Transducție nespecifică. Transducția fagilor

Transducția specifică a fost descoperită în 1956 de M. Morse și soții E. și J. Lederberg. O trăsătură caracteristică a transducției specifice este că fiecare fag transductor transmite doar o anumită regiune, foarte limitată, a cromozomului bacterian. Dacă în transducția generalizată fagul acționează ca un purtător „pasiv” al materialului genetic al bacteriilor, iar recombinarea genetică în bacteriile transduse are loc conform tiparelor generale ale procesului de recombinare, atunci în cazul transducției specifice, fagul nu numai transferă materialul genetic, dar asigură și încorporarea acestuia în cromozomul bacterian. Cel mai cunoscut exemplu de transducție specifică este transducția efectuată de fagul λ, care este capabil să infecteze celulele bacteriene E. coli cu integrarea ulterioară a ADN-ului său în genomul bacterian. În timpul lizogenizării bacteriilor, fagul temperat λ ca urmare a recombinării site-specifice (ruperea și reunirea încrucișată a catenelor de ADN) este integrat în cromozomul acestora doar într-un singur loc: în zona dintre locii bio și gal. Această zonă se numește attλ. Excizia (excizia) profagului din cromozom în timpul inducției profagelui este, de asemenea, efectuată conform mecanismului recombinării specifice locului. Recombinarea specifică site-ului are loc cu acuratețe, dar nu fără erori. Aproximativ o dată la un milion de evenimente în timpul exciziei profage, recombinarea nu are loc în locul attλ, ci captează regiunile gal sau bio. Se crede că acest lucru se datorează formării „greșite” a buclei în timpul dezintegrarii profagului. Ca rezultat, regiunea genomului bacterian adiacent profagului este scindată din cromozom și devine parte a genomului fagului liber. Regiunea genomului profag corespunzătoare locației sale în buclă rămâne în cromozomul bacterian. Astfel, are loc un schimb genetic între profet și cromozomul bacterian. Materialul genetic bacterian care se integrează în genomul fagilor poate înlocui până la 1/3 din materialul genetic al fagilor. După împachetarea ADN-ului fagic, din care o parte este înlocuită cu ADN bacterian, particulele de fagi defecte se formează în capul fagului. Fagul este defect datorită faptului că volumul capului este limitat și când un fragment de ADN bacterian este inclus în genomul său, o parte a genomului fagului rămâne în cromozomul bacterian. Dacă defectul este nesemnificativ, atunci fagul rămâne viabil, deoarece învelișul proteic rămâne intact și asigură adsorbția pe celule. Un astfel de fag defect poate infecta alte celule, dar nu poate provoca o infecție a reproducerii, deoarece genele responsabile de reproducere sunt absente. Dacă într-un astfel de fag defect se păstrează capete lipicioase de ADN, care asigură transformarea acestuia într-o formă circulară, atunci ADN-ul fagului defect, împreună cu un fragment de ADN bacterian, se poate integra în ADN-ul bacteriilor primitoare și poate provoca lizogenizarea acestora. se formează particule defecte care conțin genele locusului gal. Astfel de particule defecte sunt denumite λdgal (fag λ, defect, gal). Dacă genomul fagului λ conține gena responsabilă pentru sinteza biotinei, atunci λdbio. Prin urmare, dacă celulele receptoare sunt tratate cu bio– sau gal– cu un fagolizat obținut după infectarea bacteriilor donatoare cu fagul λ, care conține particule defecte, se formează transductanții bio+ sau gal+ cu o frecvență de 10–5–10–6. Transducția specifică în E. coli este efectuată nu numai de fagul λ, ci și de fagii înrudiți numiți fagi lambdoizi, care includ φ80, 434, 82 etc. În special, fagul φ80 este încorporat în cromozomul lângă genele care codifică formarea enzimelor responsabile de sinteza triptofanului. Din acest motiv, fagul φ80 este potrivit pentru transferul genelor trp. S-a descoperit că fagul P22 al S. typhimurium, pe lângă transducția generală, poate efectua și transducția specifică. În timpul ciclului litic de dezvoltare, bacteriofagul P22 poate efectua transducția generală, în timp ce în timpul lizogenizării, poate efectua transducția specifică. ADN-ul fagului P22 este integrat într-o regiune a cromozomului lângă genele responsabile de sinteza prolinei. Integrarea profagelor stimulează dramatic formarea unor particule transductoare specifice. Astfel, transducția specifică necesită lizogenizarea preliminară a bacteriilor donatoare și inducerea ulterioară a profagului din celule. Particulele de fagi transductoare defecte rezultate infectează celulele tulpinii primitoare, ele sunt lizogenizate și profagul este introdus cu o porțiune din genomul bacterian al donatorului în cromozomul receptorului. Transducția poate fi utilizată în următoarele direcții: transduce plasmidele și fragmentele scurte ale cromozomului donor; pentru construirea tulpinilor unui genotip dat, în special tulpinilor izogenice. Aici, dimensiunea mică a fragmentelor transferate oferă avantajul transducției față de conjugare. Tulpinile izogenice construite folosind transducția generalizată diferă numai în regiunea cromozomală purtată de fagul transductor; pentru cartografierea precisă a genelor bacteriene, stabilirea ordinii și a localizării lor în operoni și a structurii fine a determinanților genetici individuali, care se realizează cu ajutorul unui test de complementaritate. Se știe că sinteza unui anumit grup de produse necesită funcționarea mai multor gene. Să presupunem că sinteza unei enzime este determinată de produsele genelor a și b. Să fie doi mutanți fenotipic identici incapabili de a sintetiza enzima, dar nu se știe dacă sunt identici sau diferiți genetic. Pentru a identifica genotipul, se efectuează transducția, adică fagul este propagat pe celulele unei populații, iar apoi celulele celei de-a doua populații sunt infectate cu fagolizat. Dacă atât colonii mari de transductanți adevărați, cât și colonii mici de transductanți abortivi se formează la însămânțarea pe un mediu selectiv, se ajunge la concluzia că mutațiile sunt localizate în gene diferite.

Transducție - un fel de variabilitate recombinativă a microorganismelor, însoțită de transferul de informații genetice de la un donator la un receptor cu bacteriofag. Transferul de segmente ale cromozomului bacterian de către fagi a fost descoperit în 1951. Lederberg și Zinder Salmonella typhimurium, descris ulterior în multe genuri de bacterii: Salmonella, Escherichia, Shigella, Bacil, Pseudomonas, Vibrio, Streptococcus, Slaphylococcus, Corynebacterium. Membrana capsidei bacteriofagului protejează ADN-ul de acțiunea nucleazelor; prin urmare, transducția, spre deosebire de transformare, nu este sensibilă la nucleaze. Se efectuează transducția fagi temperati. Ei transferă doar un mic fragment din genomul celulei gazdă și, de regulă, între indivizii aceleiași specii, dar transferul interspecie al informațiilor genetice este posibil și dacă bacteriofagul are o gamă largă de gazde.

În funcție de rezultatul interacțiunii unui fag cu o bacterie, sunt izolați fagii litici și temperați.

Fagi litici (virulenți). injectează acid nucleic în celulă și se reproduc în ea, după care părăsesc celula prin liză.

Fagi lizogeni sau temperati, după ce și-au injectat ADN-ul într-o celulă, pot face două lucruri: 1) să înceapă un ciclu de reproducere și să părăsească celula prin liză; 2) să-și integreze informațiile genetice în genomul bacterian și, ca parte a acestuia, să fie transferate la celulele fiice. Fagii care sunt integrați în genomul bacterian sunt numiți profagii, iar bacteriile cu fagi integrați în genom sunt lizogenice. Ca urmare a acțiunii factorilor care întrerup lizogenia (UV, radiații ionizante, mutageni chimici), particulele virale sunt din nou sintetizate și părăsesc celula. Un exemplu de fag moderat este fagul l, care infectează E coli. Etapele transducției sale:

1. Adsorbția fagilor la receptorii de suprafață E coli.
2. Penetrarea cozii fagului prin peretele celular și injectarea de ADN în celula gazdă.
3. Recombinarea moleculei de ADN fag circular cu ADN gazdă și stabilirea lizogeniei (ADN-ul fagului este într-o stare integrată).
4. Transferul profagului la celulele fiice în timpul reproducerii E coli. Cu cât sunt mai multe diviziuni, cu atât bacteriofagul conține mai multe celule. .
5. sfârşitul lizogeniei. ADN-ul bacteriofag este excizat din cromozomul bacterian. Există o sinteză a proteinelor virale și replicarea ADN-ului fag, însoțită de maturarea particulelor virale și eliberarea lor din celulă prin liza acesteia. În timpul exciziei, bacteriofagul poate capta genele bacteriene din apropiere, care ulterior intră în celula primitoare.
6. Încorporarea genomului unui bacteriofag care poartă gene bacteriene în ADN-ul unei bacterii primitoare. În funcție de locul de înglobare a bacteriofagului, se disting următoarele tipuri de transducție:

A. Nespecific (general). Un bacteriofag se poate integra oriunde în genomul bacterian și, prin urmare, este capabil să transporte orice fragment din ADN-ul gazdei.

b. Specific. Bacteriofagul se integrează în locuri strict definite din genomul bacterian și, prin urmare, transferă doar fragmente strict definite de ADN.

c. avortiv. Porțiunea de cromozom bacterian al donorului transferată de bacteriofag nu intră în recombinare cu cromozomul receptorului, ci rămâne în afara cromozomului. Are loc transcripția ADN-ului transferat (după cum este indicat de sinteza produsului genetic corespunzător), dar nu și replicare. În procesul de diviziune celulară, fragmentul donor trece doar la una dintre celulele fiice și se pierde în timp.

Transducția este transferul de gene de la o celulă bacteriană la alta de către un bacteriofag. Acest fenomen a fost stabilit pentru prima dată în 1952 de către N. Zinder și J. Lederberg. Ei au efectuat studii asupra bacteriilor Salmonella typhimurium, patogene pentru șoareci. Au fost selectate două tulpini ale acestor bacterii: tulpină auxotrofă 22A, incapabilă de a sintetiza triptofan (T ~), și tulpină 2A, capabilă să sintetizeze triptofan (T 1"). Aceste tulpini au fost însămânțate într-un tub în formă de U, separat la fund. printr-un filtru bacterian (Fig. 24 Tulpina 22A (T~) a fost inoculată într-un genunchi al tubului, iar tulpina 2A (T1") în celălalt. După o anumită perioadă de incubație, bacteriile din tulpina 22A, atunci când au fost semănate pe un mediu nutritiv minim, au dat un număr mic de colonii (frecvența apariției celulelor transduse a fost N0 ~ 5). Acest lucru a indicat că unele celule au dobândit capacitatea de a sintetiza triptofan. Cum ar putea bacteriile să dobândească această proprietate? Cercetare

Orez. 24. Schema experimentului asupra transducției

a arătat că tulpina 22A a fost lizogenă pentru fagul P-22. Acest
fagul a fost eliberat din cultura lizogenă, trecut prin
filtru și tulpina lizată 2A. Prin adăugarea unei părți din genetică
a tulpinii 2A, fagul bacterian a revenit și a transferat acest material genetic în tulpina 22A. Tulpina 22A la
a dobândit proprietăți ereditare specifice ale tulpinii 2A,
în acest caz, proprietatea de a sintetiza triptofan. Alte trăsături pot fi transduse într-un mod similar, inclusiv capacitatea
fermentație, rezistență la antibiotice etc.

Fenomenul de transducție a fost stabilit și la Escherichia coli și actinomicete. De regulă, o genă este transdusă, rar două și foarte rar trei gene legate. În timpul transferului de material genetic, o porțiune din molecula de ADN fag este înlocuită. Fagul își pierde propriul fragment și devine defect. Includerea materialului genetic în cromozomul bacteriei primitoare se realizează printr-un mecanism precum crossing over. Există un schimb de material ereditar între regiunile omoloage ale cromozomului primitorului și materialul introdus de fag.

Există trei tipuri de transducție: generală sau nespecifică, specifică și abortivă. În timpul transducției nespecifice în timpul asamblarii particulelor de fagi, oricare dintre fragmentele de ADN ale bacteriei afectate pot fi incluse în capul lor împreună cu ADN-ul fagilor. Ca rezultat, diferite gene ale bacteriei donatoare pot fi transferate la celulele primitoare. Transducția nespecifică poate fi efectuată de fagii P-1 și P-22 din Escherichia, Shigella și Salmonella. Cu transducție specifică, profagul este inclus într-un loc specific pe cromozomul bacterian și transduce anumite gene situate pe cromozomul celulei donatoare de lângă profag. De exemplu, fagul "k (lambda) în starea profag este întotdeauna inclus în același loc în cromozomul Escherichia coli și transduce locusul care determină capacitatea de a fermenta galactoza. Când profagii sunt separati de ADN-ul gazdă, genele bacteriene adiacente profagului sunt scindate împreună cu acesta din cromozomii de compoziție, iar o parte din genele profagelor rămâne în compoziția sa.Frecvența transducției totale este de la 1 la 1 milion la 1 la 100 de milioane. Transducția specifică are loc mai des.

S-a stabilit că un fragment din cromozomul donatorului transferat în celula primitorului nu este întotdeauna inclus în cromozomul primitorului, dar poate fi păstrat în citoplasma celulei. Când bacteriile se divid, intră doar într-una dintre celulele fiice. Această condiție se numește transducție abortivă.

Transducția generală

Mecanismul său constă în faptul că, în procesul de reproducere intracelulară a unui fag, un fragment de ADN bacterian de lungime egală cu cel al fagului poate fi inclus accidental în capul său în locul ADN-ului fagului. Acest lucru este foarte posibil, deoarece într-o celulă infectată biosinteza ADN-ului său este blocată, iar ADN-ul însuși suferă dezintegrare. Astfel, în procesul de reproducere a fagilor, apar virioni defecte, în care capetele în loc de propriul ADN genomic conțin un fragment de ADN al unei bacterii. Astfel de fagi păstrează proprietăți infecțioase. Sunt adsorbite pe celula bacteriană, introduc în ea ADN-ul conținut în cap, dar fagul nu se înmulțește. ADN-ul donatorului (un fragment al cromozomului donatorului) introdus în celula primitorului, dacă conține gene care sunt absente la primitor, îl înzestrează cu o nouă trăsătură. Această caracteristică va depinde de gena (genele) care a intrat în capul fagului transductor. În cazul recombinării unui fragment de ADN al donorului introdus de fag cu cromozomul celulei primitoare, această trăsătură este fixată ereditar.

Transducția specifică

Diferă de nespecific prin faptul că, în acest caz, fagii transductori poartă întotdeauna doar anumite gene, și anume, cele care sunt situate pe cromozomul celulei lizogene în stânga lui attL sau în dreapta attR. Transducția specifică este întotdeauna asociată cu integrarea fagului temperat în cromozomul celulei gazdă. Când părăsește (excluderea) din cromozom, profagul poate capta gena din flancul stâng sau drept, de exemplu, fie gal, fie bio. Dar în acest caz, trebuie să piardă aceeași dimensiune a ADN-ului său de la capătul opus, astfel încât lungimea sa totală să rămână neschimbată (altfel nu poate fi împachetat în capul fagului). Prin urmare, cu această formă de excludere se formează fagi defecte: A - dgal sau Xdbio.

transducție specifică la E coli efectuează nu numai fagul lambda, ci și lambdoidul înrudit și alți fagi. În funcție de locația site-urilor attB pe cromozom, atunci când sunt excluse, ele pot activa diverse gene bacteriene legate de profage și le pot transduce în alte celule. Materialul integrat în genom poate înlocui până la 1/3 din materialul genetic al fagului.

Fagul transductor, în cazul infecției celulei primitoare, se integrează în cromozomul său și introduce o nouă genă (trăsătură nouă) în acesta, mediand nu numai lizogenizarea, ci și conversia lizogenă.

Astfel, dacă în timpul transducției nespecifice fagul este doar un purtător pasiv al materialului genetic, atunci în timpul transducției specifice, fagul include acest material în genomul său și îl transferă, bacterii lizogenizante, către receptor. Cu toate acestea, conversia lizogenă poate apărea și dacă genomul fagului temperat conține propriile sale gene, care sunt absente în celulă, dar sunt responsabile pentru sinteza proteinelor esențiale. De exemplu, numai acei agenți patogeni ai difteriei au capacitatea de a produce exotoxină, în cromozomul căruia este integrat un profag moderat care poartă operonul tox. Este responsabil pentru sinteza toxinei difterice. Cu alte cuvinte, fagul tox temperat provoacă conversia lizogenă a bacilului difteric non-toxigen în toxigen.

Orez. patru.

1 - test la fața locului; 2 - titrare conform Grazia.

Metoda stratului de agar este următoarea. Mai întâi, un strat de agar nutritiv este turnat în vas. După solidificare, în acest strat se adaugă 2 ml de agar topit și răcit la 45 ° C 0,7%, la care se adaugă mai întâi o picătură de suspensie bacteriană concentrată și un anumit volum de suspensie de fagi. După ce stratul superior se întărește, cupa este plasată într-un termostat. Bacteriile se înmulțesc în interiorul stratului moale de agar, formând un fundal solid opac, pe care coloniile de fagi sunt clar vizibile sub formă de pete sterile (Fig. 4.2). Fiecare colonie este formată prin multiplicarea unui virion fag părinte. Utilizarea acestei metode vă permite să:

a) determinați cu precizie numărul de virioni fagi viabili dintr-un material dat prin numărarea coloniilor;

b) prin trăsături caracteristice (mărime, transparență etc.), să studieze variabilitatea ereditară a fagilor V.

În funcție de spectrul de acțiune asupra bacteriilor, fagii sunt împărțiți în polivalent(bacteriile legate de liză, de exemplu, fagul polivalent Salmonella lizează aproape toate Salmonella), monofage(ele lizează bacteriile dintr-o singură specie, de exemplu, fagul Vi-I lizează doar agenții cauzatori ai febrei tifoide) și specifice tipului fagi care lizează selectiv variante individuale de bacterii din cadrul unei specii. Cu ajutorul unor astfel de fagi se realizează cea mai subtilă diferențiere a bacteriilor în cadrul unei specii, cu împărțirea lor în variante de fagi. De exemplu, folosind un set de fagi Vi - II, agentul cauzal al tifoidului este împărțit în mai mult de 100 de variante de fagi. Deoarece sensibilitatea bacteriilor la fagi este o caracteristică relativ stabilă asociată cu prezența receptorilor corespunzători, tiparea fagilor are o mare importanță diagnostică și epidemiologică.

Cuprinsul subiectului „Elemente genetice ale bacteriilor. Mutații în bacterii. Transducție.”:
1. Migrarea elementelor genetice ale bacteriilor. Transpozonii. Bacteriofagii ca elemente genetice migratoare.
2. Mutație. mutații la bacterii. Mutageni. mutatii spontane. Mutații ale spatelui (reversiuni).
3. Mutații induse ale bacteriilor. mutageneza chimică. mutageneza radiatiilor. Tipuri de mutații.
4. Repararea ADN-ului bacteriilor. Sisteme de reparare a ADN-ului. Compensarea funcțiilor afectate ca urmare a mutațiilor. Suprimare tragedia. Suprimarea extragenă.
5. Transfer de ADN bacterian. conjugarea bacteriană. Factorul F al bacteriilor.
6. Transformarea bacteriilor. Etapele transformării bacteriene. Cartografierea cromozomilor bacterieni.

8. Proprietăţile bacteriilor. Modificări nemoștenite ale proprietăților bacteriilor. S - colonii. R - colonii. M - colonii. D - colonii bacteriene.

transducție- transferul de către un bacteriofag în celula infectată a fragmentelor din materialul genetic al celulei care a conținut inițial bacteriofagul. bacteriofag transducător transferă de obicei doar o mică bucată de ADN gazdă de la o celulă (donator) la alta (destinatar).

Alocat trei tipuri de transducție: nespecifice(general), specificși avortiv. Într-o celulă infectată cu un bacteriofag, fragmente de ADN bacterian sau plasmide pot pătrunde în capetele unor fagi împreună cu ADN-ul viral în timpul adunării populației fiice. Virușii sunt limitati în cantitatea de material genetic în funcție de volumul capului. Dacă ADN-ul unei celule bacteriene este scindat de un fag într-un loc atipic, atunci pentru a face loc unui fragment de ADN cromozomial, unele secțiuni ale ADN-ului viral sunt „sacrificate”, ceea ce duce la pierderea anumitor funcții ale acestora. . În acest caz, particula de fag poate deveni defecte. Numărul de fagi anormali poate ajunge la 0,3% din întreaga populație de fiice.

Fagul rezultat este particula care provoacă transducție nespecifică (generală).. Cu acest formular transducție practic orice genă poate fi introdusă în celulele primitoare.

Cu transducție nespecifică de către fag orice fragment din ADN-ul gazdei poate fi transferat, dar cu unul specific se pot transfera doar fragmente de ADN strict definite. Cel mai cunoscut exemplu de transducție specifică este transducția mediată de fagi. Deoarece acest fag, la trecerea la starea profag, este inclus în cromozomul bacterian între genele care codifică sinteza galactozei și biotinei, aceste gene le poate transfera în timpul transducției. În timpul transducției abortive, fragmentul introdus de ADN donor nu este integrat în genoforul receptorului, ci rămâne în citoplasmă, unde ADN-ul său este transcris dar nu este replicat. Acest lucru duce la faptul că în timpul diviziunii celulare este transmis doar uneia dintre celulele fiice (adică este moștenit uniliniar) și apoi se pierde în urmași.

Proprietăți de transducere a particulelor fagice următoarele:

Particulele transportă doar o parte ADN fagic, adică nu sunt viruși funcționali, ci mai degrabă recipiente care poartă fragmente de ADN bacterian.

ca alţii virusuri defecte, particulele nu sunt capabile de replicare.

Fagi transductori poate conține o parte a cromozomului gazdă cu gene care oferă bacteriei primitoare un anumit avantaj (de exemplu, gene de rezistență la antibiotice sau gene care codifică capacitatea de a sintetiza diferite substanțe). Această dobândire de noi proprietăți de către bacterii se numește fenomen de lizogenie.

Fenomenul de transducție poate fi folosit pentru cartografierea cromozomului bacterian dacă se respectă aceleași principii ca și pentru cartografierea folosind fenomenul de transformare.