Reacții serologice. reacție de precipitare

Acest articol va fi dedicat fenomenului reacției de precipitare. Aici vom lua în considerare trăsăturile formulării acestui fenomen, fenomenul de difuzie, caracteristicile generale, rolul în viața umană și multe altele.

Cunoașterea fenomenului

Precipitația este un fenomen de tip serologic, în timpul căruia antigenele solubile interacționează cu anticorpii și, ca urmare, se observă precipitare - precipita.
Caracteristica generală a reacției de precipitare este o formă de influență coordonată a antigenului și a anticorpului. Aceste tipuri de interacțiuni fac posibilă determinarea prezenței antigenelor necunoscute în substanța de testat prin adăugarea de anticorpi și antigeni cunoscuți. Procesul de precipitare fără prezența sărurilor va continua mai rău, iar cel mai bun optim se află în intervalul 7,0-7,4 pH.

Constituenții unei reacții

Printre componentele reacției de precipitare, există trei elemente principale:

1. Un antigen de natură moleculară. Este în stare de tip fin, cu alte cuvinte, este solubil. De asemenea, un astfel de antigen se numește precipitogen, care este un lizat sau extract de țesut etc. Un precipitogen are o diferență caracteristică față de un aglutinogen, care constă în dimensiunea particulelor din care constă. Aglutinogenul are o dimensiune celulară inerentă, iar precipitații sunt proporționali cu dimensiunea moleculei. Soluția de antigen se caracterizează prin transparență.
2. Un anticorp găsit în serul de sânge uman, precum și în serul de diagnostic imun, care conține anticorpii studiați.
3. Electroliții sunt o soluție de clorură de sodiu, care se caracterizează printr-o stare izotonă.

Prepararea precipitatogenului

Configurarea unei reacții de precipitare este imposibilă fără un precipitatogen, care este obținut prin măcinarea materialelor și extragerea antigenelor proteice din acestea. Extracția are loc prin fierbere sau prin alte metode.
Un exemplu izbitor de precipitatogeni sunt lizatele, precum și extractele de țesuturi și organe, serul sanguin, diferite tipuri de filtrate pe bază de culturi microbiene în bulion, precum și extractele sărate ale microorganismelor și substanțe autolizate.

Stadionarea precipitațiilor

Acum luați în considerare metoda de stabilire a reacției de precipitare.
Se efectuează o reacție de precipitare inelă, care are loc în eprubete special pregătite. Serul se introduce în cavitatea vaselor, turnându-l peste perete cu ajutorul unei pipete. Apoi, cantitatea adecvată de precipitator este stratificată cu grijă deasupra, iar apoi tubul este adus într-o poziție verticală de la una orizontală. Stabilirea și luarea în considerare a reacției de precipitare este o operație foarte meticuloasă. Rezultatul este înregistrat după apariția unui inel alb la granița dintre antigen și anticorp. Dacă elementele de reacție ale reacției corespund între ele, atunci ele sunt conectate, dar acest lucru devine vizibil după o perioadă lungă de timp de interacțiune.
Reacția de precipitare se realizează și într-o cutie Petri sau pe o lamă de sticlă, unde se transferă gelul de agar, aplicându-l într-un strat mic. După ce se întărește în gel, se decupează un număr mic de godeuri în care vor fi plasați antigeni și anticorpi. Există două modalități de a efectua această acțiune: metoda imunodifuziei radiale și imunodifuziei duble.

Informatii generale

Mecanica de funcționare a precipitației este similară cu cea a dispozitivului de aglutinare. Sub influența serului de tip imun, antigenul care a reacționat deja își reduce pe al său.O condiție importantă este transparența atât a serului, cât și a antigenului.
Este posibil să se îmbunătățească înregistrarea reacției dacă antigenele sunt suprapuse anticorpilor. Ca urmare, se poate observa apariția precipitatelor sub formă de inel. Acest fenomen se numește precipitare inelară și se realizează în tuburi speciale cu un diametru de 2,5 până la 3,5 mm. Unul dintre cele mai răspândite exemple de reacție de precipitare este diagnosticul de antrax.
Precipitația face posibilă determinarea nivelului de toxicitate al culturii de difterie în agar.
În cursul reacției luate în considerare, complexele antigenice și anticorpii sunt precipitate. Precipitația este un fenomen imunologic care vă permite să determinați cantitatea de anticorpi din serul sanguin al unei persoane bolnave sau vaccinate și al animalelor.

Consecința titrarii

Este important de știut că datele obținute prin titrarea metodei menționate mai sus nu sunt cuantificabile. Pentru a crea și analiza o evaluare cantitativă a numărului de anticorpi conținut, a fost dezvoltată o tehnică specială de reacție de către M. Heidelberger și E. Kabat, care se bazează pe căutarea și identificarea zonei de echivalență. Amestecarea numărului de vârstă al antigenelor cu un volum constant de antiser duce la o creștere a precipitatului format inițial, iar apoi scade din nou datorită creșterii capacității de a dizolva complexele antigene. Prin determinarea cantității de anticorpi din supernatanții conținute în fiecare tub, puteți constata că unui anumit număr de vase cu anticorpi vor lipsi lichid. Aici, în comparație cu alte eprubete, se va forma cel mai mare precipitat. Datorită acestui fapt și scăderii precipitatului proteic antigenic din valoarea totală a proteinelor, este posibil să se obțină valoarea exactă a anticorpilor conținuti în volumul serului studiat special. Mai mult, cantitatea de molecule proteice din precipitat este determinată de cantitatea de azot sau prin metode colorimetrice.

Estimarea valorilor

Evaluarea valorilor precipitațiilor în metodologia de diagnostic ar trebui să țină cont de posibilitatea prezenței în serul imun a unui anticorp care nu are proprietatea precipitinei, din care rezultă că precipitatul în sine nu se poate forma după reacția cu antigene. Lista acestor molecule include anticorpi incompleti și unele specii din grupul globulinelor gamma-A.

Reacția de precipitare în condiții de laborator își găsește aplicarea în diferite tipuri de modificări. De exemplu, reacția de termoprecipitare este utilizată pentru a detecta antigenele bacteriene de botulism, antrax etc., care nu suferă denaturare termică. Spre deosebire de precipitarea inelară, acest tip de reacție utilizează filtrate ale materialului în cauză în stare de fierbere.
precipitarea într-un amestec complex nu permite să se caracterizeze proprietățile elementelor individuale ale amestecului. În astfel de cazuri, o persoană recurge la metoda de precipitare în agar și, de asemenea, utilizează imunoelectrofereza.

Precipitații difuze

În acest domeniu de cercetare, există conceptul de reacție de precipitare difuză (RPD). Se bazează pe capacitatea de a difuza în gel de anticorpi și antigene solubile. Difuzia este capacitatea unei molecule dintr-o anumită substanță de a pătrunde în moleculele alteia, care este cauzată de mișcarea termică.
Gelul este un sistem de tip dispers în care faza lichidă este distribuită uniform în faza solidă. Cel mai adesea, gelul de agar este utilizat pentru o astfel de reacție.
După ce se dau parametrii sub care moleculele pot difuza unele față de altele, întâlnirea lor va fi însoțită de formarea unui complex antigen + anticorp. Un astfel de neoplasm este capabil să difuzeze, aflându-se în gelul propriu-zis, și va precipita, luând forma unei benzi care poate fi detectată cu ochiul liber. Dacă antigenul și anticorpul sunt omoloage, nu se va forma nicio bandă.
Crearea condițiilor în care va avea loc difuzia în timpul stratului de agar presupune umplerea componentelor, dar numărul total de godeuri și poziția relativă a acestora este determinat de tipul de problemă care trebuie rezolvată. RPD permite unei persoane să detecteze și să identifice virusuri izolate necunoscute prin testarea utilizând seruri de anticorpi cunoscute.

Aplicație

Precipitația este utilizată pe scară largă nu numai în diagnosticul bolilor, dar își găsește aplicarea și în examinarea medico-legală. Este greu de imaginat o analiză în care să fie posibilă determinarea speciei de sânge, a unei părți a unui organ sau a țesuturilor găsite pe o armă criminală care nu folosește reacția de precipitare. In timpul acestui proces se folosesc seruri precipitante care se obtin prin imunizarea diferitelor animale si pasari. Este important ca nivelul titrului seric să nu fie mai mic de 1:10000 și, de asemenea, trebuie să aibă suficientă specificitate. Din punctul detectat de sânge sau crusta acestuia, se face un extract pentru fizic. soluție, care va fi expusă în continuare serului precipitat. Conform acestei reacții, este posibil să se stabilească tipurile de proteine ​​​​de țesut și organ atât ale oamenilor, cât și ale animalelor. Obținerea extractelor tulburi obligă să recurgă la precipitarea pe agar.

concluzii

Analizând informațiile citite, putem concluziona că reacțiile de precipitare sunt extrem de importante pentru o persoană, deoarece permit diagnosticarea diferitelor antigene cu ajutorul anticorpilor, acest fenomen fiind utilizat pe scară largă și în examenele medico-legale și vă permite să identificați tipul de sânge, țesut sau organ. în legătură cu un anumit subiect. Există mai multe tipuri și metode de precipitare, care sunt utilizate în conformitate cu nevoile emergente ale problemei care se rezolvă.

O reacție de precipitare (RP) este formarea și precipitarea unui complex de antigen molecular solubil cu anticorpi sub formă de nor numit precipitat. Se formează prin amestecarea antigenelor și anticorpilor în cantități echivalente; un exces al unuia dintre ele reduce nivelul de formare a complexului imun.

RP este plasat în eprubete (reacție de precipitare cu inel), în geluri, medii nutritive etc. Sunt utilizate pe scară largă soiurile de RP într-un agar semi-lichid sau gel de agaroză: imunodifuzie dublă Ouchterlony, imunodifuzie radială, imunoelectroforeză etc.

Mecanism. Se efectuează cu antigene solubile coloidale transparente extrase din material patologic, obiecte de mediu sau culturi bacteriene pure. Reacția folosește seruri transparente de precipitare de diagnostic cu titruri mari de anticorpi. Titrul serului de precipitare este considerat a fi cea mai mare diluție a antigenului, care, atunci când interacționează cu serul imunitar, determină formarea unui precipitat vizibil - turbiditate.

Reacția de precipitare inelară este plasată în eprubete înguste (diametru 0,5 cm), în care se adaugă 0,2-0,3 ml de ser precipitant. Apoi, cu o pipetă Pasteur, se stratifică încet 0,1-0,2 ml de soluție de antigen. Tuburile se transferă cu grijă în poziție verticală.Reacția se înregistrează după 1-2 minute.În cazul unei reacții pozitive apare un precipitat sub forma unui inel alb la limita dintre ser și antigenul studiat. Nu se formează precipitat în tuburile de control.

15. Reacție care implică complement: reacție de hemoliză, reacție de fixare a complementului. Mecanism, componente, aplicație.

Reacția de fixare a complementului (RCC) constă în faptul că, atunci când antigenele și anticorpii corespund între ele, ele formează un complex imun, la care complementul (C) este atașat prin fragmentul Fc al anticorpilor, adică complementul este legat de antigen- complex de anticorpi. Dacă nu se formează complexul antigen-anticorp, atunci complementul rămâne liber.

Interacțiunea specifică a AG și AT este însoțită de adsorbția (legarea) complementului. Deoarece procesul de fixare a complementului nu apare vizual, J. Bordet și O. Zhangu au propus să utilizeze sistemul hemolitic (eritrocite de oaie + ser hemolitic) ca indicator, care arată dacă complementul este fixat.

complex AG-AT. Dacă AG și AT corespund între ele, adică s-a format un complex imun, atunci complementul se leagă de acest complex și nu are loc hemoliza. Dacă AT nu corespunde cu AG, atunci complexul nu se formează și complementul, rămânând liber, se conectează cu cel de-al doilea sistem și provoacă hemoliză.

Componente. Testul de fixare a complementului (RCC) este un test serologic complex. Pentru implementarea lui sunt necesare 5 ingrediente și anume: AG, AT și complement (primul sistem), eritrocite de oaie și ser hemolitic (al doilea sistem).

Antigenul pentru CSC poate fi culturi de diferite microorganisme ucise, lizatele acestora, componente ale bacteriilor, organe alterate patologic și normale, lipide tisulare, viruși și materiale care conțin virusuri.

Ca o completare se foloseste ser proaspat sau uscat de cobai.

Mecanism. RSK se efectuează în două faze: prima fază - incubarea unui amestec care conține trei componente ale antigenului + anticorpi + complement; Faza a 2-a (indicator) - detectarea complementului liber în amestec prin adăugarea acestuia a unui sistem hemolitic format din eritrocite de oaie și ser hemolitic care conține anticorpi împotriva acestora. În prima fază a reacției, în timpul formării complexului antigen-anticorp, are loc legarea complementului, iar apoi în a 2-a fază nu va avea loc hemoliza eritrocitelor sensibilizate de anticorpi; reactia este pozitiva. Dacă antigenul și anticorpul nu se potrivesc între ele (nu există antigen sau anticorp în proba de testat), complementul rămâne liber și în a 2-a fază se va alătura complexului eritrocit-anticorp antieritrocitar, determinând hemoliză; reacţia este negativă.Aplicaţie. RSK este utilizat pentru a diagnostica multe boli infecțioase, în special sifilisul (reacția Wasserman)

reacții de imunodiagnostic. Reacții antigen-anticorp și reacții cu componente marcate. Utilizare pentru identificarea microorganismelor și diagnosticarea bolilor infecțioase.

Reacțiile imune sunt utilizate în studiile de diagnostic și imunologic la persoanele bolnave și sănătoase. În acest scop, aplicați metode serologice(din lat. ser - ser şi logos - doctrină), adică metode pentru studierea anticorpilor și antigenilor folosind reacții antigen-anticorp determinate în serul sanguin și alte fluide, precum și în țesuturile corpului.

Detectarea anticorpilor împotriva antigenilor agentului patogen în serul sanguin al pacientului face posibilă diagnosticarea bolii. Studiile serologice sunt folosite și pentru identificarea antigenelor microbiene, a diferitelor substanțe biologic active, a grupelor sanguine, a antigenelor tisulare și tumorale, a complexelor imune, a receptorilor celulari etc.

Când un microb este izolat de la un pacient, agentul patogen este identificat prin studierea proprietăților sale antigenice folosind seruri de diagnostic imun, adică seruri de sânge ale animalelor hiperimunizate care conțin anticorpi specifici. Acest așa-zis identificarea serologică microorganisme.

În microbiologie și imunologie, reacțiile de aglutinare, precipitare, neutralizare, reacții care implică complement, folosind anticorpi și antigeni marcați (radioimunologice, imunotestare enzimatică, metode de imunofluorescență) sunt utilizate pe scară largă. Reacțiile enumerate diferă în ceea ce privește efectul înregistrat și tehnica de setare, cu toate acestea, toate sunt de bază. vans pe reacția interacțiunii unui antigen cu un anticorp și sunt utilizate pentru a detecta atât anticorpi, cât și antigene. Reacțiile imunitare se caracterizează prin sensibilitate și specificitate ridicate.

Principiile și schemele principalelor reacții de imunodiagnostic sunt prezentate mai jos. O tehnică detaliată pentru stabilirea reacțiilor este dată în. ghiduri practice pentru imunodiagnostic.

Reacția de aglutinare - RA(din lat. agluti- natie- legare) - o reacție simplă în care anticorpii leagă antigenele corpusculare (bacterii, eritrocite sau alte celule, particule insolubile cu antigeni adsorbiți pe ele, precum și agregate macromoleculare). Apare în prezența electroliților, de exemplu, atunci când se adaugă o soluție izotonică de clorură de sodiu.

Se folosesc diverse variante ale reacţiei de aglutinare: expandată, aproximativă, indirectă etc. Reacţia de aglutinare se manifestă prin formarea de fulgi sau sedimente.

RA este folosit pentru:

determinarea anticorpilor în serul sanguin al pacienților, de exemplu, cu bruceloză (reacții Wright, Heddelson), febră tifoidă și febră paratifoidă (reacție Vidal) și alte boli infecțioase;

determinarea agentului patogen izolat de la pacient;

determinarea grupelor sanguine cu ajutorul anticorpilor monoclonali împotriva alogenelor eritrocitare.

Pentru a determina anticorpii pacientului a punereacție de aglutinare extinsă: adăugați la diluțiile serului sanguin al pacientului diagnosticum(suspendarea microbilor omorâți) și după câteva ore de incubare la 37 ° C, se notează cea mai mare diluție a serului (titru de ser), la care a avut loc aglutinarea, adică s-a format un precipitat.

Natura și viteza de aglutinare depind de tipul de antigen și de anticorpi. Un exemplu este interacțiunea diagnosticului (antigenele O și R) cu anticorpi specifici. Reacție de aglutinare cu O-diagnosticum(bacterii ucise de căldură, păstrând un termostabil O antigen) apare sub formă de aglutinare cu granulație fină. Reacția de aglutinare cu H-diagnosticum (bacterii ucise de formol, reținând antigenul H flagelar labil la căldură) este cu granulație grosieră și decurge mai rapid.

Dacă este necesar să se determine agentul patogen izolat de la pacient, se pune reacția de aglutinare de orientare, folosind anticorpi de diagnostic (ser aglutinant), adică se efectuează serotiparea agentului patogen. O reacție aproximativă este efectuată pe o lamă de sticlă. La o picătură de ser aglutinant diagnostic într-o diluție de 1:10 sau 1:20 se adaugă o cultură pură a agentului patogen izolat de la pacient. În apropiere este plasat un control: în loc de ser, se aplică o picătură de soluție de clorură de sodiu. Când un sediment floculent apare într-o picătură cu ser și microbi, se pun reacție extinsă de aglutinareîn eprubete cu diluții crescânde de ser aglutinant, la care se adaugă 2-3 picături de suspensie de agent patogen. Aglutinarea este luată în considerare de cantitatea de sediment și de gradul de limpezire a lichidului. Reacția este considerată pozitivă dacă se observă aglutinarea într-o diluție apropiată de titrul serului de diagnostic. În același timp, se ține cont de controale: serul diluat cu soluție izotonică de clorură de sodiu trebuie să fie transparent, o suspensie de microbi în aceeași soluție să fie uniform tulbure, fără sedimente.

Diferitele bacterii înrudite pot fi aglutinate de același ser aglutinant diagnostic, ceea ce face dificilă identificarea lor. Prin urmare, bucurați-vă seruri aglutinante adsorbite, din care anticorpii reactivi încrucișați au fost îndepărtați prin adsorbție de către bacteriile înrudite. În astfel de seruri rămân anticorpi specifici doar acestei bacterii. Prepararea serurilor aglutinante de diagnostic monoreceptor în acest mod a fost propusă de A. Castellani (1902).

Reacția de hemaglutinare indirectă (pasivă). (RNHA, RPHA) se bazează pe utilizarea eritrocitelor cu antigene sau anticorpi adsorbiți la suprafață, a căror interacțiune cu anticorpii sau antigenii corespunzători din serul sanguin al mingii face ca eritrocitele să se lipească împreună și să cadă pe fundul eprubeta sau celula în forma unui sediment festonat (Fig. 13.2). Cu o reacție negativă, eritrocitele se instalează sub forma unui „buton”. De obicei, anticorpii sunt detectați în RNHA folosind un diagnostic de eritrocite antigenice, care este eritrocite cu adsorbție. pe acestea antigene. Uneori folosim diagnosticul de eritrocite cu anticorpi, pe care anticorpii sunt adsorbiți. De exemplu, toxina botulină poate fi detectată prin adăugarea de anticorpi eritrocitari botulinum diagnosticum la ea (această reacție se numește reacție inversă de hemaglutinare indirectă- RONGA). RNHA este utilizat pentru a diagnostica boli infecțioase, pentru a determina hormonul gonadotrop în urină atunci când sarcina este stabilită, pentru a detecta hipersensibilitatea la medicamente, hormoni și, în unele alte cazuri.

Reacția de coaglutinare . Celulele patogene sunt determinate folosind stafilococi, pre-tratați cu ser de diagnostic imun. Stafilococi care conțin proteine DAR, având afinitate pentru Fc -fragment de imunoglobuline, adsorb nespecific anticorpi antimicrobieni, care interactioneaza apoi cu centrii activi cu microbii corespunzatori izolati de la pacienti. Ca urmare a coaglutinării se formează fulgi formați din stafilococi, anticorpi serici de diagnosticare și se determină microbul.

Reacția de inhibare a hemaglutinării (RTGA) se bazează pe blocarea, suprimarea antigenelor virușilor de către anticorpii serului imun, drept urmare virușii își pierd capacitatea de a aglutina globulele roșii (Fig. 13.3). RTHA este utilizat pentru a diagnostica multe boli virale, ai căror agenți cauzali (gripa, rujeola, rubeola, encefalita transmisă de căpușe etc.) pot aglutina eritrocitele diferitelor animale.

Reacție de aglutinare pentru determinarea grupelor sanguine utilizat pentru stabilirea sistemului ABO (vezi secțiunea 10.1.4.1) folosind aglutinarea eritrocitelor cu anticorpi din ser imun împotriva antigenelor grupelor sanguine A (II), B (III). Martorii sunt: ​​ser fără anticorpi, adică ser AB (GU) grupele sanguine; antigenele conținute în eritrocitele grupelor A (II), B (III). Martorul negativ nu conține antigene, adică se folosesc eritrocite din grupa 0 (I).

LA reacţii de aglutinare pentru determinarea factorului Rh(vezi secțiunea 10.1.4.1) utilizați seruri anti-Rh (cel puțin două serii diferite). În prezența antigenului Rh pe membrana eritrocitelor studiate are loc aglutinarea acestor celule. Eritrocitele standard Rh pozitive și Rh negative ale tuturor grupelor de sânge servesc drept martori.

Reacție de aglutinare pentru determinarea anticorpilor anti-Rhesus (reacție Coombs indirectă)utilizat la pacienții cu hemoliză intravasculară. La unii dintre acești pacienți se găsesc anticorpi anti-Rhesus, care sunt incompleti, monovalenți. Ele interacționează în mod specific cu eritrocitele Rh-pozitive, dar nu provoacă aglutinarea acestora. Prezența unor astfel de anticorpi incompleti este determinată în reacția Coombs indirectă. Pentru a face acest lucru, la sistemul de anticorpi anti-Rh + eritrocite Rh-pozitive se adaugă ser antiglobuline (anticorpi împotriva imunoglobulinelor umane), ceea ce determină aglutinarea eritrocitelor (Fig. 13.4). Folosind reacția Coombs, sunt diagnosticate condiții patologice asociate cu liza intravasculară a eritrocitelor de origine imună, de exemplu, boala hemolitică a nou-născutului: eritrocitele unui făt Rh pozitiv se combină cu anticorpi incompleti la factorul Rh care circulă în sânge, care s-au încrucișat. placenta de la o mamă Rh negativ.

Reacții de precipitare

reacție de precipitare - RP (de lalat. praeci-pito- precipitat,) este formarea și precipitarea unui complex de antigen molecular solubil cu anticorpi sub formă de turbiditate, numit precipitat. Se formează prin amestecarea antigenelor și anticorpilor în cantități echivalente; un exces al unuia dintre ele reduce nivelul de formare a complexului imun.

Reacții de precipitare introduse în eprubete (reacție de precipitare inelară),în geluri, medii nutritive etc. Sunt utilizate pe scară largă varietăți ale reacției de precipitare într-un gel semilichid de agar sau agaroză: imunodifuzie dublă conform Ouchterlony. imunodifuzie radială, imunoelectroforeză si etc.

Reacția de precipitare inelară . Reacția se efectuează în tuburi de precipitare înguste cu ser imun, pe care este stratificat un antigen solubil. Cu un raport optim de antigen și anticorpi, la marginea acestor două soluții se formează un inel de precipitat opac (Fig. 13.5). Un exces de antigen nu afectează rezultatul reacției de precipitare a inelului datorită difuzării treptate a reactivilor la limita lichidului. Dacă extractele apoase fierte și filtrate de organe sau țesuturi sunt folosite ca antigene în reacția de precipitare a inelului, atunci o astfel de reacție se numește reacție de termoprecipitare-iii (reacția Ascoli, cu antrax /

Oukhteruni dublă reacție de imunodifuzie . Pentru a stabili reacția, gelul de agar topit este turnat într-un strat subțire pe o placă de sticlă, iar după ce se întărește, se decupează în ea găuri de 2-3 mm. Antigenele și serurile imune sunt plasate separat în aceste godeuri, care difuzează unul spre celălalt. La punctul de întâlnire în proporții echivalente, ele formează un precipitat sub forma unei benzi albe. În sistemele multicomponente, între godeuri apar mai multe linii de precipitat cu antigeni diferiți și anticorpi serici; pentru antigeni identici, liniile de precipitat fuzionează; pentru cele neidentice, acestea se intersectează (Fig. 13.6).

Reacție de imunodifuzie radială . Serul imunitar cu gel de agar topit este turnat uniform pe pahar. După solidificare în gel, se fac godeuri în care antigenul este plasat în diferite diluții. Antigenul, difuzând în gel, formează zone de precipitare în inel în jurul godeurilor cu anticorpii (Fig. 13.7). Diametrul inelului de precipitare este proporțional cu concentrația de antigen. Reacția este utilizată pentru a determina nivelurile sanguine ale imunoglobulinelor din diferite clase, componente ale sistemului complement etc.

Imunoelectroforeza- o combinație a metodei de electroforeză și imunoprecipitare: un amestec de antigeni este introdus în godeurile gelului și separat în gel prin electroforeză. Apoi, paralel cu zonele de electroforeză, în șanț se introduce un ser imun, ai cărui anticorpi, difuzând în gel, se formează la punctul de întâlnire cu antigenul liniei de precipitare.

reacție de floculare(după Ramon) (din lat. flocul- fulgi de lână) - apariția opalescenței sau a masei floculente (imunoprecipitare) într-o eprubetă în timpul unei reacții toxină-antitoxină sau anatoxină-antitoxină. Este utilizat pentru determinarea activității serului antitoxic sau a toxoidului.

Microscopia electronică imunitară- microscopia electronică a microbilor, mai des viruși, tratați cu anticorpi corespunzători. Virușii tratați cu ser imun formează agregate imunitare (microprecipitate). În jurul virionilor se formează o „corolă” de anticorpi, în contrast cu acidul fosfotungstic sau cu alte preparate dense electron-optic.

Reacții care implică complement

Reacții care implică complementbazat pe activarea complementului de către un complex antigen-anticorp (reacție de fixare a complementului, hemoliză radială etc.).

Reacția de fixare a complementului (RSK) constă în faptul că, atunci când corespund între ele, antigenele și anticorpii formează un complex imun, la care, prin Fc -fragmentul de anticorpi unește complementul (C), adică legarea complementului are loc cu un complex antigen-anticorp. Dacă nu se formează complexul antigen-anticorp, atunci complementul rămâne liber (Fig. 13.8). RSK se efectuează în două faze: prima fază - incubarea unui amestec care conține trei componente ale antigenului + anticorpi + complement; Faza a 2-a (indicator) - detectarea complementului liber în amestec prin adăugarea acestuia a unui sistem hemolitic format din eritrocite de oaie și ser hemolitic care conține anticorpi împotriva acestora. În prima fază a reacției, în timpul formării complexului antigen-anticorp, are loc legarea complementului, iar apoi în a 2-a fază nu va avea loc hemoliza eritrocitelor sensibilizate de anticorpi; reactia este pozitiva. Dacă antigenul și anticorpul nu corespund între ele (nu există antigen sau anticorp în proba de testat), complementul rămâne liber și în a 2-a fază se va alătura complexului eritrocit-anticorp antieritrocitar, determinând hemoliză; reactia este negativa.

RSK este utilizat pentru a diagnostica multe boli infecțioase, în special sifilisul (reacția Wasserman).

Reacția de hemoliză radială (RRH ) plasate în godeuri de gel de agar care conțin eritrocite de berbec și complement. După adăugarea serului hemolitic (anticorpi împotriva eritrocitelor de berbec) în godeurile gelului, în jurul lor se formează o zonă de hemoliză (ca urmare a difuziei radiale a anticorpilor). Astfel, este posibilă determinarea activității complementului și a serului hemolitic, precum și a anticorpilor din serul sanguin al pacienților cu gripă, rubeolă, encefalită transmisă de căpușe. Pentru a face acest lucru, antigenele corespunzătoare ale virusului sunt adsorbite pe eritrocite, iar serul de sânge al pacientului este adăugat în godeurile gelului care conține aceste eritrocite. Anticorpii antivirali interactioneaza cu antigenii virali adsorbiti pe eritrocite dupa

Componentele complementului se atașează la acest complex, provocând hemoliză.

Reacția imună de adeziune (RIP ) se bazează pe activarea sistemului complement de către antigeni corpusculari (bacterii, viruși) tratați cu ser imun. Ca rezultat, se formează o componentă a treia a complementului activată (C3b), care se atașează la antigenul corpuscular ca parte a complexului imun. Pe eritrocite, trombocite, macrofage există receptori pentru C3b, datorită cărora, atunci când aceste celule sunt amestecate cu complexe imune purtătoare de C3b, se combină și se aglutinează.

Reacția de neutralizare

Anticorpii serici imunitari sunt capabili să neutralizeze efectul dăunător al microbilor sau al toxinelor acestora asupra celulelor și țesuturilor sensibile, care este asociat cu blocarea antigenelor microbiene de către anticorpi, adică neutralizare. Reacția de neutralizare(RN) se efectuează prin introducerea unui amestec antigen-anticorp în animale sau în obiecte de testare sensibile (cultură celulară, embrioni). În absența efectului dăunător al microorganismelor sau al antigenelor acestora, al toxinelor la animale și al obiectelor de testat, ele vorbesc despre efectul neutralizant al serului imun și, prin urmare, despre specificitatea interacțiunii complexului antigen-anticorp (Fig. 13.9).

Reacție de imunofluorescență - RIF (metoda Koons)

Există trei varietăți principale ale metodei: directă, indirectă (Fig. 13.10), cu un complement. Reacția Koons este o metodă de diagnosticare rapidă pentru detectarea antigenelor microbiene sau detectarea anticorpilor.

Metoda RIF directă se bazează pe faptul că antigenele tisulare sau microbii tratați cu seruri imune cu anticorpi marcați cu fluorocromi sunt capabili să strălucească în razele UV ale unui microscop fluorescent.

Bacteriile într-un frotiu, tratate cu un astfel de ser luminiscent, strălucesc de-a lungul periferiei celulei sub forma unui chenar verde.

Metoda RIF indirectă este de a identifica complexul antigen-anticorp folosind ser antiglobulină (anti-anticorp) marcat cu fluorocrom. Pentru a face acest lucru, frotiurile dintr-o suspensie de microbi sunt tratate cu anticorpi din serul de diagnostic antimicrobian de iepure. Apoi, anticorpii care nu sunt legați de antigeni microbieni sunt spălați, iar anticorpii care rămân pe microbi sunt detectați prin tratarea frotiului cu ser antiglobulină (anti-iepure) marcat cu fluorocromi. Ca rezultat, se formează un microb complex + anticorpi antimicrobieni de iepure + anticorpi anti-iepure marcați cu fluorocrom. Acest complex este observat la un microscop fluorescent, ca și în metoda directă.

Metoda ELISA sau analiză (ELISA)

ELISA -detectarea antigenelor folosind anticorpii corespunzători acestora conjugați cu o enzimă de marcare (peroxidază de hrean, beta-galactozidază sau fosfatază alcalină). După ce antigenul a fost combinat cu serul imun marcat cu enzimă, substratul/cromogenul este adăugat la amestec. Substratul este scindat de enzimă, iar culoarea produsului de reacție se modifică - intensitatea culorii este direct proporțională cu numărul de molecule de antigen și anticorpi legate.

ELISA în fază solidă - varianta cea mai frecventă a testului imunologic, atunci când una dintre componentele răspunsului imun (antigen sau anticorpi) este adsorbită pe un purtător solid, de exemplu, în godeurile plăcilor de polistiren

La determinarea anticorpilor, serul sanguin al pacientului, serul antiglobulinic marcat cu enzima și substratul (cromogenul) pentru enzimă sunt adăugate secvenţial în godeurile plăcilor cu antigenul adsorbit.

De fiecare dată după adăugarea următoarei componente, reactivii nelegați sunt îndepărtați din godeuri prin spălare temeinică. Cu un rezultat pozitiv, culoarea soluției de cromogen se schimbă. Un purtător în fază solidă poate fi sensibilizat nu numai cu un antigen, ci și cu anticorpi. Apoi, antigenul dorit este introdus în godeurile cu anticorpi adsorbiți, se adaugă serul imun împotriva antigenului marcat cu enzima și apoi se adaugă substratul pentru enzimă.

ELISA competitivă . antigenul țintă și antigenul marcat cu enzimă concurează unul cu celălalt pentru legarea unei cantități limitate de anticorpi din ser imun. Un alt test sunt anticorpii pe care îi căutați

iar anticorpii marcaţi concurează între ei pentru antigeni.

Metodă radioimunologică sau analiză (RIA)

O metodă foarte sensibilă bazată pe reacția antigen-anticorp folosind antigene sau anticorpi marcați cu un radionuclid (125 J, 14 C, 3 H, 51 Cr etc.). După interacțiunea lor, complexul imunitar radioactiv rezultat este separat și radioactivitatea acestuia este determinată în contorul corespunzător (radiații beta sau gamma):

intensitatea radiației este direct proporțională cu numărul de antigen și molecule de anticorpi legați.

La versiunea în fază solidă a RIA unul dintre componentele de reacție (antigen sau anticorpi) este adsorbit pe un purtător solid, de exemplu, în godeuri de micromatrice de polistiren. O altă versiune a metodei este RIA competitivă. antigenul țintă și antigenul marcat cu radionuclizi concurează unul cu celălalt pentru legarea unei cantități limitate de anticorpi serici imunitari. Această opțiune este utilizată pentru a determina cantitatea de antigen din materialul de testat.

RIA este utilizat pentru detectarea antigenelor microbilor, determinarea hormonilor, enzimelor, substanțelor medicinale și imunoglobulinelor, precum și a altor substanțe conținute în materialul de testat în concentrații minore - 10 ~ | 0 -I0 ~ 12 g / l. Metoda prezintă un anumit pericol pentru mediu.

Imunoblotting

Imunoblotting (IB)- o metodă foarte sensibilă bazată pe o combinație de electroforeză și ELISA sau RIA.

Antigenul este izolat folosind electroforeza pe gel de poliacrilamidă, apoi este transferat (blotting - din engleză. pata, spot) din gel pe hârtie activată sau membrană de nitroceluloză și dezvoltat prin ELISA. Firmele produc astfel de benzi cu „blots”

antigene. Pe aceste benzi se aplică serul pacientului. Apoi, după incubare, pacientul este spălat de anticorpii nelegați ai pacientului și se aplică ser împotriva imunoglobulinelor umane, marcate cu o enzimă. Complexul antigen + anticorp al pacientului + anticorp împotriva Ig-ului uman format pe bandă este detectat prin adăugarea unui substrat/cromogen care își schimbă culoarea sub acțiunea enzimei (Fig. 13.12).

IB este folosit ca metodă de diagnosticare a infecției cu HIV etc.

13.1. Reacții antigen-anticorp și utilizări ale acestora

Când un antigen este injectat, în organism se formează anticorpi. Anticorpii sunt complementari cu antigenul care a determinat sinteza lor și sunt capabili să se lege de acesta. Legarea antigenelor de anticorpi constă în două faze. Prima fază este specifică, în care are loc o legare rapidă a determinantului antigenic la centrul activ al fragmentului Fab de anticorpi. Trebuie remarcat faptul că legarea se datorează forțelor van der Waals, hidrogenului și interacțiunilor hidrofobe. Forța legăturii este determinată de gradul de corespondență spațială dintre locul activ al anticorpului și epitopul antigenului. După faza specifică, începe una mai lentă - nespecifică, care se manifestă printr-un fenomen fizic vizibil (de exemplu, formarea de fulgi în timpul aglutinarii etc.).

Reacțiile imune sunt interacțiuni între anticorpi și antigeni, iar aceste reacții sunt specifice și foarte sensibile. Sunt utilizate pe scară largă în practica medicală. Cu ajutorul reacțiilor imune pot fi rezolvate următoarele sarcini:

Determinarea anticorpilor necunoscuți prin antigeni cunoscuți (diagnostic antigenic). O astfel de sarcină este atunci când este necesar să se determine anticorpii la agentul patogen în serul sanguin al pacientului (serodiagnostic). Găsirea anticorpilor vă permite să confirmați diagnosticul;

Determinarea antigenelor necunoscute prin anticorpi cunoscuți (ser diagnostic). Acest studiu se realizează la identificarea culturii agentului patogen izolat din materialul pacientului (serotipizare), precum și la detectarea

antigenii microbilor și toxinele acestora din sânge și alte fluide biologice. Există multe tipuri de reacții imune care diferă în tehnica de setare și efectul înregistrat. Acestea sunt reacții de aglutinare (RA), precipitare (RP), reacții care implică complement (RCC), reacții care utilizează componente marcate (RIF, ELISA, RIA).

13.2. Reacția de aglutinare

Reacția de aglutinare (RA) este o reacție imună a interacțiunii unui antigen cu anticorpi în prezența electroliților, iar antigenul se află în stare corpusculară (eritrocite, bacterii, particule de latex cu antigene adsorbite). În timpul aglutinării, antigenele corpusculare sunt lipite împreună de anticorpi, ceea ce se manifestă prin formarea unui precipitat floculent. Formarea fulgilor are loc datorită faptului că anticorpii au doi centri activi, iar antigenele sunt polivalente, adică. au multipli determinanți antigenici. RA este utilizat pentru a identifica agentul patogen izolat din materialul pacientului, precum și pentru a detecta anticorpi la agentul patogen în serul sanguin al pacientului (de exemplu, reacțiile Wright și Huddleson în bruceloză, reacția Vidal în febra tifoidă și febra paratifoidă). ).

Cel mai simplu mod de a configura RA este o reacție pe sticlă, aceasta este o RA aproximativă, care este folosită pentru a determina agentul patogen izolat de la pacient. La fixarea reacției pe o lamă de sticlă se aplică un ser aglutinant diagnostic (la o diluție de 1:10 sau 1:20), apoi se introduce o cultură de la pacient. Reacția este pozitivă dacă în picătură apare un precipitat floculent. În apropiere este plasat un control: în loc de ser, se aplică o picătură de soluție de clorură de sodiu. Dacă serul aglutinant de diagnostic este neadsorbit 1, atunci este diluat (la titrul - diluția la care ar trebui să aibă loc aglutinarea), adică. pune RA expandată în eprubete cu creștere

1 Serul aglutinant neadsorbit poate aglutina bacteriile înrudite care au antigene comune (reacții încrucișate). Prin urmare, bucurați-văseruri aglutinante adsorbite, din care anticorpii reactivi încrucișați au fost îndepărtați prin adsorbție de către bacteriile înrudite. În astfel de seruri rămân anticorpi specifici doar acestei bacterii.

diluții de ser aglutinant, la care se adaugă 2-3 picături dintr-o suspensie de agent patogen izolat de la pacient. Aglutinarea este luată în considerare de cantitatea de sediment și de gradul de limpezire a lichidului din eprubete. Reacția este considerată pozitivă dacă se observă aglutinarea într-o diluție apropiată de titrul serului de diagnostic. Reacția este însoțită de controale: serul, diluat cu soluție izotonică de clorură de sodiu, trebuie să fie transparent, suspensia de microbi în aceeași soluție să fie uniform tulbure, fără sedimente.

Pentru a determina anticorpii la agentul patogen din serul sanguin al pacientului, se utilizează un RA extins. Când este plasat în eprubete, serul de sânge al pacientului este diluat și o cantitate egală de suspensie de diagnosticum (suspensie de microbi uciși) este adăugată în eprubete. După incubare, se determină cea mai mare diluție a serului la care a avut loc aglutinarea, adică. s-a format un precipitat (titru seric). În acest caz, reacția de aglutinare cu O-diagnosticum (bacterii ucise prin încălzire, reținând un O-antigen termostabil) are loc sub formă de aglutinare cu granulație fină. Reacția de aglutinare cu H-diagnosticum (bacterii ucise de formol, reținând antigenul H flagelar labil la căldură) este cu granulație grosieră și decurge mai rapid.

Reacția de hemaglutinare indirectă (pasivă).(RNGA sau RPGA) este un tip de RA. Această metodă este foarte sensibilă. Cu ajutorul RNGA se pot rezolva două sarcini: determinarea anticorpilor din serul sanguin al pacientului, la care se adaugă un diagnostic de eritrocite antigenice, adică eritrocite pe care sunt adsorbiți antigeni cunoscuți; determinați prezența antigenelor în materialul de testat. În acest caz, reacția este uneori numită reacție de hemaglutinare indirectă inversă (RONGA). La stadializare, la materialul de testat se adaugă un anticorp erythrocyte diagnosticum (eritrocite cu anticorpi adsorbiți pe suprafața lor). Eritrocitele din această reacție acționează ca purtători și sunt implicate pasiv în formarea agregatelor imune. Cu o reacție pozitivă, eritrocitele lipite pasiv acoperă fundul puțului cu un strat uniform cu margini festonate („umbrelă”); în absența aglutinarii, eritrocitele se acumulează în adâncitura centrală a găurii, formând un „buton” compact cu margini bine definite.

Reacția de coaglutinare folosit pentru a detecta celulele patogene (antigeni) folosind anticorpi adsorbiți pe Staphylococcus aureus, conţinând proteina A. Proteina A are afinitate pentru fragmentul Fc al imunoglobulinelor. Datorită acestui fapt, anticorpii se leagă de stafilococ indirect prin fragmentul Fc, iar fragmentele Fab sunt orientate spre exterior și sunt capabile să interacționeze cu microbii corespunzători izolați de la pacienți. În acest caz, se formează fulgi.

Reacția de inhibare a hemaglutinării (HITA) utilizat în diagnosticul infecțiilor virale, și numai infecții cauzate de virusuri hemaglutinante. Acești virusuri conțin pe suprafața lor o proteină - hemaglutinina, care este responsabilă de reacția de hemaglutinare (RHA) atunci când este adăugată virusurilor eritrocitare. RTGA constă în blocarea antigenelor virale cu anticorpi, în urma cărora virusurile își pierd capacitatea de a aglutina globulele roșii.

Reacția Coombs - RA pentru detectarea anticorpilor incompleti. În unele boli infecțioase, cum ar fi bruceloza, în serul sanguin al pacientului circulă anticorpi incompleti împotriva agentului patogen. Anticorpii incompleti sunt numiți blocare deoarece au un loc de legare a antigenului și nu două, ca anticorpii completi. Prin urmare, atunci când se adaugă un diagnostic antigenic, anticorpii incompleti se leagă de antigene, dar nu îi lipesc împreună. Pentru a manifesta reacția se adaugă ser antiglobulinic (anticorpi la imunoglobulinele umane), care va duce la aglutinarea complexelor imune (diagnostic antigenic + anticorpi incompleti) formate în prima etapă a reacției.

Reacția Coombs indirectă este utilizată la pacienții cu hemoliză intravasculară. La unii dintre acești pacienți se găsesc anticorpi anti-Rhesus monovalenți incompleti. Ele interacționează în mod specific cu eritrocitele Rh-pozitive, dar nu provoacă aglutinarea acestora. Prin urmare, serul antiglobulinic este adăugat la sistemul de anticorpi anti-Rh + eritrocite Rh-pozitive, ceea ce determină aglutinarea eritrocitelor. Folosind reacția Coombs, sunt diagnosticate condiții patologice asociate cu liza intravasculară a eritrocitelor de origine imună, de exemplu, boala hemolitică a nou-născutului din cauza conflictului Rhesus.

RA pentru determinarea grupelor sanguine se bazează pe aglutinarea eritrocitelor de către anticorpii serului imun la antigenele grupelor sanguine A (II), B (III). Martorul este ser care nu conține anticorpi, adică. serul AB (IV) grupele sanguine și antigenele eritrocitelor din grupele A (P) și B (III). Eritrocitele din grupa 0(I) sunt folosite ca martor negativ deoarece nu au antigeni.

Pentru determinarea factorului Rh se folosesc seruri anti-Rh (cel puțin două serii diferite). În prezența antigenului Rh pe membrana eritrocitelor studiate are loc aglutinarea acestor celule.

13.3. reacție de precipitare

RP este o reacție imună a interacțiunii anticorpilor cu antigenele în prezența electroliților, iar antigenul este în stare solubilă. În timpul precipitării, antigenele solubile sunt precipitate de anticorpi, ceea ce se manifestă prin turbiditate sub formă de benzi de precipitare. Formarea unui precipitat vizibil se observă atunci când ambii reactivi sunt amestecați în rapoarte echivalente. Un exces al unuia dintre ele reduce cantitatea de complexe imune precipitate. Există diferite moduri de a stabili o reacție de precipitare.

Reacția de precipitare inelară plasate în tuburi de precipitare cu diametru mic. Serul imunitar este adăugat în eprubetă și antigenul solubil este stratificat cu grijă. Cu un rezultat pozitiv, la limita celor două soluții se formează un inel lăptos. Reacția de precipitare inelară, care determină prezența antigenelor în organe și țesuturi, ale căror extracte sunt fierte și filtrate, se numește reacția de termoprecipitare (reacția Ascoli pentru determinarea unui antigen antrax termostabil).

Reacție de imunodifuzie dublă Ouchterlony. Această reacție este efectuată pe un gel de agar. Godeurile sunt tăiate într-un strat de gel de grosime uniformă, la o anumită distanță unele de altele și umplute cu antigen și, respectiv, ser imun. După aceea, antigenele și anticorpii difuzează în gel, se întâlnesc și formează complexe imune, care precipită în gel și devin vizibile ca linii de precipitare.

nutriție. Această reacție poate fi utilizată pentru a detecta antigene sau anticorpi necunoscuți, precum și pentru a verifica asemănarea dintre diferiți antigeni: dacă antigenele sunt identice, liniile de precipitare se contopesc; dacă antigenele nu sunt identice, liniile de precipitare se intersectează; dacă antigenele sunt parțial identic, se formează un pinten.

Reacție de imunodifuzie radială. La gelul de agar topit se adaugă anticorpi și gelul este aplicat într-un strat uniform pe lamă. Godeurile sunt tăiate în gel și se introduce în ele un volum standard de soluții de antigen de diferite concentrații. În timpul incubației, antigenele difuzează radial în afara godeului și, la întâlnirea cu anticorpi, formează un inel de precipitare. Atâta timp cât există un exces de antigen în godeu, există o creștere treptată a diametrului inelului de precipitare. Această metodă este utilizată pentru a determina antigene sau anticorpi în soluția de testare (de exemplu, pentru a determina concentrația de imunoglobuline de diferite clase în serul sanguin).

Imunoelectroforeza. Amestecul de antigeni este separat în prealabil prin electroforeză, apoi antiserul precipitant este introdus în șanțul care merge de-a lungul direcției de mișcare a proteinei. Antigenii și anticorpii difuzează în gel unul către celălalt; interacționând, formează linii arcuite de precipitații.

reacție de floculare(conform lui Ramon) - un fel de reacție de precipitare, care este folosită pentru a determina activitatea serului antitoxic sau a toxoidului. Reacția se realizează în eprubete. Într-o eprubetă în care toxoidul și antitoxina sunt într-un raport echivalent, se observă turbiditate.

13.4. Reacția de fixare a complementului

Anticorpii, care interacționează cu antigenul corespunzător, leagă complementul adăugat (primul sistem). Indicatorul fixării complementului este eritrocitele sensibilizate prin ser hemolitic, adică. anticorpi la eritrocite (sistemul 2). Dacă complementul nu este fixat în sistemul I, adică. reacția antigen-anticorp nu are loc, atunci hematiile sensibilizate sunt complet lizate (reacție negativă). Când complementul este legat de complexele imune ale primului sistem, după adăugarea de eritrocite sensibilizate, hemoliză

absent (reacție pozitivă). Reacția de fixare a complementului este utilizată pentru a diagnostica boli infecțioase (gonoree, sifilis, gripă etc.).

13.5. Reacția de neutralizare

Microbii și toxinele lor au un efect dăunător asupra organelor și țesuturilor corpului uman. Anticorpii sunt capabili să se lege de acești agenți dăunători și să-i blocheze, de exemplu. neutraliza. Reacția de neutralizare diagnostică se bazează pe această caracteristică a anticorpilor. Se realizează prin introducerea unui amestec antigen-anticorp în animale sau în obiecte sensibile de testare (cultură celulară, embrioni). De exemplu, pentru a detecta toxine în materialul pacientului, animalele din primul grup sunt injectate cu materialul pacientului. Animalele din grupa a 2-a sunt injectate cu un material similar, pre-tratat cu antiserul adecvat. Animalele din primul grup mor în prezența toxinei în material. Al doilea grup de animale supraviețuiește, efectul dăunător al toxinei nu se manifestă, deoarece este neutralizat.

13.6. Reacții folosind anticorpi sau antigeni marcați

13.6.1. Reacție de imunofluorescență (RIF, metoda Koons)

Această metodă este utilizată pentru diagnosticare expresă. Poate detecta atât antigenele microbiene, cât și anticorpii.

Metoda RIF directă- o reacție imună a interacțiunii anticorpilor cu antigenele, iar anticorpii sunt marcați cu un fluorocrom - o substanță capabilă să emită cuante de lumină de o anumită lungime de undă atunci când sunt lovite de lumina de o anumită lungime de undă. Particularitatea setării acestei metode este necesitatea de a elimina componentele nereacționate pentru a exclude detectarea luminiscenței nespecifice. Pentru a face acest lucru, efectuați spălarea anticorpilor nereacționați. Rezultatele sunt evaluate folosind un microscop fluorescent. Bacteriile dintr-un frotiu tratate cu un astfel de ser luminiscent strălucesc pe un fundal întunecat de-a lungul periferiei celulei.

Metoda RIF indirectă folosit mai mult decât precedentul. Această reacție se realizează în două etape. În prima etapă, antigenele reciproc

interacționează cu anticorpii corespunzători, formând complexe imune. Toate componentele care nu au reacționat (adică nu fac parte din complexele imune) trebuie îndepărtate prin spălare. În a doua etapă, complexul antigen-anticorp format este detectat folosind ser antiglobulină fluorocrom. Ca rezultat, se formează un microb complex + anticorpi antimicrobieni de iepure + anticorpi la imunoglobulinele de iepure marcate cu fluorocrom. Rezultatele sunt evaluate folosind un microscop fluorescent.

13.6.2. Imunotest sau test

ELISA este cea mai comună metodă modernă folosită pentru a diagnostica infecțiile virale, bacteriene, protozoare, în special pentru a diagnostica infecția cu HIV, hepatita virală etc.

Există o mulțime de modificări ELISA. ELISA necompetitiv în fază solidă este utilizat pe scară largă. Se realizează în plăci de polistiren cu 96 de godeuri (fază solidă). În timpul reacției, este necesară spălarea componentelor nereacționate în fiecare etapă. La determinarea anticorpilor, godeurile pe care sunt adsorbiți antigenele sunt umplute cu serul sanguin studiat, apoi serul antiglobulinic marcat cu enzima. Arată reacția prin adăugarea unui substrat pentru enzimă. În prezența enzimei, substratul se modifică, iar complexul enzimă-substrat este selectat în așa fel încât produsul format în reacție să fie colorat. Astfel, cu o reacție pozitivă, se observă o schimbare a culorii soluției. Pentru determinarea antigenelor, un purtător în fază solidă este sensibilizat cu anticorpi, apoi materialul de testat (antigenele) și serul antigen marcat cu enzimă sunt introduse secvenţial. Pentru manifestarea reacției se introduce un substrat pentru enzimă. O schimbare a culorii soluției are loc cu o reacție pozitivă.

13.6.3. Imunoblotting

Această metodă se bazează pe o combinație de electroforeză și ELISA. Când se efectuează imunoblotting (blotting din engleză. pata- spot) un amestec complex de antigeni este mai întâi supus electroforezei într-un gel de poliacrilamidă. Anti-

peptidele genice sunt transferate pe o membrană de nitroceluloză. Petele sunt apoi tratate cu anticorpi marcați cu enzimă la antigenul specific, de exemplu. efectuați un test ELISA. Imunoblotting este utilizat în diagnosticarea infecțiilor precum HIV.

13.6.4. Microscopia electronică imunitară

Metoda constă în microscopia la un microscop electronic a virușilor (mai rar alți microbi), tratați în prealabil cu un ser imun adecvat marcat cu preparate dense electron-optic, de exemplu, feritina, o proteină care conține fier.

13.7. citometrie în flux

Celulele sanguine sunt diferențiate pe baza citofluorometriei cu laser. Pentru a face acest lucru, celulele dorite sunt colorate cu anticorpi monoclonali fluorescenți la antigenele CD. O probă de sânge după tratamentul cu anticorpi marcați este trecută printr-un tub subțire și prin acesta trece un fascicul laser, care excită luminescența fluorocromului. Intensitatea fluorescenței se corelează cu densitatea antigenelor de pe suprafața celulei și poate fi cuantificată folosind un fotomultiplicator. Rezultatele obţinute sunt convertite într-o histogramă.

Citometria în flux este utilizată pentru a determina starea imună (conținutul principalelor populații de limfocite, conținutul de citokine intracelulare și extracelulare, activitatea funcțională a celulelor NK, activitatea fagocitozei etc.).

Sub formă de turbiditate, numită precipitat. Se formează prin amestecarea antigenelor și anticorpilor în cantități echivalente; un exces al unuia dintre ele reduce nivelul de formare a complexului imun. Reacția de precipitare se pune în eprubete (reacție de precipitare inelă), în geluri, medii nutritive etc. Sunt utilizate pe scară largă varietati de reacție de precipitare într-un gel semilichid de agar sau agaroză: imunodifuzie dublă Ouchterlony, imunodifuzie radială, imunoelectroforeză etc. .
Reacția de precipitare inelară. Reacția se efectuează în tuburi de precipitare înguste: un antigen solubil este stratificat pe serul imunitar. Cu un raport optim de antigen și anticorpi, la marginea acestor două soluții se formează un inel de precipitat opac (Fig. 7.50). Dacă extractele de țesut fierte și filtrate sunt folosite ca antigene în reacție, atunci o astfel de reacție se numește reacție de termoprecipitare (reacție Ascoli, în care este detectată haptena de antrax).

Orez. 7.50.

Reacție de imunodifuzie dublă Ouchterlony.

Pentru a stabili reacția, gelul de agar topit este turnat într-un strat subțire pe o placă de sticlă, iar după solidificare, se decupează găuri în el. Antigenele și serurile imune sunt plasate separat în godeurile gelului, care difuzează unul spre celălalt. La punctul de întâlnire în proporţii echivalente formează un precipitat sub forma unei benzi albe (Fig. 7.51). În sistemele multicomponente, între godeurile cu antigeni și anticorpi apar mai multe linii de precipitat; în antigene identice, liniile de precipitat se contopesc, în antigenele neidentice, se intersectează.

Orez. 7.51

Serul imunitar cu gel de agar topit este turnat uniform pe pahar. După solidificare în gel, se fac godeuri în care antigenul (Ag) este plasat în diferite diluții. Antigenul, difuzând în gel, formează zone inelare de precipitare în jurul godeurilor cu anticorpi. Diametrul inelului de precipitare este proporțional cu concentrația antigenului (Fig. 7.52). Reacția este utilizată pentru a determina în serul sanguin imunoglobuline de diferite clase, componente ale sistemului complement etc.

Orez. 7,52.

O combinație de electroforeză și imunoprecipitare: un amestec de antigene este introdus în godeurile gelului și separat în gel folosind electroforeză, apoi serul imun este introdus în canalul de gel paralel cu zonele de electroforeză. Anticorpii serului imun difuzează în gel și formează o linie de precipitare la locul de „întâlnire” cu antigenul (Fig. 7.53).

Orez. 7,53.

Reacția de floculare (după Ramon) (din lat. flocul- fulgi de lână) - apariția opalescenței sau a masei fulgioase (imunoprecipitare) într-o eprubetă în timpul unei reacții toxină-antitoxină sau anatoxină-antitoxină (Fig. 7.54). Este utilizat pentru determinarea activității serului antitoxic sau a toxoidului.

Orez. 7,54.

Tulpinile agentului cauzal al difteriei - C. diphtheriae pot fi toxigenice (producând exotoxină) și non-toxigenice. Formarea exotoxinei depinde de prezența în bacterii a unui profag care poartă gena toxică care codifică formarea exotoxinei. În caz de boală, toate izolatele sunt testate pentru toxicitate - producția de exotoxină difteric folosind o reacție de precipitare în agar (Fig. 7.55).

Orez. 7,55