam 199'da yoğunluk gradyanında üç kez yıkanır;

1x106 R hücreleri (0,8 mi), mitomisin C ile işlenen ve 37°C'de 144 saat boyunca inkübe edilen 2x106 S hücreleri (0,2 mi) ile santrifüj tüplerinde karıştırılır;

Hücreler 150 g'de 10 dakika süreyle santrifüjlenir ve çökelti, %20 buzağı serumu (ortam 199 + yani) eklenerek ortam 199'da yeniden süspanse edilir ve konsantrasyon 1 ml'de 1x106'ya getirilir;

Örneklerden biri MLC seviyesini incelemek için bırakılır, geri kalanı hazır katil olarak kullanılır.

Hedef alma:

Olağan şekilde izole edilen lenfositler, %20 AB serumu içeren ortam 199'da yeniden süspanse edilir ve fitohemaglutinin (0.003 mg/ml Wellcome) ile 37°C'de 72 saat süreyle inkübe edilir; 1 ml'de hücre konsantrasyonu 1x106;

Hücreler 10 dakika boyunca 150 g'de santrifüje tabi tutulur, çökelti %5 AB serumu ile ortam 199'da yeniden süspanse edilir ve hücre konsantrasyonu 1 ml'de 2x104'e ayarlanır;

Süspansiyona 51 Cr 100 uCi/ml (3.7x106 BC/ml) eklenir ve 37°C'de 40 dakika süreyle inkübe edilir;

Hücreler, %5 AB serumu (150 g, 10 dakika) eklenerek ortam 199'da üç kez yıkanır ve çökelti, %5 AB serumu ile ortam 199'da yeniden süspanse edilir. konsantrasyonun 1 ml'de 2x10 4'e getirilmesi.

Reaksiyonları ayarlama:

5x105 katil (0,5 mi), 1x104 hedef (0,5 mi) ile karıştırılır, 4 saat süreyle (37°C) inkübe edilir ve 150 g'de 10 dakika süreyle santrifüjlenir;

Süpernatan aspire edilir ve 51Cr'nin neden olduğu darbe bir sayaçta sayılır; sayma 0,5 ml süpernatan içinde gerçekleştirilir;

Sitoliz düzeyi aşağıdaki formül kullanılarak hesaplanır:

Ekper. çıkış 51 Cr - anlık çıkış 51 Cr/maks, çıkış 51 Cr - anlık çıkış 41 Cr × 100.

Kendiliğinden krom salınımı, öldürücü hücreler olmadan 4 saat (37°C) inkübe edilen hedefler üzerinde ölçülür; maksimum krom verimi - donma ve çözülme nedeniyle tamamen yok edilen hedeflerde; Tüm testler üçlü olarak gerçekleştirilir.

Tabletlerdeki CML'nin mikro çeşidi [Mawas S., 1976'ya göre]:

Öldürücülerin elde edilmesi aşaması, yuvarlak dipli plakalarda MLC olarak gerçekleştirilir, ancak R- ve S-hücreleri, her bir kuyucuğa 2x105 pa olmak üzere eşit miktarlarda karıştırılır ve 37°C'de inkübe edilir;

5 gün sonra hücreler Pasteur pipeti ile bir test tüpüne toplanır, tripan mavisi ile canlıların sayısı sayılır ve konsantrasyon 1 ml'de 10x106'ya ayarlanır;

Hedef hücreler 3 gün boyunca PHA ile kültürlenir;

Reaksiyon gününde hedef hücreler yıkanır (300 g) ve bir kültür ortamında yeniden süspanse edilir, 1 ml test tüplerine dağıtılır ve 1 ml'de 1x106'ya ayarlanır;

Hedef hücrelerin bulunduğu her tüpe 200 μCi51 Cr (7,4x106 BC) ekleyin ve 37°C'de 1 saat inkübe edin; hücreleri 3 kez yıkayın; çökelti yeniden süspanse edilir ve 1 ml'de (canlı) 1x10 konsantrasyonuna ayarlanır;

Test, yuvarlak tabanlı mikroplakalarda uygulanır; bunun için her kuyucuğa 0,7 - 1x106 öldürücü hücre (0,1 mi) ve 1x104 hedef hücre (0,1 mi) dağıtılır; her bir kuyucuktaki süspansiyonun toplam hacmi 0,2 ml'dir, her bir kuyucuğa 0,05 ml ortam ekleyin ve 4 saat boyunca (37°C) inkübe edin;

Plakalar 10 dakika boyunca bir Beckman santrifüjünde 800 g'de santrifüjlendi; her kuyucuktan gelen süpernatan test tüplerine aktarılır ve bir γ sayacında sayılır;

Öldürücü hücrelerin (MLC) üretim aşaması, %20 insan plazmasının eklenmesiyle RPMJ-1640 ortamında gerçekleştirilir; öldürme aşaması için, önceden ısıtılmış %20 insan plazması ilavesiyle MEM ortamını kullanın.

Doğrudan CML (D-CML). Doğrudan CML, immünolojik izlemede kullanım alanı bulmuş, klinik amaçlar için özel olarak geliştirilmiş bir tekniktir. Bu reaksiyonun şeması Şekil 2'de gösterilmektedir. 13.

Geleneksel KML'den temel fark, öldürücü hücre oluşumu aşamasının (duyarlılaşma aşaması) in vitro değil in vivo, yani allojenik bir organ veya dokunun transplantasyonuyla duyarlı hale getirilmiş insan vücudunda gerçekleşmesidir. Allojeneik dokunun etkisi nedeniyle alıcının lenfositleri, donörün doku antijenlerine karşı duyarlı hale gelir ve in vitro özel bir tedavi gerektirmez; yalnızca hedeflerin ilk önce hazırlanması gerektiğinden testin süresi zaman içinde önemli ölçüde kısalır.

Kullanılan hedefler, periferik kandan veya daha sık olarak donörün dalağından (bkz. 2.1.2) elde edilen ve yukarıda açıklanan yöntemlerden herhangi biri (bkz. 2.1.3) kullanılarak dondurulmuş lenfositlerdir.

2.2.3. Antikora bağımlı hücre aracılı Sitotoksisite (ADCC)

Bu tip hücresel yanıt, etki mekanizması açısından yukarıda açıklanan CML'ye benzer. Reaksiyon prensibi Şekil 2'de gösterilmektedir. 14. Reaksiyonun bileşenleri, hedef hücreler (donör hücreler veya allojenik lenfositler), muhtemelen hedef hücrelerin belirleyicilerine yönelik antikorları içeren serum (alojeneik veya alıcı) ve efektör hücrelerdir (alıcı lenfositler veya allojenik lenfositler).

Bu tür etkileşimdeki efektör hücreler, periferik kanda bulunan K hücreleri olarak adlandırılan hücrelerdir. KML'deki öldürücü hücrelerin aksine, önceden duyarlılaşma olmadan sitotoksik etki gösterirler, ancak K hücrelerinin sitotoksik etkisinin ortaya çıkması yalnızca hedef hücrelerin belirleyicilerine yönelik antikorlar yoluyla mümkündür. Spesifik lizis, test serumunun hedef belirleyicilere karşı antikorlar içermesi durumunda51Cr salınımıyla ölçülür.

ADCC'deki hedef belirleyiciler pratik olarak HLA-D, HLA-DR dahil olmak üzere tüm HLA lokuslarının özgüllüklerinin yanı sıra HLA sisteminin dışında yer alan belirleyiciler de olabilir.

En yaygın Bu karmaşık reaksiyon, B hücresi antikorlarını tespit etmek için immünolojik izleme sırasında elde edildi. Bu bağlamda, hedef hücre süspansiyonunun B lenfositleri ile zenginleştirilmesini, serumun trombositlere adsorbsiyonunu vb. sağlayan çeşitli modifikasyonlar önerilmiştir.

Ek olarak, bu sistemdeki bir dizi başka yanıt özelliği de dikkate alınır. Test serumu dekomplemante edilmelidir, aksi takdirde reaksiyon antikor aracılı kompleman bağımlı sitotoksisite olabilir. Ayrıca efektör hücrelerin, CML tipine göre hedeflerin belirli bir tahribatına neden olabileceği varsayılmaktadır.

Sonuçta antikora bağımlı hücre aracılı lenfositotoksisite testindeki numunelerin tamamı aşağıdaki gibidir:

Hedefler + efektörler + test serumu (deneysel numune);

Hedefler (kontrol numunesi, yani 51Cr'nin spontan salınımı);

Hedefler + efektörler (efektör aktivitesi için kontrol testi);

Hedefler + test serumu (serum kontrolü).

Lenfositler rutin olarak izole edildi ve RPMI-1640 + %10 fetal sığır serumu içerisinde yeniden süspanse edildi; monositlerin uzaklaştırılması için süspansiyonun karbonil demir ile işlenmesi; kalan kırmızı kan hücrelerini parçalamak için amonyum klorür veya H20 ekleyin;

Hedef hücre süspansiyonuna 100 - 200 uCi ml (3,7x106 - 7,4x106 BC/ml) Na2CrO4 çözeltisi formundaki 51Cr eklenir ve 40 - 60 dakika inkübe edilir;

Hücreler RPMI + %0.1 HSA'da üç kez yıkanır, aynı ortamda yeniden süspanse edilir ve 1 ml'de 2x108'e ayarlanır; 50 ul etiketli hücre süspansiyonu bir test tüpüne yerleştirilir ve izotop aktivitesi daha sonra tam izotopik "asimilasyonu" tanımlamak için bir y-sayacı üzerinde hesaplanır; geri kalanı plakanın oyuklarına dökülür, 50 ul süspansiyon (oyuk başına 1x105 hücre);

Efektör hücrelerin süspansiyonu 1 ml'de 2x107 hücreye getirilir ve c. her kuyucuk 50 ul süspansiyon (veya 100 ul) ile doldurulur, efektörlerin hedeflere oranı 10:1'dir (veya 20:1);

İnkübasyon %5 CO2 içeren nemli termostat atmosferinde 4 saat devam eder (inkübasyon süresi 8 saate kadar uzatılabilir);

Test tüplerinde (1:25; 1:100) test serumunun birkaç seyreltisini hazırlayın ve kuyucuklara her seyreltmeden 50 µl'ye kadar ekleyin: ve seyreltilmemiş serum; son test kurulumu tabloda gösterildiği gibi görünür. 23.

Tablo 23

ADCC evrelemesi. Tüm numune seçenekleri, µl

* (Test serumu yerine AB serumlarından oluşan bir havuz aşılanır.)

** (Test serumu yerine hedeflere (efektörlere değil) yönelik monospesifik bir HLA serumu aşılanır.)

Panellerin inkübasyonu %4 CO2 ile nemlendirilmiş bir atmosferde 4 saat devam eder; kuluçka süresi 8 saate kadar uzatılabilir;

İnkübasyondan sonra, her bir kuyucuğun hacminin yarısı (100 ul) otomatik bir pipetle dikkatlice aspire edilir ve 51 Cr nabız sayma tüplerine yerleştirilir; aktivite bir γ sayacında sayılır;

Hesaplamalar aşağıdaki gibidir:

51 Cr salınımı yüzdesi = 2 × A op - arka plan etkinliği/B - arka plan etkinliği × 100;

% sitotoksisite = A op - A sp /100 - A sp × 100, burada A op, deneysel numunelerde 51 Cr'nin % salımıdır; A sp - % spontan salınım; B - izotopun tam asimilasyonu.

Nasıl olumlu sonuç 4 saatlik inkübasyondan sonra %5 veya daha yüksek sitotoksisite kabul edilir.