Diagnosticul de laborator al infecțiilor virale

Se efectuează diagnosticul etiologic al bolilor virale metode virologice, virologice, serologice și genetice moleculare. Ultimele trei metode pot fi utilizate ca metode de diagnostic expres.

Metoda de diagnostic virologic.

Scopul final al metodei este de a identifica virusurile la o specie sau o variantă serologică. Metoda virologică cuprinde mai multe etape: 1) selectarea materialului pentru cercetare; 2) prelucrarea materialelor care conțin viruși; 3) contaminarea cu materiale a sistemelor vii sensibile; 4) indicarea virușilor în sistemele vii; 5) titrarea virusurilor izolate; 6) identificarea virusurilor în reacțiile imune.

1. Selectarea materialului pentru cercetare. Se efectuează în stadiile incipiente ale bolii, sub rezerva regulilor care împiedică contaminarea materialului cu microfloră străină și infectarea personalului medical. Pentru a preveni inactivarea virusului în timpul transportului, materialul este plasat într-un mediu de transport viral (VTS) constând din soluție echilibrată de sare, antibiotice și albumină serică. Materialul este transportat într-un container special cu izolație termică și pungi de plastic închise care conțin gheață. Dacă este necesar, materialul este depozitat la -20˚C. Fiecare eșantion de material pentru cercetare trebuie să fie etichetat și etichetat cu numele pacientului, tipul de material, data prelevării, diagnosticul clinic detaliat și alte informații.

În funcție de natura bolii, materialul pentru studiu poate fi: 1) tampoane din partea nazală a faringelui și un tampon din faringe; 2) lichid cefalorahidian; 3) fecale și tampoane rectale; 4) sânge; 5) urină; 6) lichid din cavitățile seroase; 7) frotiu din conjunctivă; 8) conținutul veziculelor; 8) material secţional.

Pentru obtinerea înroșirea din orofaringe utilizați 15-20 ml de VTS. Pacientul clătește cu atenție gâtul VTS timp de 1 minut și colectează spălarea într-un flacon steril.

Un frotiu din peretele faringian posterior se ia cu un tampon de vată steril, apăsând pe rădăcina limbii cu o spatulă. Tamponul se pune în 2-3 ml de VTS, se clătește și se stoarce.

fluid cerebrospinal obținut prin puncție lombară. 1-2 ml de lichid cefalorahidian se pun intr-un recipient steril si se livreaza la laborator.

Probele de fecale se prelevează în 2-3 zile în flacoane sterile. Din materialul obținut se prepară o suspensie 10% folosind soluția lui Hank. Suspensia se centrifuge la 3000 rpm, se colectează supernatantul, se adaugă antibiotice și se plasează într-un recipient steril.

Sângele obţinut prin puncţie venoasă într-un volum de 5-10 ml se defibrinează prin adăugare de heparină. Sângele integral nu este înghețat și nu se adaugă antibiotice. Pentru a obține ser, probele de sânge sunt incubate la 37°C timp de 60 de minute.

Lichidul din cavitățile seroase se obține prin puncție în cantitate de 1-2 ml. Lichidul se folosește imediat sau se păstrează congelat.

Se prelevează un frotiu din conjunctivă cu un tampon steril și se introduce în VTS, după care materialul este centrifugat și înghețat.

Conținutul veziculelor aspirat cu o seringă cu un ac subțire și introdus în VTS. Materialul este trimis la laborator sub formă de frotiuri uscate pe lame de sticlă sau în capilare sau fiole sterile sigilate.

material secţional luate cât mai curând posibil, cu respectarea regulilor de asepsie. Se folosesc seturi separate de instrumente sterile pentru a colecta fiecare probă. Cantitatea de țesuturi selectate este de 1-3 g, care sunt plasate în flacoane sterile. În primul rând, se prelevează probe de organe extracavitare (creier, ganglioni limfatici etc.). Țesuturile cavității toracice sunt prelevate înainte de deschiderea cavității abdominale. Probele de țesut rezultate sunt măcinate într-un mortar cu adăugarea de nisip steril și soluție sterilă de clorură de sodiu, după care materialul este centrifugat. Supernatantul este colectat în flacoane, se adaugă antibiotice. Materialul pentru cercetarea virusologică se utilizează imediat sau se păstrează la -20°C.

2. Prelucrarea materialului care conține viruși. Se efectuează pentru a elibera materialul de microflora bacteriană însoțitoare. Pentru aceasta se folosesc metode fizice și chimice. Metode fizice: 1) filtrare prin diverse filtre bacteriene; 2) centrifugare. Metode chimice: 1) tratarea materialului cu eter în cazurile de izolare a virusurilor care nu au supercapsidă; 2) adăugarea unui amestec de heptan și freon la material; 3) introducerea antibioticelor (penicilina - 200-300 U/ml; streptomicina - 200-500 μg/ml; nistatina - 100-1000 U/ml).

animale de laborator. Se folosesc șoareci albi, cobai, hamsteri, iepuri etc.. Șoarecii albi sunt cei mai sensibili la un număr mare de tipuri de virusuri. Modul de infectare a animalelor este determinat de tropismul virusului la țesuturi. Infecția la nivelul creierului este utilizată în izolarea virusurilor neurotropice (virusuri rabice, poliovirusuri etc.). Infecția intranazală se efectuează atunci când agenții patogeni ai infecțiilor respiratorii sunt izolați. Utilizate pe scară largă intramusculară, intravenoasă, intraperitoneală, subcutanată și alte metode de infecție. Animalele bolnave sunt eutanasiate cu eter, deschise și materialul este prelevat din organe și țesuturi.

embrioni de pui. Disponibil pe scară largă și ușor de utilizat. Aplicați embrioni de pui cu vârsta cuprinsă între 5 și 14 zile. Înainte de infectare, embrionii de pui sunt ovoscopați: viabilitatea lor este determinată, marginea sacului aerian și locația embrionului („ochiul întunecat” al embrionului) sunt marcate pe coajă. Lucrul cu embrionii de pui se desfășoară într-o cutie sterilă cu instrumente sterile (pensete, seringi, foarfece, sulițe etc.). După finalizarea unui fragment din lucrare, instrumentele sunt scufundate în alcool etilic 70% și arse înainte de următoarea manipulare. Înainte de infectare, coaja unui embrion de pui este șters cu un tampon cu alcool arzând și o soluție alcoolică de iod. Volumul materialului de testat injectat în embrion este de 0,1-0,2 ml. Cel puțin 4 embrioni de pui sunt utilizați pentru a izola virușii dintr-un material.

Infecție în cavitatea alantoidei. Oul de gaina se aseaza vertical, cu airbag-ul sus. În centrul polului contondent al oului de deasupra sacului de aer, coaja este străpunsă, se introduce un ac pentru injecții intramusculare la 2-3 mm sub marginea sacului de aer, iar materialul de testat este injectat cu o seringă cu tuberculină. Puncția din coajă este închisă cu parafină topită sau bandă adezivă.

Infecție în cavitatea amnionică. O fereastră de 1 x 1 cm este tăiată deasupra sacului de aer al unui ou situat vertical și o parte a membranei corion-alantoide de deasupra corpului embrionului este îndepărtată cu grijă. Materialul de testat este injectat în el cu o pensetă folosind o seringă cu tuberculină. Amnionul este adus în poziția inițială prin eliberarea pensetei. Orificiul din carcasă este închis cu bandă adezivă.

Infecție pe membrana corion-alantoidiană. Deasupra camerei de aer a unui ou situat vertical, o bucată de coajă este tăiată, creând o fereastră. Apoi, coaja este dezlipită de sub coajă, expunând zona învelișului corion-alantoic, pe care este aplicat materialul de testat. Orificiul din carcasă este sigilat cu bandă adezivă.

Infecție în sacul vitelin. Oul este depus orizontal, astfel încât corpul embrionului să fie în partea de jos, iar gălbenușul să fie deasupra lui. Un ac pentru injecții intramusculare este introdus prin puncția cochiliei în zona sacului de aer de-a lungul axei centrale a oului la o adâncime de 2/3 din lungimea acului, iar materialul de testat este injectat cu o seringă. Orificiul din carcasă este sigilat cu bandă adezivă.

După infectare, embrionii sunt incubați într-un termostat, cu capătul tocit. Temperatura și durata incubației depind de proprietățile biologice ale virusului izolat. La sfârșitul incubației, embrionii sunt răciți la +4°C timp de 16-18 ore.După aceasta, embrionul de pui este deschis steril prin tăierea unei orificii în coajă deasupra sacului de aer deasupra marginii desemnate. Alantoic, apoi lichidul amniotic este aspirat cu o pipetă Pasteur sau cu o seringă, membrana corion-alantoică este tăiată pentru studiu, restul conținutului oului este îndepărtat într-o cutie Petri. Lichidele alantoice și amniotice sunt folosite pentru a indica viruși.

Culturi de organe. Acestea sunt secțiuni de organe pregătite corespunzător, care in vitro își păstrează structura și funcțiile timp de câteva zile și uneori săptămâni. Culturile de organe sunt cultivate pe suprafața unui mediu nutritiv lichid folosind o „plută” sau „platformă”. Infecția culturii de organe se realizează prin introducerea bucăților de organ sau țesut într-o eprubetă cu materialul de testat. Adsorbția virusului se realizează timp de 1-2 ore la temperatura camerei. Apoi materialul de testat este drenat, fragmentele de organ sau țesut sunt spălate în soluție Hank, plasate într-un vas de cultură, se adaugă un mediu nutritiv și se păstrează într-un termostat. Prelevarea de probe de material pentru detectarea virusului în cultura de țesut începe în a 2-a zi de cultură.

Culturi celulare. Cultura celulară este o populație de același tip de celule ale unui organism animal sau uman, care este crescută în condiții artificiale și este destinată cultivării virușilor. După durata de viață, culturile celulare se împart în: 1) primare; 2) semitransplantabil; 3) transplantabil.

Culturi de celule primare obţinute din ţesuturi animale şi umane prin dezintegrarea lor enzimatică. Bucățile de țesut sunt plasate într-o soluție de tripsină 0,25% la o temperatură de 37°C și amestecate periodic. Ca rezultat, celulele tisulare se separă unele de altele. Porțiuni de celule sunt colectate pe măsură ce sunt separate, centrifugate, tripsina este drenată, se adaugă mediul de creștere și celulele sunt suspendate în acesta. Culturile de celule primare pot suferi până la 10 diviziuni in vitro, sunt foarte sensibile la mulți virusuri, pot fi obținute în cantități mari și sunt sigure din punct de vedere oncogenic. Dezavantajul culturilor primare este laboriozitatea semnificativă și durata producției, precum și posibila contaminare cu viruși latenți. Culturile de celule primare includ celule de rinichi ale unui embrion uman, maimuță rhesus, embrion de porc, fibroblaste de embrion de pui.

Culturi celulare semi-permanente sunt celule diploide de același tip, care sunt capabile să sufere până la 100 de diviziuni in vitro, menținând în același timp setul diploid original de cromozomi. Culturile de celule semi-transplantabile includ fibroblaste embrionare umane (Fig. 2). Aceste celule sunt extrem de solicitante în condițiile de cultivare, prin urmare, sunt de utilizare limitată în practica laboratoarelor virologice.

Culturi celulare continue sunt același tip de tumoră sau celule normale umane și animale cu un cariotip alterat, capabile de creștere nelimitată în condiții in vitro. Culturile de celule continue sunt ușor de cultivat și, prin urmare, sunt utilizate pe scară largă în diagnosticul de laborator al bolilor virale la om. Culturile de celule transplantate includ HeLa (celule de carcinom de col uterin uman), KB (celule de carcinom al cavităţii bucale umane), Vero (celule de rinichi de maimuţă verde), SPEV (celule de rinichi embrionari de porc), etc.

Cultivarea culturilor celulare, indiferent de tipul lor, se realizează în condiții sterile în vase speciale de sticlă plate - saltele, în care se introduce un mediu nutritiv. În partea de jos a saltelei, celulele în timpul reproducerii formează un monostrat.

Pentru cultivarea culturilor celulare se folosesc medii nutritive speciale, care conțin cantități fiziologice de aminoacizi, carbohidrați, săruri minerale și având pH=7,2-7,4. Alături de nutrienții din mediu există un indicator care schimbă culoarea mediului atunci când pH-ul trece de la valoarea optimă. Cele mai utilizate atunci când se lucrează cu culturi celulare sunt: ​​mediu 199, mediu cu ac. Mediul 199 include 60 de componente și este utilizat pentru cultivarea celulelor tripsinizate continue și primare. Medium Needle conține un set minim de aminoacizi (13) și vitamine (8). Este utilizat pentru cultivarea culturilor celulare diploide și continue.

Cultivarea celulelor trebuie efectuată în condiții aseptice și, prin urmare, antibioticele (de exemplu, penicilină și streptomicina) sunt adăugate în mediile nutritive.

4. Indicarea virusurilor în sistemele vii. Indicația virușilor este detectarea virusurilor în materialul de testat fără a stabili apartenența acestora la o familie, gen, specie sau serovariant.

Indicarea virusurilor la animalele de laborator. Prezența virusurilor în organism este indicată în primul rând de dezvoltarea simptomelor bolii sau moartea animalului. Se prelevează probe de organe și țesuturi afectate de la un animal mort sau eutanasiate în prealabil cu eter, se pun într-un mortar de porțelan, se adaugă soluție de sare și se freacă cu nisip. Suspensia rezultată este centrifugată pentru a precipita resturile tisulare. În supernatant, virusurile sunt indicate prin hemaglutinare, fixarea complementului sau alți antigeni.

Detectarea virusului în embrioni de pui.În lichidul amniotic și alantoic, indicarea virusurilor se realizează în reacția de hemaglutinare (RGA). Când un embrion de pui este infectat, pe membrana corion-alantoidiană se găsesc adesea plăci sau urme, care sunt leziuni specifice virusului. Indicarea virusurilor în membrana corion-alantoică se realizează în reacțiile de hemaglutinare sau fixare a complementului (RCC). Pentru a face acest lucru, coaja este măcinată într-un mortar, se prepară o suspensie, care este centrifugată pentru a precipita detritusul tisular, iar supernatantul este examinat în RGA sau RSK.

Indicarea virusurilor în culturi de organe și celule efectuat conform: 1) efectul citopatic al virusurilor (CPE); 2) formarea incluziunilor intracelulare; 3) în reacția de hemaglutinare; 4) prin formarea plăcii; 5) după eșantion de culoare; 6) în funcție de reacția de hemadsorbție.

JPC- Acestea sunt modificări morfologice în cultura de organe și celule care apar în procesul de reproducere a virusurilor în celule. Virușii care provoacă CPP se numesc citopatogene. Natura CPD depinde de proprietățile biologice ale virusurilor, de doza virusului, de proprietățile celulelor și de condițiile de cultivare a acestora. CPD a virusurilor se poate manifesta prin necroză, formare de clustere, formare de symplasto- și sincitium, degenerare a celulelor rotunde, proliferare celulară și distrugere focală.

Cu CPD necrotic al poliomielitei, Coxsackie, virusurile ECHO, majoritatea celulelor sunt complet distruse, celulele rămase sunt încrețite (picnoza nucleului și a membranei citoplasmatice, vacuolizare), sunt caracterizate prin birefringență - o strălucire puternică la microscopie.

CPE după tipul de grupare este tipic pentru adenovirusuri, în timp ce celulele sunt rotunjite, mărite, se contopesc parțial unele cu altele odată cu formarea de clustere (Fig. 3).

Syncytium este format din celule conectate prin punți citoplasmatice, în timp ce symplast este o celulă mare multinucleată formată ca urmare a multiplelor mitoze incomplete.

CPD a virusurilor în funcție de tipul de degenerare a celulelor rotunde se caracterizează prin rotunjirea celulelor și pierderea conexiunilor lor intercelulare. Se pot observa și picnoza, încrețirea și distrugerea celulelor (Fig. 5).

În virusurile oncogene, CPE se poate manifesta ca transformarea celulelor în cele maligne, care este însoțită de proliferarea celulară intensivă și formarea de structuri celulare multistrat. CPE ale unor tulpini de virusuri gripale, vaccinia, variola se manifestă prin distrugerea focală a culturii celulare - pe fondul monostratului păstrat în ansamblu, apar focare de afectare celulară (microplaci).

În absența sau CPE ușoară, noi culturi de celule sunt infectate cu lichidul de cultură.

Incluziuni intracelulareîn citoplasmă sau nucleul celulelor se formează în timpul reproducerii virusurilor rabiei, variolei, gripei, herpesului, adenovirusurilor etc.. Incluziunile intracelulare sunt grupuri cristaline de virioni. Incluziunile sunt detectate prin microscopie cu imersie în lumină după colorarea ochelarilor cu un monostrat conform Romanovsky-Giemsa, sau prin microscopie cu fluorescență după tratamentul cu portocaliu de acridină. Când sunt colorate conform Romanovsky-Giemsa, incluziunile virale capătă o culoare roz sau roz-liliac. Atunci când sunt colorate cu portocaliu de acridină, structurile ADN emană o strălucire verde, în timp ce structurile ARN emană o culoare portocalie-roșiatică. În prezent, depistarea incluziunilor intracelulare se realizează în diagnosticul rabiei (corpii Babes-Negri) (Fig. 6). Anterior, cu variola naturală, s-a efectuat depistarea corpurilor Guarneri.

Formarea plăcilor. Plăcile sunt focare de celule primare infectate cu virusul distruse ale monostratului de sub învelișul de agar. Plăcile sunt detectate prin colorarea culturii cu roșu neutru, care este fie inclusă în acoperirea cu agar, fie adăugată imediat înainte ca rezultatele să fie înregistrate. Deoarece plăcile constau din celule moarte care nu percep colorantul, ele sunt, prin urmare, vizibile ca pete luminoase pe fundalul unui monostrat roz-roșu de celule vii. Contabilitatea formării plăcii este efectuată pentru o analiză cantitativă a activității infecțioase a celulelor.

mostra de culoare. Mediile 199 și Needle, în care se cultivă culturi celulare, au o culoare purpurie, pH=7,2-7,4 și conțin un indicator care modifică culoarea mediului cu o modificare a pH-ului. Atunci când culturile celulare neinfectate cu virusul sunt cultivate în aceste medii, culoarea mediului se schimbă în portocaliu datorită eliberării de către celule a produselor metabolice acide. Celulele infectate cu virus sunt distruse ca urmare a suprimării metabolismului prin reproducerea virală, precum și ca urmare a CPE a virușilor, iar citoplasma alcalină a celulelor intră în mediu fără a-și schimba culoarea (mediul rămâne roșu) .

Reacția de hemaglutinare (RHA) se bazează pe capacitatea unor virusuri care conțin aglutinină pe învelișul lor exterior de a lipi (aglutina) eritrocitele anumitor specii de animale. Pentru RGA, se folosește un material care conține virus fără celule (lichid alantoic sau amniotic, supernatant de cultură de țesuturi). Lichidul care conține virusul este amestecat cu 0,5 ml soluție izotonică de clorură de sodiu și 0,5 ml suspensie 1% de eritrocite spălate, după care este incubat la 37˚, 20˚ sau 4˚C timp de 30-60 de minute. Cu un control negativ, dezvoltarea aglutinarii în experiment indică prezența virusului în lichidul de testat. Martorul este un amestec de 0,5 ml de eritrocite cu un volum egal de soluție izotonică de clorură de sodiu care nu conține virusul.

Reacția de hemadsorbție (RGads) face posibilă detectarea virusurilor care conțin hemaglutinină în culturile celulare înainte de dezvoltarea CPD (Fig. 7). Hemadsorbția se observă numai dacă hemaglutinina virusului este prezentă pe membrana citoplasmatică a celulelor de cultură. Rgads se efectuează prin adăugarea a 0,2 ml dintr-o suspensie 0,5% de eritrocite la cultura celulară, după care celulele sunt păstrate timp de 15-20 de minute la 37˚, 20˚ sau 4˚C (în funcție de proprietățile virusului) . Apoi tuburile sunt agitate pentru a elimina eritrocitele neadsorbite și acumularea lor pe celule individuale sau pe întregul monostrat se ia în considerare la o mică mărire a microscopului. Pe celulele neinfectate cu viruși nu se observă adsorbția eritrocitelor.

5. Titrarea virusurilor izolate - aceasta este o etapă obligatorie a metodei de diagnostic virologic, al cărei scop este de a cuantifica conținutul de particule virale pe unitatea de volum a materialului de testat.

Metode de titrare a virusurilor izolate de la animale de laborator prevăd determinarea dozei (titrului) la care agentul patogen provoacă moartea a 50% din animalele infectate sau simptomele caracteristice bolii. Titrul virusului este exprimat în LD 50 - doză letală sau ID 50 - doză infecțioasă.

Titrarea virusurilor izolate din embrioni de pui iar care posedă activitate hemaglutinantă se realizează într-o reacție de hemaglutinare. RGA se realizează în eprubete sau în tablete speciale. Din materialul care conține virus se prepară diluții de două ori în 0,5 ml de soluție izotonă de clorură de sodiu. Adăugați 0,5 ml suspensie de eritrocite în toate tuburile. Martorul este un amestec de 0,5 ml de eritrocite cu același volum de soluție izotonică de clorură de sodiu care nu conține viruși. În funcție de proprietățile virusului studiat, amestecul este incubat într-un termostat la 37˚, 20˚ și 4˚C. Rezultatele reacției sunt luate în considerare la 30-60 de minute după sedimentarea completă a eritrocitelor în control: (++++) - aglutinare intensivă și rapidă a eritrocitelor, sedimentul are formă în formă de stea cu margini festonate (" umbrelă"); (+++) - sedimentul eritrocitar are goluri; (++) - precipitat mai puțin pronunțat; (+) - sediment eritrocitar floculent înconjurat de o zonă de bulgări de eritrocite aglutinate și (-) - un sediment eritrocitar bine definit ("coloană de monede"), la fel ca și în control. Titrul virusului în timpul RGA este cea mai mare diluție a acestuia, la care se observă încă aglutinarea eritrocitelor. Se consideră că această diluție conține o unitate hemaglutinantă de virus (1 HAU). Diluțiile care preced 1 HAU vor conține de 2 ori cantitatea de HAU comparativ cu diluția ulterioară din acestea. De exemplu, dacă 1 GAU corespunde unei diluții de 1:64, atunci o diluție de 1:32 va corespunde cu 2 GAU, iar diluțiile de 1:16 și 1:8 vor corespunde la 4 și, respectiv, 8 GAU. Titrul de virus de 4 HAU este de obicei folosit pentru a identifica viruși.

Titrarea virusurilor în culturi celulare efectuat prin CPP, formarea plăcii și testul de culoare.

Titrul virusului atunci când este determinat în culturi de celule prin CPE este cea mai mare diluție a materialului care conține virus în care virusul este capabil să provoace CPE în 50% din culturile de celule infectate. Această valoare se numește doză citopatică tisulară de 50% (TCD 50). Titrarea virusului prin CPE include următoarele etape: 1) inocularea, cultivarea și selecția culturilor în eprubetă de celule cu un monostrat format; 2) obţinerea de diluţii de 10 ori de material care conţine virus; 3) infectarea culturilor celulare cu diferite diluții ale virusului; 4) menținerea culturilor celulare într-un termostat la 37˚; 5) luarea în considerare a rezultatelor timp de 5-7 zile conform sistemului de plusuri (++++) și prelucrarea statistică a rezultatelor. Pentru a obține rezultate sigure din punct de vedere statistic, trebuie respectate o serie de reguli: a) utilizarea a cel puțin 4 culturi tubulare de celule pentru infectarea cu 1 diluție a virusului; b) includerea în seria de titrare a 2 diluții ale virusului - sub și peste CPP 50.

Titrarea virusurilor în culturi celulare prin formarea plăcii este una dintre cele mai sensibile și precise metode pentru determinarea cantitativă a virusurilor. Cu toate acestea, metoda este complexă din punct de vedere tehnic și este utilizată în principal în cercetarea științifică.

Titrarea virusurilor în culturi celulare prin metoda testului de culoare este concepută pentru a determina cea mai mare diluție a materialului care conține virus, la care culoarea mediului care conține suspensia celulară la o concentrație de 200.000 de celule la 1 ml își schimbă culoarea. După stabilirea titrului virusului, se prepară o doză de lucru - 100 TCD 50, care este utilizată în identificarea virusurilor.

6. Identificarea virusurilor în reacțiile imune. Identificarea sau titrarea virusurilor este stabilirea variantei, speciilor, genericelor și afilierii acestora. Identificarea virușilor se realizează după principiul: definirea necunoscutului prin cunoscut. O componentă binecunoscută în identificarea virusurilor sunt serurile antivirale specifice (antigripală, antirujeola etc.), care sunt utilizate în testele de neutralizare serologică (RN), inhibarea hemadsorbției (RTGads), inhibarea hemaglutinării (RTGA), RPHA, RSK, precum și în ELISA și RIA. Aceste seruri conțin anticorpi antivirali specifici și se numesc diagnostic.

Reacția de neutralizare (RN) poate fi efectuat pe culturi celulare, embrioni de pui și animale. Amestecuri de neutralizare sunt preparate în eprubete, constând din volume egale de material care conține virus (de obicei 100 TCD50 de virus în 1,0 ml) și ser de diagnostic (1,0 ml). După agitare temeinică, amestecurile preparate sunt păstrate pentru interacțiune timp de 3 ore la 37°C. Apoi, amestecurile de neutralizare sunt introduse într-o cultură de celule sensibile, care este incubată la 37°C timp de 5-7 zile, după care se iau în considerare rezultatele CPE și proba de culoare (Tabelul 1).

Lucrări de curs

„Metode de virologie clinică”

Introducere

Diagnosticul de laborator al infecțiilor virale se realizează în principal folosind microscopie electronică, culturi de celule sensibile și metode imunologice. De regulă, se alege orice metodă pentru diagnostic, în funcție de stadiul infecției virale. Astfel, de exemplu, toate cele trei abordări pot fi utile în diagnosticul varicelei, dar utilizarea cu succes a metodelor de microscopie și cultură celulară depinde de capacitatea de a colecta probe satisfăcătoare într-un stadiu relativ incipient al bolii.

În mare măsură, succesul diagnosticului viral depinde și de calitatea probelor obținute. Din acest motiv, personalul laboratorului însuși ar trebui să fie direct implicat în colectarea probelor necesare. Caracteristicile probelor, precum și metodele de livrare a acestora în laborator, sunt descrise de Lennett, Schmidt, Krist și colab.

Majoritatea reactivilor și instrumentelor utilizate în diagnosticarea de laborator sunt disponibile de la diverse companii. În cele mai multe cazuri, același reactiv este produs simultan de mai multe companii. Din acest motiv, nu am enumerat firme individuale, cu excepția cazului în care reactivul este furnizat de o singură firmă. În toate celelalte cazuri, ar trebui să vă referiți la lista generală a furnizorilor indicată în tabel. unu.

Nu am urmărit o descriere cuprinzătoare a tuturor metodelor disponibile în prezent pentru diagnosticarea infecțiilor virale umane. În primul rând, am descris principalele metode. Pe măsură ce câștigați experiență cu munca independentă, aceste metode de bază pot fi folosite pentru a rezolva probleme mai complexe.

1. Microscopia electronică

Pentru diagnosticul microscopic electronic al infecțiilor virale, se pot utiliza secțiuni subțiri ale țesutului afectat. Cel mai comun material pentru microscopia electronică sunt fecalele sau lichidul.

Tabelul 1. Lista companiilor furnizoare de reactivi și echipamente

vezicule care caracterizează anumite boli, cum ar fi varicela. În analiza unui astfel de material, virușii pot fi detectați folosind colorarea negativă, ceea ce duce la delimitarea componentelor virionului cu material dens în electroni. Metoda este eficientă la concentrații mari de virus în probele de testat, cum ar fi în fecale sau în lichidul vezicular. În cazurile în care conținutul de particule virale din probe este scăzut, probabilitatea detectării virusului poate fi crescută prin concentrarea virusului prin ultracentrifugare sau prin agregarea acestuia cu anticorpi specifici. Această din urmă metodă este, de asemenea, convenabilă pentru identificarea virușilor. Aici descriem metoda microscopică electronică pentru diagnosticarea infecției cu rotavirus și metoda microscopiei imunoelectronice folosind exemplul de detectare a anticorpilor specifici la parvovirusuri. Metodele de microscopie electronică sunt descrise mai detaliat de Field.

2.1 Microscopia electronică directă a fecalelor

1. Capătul pipetei Pasteur este scufundat în fecale și se colectează suficient material pentru a obține un frotiu de 1 cm.

2. Resuspendați frotiul fecal în colorant negativ la microscop electronic până când se obține o suspensie translucidă. Pata de contrast negativ este o soluție 2% de acid fosfotungstic în apă distilată.

3. Pentru a obține un preparat microscopic electronic, o picătură de suspensie este plasată pe o rețea de microscopie electronică acoperită cu un film de carbon-formvar. În timpul acestei operațiuni, plasa este ținută cu o pensetă fină.

4. Medicamentul este lăsat în aer timp de 30 de secunde.

5. Excesul de lichid este îndepărtat prin atingerea marginii paharului cu hârtie de filtru.

6. Medicamentul este uscat în aer.

7. Dacă este necesar, virusul viabil este inactivat prin iradierea ambelor părți ale rețelei cu lumină ultravioletă la o intensitate de 440.000 μW-s/cm2. În acest caz, se folosește o lampă ultravioletă cu undă scurtă cu filtru. Lampa trebuie să fie la o distanță de 15 cm de grilă; timpul de iradiere a fiecărei părți - 5 min.

8. Virionii rotavirus pot fi caracterizați la microscop electronic cu transmisie cu o mărire de 30.000 până la 50.000.

2.2 Microscopia imunoelectronică

Metoda de microscopie imunoelectronică descrisă mai jos este doar una dintre multele astfel de metode imunologice. Pentru a studia anticorpii specifici virusului, în plus, se folosește o metodă care implică legarea la o rețea microscopică a proteinei A. Concentrația de lucru a anticorpilor antivirali este determinată prin încercare și eroare în intervalul de la 1/10 la 1/1000. Concentrația indicată de noi, de regulă, este folosită în munca de rutină. Pentru a obține rezultate optime ale interacțiunii anticorpilor cu virusul, serul care conține parvovirus este titrat în același mod.

1. 10 pl de antiser uman parvovirus diluat de 100 de ori cu PBS. Soluția este încălzită într-o baie de apă la 56°C.

2. Topiți 10 ml de agaroză 2% în PBS în modul obișnuit și răciți la 56°C într-o baie de apă.

3. La 56°C, amestecați 1 ml de antiser diluat cu 1 ml de agaroză 2%.

4. Transferați 200 µl din amestecul rezultat în două godeuri ale unei plăci de microtitrare cu 96 de godeuri.

5. Lăsați agaroza să se solidifice la temperatura camerei. Placa poate fi păstrată la 4°C timp de câteva săptămâni dacă este sigilată cu bandă adezivă.

6. Adăugați 10 µl de ser care conține parvovirus în godeul care conține amestecul de agaroză și antiser.

7. O grilă de microscopie electronică cu un strat de carbon-formvar pregătit în prealabil este plasată cu partea mai puțin lucioasă pe o picătură de ser.

8. Grila se ține 2 ore la 37 °C într-o cameră umedă.

9. Cu penseta subțire se scoate plasa și se aplică o picătură de acid fosfotungstic 2% pe suprafața plasei care a fost în contact cu serul.

10. După 30 s, excesul de vopsea este spălat, preparatul este uscat și virusul este inactivat.

Particulele virale agregate sunt examinate la un microscop electronic cu transmisie la o mărire de 30.000 până la 50.000.

3. Identificarea antigenelor virale

Virușii din țesuturi sau fluide tisulare pot fi identificați prin proteine ​​specifice virusului folosind reacția antigen-anticorp. Produsul reacției antigen-anticorp este testat pentru o etichetă, care este introdusă fie direct în anticorpi antivirali, fie în anticorpi direcționați împotriva anticorpilor specifici virusului. Anticorpii pot fi marcați cu fluoresceină, iod radioactiv sau o enzimă care scindează substratul cu o schimbare de culoare. În plus, o reacție de hemaglutinare este utilizată pentru a identifica virusul. În practica de zi cu zi, metodele descrise sunt utilizate în principal pentru a detecta antigenele virusului hepatitei B în sânge și pentru a căuta antigene ale diferitelor virusuri care provoacă diferite boli respiratorii.

În prezent, multe companii produc diagnostice eritrocitare, radioactive și enzimatice, inclusiv cele pentru depistarea virusului hepatitei B. Nu considerăm oportun să descriem metodele de lucru cu aceste diagnostice: este suficient să urmați instrucțiunile atașate. Mai jos ne vom concentra pe metoda imunofluorescentă pentru identificarea virusului respirator sincițial în secrețiile nazofaringiene.

3.1 Identificarea virusului respirator sincițial în secrețiile nazofaringiene prin imunofluorescență

Metoda de obținere a preparatelor de secreții nazofaringiene este descrisă de Gardner și McQuilin. În condiții de laborator, această operație se realizează în două etape. Mai întâi, se prepară un frotiu din mucusul nazofaringian pe o lamă de sticlă. Tampoanele obținute pot fi păstrate în stare fixă ​​la -20°C timp de mai multe luni. În a doua etapă, frotiurile sunt colorate pentru a detecta antigenul virusului respirator sincițial. În acest scop, se utilizează metoda imunofluorescenței indirecte.

3.1.1 Prepararea secretiilor nazofaringiene

1. Mucusul de la pense speciale este spălat cu 1-2 ml de PBS și transferat într-un tub de centrifugă.

2. Se centrifugă timp de 10 minute la 1500 rpm într-o centrifugă de masă.

3. Supernatantul este aruncat.

4. Peletul celular este resuspendat ușor în 2-3 ml PBS până se obține o suspensie omogenă. Pentru a face acest lucru, utilizați o pipetă Pasteur cu gura largă.

5. Suspensia rezultată este transferată într-o eprubetă.

6. Se adaugă încă 2-4 ml de PBS în suspensie și se amestecă prin pipetare. Cheaguri mari de mucus sunt îndepărtate.

7. Se centrifugă timp de 10 minute la 1500 rpm într-o centrifugă de masă.

8. Supernatantul este drenat, precipitatul este resuspendat într-un astfel de volum de PBS încât suspensia rezultată este ușor separată de pereții eprubetei.

9. Suspensia rezultată se aplică pe lama de sticlă marcată.

10. Paharul se usucă la aer.

Se fixează în acetonă timp de 10 minute la 4°C.

12. După fixare, sticla este din nou uscată la aer.

13. Preparatele rezultate se colorează imediat sau se păstrează la -20 °C.

3.1.2. Tehnica de colorare

1. Imprimați și diluați antiserul comercial împotriva RSV în PBS la concentrația de lucru recomandată.

2. Aplicați o picătură de antiser pe preparatul preparat cu o pipetă Pasteur.

3. Medicamentul este plasat într-o cameră umedă.

4. Preparatul este incubat timp de 30 de minute la 37 °C.

5. Probele sunt spălate cu grijă cu PBS pentru a îndepărta excesul de anticorpi într-un rezervor special.

6. Probele sunt spălate în trei schimburi de PBS timp de 10 minute fiecare.

7. Uscați probele, îndepărtați excesul de PBS cu hârtie de filtru și uscați la aer.